Universidade Estadual de Maringá: Centro de Ciências Exatas Departamento de Química

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
“Desenvolvimento de método cromatográfico limpo para a

determinação de vitaminas lipossolúveis em alimentos explorando
a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e ambientes
micelares”
Dissertação apresentada por

Vanessa Kienen ao Programa de
Pós-Graduação em Química do
Departamento de Química do Centro
de Ciências Exatas da Universidade
Estadual de Maringá como parte dos
requisitos para a obtenção do título de
Mestre em Química
MARINGÁ, MARÇO/2007
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
Kienen, Vanessa
K47d Desenvolvimento de método cromotográfico limpo para a determinação de
vitaminas lipossolúveis em alimentos explorando a cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE) e ambientes micelares / Vanessa Kienen. --
Maringá : [s.n.], 2007.
92 f. : il.
Orientador : Prof. Dr. Cláudio Celestino de Oliveira.

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Maringá. Programa de
Pós-Graduação em Química, 2007.
1. CLAE. 2. Vitaminas lipossolúveis. 3. Química limpa. I. Universidade

Estadual de Maringá. Programa de Pós-Graduação em Química. II. Título.
CDD 21.ed. - 543.089

Universidade Estadual de Maringá
Centro de Ciências Exatas
Departamento de Química
Programa de Pós-graduação em Química
Desenvolvimento de método cromatográfico limpo para a determinação de
vitaminas lipossolúveis em alimentos explorando a cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE) e ambientes micelares.
Vanessa Kienen
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Química, da Universidade
Estadual de Maringá, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Mestre em Química.
Orientador: Prof. Dr Cláudio Celestino de Oliveira
Maringá, março de 2007.

“Não digamos não, nem nunca mais. Não digamos
sempre ou jamais. Digamos, simplesmente: ainda!...
Ainda nos veremos um dia. Ainda nos encontraremos
na estrada da vida. Ainda encontraremos a pousada, o
afeto almejado, a guarida. Ainda haverá tempo de
amar, sem medo, totalmente... infinitamente... sem ter
medo de pedir, de implorar, ou chorar... Ainda haverá
tempo, para ser feliz novamente. Ainda haverá
tristeza, ainda haverá saudade, ainda haverá
primavera, o sonho, a quimera. Ainda haverá alegria,
apesar das cicatrizes. Ainda haverá esperança, porque
amanhã será um novo dia!...”.
Paulo Coelho
ii
DEDICATÓRIA
A Deus, por ter estar sempre ao meu lado iluminando
o meu caminho, por me dar forças para vencer todos os
obstáculos e por conceder a serenidade necessária para aceitar
as coisas que não podemos mudar; coragem para mudar
aquelas que podemos e sabedoria para distinguir uma das
outras.
Aos meus pais, pois de vocês recebi o dom mais
precioso a Vida. Já por isso sou infinitamente grata. Mas
vocês não se contentaram em presentear-me apenas com ela,
mas sim revestiram minha existência com amor, carinho,
incentivo, compreensão e dedicação.
Aos meus familiares e amigos, pelo amor e incentivo
em todos os momentos de minha vida.
iii
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Cláudio, pela orientação, paciência, confiança, amizade, incentivo
e por compartilhar não apenas seus conhecimentos acadêmicos, mas também suas
experiências de vida;
Ao Prof. e amigo Willian, pelo incentivo, ajuda, colaboração, pelas idéias e pelos
ensinamentos no laboratório e na vida.
A Profa. Maria Helena pela amizade, ajuda e incentivo;
Ao Prof. Nilson e Jesuí pela amizade, colaboração e incentivo;
Ao Programa de Pós Graduação em Química pela oportunidade;
Aos amigos Ana Cláudia, Ana Paula Ozima, Ana Paula, Ângela, André, Augusto,
Cristiano, Danielle, Eliane, Elidia, Elisa, Flávia, Gisele, Higo, Lílian, Marcela, Marina,
Milton, Rúbia, Simone, Silvia, Solange, Patrícia, Valquíria e Vanessa pela amizade,
incentivo e por me ajudar sempre nas horas em que mais precisei;
Ao Claudemir, Cristina, Edson e Moacir pela amizade e disposição em ajudar sempre que
necessário;
A CAPES pela concessão da bolsa de estudos;
Aos meus pais, Waldemiro e Lia pelo carinho, incentivo e compreensão;
As minhas amigas Adriana, Daniele, Flávia, Francieli, Francielle, Juliana, Michely, Paula,
Tatiana e Vânia pela amizade, incentivo, carinho e compreensão.
A toda minha família, amigos e a todas as pessoas que de alguma forma colaboraram no
desenvolvimento deste trabalho.
iv
SUMÁRIO
Páginas
Índice de Figuras........................................................................................................... viii
Índice de Tabelas.......................................................................................................... xi
Resumo........................................................................................................................... xii
Abstract......................................................................................................................... xiv
1.INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 01
2.REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................. 05
2.1. Vitaminas Lipossolúveis...................................................................................... 05
2.1.1. Vitamina A.................................................................................................... 06
2.1.2. Vitamina D.................................................................................................... 10
2.1.3. Vitamina E.................................................................................................... 12
2.1.4.Vitamina K..................................................................................................... 16
2.2. Análise química das vitaminas lipossolúveis...................................................... 18
2.3. Formas de extração das vitaminas lipossolúveis................................................. 21
2.4. Cromatografia...................................................................................................... 23
2.4.1.Classificação pela forma física...................................................................... 25
2.4.2.Classificação cromatográfica pela fase móvel............................................... 25
2.4.3.Classificação pela fase estacionária............................................................... 26
2.4.4.Classificação pelo modo de separação.......................................................... 26
2.5.Cromatografia Líquida de Alta Eficiência............................................................ 27
2.6. Surfactantes e Ambientes Micelares.................................................................... 34
v
2.7. Química Limpa.................................................................................................... 37
2.8. Parâmetros Cromatográficos............................................................................... 39
2.9. Planejamento fatorial........................................................................................... 43
3.OBJETIVOS.............................................................................................................. 46
3.1.Objetivo Geral...................................................................................................... 46
3.2.Objetivo Específico.............................................................................................. 46
4.MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 47
4.1.Reagentes e Soluções............................................................................................ 47
4.1.1.Reagentes....................................................................................................... 47
4.1.2.Soluções......................................................................................................... 48
4.2.Equipamentos e Acessórios.................................................................................. 49
4.2.1.Espectrofotômetro.......................................................................................... 49
4.2.2.Cromatógrafo................................................................................................. 49
4.3.Métodos................................................................................................................ 51
4.3.1. Espectros UV-Vis......................................................................................... 51
4.3.2. Testes preliminares....................................................................................... 51
4.3.3. Planejamento fatorial para otimização do método cromatográfico para
determinação das vitaminas lipossolúveis.............................................................. 52
4.3.4.Método convencional..................................................................................... 53
4.4. Aplicações............................................................................................................ 54
4.4.1. Extração das vitaminas lipossolúveis (A, D3, E e K1) de alimentos........... 54
vi
4.4.2. Extração das vitaminas lipossolúveis (A, D3, E e K1) dos complexos
vitamínicos.............................................................................................................. 56
5.RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................. 57
5.1.Espectros de UV-Vis............................................................................................ 57
5.2. Determinação de vitaminas utilizando cromatografia líquida de alta eficiência
em ambientes micelares.............................................................................................. 59
5.2.1. Testes preliminares....................................................................................... 59
5.2.2. Planejamento fatorial e otimização das variáveis......................................... 68
5.2.3. Determinação das vitaminas utilizando o método cromatográfico
convencional........................................................................................................... 73
5.3. Aplicações............................................................................................................ 74
5.3.1. Figuras de mérito do método proposto......................................................... 74
5.3.2. Figuras de mérito do método convencional.................................................. 78
5.3.3. Comparação das características do método proposto e do método
convencional........................................................................................................... 81
5.3.4. Determinação de vitaminas em amostras de alimentos e complexos
vitamínicos.............................................................................................................. 82
6. CONCLUSÕES......................................................................................................... 86
7. REFERÊNCIAS........................................................................................................ 88
vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Páginas
Figura 01. Fórmula estrutural do Retinol (Vitamina A)................................................. 07
Figura 02. Fórmula estrutural do Acetato de Retinol..................................................... 07
Figura 03. Fórmula estrutural do Ergocalciferol (Vitamina D2).................................... 10
Figura 04. Fórmula estrutural do Colecalciferol (Vitamina D3).................................... 10
Figura 05. Fórmula estrutural do Tocoferol (Vitamina E)............................................. 13
Figura 06. Fórmula estrutural do α-Acetato de Tocoferol.............................................. 14
Figura 07. Fórmula estrutural da Filoquinone (Vitamina K1)........................................ 16
Figura 08. Fórmula estrutural da Menaquinone (Vitamina K2)..................................... 16
Figura 09. Fórmula estrutural da Menadione (Vitamina K3)......................................... 16
Figura 10. Formação do agregado micelar..................................................................... 35
Figura 11. Diferentes aglomerados de sistemas micelares............................................. 36
Figura 12. Medidas relacionadas à determinação da resolução...................................... 40
Figura 13. Medidas relacionadas ao cálculo do fator de assimetria e de alargamento... 41
Figura 14. Cromatográfo líquido de alta eficiência........................................................ 50
Figura 15. Esquema da extração das vitaminas lipossolúveis das amostras de
alimentos e complexos vitamínicos................................................................................ 55
Figura 16. Espectro eletrônico das vitaminas lipossolúveis em solução de álcool
etílico.............................................................................................................................. 57
Figura 17. Espectro eletrônico da mistura dos surfactantes........................................... 59
Figura 18. Efeito da utilização de soluções aquosas do surfactante SDS na separação
das vitaminas lipossolúveis............................................................................................. 60
viii
Figura 19. Efeito da utilização de soluções aquosas de álcool etílico na separação das
vitaminas lipossolúveis................................................................................................... 61
Figura 20. Efeito da concentração do surfactante SDS na separação das vitaminas
lipossolúveis................................................................................................................... 62
Figura 21. Efeito da composição da fase móvel na separação das vitaminas
lipossolúveis................................................................................................................... 63
Figura 22. Efeito da adição de modificadores químicos à fase móvel na separação
Figura 23. Efeito da concentração de álcool etílico na separação das vitaminas
lipossolúveis na temperatura de 30,0 oC........................................................................ 66
Figura 24. Efeito da vazão e da presença de álcool butílico na separação das
Figura 25. Otimização dos parâmetros experimentais utilizando planejamento fatorial
na separação das vitaminas lipossolúveis....................................................................... 69
Figura 26. Cromatograma de uma solução padrão contendo as vitaminas D3, A, E,
K1................................................................................................................................... 72
Figura 27. Efeito do controle de temperatura na separação das vitaminas
lipossolúveis D3, A, E.................................................................................................... 73
Figura 28. Determinação de vitaminas lipossolúveis empregando-se método
cromatográfico convencional.......................................................................................... 74
Figura 29. Curva Analítica para a Vitamina A pelo método proposto........................... 75
Figura 30. Curva Analítica para a Vitamina D3 pelo método proposto......................... 76
Figura 31. Curva Analítica para a Vitamina E pelo método proposto............................ 76
ix
Figura 32. Curva Analítica para a Vitamina K1 pelo método proposto......................... 77
Figura 33. Curva Analítica para a Vitamina A pelo método convencional.................... 78
Figura 34. Curva Analítica para a Vitamina D3 pelo método convencional.................. 79
Figura 35. Curva Analítica para a Vitamina E pelo método convencional.................... 79
Figura 36. Curva Analítica para a Vitamina K1 pelo método convencional.................. 80
Figura 37. Cromatograma de amostras de preparações farmacêuticas........................... 85
x
ÍNDICE DE TABELAS
Páginas
Tabela 01. Estrutura relativa do tocoferol aos radicais R1 e R2.................................... 13
Tabela 02. Informações sobre a toxicidade de alguns solventes orgânicos em teste
realizado com ratos......................................................................................................... 33
Tabela 03. Combinação dos ensaios de um planejamento fatorial 22............................. 44
Tabela 04. Combinação dos ensaios de um planejamento fatorial 23............................. 45
Tabela 05. Fatores utilizados no planejamento fatorial 23 para a separação das
Tabela 06. Resoluções cromatográficas para planejamento fatorial 23 para
determinação das vitaminas lipossolúveis...................................................................... 71
Tabela 07. Características do método cromatográfico proposto para a determinação
Tabela 08. Características do método cromatográfico convencional para a
determinação das vitaminas lipossolúveis...................................................................... 80
Tabela 09. Comparação das características do método cromatográfico proposto e do
método convencional para a determinação das vitaminas lipossolúveis....................... 81
Tabela 10. Ensaio de recuperação das vitaminas lipossolúveis em amostras de leite
fortificado, leite em pó, óleo e repolho através do método proposto e do método
convencional utilizando adição de padrão...................................................................... 83
xi
Desenvolvimento de método cromatográfico limpo para a determinação
de vitaminas lipossolúveis em alimentos explorando a cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) e ambientes micelares
Autora: Vanessa Kienen
Orientador: Prof. Dr Cláudio C. Oliveira
Resumo
Neste trabalho é proposta a separação e determinação de vitaminas lipossolúveis
utilizando-se CLAE associada a ambientes micelares, sem a utilização de reagentes
potencialmente tóxicos como fase móvel. Como aplicação foi selecionada a determinação
de vitaminas lipossolúveis em amostras de alimentos, complexos vitamínicos e similares,
sempre utilizando como fase estacionária uma coluna cromatográfica C18, sendo esta
temporariamente modificada, durante a análise química, pelos constituintes da própria fase
móvel, o que amplia as possibilidades de aplicação da estratégia e possibilita o
desenvolvimento de métodos analíticos limpos explorando a CLAE. O método
cromatográfico desenvolvido para a determinação de vitaminas lipossolúveis utilizou como
fase móvel álcool butílico 15,0 % (v/v), SDS 3,00 % (m/v) e solução tampão fosfato 0,02
mol/L, pH 7,00, temperatura de 30,0ºC, associada a uma vazão de 2,00 mL/min e como
fase estacionária uma coluna C18. A metodologia mostrou-se seletiva, sensível, robusta,
simples, alta frequência analítica, com tempos de retenção de 4,0; 9,6; 13,0 e 22,7 min e
limites de detecção e quantificação de 0,94: 0,89; 1,18 e 0,87 mg/L e 3,12; 3,00; 4,00 e 2,90
xii
mg/L respectivamente para as vitaminas D3, A, E e K1 com desvio padrão de ca 5,0 %.
Quando o método proposto foi aplicado a amostras reais os resultados obtidos foram
concordantes com aqueles obtidos pelo procedimento convencional.
xiii
Development of a green chromatographic method for determination of fat
soluble vitamins in foods exploiting high performance liquid
chromatograph (HPLC) and micellar media
Author: Vanessa Kienen
Adviser: Prof.Cláudio C. Oliveira
Abstract
In the present work is proposed the separation and determination of fat soluble
vitamins by using HPLC associated to micelar media, without usage of potentially toxic
reagents as mobile phase. The determination of fat soluble vitamins in food, vitamin
complex and similar samples were selected as application, always using a RP-18 column as
stationary phase, which was temporary modified during the chemical analysis by the
mobile phase constituents, increasing the applicability of the strategy and becoming
possible the development of green analytical methods exploiting HPLC. The proposed
method for determination of fat soluble vitamins was carried out by using 15.0 % (v/v)
butyl alcohol, 3.00 % (w/v) SDS and 0.02 mol/L phosphate buffer, pH 7.00, temperature of
30.0º C, associated to a flow rate of 2.00 mL/min and a RP-18 as stationary phase. The
analytical method is selective, sensitive, robust, simple, presents high analytical frequency,
with retention times of 4.0; 9.6; 13.0 e 22.7 min, detection and quantification limits of 0.94:
0.89; 1.18 e 0.87 mg/L and 3.12; 3.00; 4.00 and 2.90 mg/L, respectively for D3, A, E and
K1 vitamins with standard deviation of ca 5.0 %. When the proposed method was applied
xiv
to real samples the obtained results were in agreement with those obtained by the
conventional method.
xv
Capítulo 1 – Introdução
1. Introdução
Com o avanço da química analítica tem sido possível desenvolver métodos
analíticos mais seletivos e sensíveis para a determinação, por exemplo, de substâncias
químicas como contaminantes, nutrientes, vitaminas e dentre outras. Assim, existe uma
demanda crescente por métodos analíticos que possibilitem análises de diversas
amostras em diferentes áreas da ciência, bem como a necessidade de automação dos
procedimentos de análises, com o objetivo de aumentar a capacidade de processamento
de amostras e obter resultados com um maior grau de confiabilidade que possam ajudar
no desenvolvimento científico e tecnológico.
Durante muito tempo o valor nutritivo de um alimento foi definido com base no
seu teor de proteínas, carboidratos, gorduras e sais minerais, uma vez que unicamente
essas substâncias eram consideradas necessárias para o crescimento e desenvolvimento
dos organismos. No entanto, há aproximadamente 100 anos foi reconhecido o fato de
que o organismo também necessita de pequenas quantidades de substâncias orgânicas
específicas e essenciais que foram denominadas de vitaminas [1].
Vitaminas são substâncias orgânicas presentes em muitos alimentos em
pequenas quantidades e são indispensáveis ao funcionamento do organismo estando
presentes na forma de co-fatores. Sua ausência sistemática na dieta resulta, quase
sempre, em crescimento e desenvolvimento deficientes e outras perturbações no
organismo, configurando-se um quadro sintomatológico característico de carência [2].
À medida que os cientistas foram associando os fatores encontrados nos
alimentos com as doenças carências, estas substâncias foram sendo designadas por
letras em ordem alfabética [3]. Assim o fator encontrado na manteiga e que tinha
atividade em vitamina A foi denominado de fator lipossolúvel A, o fator cuja
1
deficiência era responsável pelo desenvolvimento do beribéri 1 foi chamado de fator
hidrossolúvel B e o fator antiescorbútico 2 foi denominado de fator hidrossolúvel C. A
partir de então, muitos fatores foram descobertos, sendo a eles atribuídas letras do
alfabeto [3].
Apesar deste sistema descritivo ter sido abandonado porque muitos destes
fatores tratavam-se da mesma substância e a nomenclatura química estava ausente
nestas primeiras designações, ainda hoje se utilizam letras para designar as vitaminas ou
grupos de compostos com atividades vitamínicas, colocando-se após a letra que indica a
vitamina, índices numéricos que identificam estes fatores, assim tem-se a vitamina D2 e
D3, as vitaminas K1, K2, K3 e entre outras [3].
Tradicionalmente, as vitaminas são classificadas em lipossolúveis
compreendendo o grupo das vitaminas A, D, E, K e hidrossolúveis compreendendo o
grupo do complexo B (B1, B2, B3, B5, B6, B8, B9, B12) e a Vitamina C, de acordo
com propriedades fisiológicas e físico-químicas [2].
Independentemente dos fatores do ambiente, a maioria dos organismos é incapaz
de sintetizá-las por via anabólica, razão pela qual as vitaminas precisam ser incluídas na
dieta alimentar. Em geral, são necessárias micro-quantidades de vitaminas que variam
em função da idade, sexo, estado fisiológico e atividade física do indivíduo. As
necessidades nutricionais desses micro-nutrientes aumentam durante os períodos de
crescimento, gestação e lactação, nas condições de trabalho intenso e na ocorrência de
determinadas doenças, notadamente as infecciosas [2].
A estreita relação entre dieta e saúde faz com que aumente a preocupação dos
consumidores em ingerir alimentos nutritivos ou de alta qualidade como, por exemplo,
1
Doença provocada por carência de vitamina B1, provoca desordens do sistema nervoso, fraqueza
muscular, dificuldades respiratórias e também pode afetar o coração.
2
Escorbuto - doença provocada por carências graves de vitamina C, provoca hemorragias nas gengivas,
inchaço, dores nas articulações e enfraquecimento das estruturas de colágeno.
2
os fortificados ou enriquecidos e os vitaminados. Lamentavelmente, a adição desses
micro-nutrientes a produtos industrializados também tem sido utilizada como mera
estratégia de “marketing”, onde os interesses comerciais prevalecem, em detrimento das
reais necessidades do indivíduo [2].
Devido à importância nutricional das vitaminas lipossolúveis, várias
metodologias têm sido desenvolvidas para a determinação destas substâncias em
amostras de alimentos, produtos farmacêuticos e fluídos biológicos [4]. No entanto, a
padronização de métodos para determinação das vitaminas lipossolúveis é dificultada
devido à diversidade de procedimentos descritos na literatura e à morosidade da
aplicação da técnica oficial da “Association Official of Analytical Chemistry” (AOAC)
[5]. Isto faz com que os organismos oficiais de fiscalização e a própria indústria fiquem
impedidos de exercerem um melhor controle de qualidade nos processos tecnológicos e
nos produtos desenvolvidos [2]. Além disso, um outro fator determinante na análise de
vitaminas são os erros nas análises, pouco freqüentes com outras substâncias, devido à
facilidade de isomerização desses nutrientes que conduz à perda total ou parcial do
valor vitamínico em condições extremas de pH, temperaturas elevadas e alto poder de
oxi-redução, fatores que devem ser considerados pelos métodos analíticos [2].
Entre os métodos modernos de análise, a cromatografia ocupa um lugar de
destaque devido à facilidade com que se efetua a separação, identificação e
quantificação das espécies químicas [6].
Atualmente, a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) vem se
destacando entre as demais técnicas analíticas devido a sua grande versatilidade e
confiabilidade em análises de compostos químicos orgânicos, que necessitam de uma
separação prévia, antes de sua quantificação. Porém, esta técnica analítica normalmente
está associada a solventes orgânicos que são utilizados como fase móvel, provocando a
3
geração de resíduos tóxicos após a análise química, sendo que estes solventes nem
sempre são degradados no meio ambiente.
Na tentativa de solucionar esta deficiência, tem sido desenvolvida recentemente
a cromatografia líquida micelar (CLM) devida à possibilidade de se conseguir a
separação de compostos iônicos e não iônicos utilizando a CLAE em fase reversa. O
efeito da formação da micela, o baixo custo da análise, a baixa volatilidade da fase
móvel são alguns dos fatores que favorecem a utilização da técnica [4]. Deve-se
ressaltar que estes métodos analíticos minimizam a utilização de solventes orgânicos
potencialmente tóxicos, mas não os eliminam completamente, pois muitas vezes, estes
solventes são utilizados como modificadores químicos. Assim, esta técnica analítica não
está de acordo com a tendência internacional moderna que exige o desenvolvimento de
métodos analíticos limpos.
Considerando estes aspectos, o presente trabalho tem o objetivo de verificar a
possibilidade de se determinar vitaminas lipossolúveis utilizando a CLAE associada a
ambiente micelar sem a utilização de solventes de alta toxicidade. Desta forma, é
proposta a exploração de ambientes micelares, com a utilização de reagentes de baixa
toxicidade como fase móvel, para a determinação de vitaminas lipossolúveis sempre
utilizando como fase estacionária uma coluna cromatográfica C18, sendo esta,
temporariamente modificada durante a análise química pelos constituintes da própria
fase móvel, ampliando as possibilidades de aplicação da estratégia e possibilitando o
desenvolvimento de métodos cromatográficos limpos.
4
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
2. Revisão Bibliográfica
O presente trabalho propõe o desenvolvimento de método cromatográfico limpo
explorando ambientes micelares para a determinação de vitaminas lipossolúveis em
alimentos, complexo vitamínico e similares. Devido às características dos métodos
cromatográficos e dos ambientes micelares que permitem separar espécies químicas e
solvatar moléculas orgânicas de baixa polaridade em meio aquoso, é possível prever que
a união destas duas ferramentas possa dar origem a sistemas cromatográficos com
características benéficas de ambos, possibilitando o desenvolvimento de métodos
cromatográficos com a utilização de solventes orgânicos de baixa toxicidade que
poderão ser classificados como limpos e estando de acordo com a tendência
internacional moderna. Assim, esta revisão foi subdividida de forma a destacar as
características das vitaminas lipossolúveis; os fundamentos da cromatografia, mais
especificamente a cromatografia líquida de alta eficiência; os surfactantes e os
ambientes micelares, a química limpa e informações sobre parâmetros cromatográficos
e planejamento fatorial.
2.1. Vitaminas Lipossolúveis
As vitaminas lipossolúveis são substâncias que apresentam uma baixa polaridade
e subdividem-se em quatro grupos, vitaminas A, D, E, K, sendo que a atividade
biológica atribuída a estas substâncias está relacionada à estrutura de cada vitamina. As
vitaminas lipossolúveis são normalmente solúveis em lipídios e nos solventes orgânicos,
5
sendo geralmente armazenadas no organismo nos mesmos locais das células adiposas
[3].
As vitaminas são nutricionalmente essenciais ao organismo na forma de
micronutrientes, pois estão presentes na maioria dos alimentos em pequenas
quantidades [7]. Os alimentos representam a maior e mais importante fonte de vitaminas
consumidas, pois elas estão naturalmente presentes nas plantas, animais e também
podem ser adicionadas na fortificação dos alimentos. Uma outra fonte de vitamina são
os suplementos vitamínicos na forma de cápsulas, soluções intravenosas, dentre outras
[7].
A deficiência de nutrientes, aqui especificamente as vitaminas, representa uns
dos maiores problemas de saúde do ser humano, por isso, a adição destas substâncias
promove uma melhora nutricional na qualidade dos alimentos industrializados. Deve ser
salientado que no caso de alimentos fortificados deve-se adicionar vitaminas nas formas
estáveis [7].
2.1.1. Vitamina A
O grupo da vitamina A inclui o retinol (Fig. 01) e os carotenóides. O termo
retinóis refere-se à classe de compostos incluindo o retinol e seus derivados químicos;
vários retinóis desempenham atividades nutricionais semelhantes. Algumas enzimas
presentes no organismo podem converter estruturas químicas semelhantes ao retinol à
forma da vitamina ou ainda converter as substâncias que são equivalentes ao retinol,
como o seu aldeído ou o seu éster [7]. O β-caroteno é um precursor de vitamina A e
também atua como antioxidante na remoção dos radicais livres no organismo,
prevenindo a formação de peróxidos e como atenuador físico, dissipando a energia extra
6
contida no oxigênio singlete que é tido como forte agente mutagênico em razão da
peroxidação de lipídios [8].
De acordo com a necessidade do organismo o β-caroteno é convertido em
vitamina A, sendo que uma molécula de β-caroteno pode ser clivada por uma enzima
intestinal específica em duas moléculas de vitamina A [7]. As formas sintéticas do
acetato de retinol (Fig. 02) e palmitato de retinol são, também, utilizadas na fabricação
de alimentos fortificados [7].
CH2OH
Figura 01. Fórmula estrutural do Retinol (Vitamina A) [7].
CH2 O C CH3
Figura 02. Fórmula estrutural do Acetato de Retinol [7].
Além destas formas químicas, a vitamina A pode apresentar diversos isômeros
espaciais, estes isômeros são formados por modificações da cadeia lateral da forma
“trans” para a forma “cis” [3].
A Vitamina A ou retinol (Fig. 01) é armazenada no fígado e de acordo com a
demanda pode ser liberada na corrente sanguínea. Esta vitamina é essencial para o bom
7
funcionamento da visão, para o crescimento, para a diferenciação dos tecidos, na
manutenção do sistema imunológico e reprodutor [9-10].
Um dos sintomas iniciais de deficiência em vitamina A é a cegueira noturna, ou
uma capacidade diminuída para ver na penumbra. A deficiência grave produz a
xeroftalmia, uma doença degenerativa da córnea do olho que se não tratada pode causar
cegueira total. A deficiência de vitamina A também pode causar o desenvolvimento
anormal nos ossos e distúrbios do sistema reprodutivo [11]. O mecanismo de atuação da
vitamina A no organismo ainda não está completamente esclarecido, mas existem claras
indicações de um importante papel na síntese de glicoproteínas, que ocorrem nas
membranas das células mucosas, e cuja falta pode aumentar a suscetibilidade a
infecções seguindo a degeneração do epitélio que reveste o trato respiratório e digestivo
[11].
Atualmente, tem-se dado atenção considerável à possibilidade de a vitamina A
ter uma função anticâncer. Experimentos em laboratórios com altas doses da vitamina
mostram alguns resultados promissores, mas ainda não existem provas concretas de seu
efeito terapêutico. Grandes doses aumentam as reservas do fígado e os riscos de
hipervitaminose, mas não aumentam a concentração da vitamina nos tecidos alvo [11].
O efeito benéfico da vitamina A, também, está relacionado à sua atividade
antioxidante, pois tanto o retinol quanto o β-caroteno são antioxidantes fracos, que
podem ajudar na eliminação de substâncias nocivas formadas em algumas reações
envolvendo oxigênio [11].
Dentre as fontes naturais de vitamina A temos o fígado bovino, gema de ovo,
óleos de fígado de peixe, derivados do leite, manteiga e margarina. Já os carotenóides
(convertidos em vitamina A no intestino) estão presentes em vegetais folhosos verdes
escuros (agrião, brócolis, repolho), vegetais e frutas amarelas (banana, laranja, cenoura)
8
[1]. As fontes sintéticas são as cápsulas de gelatina mole; comprimidos mastigáveis,
efervescentes, ampolas e ainda na maioria dos suplementos multi-vitamínicos.
Deve ser considerado que o excesso de vitamina A pode ser tóxico ao ser
humano. Como esta vitamina é armazenada no fígado, a administração de quantidades
elevadas de vitamina A durante um longo período de tempo, pode eventualmente
exceder a capacidade de armazenamento do fígado, passando para a corrente sanguínea
podendo provocar efeitos adversos como cefaléia (dor de cabeça), descamação da pele,
aumento do baço e dos rins, espessamento dos ossos e dores articulares [11]. Por outro
lado, o β-caroteno, convertido lentamente em vitamina A no organismo, pode ser
consumido em grandes quantidades sem causar intoxicação; o único efeito secundário
observado é o surgimento de um tom amarelo-escuro (carotenose) nas palmas das mãos
e nas plantas dos pés [11].
A vitamina A é estável em meio alcalino e instável em meio ácido e oxidante,
sendo a perda de sua atividade acelerada pelo calor e pela exposição à luz [7]. Por serem
mais estáveis a oxidação que a forma alcoólica, os ésteres de retinol, especialmente o
acetato de retinol e o palmitato de retinol, são utilizados nos alimentos fortificados [3].
A degradação da vitamina A, geralmente, ocorre juntamente com a degradação
dos lipídios insaturados. Assim, fatores que promovem a oxidação dos lipídios
insaturados também promovem a degradação da vitamina A; ambas causadas pela
oxidação direta ou por efeitos indiretos dos radicais livres [7]. As perdas da atividade da
vitamina A em alimentos ocorrem através das reações envolvendo as insaturações da
cadeia lateral, reações de autoxidação ou pela isomerização [7].
9
2.1.2. Vitamina D
O grupo da vitamina D compreende a ergocalciferol (vitamina D2) e a
colecalciferol (vitamina D3). A vitamina D2 (Fig. 03) é produzida a partir do ergosterol
e a vitamina D3 (Fig. 04) é produzida a partir do 7-dehidrocolesterol [3].
CH3
CH3 CH3
CH3
CH2
HO
Figura 03. Fórmula estrutural do Ergocalciferol (Vitamina D2) [6].
CH3 CH3
CH3
CH2
HO
Figura 04. Fórmula estrutural do Colecalciferol (Vitamina D3) [6].
10
O ergosterol é uma pró-vitamina D2 existente nas plantas, fermentos e fungos;
por ação da radiação ultravioleta a molécula de ergosterol sofre um rearranjo
intramolecular formando a vitamina D2 [3]. A substância 7-dehidrocolesterol também é
uma pró-vitamina que é biosintetizada na pele quando a substância é exposta à radiação
solar, ocorrendo rearranjo estrutural e a formação da vitamina D3 [9-10]. As duas
formas desta vitamina são utilizadas na forma sintética para a produção de alimentos
fortificados [7].
A vitamina D é essencial para o desenvolvimento ósseo e na prevenção de
doenças relacionadas aos ossos como a osteoporose, a osteomalácia (adultos) e o
raquitismo (crianças). Também atua na absorção do cálcio e do fósforo no intestino
grosso, para a sua mobilização a partir dos ossos e na reabsorção nos rins. Através
destas três funções, a vitamina D tem um papel importante que é assegurar o
funcionamento correto dos músculos, nervos, coagulação sanguínea, crescimento
celular e utilização de energia [9-10]. O organismo é capaz de manter estoques desta
vitamina, mas diferentemente das outras vitaminas lipossolúveis, ela não é armazenada
no fígado, mas nas células lipídicas da maioria dos tecidos, sobretudo no tecido adiposo
[11].
Na deficiência de vitamina D, o primeiro distúrbio observado no ser humano é a
perda de minerais dos tecidos ósseos e das cartilagens; a concentração de cálcio e de
fósforo no sangue diminui, provocando doenças ósseas [11]. O raquitismo e a
osteomalácia são as manifestações mais amplamente reconhecidas da deficiência de
vitamina D, ambas caracterizadas pela perda de mineral a partir dos ossos, resultando
em deformidades do esqueleto como: pernas arqueadas nas crianças, retardamento do
crescimento de ossos longos (perna e braços) ou até mesmo mineralização inadequada
do esmalte dos dentes e da dentina [12]. Na osteoporose, ocorre uma perda óssea e não
11
apenas desmineralização, que pode estar associada com uma perturbação do
metabolismo da vitamina D [l2].
As fontes naturais de vitamina D são os óleos de fígado de peixe, ovos, leite
enriquecido, queijo, manteiga e margarina [1]. As fontes sintéticas são os comprimidos,
cápsulas, soluções oleosas e injeções.
O excesso de vitamina D pode causar intoxicação, acarretando num aumento da
concentração de cálcio no sangue. O cálcio pode depositar-se por todo o corpo,
sobretudo nos rins e pulmões, podendo causar a calcificação dos tecidos moles.
Quantidade elevada desta vitamina no organismo não está associada à exposição
exagerada à radiação solar, mas sim, à ingestão exagerada de complexos vitamínicos
que contém vitamina D [11].
A vitamina D é relativamente estável em meio ácido e instável em meio alcalino
e oxidante, sendo sensível à luz e a temperatura [7].
2.1.3. Vitamina E
Vitamina E é um nome coletivo que engloba oito diferentes produtos
sintetizados pelos vegetais, os quais podem ser divididos em duas classes: os tocoferóis
que podem ser encontrados na natureza na forma de tocoferol (α, β, γ, δ) e os
tocotrienóis [9-10].
Os tocoferóis (Fig.05 e Tab.01) e tocotrienóis quando não estão na forma
esterificada, atuam como substâncias antioxidantes [7].
12
R1
HO
CH3
R2 O
CH3 CH3 CH3 CH3
CH3
Figura 05. Fórmula estrutural do Tocoferol (Vitamina E) [7].
Tabela 01. Estrutura relativa do tocoferol aos radicais R1 e R2 [7].
Tocoferol R1 R2
α CH3 CH3
β CH3 H
γ H CH3
δ H H
As substâncias antioxidantes previnem a ocorrência de danos oxidativos em
macromoléculas biológicas provocada pelas espécies reativas provenientes do oxigênio,
tais alterações oxidativas podem contribuir para o desenvolvimento de várias doenças
[8]. A hipótese antioxidante sugere que os agentes redutores possuem a capacidade de
prevenir as alterações oxidativas, pois desempenham a função de remover os radicais
livres e também de atenuar o efeito físico do oxigênio singlete, assim, níveis elevados
destas substâncias reduzem o risco do aparecimento de doenças crônicas [8]. Dietas
ricas em substâncias que atuam como antioxidantes; como a ingestão de frutas, vegetais,
cereais, óleo e grãos são benéficas à defesa celular, protegendo os componentes da
célula de alterações oxidativas [8]. De uma forma geral, estas substâncias não tornarão
saudáveis as células ou tecidos doentes, entretanto inibirão ou tornarão o progresso mais
13
lento [8]. Existem evidências crescentes mostrando que a vitamina E, a vitamina A, o
selênio (componente da enzima glutationa peroxidase) e o ácido ascórbico (vitamina C)
funcionam coletivamente como compostos antioxidantes do organismo [11].
Os tocoferóis (Fig. 05) são compostos biologicamente ativos, que se diferenciam
somente no número e nas posições de radicais metila (-CH3) da sua molécula, embora
mínimas estas mudanças estruturais influenciam na atividade biológica destas moléculas
[7]. Os tocoferóis são eficientes receptores do oxigênio singlete, sendo o α-tocoferol o
mais reativo dentre os quatro tipos de tocoferóis, combinando processos físico e
químico [8]. Sua reatividade frente ao oxigênio singlete está relacionada com a
atividade da vitamina E, sendo a forma alfa 100,0 % reativa enquanto as formas beta,
gama e delta são 50,0; 26,0 e 10,0 % reativas, respectivamente. A atividade biológica
dos tocoferóis está relacionada com a habilidade de inibir a oxidação de ácidos graxos
instaurados, interrompendo a reação em cadeia da membrana [8].
As formas sintéticas da vitamina são utilizadas para a produção de alimentos
fortificados. Dentre essas formas temos o α - acetato de tocoferol (Fig. 06), no entanto
esta forma, não apresenta atividade antioxidante [7].
O
CH3
CH3C O
CH3
CH3 O
CH3 CH3 CH3 CH3
CH3
Figura 06. Fórmula estrutural do α – Acetato de Tocoferol [7].
A vitamina E protege as membranas das células dos radicais peroxil, atua na
proteção dos tecidos, nas reações de perioxidação, nos processos metabólicos e na
14
prevenção das doenças cardiovasculares e coronárias [13]. A vitamina E é armazenada
no fígado e no tecido adiposo, existindo uma relação intrínseca entre o envelhecimento
humano e o teor de vitamina E nos tecidos [3].
A deficiência da vitamina E em seres humanos é muito rara, não ocorrendo
casos de deficiência clínica em adultos saudáveis sob quaisquer circunstâncias normais.
A manutenção dos níveis satisfatórios da vitamina E nos tecidos está diretamente
relacionada à quantidade de ácidos graxos polinsaturados ingeridos na dieta [11].
As fontes naturais de vitamina E são óleos vegetais (amendoim, soja, palma,
milho, girassol), o gérmen de trigo, a castanha do Pará, os vegetais de folhas verdes
(espinafre e alface), leite fortificados e ovos [1]. As fontes sintéticas de vitamina E são
as cápsulas de gelatina mole, comprimidos mastigáveis ou efervescentes, ampolas e
suplementos multivitamínicos.
A vitamina E é estável em meio alcalino e ácido. Apresenta instabilidade à luz,
oxigênio, calor e longos períodos de armazenagem [7]. Deve-se ter muito cuidado para
prevenir a oxidação durante os processos de extração utilizando a saponificação e outros
tratamentos preliminares [7]. Em extratos de óleos vegetais a vitamina E é bastante
estável, a menos que existam condições que permitam a auto-oxidação dos ácidos
graxos [11]. Sua presença nos óleos impede o início do processo de rancificação do
produto, mas o desenvolvimento dos peróxidos pode superar a quantidade de tocoferóis
causando a oxidação. A atividade da vitamina é rapidamente perdida no processo de
frituras; e durante a estocagem nem mesmo baixas temperaturas impedem a perda da
maior parte da atividade da vitamina [11].
15
2.1.4.Vitamina K
O grupo da vitamina K compreende as vitaminas K1 (filoquinone), K2
(menaquinone) e a vitamina K3 (menadione). A vitamina K1 (Fig. 07) é encontrada em
vegetais de folhas verde enquanto a vitamina K2 (Fig. 08) é formada pela ação de
bactérias presentes no intestino dos vertebrados [9-10]. Já a vitamina K3 (Fig. 09) é
uma forma sintética utilizada na produção de alimentos fortificados [7].
O
CH3
CH3 CH3
CH2 CH C CH2 (CH2 CH2 CH CH2) 3
O
Figura 07. Fórmula estrutural da Filoquinone (Vitamina K1) [7].
O
CH3
CH3
(CH2 CH C CH2)N
O
Figura 08. Fórmula estrutural da Menaquinone (Vitamina K2) [7].
O
CH3
H
O
Figura 09. Fórmula estrutural Menadione (Vitamina K3) [7].
16
A Vitamina K é essencial na ativação da protombina, proteína que converte o
fibrinogênio solúvel numa proteína bastante insolúvel chamada fibrina, componente
principal da coagulação sanguínea, atua na prevenção das hemorragias internas e
também no metabolismo dos ossos [14]. A administração da vitamina K nos estados
pré-operatórios melhora o nível de protombina prevenindo as hemorragias [3].
A deficiência de vitamina K é algo muito raro em pessoas adultas por causa da
abundante presença de vitamina K1 presente nos alimentos e por causa das bactérias da
flora intestinal que sintetizam a vitamina K2 [7]. No entanto, a deficiência pode estar
associada com má absorção intestinal ou devido à utilização medicamentos
anticoagulantes [7]. Esta deficiência pode resultar numa redução do nível de protombina
do sangue com conseqüente retardamento no tempo de coagulação do sangue, podendo
provocar sérias hemorragias [3]. Tratamento prolongado com antibióticos associado à
falta de uma dieta alimentar e a problemas hepáticos podem levar à deficiência de
vitamina K [3]. Os recém nascidos podem sofrer da deficiência desta vitamina que se
manifesta através da chamada doença hemorrágica do recém nascido, no entanto,
devido à transferência da mãe para o feto a administração de vitamina K as gestantes
diminui consideravelmente a incidência da doença [3].
A ingestão de quantidades excessivas de óleo mineral ou de ácidos graxos pode
impedir a absorção da vitamina K interferindo diretamente na coagulação sanguínea.
As melhores fontes naturais de vitamina K são os vegetais de folhas verdes
(espinafre, brócolis, couve, repolho e alface), fígado bovino, leite fortificado e ovo [1],
podendo ser encontrada em quantidades menores em tomates, batatas e nos óleos
vegetais [7]. As fontes sintéticas da vitamina K são as cápsulas, ampolas e suplementos
multivitamínicos.
17
O excesso de vitamina K é algo incomum, pois o organismo apresenta uma
grande tolerância a esta vitamina. Somente em duas situações a vitamina K possui
atividade tóxica quando utilizada em altas doses em recém-nascidos e quando
administrada em injeções intravenosas em adultos. O excesso de vitamina K3
(menadione) pode causar náuseas, anemia, entre outros sintomas [12].
A vitamina K é moderadamente estável ao calor e a oxidação, mas é sensível aos
meios ácidos, alcalinos e a exposição à luz [7]. Aparentemente a vitamina K é bastante
estável nas condições normais de processamento dos alimentos [11].
2.2. Análise química das vitaminas lipossolúveis
O interesse crescente em relação à demanda orgânica por nutrientes, o
estabelecimento de padrões nutricionais de ingestão, a preocupação mundial quanto à
confiabilidade dos valores nutricionais declarados nos rótulos dos alimentos
enriquecidos e a possível toxicidade das doses elevadas tem ressaltado a necessidade de
se determinar a composição química das vitaminas nos alimentos [2].
Até a década de 1950, a avaliação das vitaminas lipossolúveis contidas nos
alimentos era feita de maneira empírica face à inexistência de técnicas confiáveis para
identificação e quantificação, principalmente pela falta de padrões. Desta forma, foram
observados os efeitos anti-xeroftálmico (lesão da córnea) e o fator anti-raquítico do óleo
de fígado de peixes e gorduras animais, indicativo inicial da relação entre doença e
alimentos. A partir destas observações consolidaram-se os ensaios biológicos em
cobaias, enquanto que os testes microbiológicos surgiram na década de 60 [2].
Os ensaios biológicos e microbiológicos são fundamentados em estudo dose e
resposta, tomando-se indicativos morfofisiológicos e bioquímicos avaliados contra um
18
placebo, através de comparações de fontes naturais de vitaminas ou formas químicas
diretamente [2].
Os métodos químicos de identificação e quantificação através de derivatização
para avaliação das vitaminas A e D envolvem reações de pouca especificidade para
produção de cor (violeta e azul ao esverdeado, respectivamente) com o tricloreto de
antimônio (SbCl3), tradicionalmente conhecido como reagente de “Carr-Price”, os
ácidos trifluoracético e tricloroacético são igualmente recomendados para o mesmo fim
[2]. Estes agentes de derivatização também reagem com carotenóides, com produtos da
degradação da vitamina A, esteróides (com e sem função vitamínica) e colesterol,
constituindo-se estes compostos em interferentes intrínsecos a análise de vitaminas.
Outros reagentes mais específicos disponíveis são o de “Emmerie-Engel” (cloreto
férrico e 2-bipiridil em solução etanólica) para a vitamina E e o de “Irreverre-Sullivan”
(dietilditiocarbamato de sódio em solução etanólica) para a vitamina K [2]. Analisadas
individualmente ou em conjunto, estas substâncias, quando derivatizadas, produzem cor
instável do amarelo-alaranjado ao salmão [2].
Os métodos espectrofotométricos nas regiões do UV-Vis, consistem na
determinação da concentração do analito relacionada à medida de absorbância. Apesar
da simplicidade desta técnica, do bom limite de detecção e da boa sensibilidade [15] ela
não é a mais indicada para a identificação das vitaminas lipossolúveis, pois estas
apresentam um máximo de absorção na região do ultravioleta, fato que inviabiliza a
determinação conjunta devido à possibilidade de apresentar a mesma região de
absorção.
Um outro fato que inviabiliza a utilização desta técnica é quando as substâncias
possuem grupos cromóforos semelhantes, assim a radiação incidente em um
comprimento de onda específico poderá estar sendo absorvida pelos compostos
19
semelhantes [15]. Já na região do visível é necessária a separação da fração de interesse
para que se minimizem problemas inerentes à estabilidade das reações envolvidas [2].
A eletroforese capilar (EC) foi muito utilizada para a separação e determinação
de substâncias de importância biológica como as vitaminas na década passada. No
entanto, as desvantagens da EC incluem a pobre sensibilidade para baixas concentrações
e também a impossibilidade de aplicação do método desenvolvido em amostras reais
como em alimentos, pois estas amostras na maioria das vezes apresentam uma baixa
concentração [16].
A falta de um método analítico adequado para a análise das vitaminas é um
problema sério, pois fatores que limitam a utilização dos métodos analíticos envolvem a
falta de especificidade dos métodos químicos tradicionais, interferentes nos ensaios
biológicos e espectrofotométricos, extração incompleta dos analitos dos alimentos e
medidas incompletas das formas dos complexos vitamínicos [7]. Assim, o método de
análise química mais recomendado para a separação de formas químicas distintas e
avaliações quantitativas das vitaminas é a cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE), pois permite a separação destes compostos antes da etapa de quantificação.
Através dos parâmetros de separação como a resolução cromatográfica (Rs) e o fator de
capacidade (k) podem ser estudados extratos vitamínicos em presença de outras
substâncias com ou sem função vitamínica como, por exemplo, produtos de degradação
e isômeros em alimentos e tecidos [2].
A confirmação das identidades dos referidos compostos com função vitamínica
pode ser conseguida por meio de reações pós-coluna ou diretamente na coluna (com os
reagentes de derivatização) ou através da associação destas técnicas de separação
analítica à espectrometria no infravermelho, de massas e à ressonância magnética
20
nuclear, que fornecem dados concludentes sobre a identificação dos picos, quando
devidamente coletados [2].
Além destes métodos outras técnicas analíticas são utilizadas em menor escala
nas análises das vitaminas como a polarografia e voltametria [17], fluorescência [18],
quimiluminescência [19] e a cromatografia gasosa [20].
2.3. Formas de extração das vitaminas lipossolúveis
A determinação das vitaminas lipossolúveis em alimentos utilizando CLAE, em
geral, não é realizada diretamente, pois esta requer algumas etapas prévias como a
extração do analito da matriz, muitas vezes complexa; a remoção de interferentes, que
são extraídos junto com os analitos, a separação, identificação e quantificação dos
compostos de interesse.
Entre os processos de extração para a remoção das vitaminas lipossolúveis de
suas matrizes temos: a extração líquido-líquido, a extração sólido-líquido, a extração
com fluído supercrítico e a extração em fase sólida [10].
A extração líquido-líquido (ELL) é muito comum para a extração das vitaminas
lipossolúveis, pois utiliza uma grande variedade de solventes orgânicos puros ou em
misturas, apresentando uma grande solubilidade dos compostos durante as análises [10].
Os equipamentos requeridos para a condução deste processo de separação são simples e,
em muitos casos, os solventes utilizados são compatíveis com as fases móveis utilizadas
nas análises cromatográficas [10].
A extração sólido-líquido (ESL) que é utilizada para amostra sólida ou semi-
sólida, possui o papel principal de promover a separação prévia. Muitas vezes, esta
etapa consiste numa simples extração com solventes orgânicos [10].
21
Algumas das desvantagens relacionadas com os processos convencionais como a
extração líquido-líquido e a extração sólido-líquido é a utilização de grandes
quantidades de solventes, tornando necessária a posterior remoção destes; podendo
ocasionar problemas ambientais, aumentar o custo da análise. Ainda, a extração não é
seletiva e, geralmente, outros processos subseqüentes de purificação do extrato são
necessários, aumentando o tempo de extração, o que pode permitir que algumas
substâncias possam se degradar devido exposição prolongada ao solvente aquecido [8].
Outra alternativa é a extração com fluido supercrítico (EFC) utilizando CO2
como substância extratora [8]. Esta técnica tem se apresentado eficiente para a extração
de amostras sólidas, pois o dióxido de carbono é um bom extrator de substâncias
lipossolúveis em diferentes tipos de matrizes, reduzindo a quantidade de rejeitos
produzidos após o processamento da amostra [10].
Deve ser ressaltado que a solubilidade de um composto em um solvente no
estado supercrítico é dependente da densidade do solvente, bem como da afinidade
físico-química do soluto pelo solvente [8]. Os compostos dissolvidos podem ser
recuperados simplesmente pela diminuição da temperatura ou da pressão que reduzem a
densidade do fluido. A densidade do fluido supercrítico é muito sensível a pequenas
alterações de temperatura ou pressão quando perto da região do seu ponto crítico [8].
Assim, a extração com fluido supercrítico baseia-se no controle da solubilidade
via manipulação da temperatura e pressão, a solubilidade de determinado soluto tende a
aumentar com a temperatura e pressão de operação [8]. A temperatura deve ser mantida
abaixo do nível em que o material a ser extraído inicia o processo de degradação
térmica, enquanto o valor da pressão deve ser fixado também se levando em
consideração questões econômicas como o custo da operação [8].
22
A extração em fase sólida (EFS) tem sido a técnica mais utilizada para a
extração e purificação da amostra. Esta técnica possibilita a utilização de métodos
rápidos, versáteis, seletivos e proporciona boa recuperação do analito mesmo quando
este está presente em pequenas quantidades [10]. O uso da EFS tem se apresentado
muito eficiente na purificação “clean-up” e na pré-concentração de vitaminas para
posterior determinação cromatográfica [10].
2.4. Cromatografia
Cromatografia é uma das técnicas analíticas mais poderosas e versáteis, pois em
uma única análise pode-se separar uma mistura de substâncias em seus componentes
individuais e simultaneamente realizar a determinação quantitativa de cada espécie
química presente na amostra [21]. As amostras podem ser gasosas, líquidas ou sólidas e,
dependendo de sua natureza, podem variar em complexidade de uma única substância
para uma mistura [21].
Os termos “cromatografia”, “cromatograma” e “método cromatográfico” são
atribuídos ao botânico russo Mikhael Semenovich Tswett, que em 1906, descreveu suas
experiências com colunas de vidro recheadas com vários sólidos, finamente divididos,
para separar componentes de extrato de folhas e gema de ovo que eram arrastados
através da coluna com éter de petróleo. O nome deriva-se das palavras gregas “chrom”
(cor) e “graphe” (escrever), embora hoje seja sabido que o processo não depende da cor,
exceto para facilitar a identificação dos componentes separados [22]. Paralelamente aos
desenvolvimentos de Tswett, Reed na Inglaterra e Day nos Estados Unidos que
empregaram colunas contendo sólidos e misturas de solventes orgânicos para a
23
separação de sais orgânicos e amostras de petróleo [21-22]. Apesar destes estudos e de
outros anteriores, que também poderiam ser considerados precursores do uso dessa
técnica, a cromatografia foi praticamente ignorada até a década de 30, quando foi
redescoberta. A partir daí, diversos trabalhos na área possibilitaram seu aperfeiçoamento
e em conjunto com os avanços tecnológicos, levaram-na a um elevado grau de
sofisticação, o qual resultou no seu grande potencial de aplicação em muitas áreas da
ciência [23].
Assim, apenas em 1930 que se iniciou a época moderna da cromatografia,
quando Kuhn e Lederer redescobriram e aperfeiçoaram a cromatografia em coluna. Em
1941, Martin e Synge publicaram um trabalho sobre a cromatografia por partição
(cromatografia líquido-líquido), aplicaram o conceito de altura equivalente a um prato
teórico e anteciparam o surgimento de duas técnicas cromatográficas, a cromatografia
gasosa e a cromatografia líquida de alta eficiência [21-22].
Devido a todos os estudos e avanços que ocorreram com os métodos
cromatográficos, atualmente a cromatografia é definida como um método físico-
químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da
distribuição destes componentes entre duas fases, que estão em contato íntimo. Uma das
fases permanece estacionária enquanto a outra se move através da primeira [22].
Durante a passagem da fase móvel pela fase estacionária, os componentes da amostra
são distribuídos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes da
mistura é seletivamente retido na fase estacionária e redissolvido na fase móvel,
resultando em migrações diferenciais que provocam a separação dos compostos
presentes na amostra [22].
Compostos que apresentam alta afinidade pela coluna cromatográfica (fase
estacionária) apresentarão tempo de retenção mais elevado, enquanto que aqueles que
24
apresentam baixa afinidade pela coluna cromatográfica serão caracterizados por um
baixo tempo de retenção e serão eluídos rapidamente da coluna. E esta diferença de
interação que permite que compostos químicos sejam separados utilizando a
cromatografia.
Os diferentes métodos cromatográficos podem ser classificados considerando-se
diversos critérios como a classificação pela forma física, pela fase móvel, pela fase
estacionária e pelo modo separação do sistema cromatográfico [6].
2.4.1.Classificação pela forma física
O sistema cromatográfico pode ser subdividido em cromatografia planar e
cromatografia em coluna. A cromatografia planar resumi-se à cromatografia em papel
(CP) e cromatografia em camada delgada (CCD), enquanto que a cromatografia em
coluna é dividida em vários tipos de cromatografia, classificados através da fase móvel,
fase estacionária e pelo modo de separação [6].
2.4.2.Classificação cromatográfica pela fase móvel
A classificação pelo tipo de fase móvel utilizada é dividida em três tipos de
cromatografia: a cromatografia gasosa (CG) que utiliza como fase móvel um gás inerte,
a cromatografia supercrítica (CSC) que utiliza um vapor pressurizado, acima de sua
temperatura crítica, e a cromatografia líquida (CL) que apresenta uma subdivisão:
cromatografia líquida clássica (CLC), na qual a fase móvel (líquido) é arrastada através
da coluna apenas pela força da gravidade e a cromatografia líquida de alta eficiência
25
(CLAE) que normalmente utiliza colunas metálicas empacotadas com partículas de
diâmetro menores, sendo necessário à utilização de equipamentos sofisticados para
propulsão dos fluidos [6, 23].
2.4.3.Classificação pela fase estacionária
Esta pode ser classificada diferenciando fases estacionárias sólidas, líquidas e
quimicamente ligada. No caso da fase estacionária ser constituída por um líquido, este
pode estar suportado sobre um sólido ou imobilizado sobre este [23]. A imobilização
pode envolver ligações químicas entre o líquido e o suporte, ou somente entre as cadeias
do próprio líquido. É comum considerar as fases estacionárias contendo líquido ativo na
separação, como fases quimicamente ligadas, esta distinção justifica-se pelo fato de seu
mecanismo de separação apresentar freqüência diferente dos mecanismos atribuídos às
fases estacionárias líquidas ou sólidas [6].
2.4.4.Classificação pelo modo de separação
As separações cromatográficas ocorrem devido a processos de adsorção,
partição, troca iônica, exclusão, bioafinidade ou misturas desses mecanismos:
Cromatografia por adsorção - utiliza uma fase estacionária sólida e uma fase móvel
líquida ou gasosa. O soluto é adsorvido na superfície da partícula sólida. O equilíbrio
entre as duas fases justifica a separação dos diferentes solutos [6].
26
Cromatografia por partição - utiliza uma fase estacionária líquida que forma um filme
fino na superfície de um suporte sólido e o soluto fica em equilíbrio entre a fase
estacionária (líquida) e a fase móvel [6].
Cromatografia de troca iônica - utiliza ânions ou cátions ligados covalentemente ao
suporte sólido, geralmente uma resina. Os íons de carga oposta do soluto são atraídos
para a fase estacionária por forças eletrostáticas [6].
Cromatografia por exclusão molecular - esta técnica separa as moléculas pelo tamanho,
com os solutos maiores passando por ela com maior velocidade enquanto os analitos de
menor tamanho passam pelos poros da fase estacionaria sendo retidos na coluna por
maior intervalo de tempo. Ao contrário de outros tipos de cromatografia, não há
interação atrativa entre a fase estacionária [6].
Cromatografia por bioafinidade - esta se baseia no isolamento de macromoléculas
biológicas, através da utilização das propriedades dessas substâncias de unirem-se
reversivelmente a ligantes específicos [6].
Somente a partir da década de 1970, com o desenvolvimento tecnológico para
construir bombas de alta pressão e fases estacionárias de menor diâmetro, conseguiu-se
um avanço considerável na cromatografia líquida que até então era subdesenvolvida e
baseava-se nos experimentos da cromatografia em coluna [6].
2.5.Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Através do desenvolvimento de suportes para fase estacionária com partículas de
diâmetros pequenos, que foi responsável por melhores separações quando comparado
com a cromatografia líquida clássica (CLC) e, com o conseqüente desenvolvimento de
bombas de alta pressão para vencer a alta pressão hidrodinâmica gerada devido à baixa
27
permeabilidade da fase móvel [23] é que se passou a fazer a distinção entre CLAE e
CLC.
A CLAE possui a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de
uma grande variedade de compostos presentes em diversos tipos de amostras, com
menor tempo de análise, com alta resolução cromatográfica, eficiência e detectabilidade
[6]. Devido a sua versatilidade e confiabilidade, a CLAE tem sido amplamente utilizada
como técnica de análise em várias áreas da ciência. As colunas analíticas mais utilizadas
são de dois tipos: as de fase normal e as de fase reversa [2]. As de fase normal são
polares (sílica e outros materiais) e produzem separação em fases móveis de baixa
polaridade, enquanto as de fase reversa são revestidas em grau variável (de 6,0 a 18,0%)
com polímeros de baixa polaridade, octilsilano (C8) e octadecilsilano (C18), que
propiciam melhor resposta com fases móveis polares [2].
Substâncias hidrofílicas como aminoácidos, carboidratos e pigmentos solúveis
em solventes de alta polaridade, são separáveis por cromatografia de fase normal.
Compostos lipofílicos como lipídios e pigmentos solúveis em solventes com baixa
polaridade, podem ser separados por cromatografia de fase reversa [8].
As colunas de fase reversa principalmente a octadecilsilano (C18) são as mais
utilizadas para sistemas simultâneos de separação analítica das vitaminas lipossolúveis.
A inserção de partículas esféricas e homogêneas de compostos com baixa polaridade
(C8 e C18) aumenta a área superficial e modifica a polaridade da coluna, sendo eficazes
para a utilização de fases móveis de média polaridade [2].
Uma das etapas mais importantes na CLAE é a seleção da fase móvel e, para se
obter os melhores resultados a escolha deve considerar as propriedades químicas e
físicas, além da pureza dos solventes [24]. Ainda, fatores como a compatibilidade com o
detector; viscosidade e ponto de ebulição; miscibilidade dos componentes da fase
28
móvel; dissolução da amostra e não decompor seus componentes, pureza do solvente e a
toxicidade são fundamentais na escolha da fase móvel [24].
9 Compatibilidade com o detector
Um dos detectores mais utilizados na CLAE é o detector UV-Vis incluindo o de
comprimento de onda fixo, o de comprimento de onda variável ou o detector por arranjo
de diodos. Sendo assim, deve ser avaliada a absorbância do solvente na região UV-Vis e
cuidar para que este não absorva no mesmo comprimento de onda dos componentes da
amostra a serem analisados [24].
Um outro fator determinante é quanto à forma de eluição utilizada que pode ser
pode ser isocrática ou por gradiente [6]. A eluição isocrática é aquela na qual a
polaridade da fase móvel permanece constante durante todo o processo de separação,
enquanto na eluição por gradiente a composição da fase móvel varia durante o processo
de separação, de modo que a polaridade é variada gradativamente [6]. A eluição
isocrática é o modo preferido de eluição devido a sua simplicidade, conveniência e
repetibilidade das análises e menor custo. Além disso, comparando a eluição isocrática e
a por gradiente temos que na eluição por gradiente não pode ser utilizada com alguns
tipos detectores, como os de índice de refração e por condutividade elétrica. Ainda, na
eluição por gradiente os ruídos da linha base são mais comuns, sendo recomendado o
uso de solventes de alta pureza e rigorosamente degaseificados [6].
9 Viscosidade e Ponto de Ebulição
A viscosidade da fase móvel pode influenciar consideravelmente na separação
cromatográfica, pois o equilíbrio na troca de massa do soluto entre a fase móvel e a fase
estacionária pode se desenvolver de forma mais lenta [24]. A viscosidade é uma
29
propriedade que afeta a queda de pressão dentro da coluna e a eficiência, pois quanto
mais viscosa for a fase móvel mais será afetado o coeficiente de difusão da substância,
acarretando numa perda considerável no número de pratos teóricos [25].
Uma outra variável determinante é o ponto de ebulição que está relacionado com
a perda por evaporação e com a conseqüente possibilidade de contaminação do
ambiente de trabalho e de acidentes por ignição. Solventes muito voláteis ou mesmo
solventes pouco voláteis operados a altas temperaturas, podem causar fenômenos de
cavitação no bombeamento, fato que acarreta perda da reprodutibilidade da vazão e,
consequentemente, do tempo de retenção [25].
9 Miscibilidade dos solventes
A necessidade de se efetuar análises por gradiente ou empregando misturas de
solventes, requer que eles sejam miscíveis entre si. A insolubilidade leva à formação de
gotículas de solventes suspensas na saída da coluna, produzindo ruído nos detectores
[25]. No sistema cromatográfico a falta de miscibilidade dos componentes da fase
móvel provoca aumento da pressão do sistema [24].
Solventes parcialmente miscíveis podem ser utilizados como fase móvel, no
entanto, a miscibilidade destes componentes deve ser testada em todas as proporções em
que serão utilizadas para a separação ou um outro componente que facilite a
solubilização dos componentes da fase móvel deve ser adicionado ao sistema [24].
Um outro caso importante é a adição de solução tampão à fase móvel que com o
decorrer do tempo os componentes desta solução tendem a precipitar na própria fase
móvel dificultando a separação [24]. Assim, em fases móveis em que há a necessidade
da adição de solução tampão a concentração desta não deve ser muito alta e as colunas
nunca devem ser guardadas antes da limpeza para retirar fases tamponadas [24].
30
9 Compatibilidade com os componentes da amostra
A substância a ser analisada deve de preferência ser dissolvida na própria fase
móvel ou em um de seus componentes para que não ocorra precipitação no injetor ou na
fase estacionária e posterior queda na resolução [24].
9 Pureza dos solventes
A presença de impurezas nos solventes pode interferir na separação
cromatográfica, pois as impurezas presentes podem afetar a região de absorção do
solvente que pode estar próximo ao comprimento de onda utilizado na detecção [24].
Um outro aspecto é que essas impurezas geralmente variam conforme o lote de
fabricação, assim estas variações podem afetar a reprodutibilidade nas separações [24].
9 Toxicidade
Na escolha da fase móvel, deve se levar em consideração à toxicidade e a
inflamabilidade do solvente orgânico [24]. Muitos dos solventes utilizados na CLAE
possuem um baixo valor de limite de toxidez e uma alta pressão de vapor sendo
extremamente perigosos [25].
Atualmente existe uma tendência internacional para se buscar o
desenvolvimento de metodologias analíticas que eliminem ou minimizem a utilização
de solventes orgânicos e reagentes tóxicos [26]. Na cromatografia, esta tendência exige
a utilização e o desenvolvimento de fases móveis que utilizem solventes de baixa
toxicidade e que sejam degradáveis no meio ambiente para substituírem as fases móveis
normalmente utilizadas na CLAE como acetonitrila, álcool metílico, clorofórmio,
tetraidrofurano, dentre outros. Algumas informações referentes sobre a possível
31
toxicidade destes solventes orgânicos estão apresentadas (Tab. 2) em teste realizado
com ratos.
Acetonitrila
Produz vapores tóxicos quando aquecido, os vapores produzidos apresentam
uma alta densidade em relação ao ar e podem se deslocar a uma distância considerável.
Caso haja contato com uma fonte de ignição pode provocar a combustão do solvente. O
líquido é prejudicial se ingerido, irritante para os olhos, a pele e apresenta capacidade
mutagênica [27]. A inalação do vapor pode causar fadiga, náusea, diarréia e dor
abdominal e, em casos severos podem ocorrer delírios, convulsões, paralisia e coma
[24] além da contaminação do meio ambiente [27].
Álcool Metílico
Produz vapores irritantes e inflamáveis. Apresenta capacidade mutagênica e
cumulativa no organismo [27]. A inalação do vapor em altas concentrações pode causar
vertigens, distúrbios digestivos e paralisia de alguns músculos além da perda da
consciência e cegueira [24]. O líquido é irritante para a pele, olhos e venenoso se
ingerido e em altas concentrações [27].
Clorofórmio
Produz gases venenosos e irritantes quando aquecido, embora não seja um
produto inflamável. O solvente na forma líquida é irritante para a pele, olhos e
prejudicial se ingerido [27]. Apresenta capacidade mutagênica e carcinogênica aos seres
vivos. Na forma de vapor é irritante para os olhos, nariz, garganta e se inalado pode
causar dor de cabeça, náusea, tontura ou perda de consciência. Em altas concentrações
pode provocar a contaminação do meio ambiente, pois é um solvente tóxico [27].
32
Tetraidrofurano
Produz vapores irritantes e inflamáveis. Apresenta capacidade mutagênica e uma
alta toxicidade aos organismos e ao ambiente [27]. O vapor é irritante para os olhos e ao
sistema respiratório, altas concentrações têm efeito alucinógeno provocando perda de
consciência [24]. O líquido é irritante para a pele, olhos e venenoso se ingerido e em
altas concentrações pode haver contaminação do meio ambiente [27].
Álcool Butílico
Produz vapores irritantes e inflamáveis. O álcool butílico é considerado como
não cancerígeno e mutagênico [27]. Deve se tomar cuidado para o produto não
contaminar o solo e a água, por não ser totalmente solúvel. É esperada uma rápida
biodegradação no ambiente e não apresenta atividade de bioacumulação, em altas
concentrações pode haver contaminação do meio ambiente [27].
Tabela 02. Informações sobre a toxicidade de alguns solventes orgânicos em teste
realizado com ratos.
Solvente Via Respiração Via Oral Via Cutânea
Orgânico (CL 50) (DL 50) (DL 50)
Acetonitrila 7.500 ppm em 8 h 200 mg/kg 5.000 mg/kg
Álcool Metilíco 64.000 ppm em 4 h 5.628 mg/kg Não disponível
Clorofórmio 8.000 ppm em 4 h 300 mg/kg Não disponível
Tetraidrofurano 60.000 ppm em 2h 3.000 mg/kg 500 mg/kg
Álcool Butílico 8.000 ppm em 4h 790 mg/kg 970 mg/kg
(CL 50 = concentração letal a 50,0%) e (DL 50 = dose letal a 50,0%)

Fonte: CETESB – Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental - (www.cetesb.com.br.); acesso
em janeiro de 2007.
33
Na tentativa de solucionar esta deficiência dos solventes orgânicos, tem sido
desenvolvida recentemente a CLAE associada a ambientes micelares, pois na
cromatografia líquida micelar pode-se ter uma alta precisão na retenção dos compostos
analisados, simplificando a otimização da composição da fase móvel [28]. Os
modificadores orgânicos de fase móvel mais comuns são os álcoois, principalmente os
que apresentam uma baixa toxicidade e são menos inflamáveis quando comparado com
fases móveis tradicionais. Estes ainda apresentam características como baixo custo,
baixa toxicidade, biodegradabilidade, podendo co-solubilizar compostos hidrofóbico e a
hidrófilo em matrizes complexas [28].
2.6. Surfactantes e Ambientes Micelares
Os surfactantes (tensoativos) são moléculas anfifílicas, compostas por uma
cabeça polar ou hidrofílica e uma cadeia carbônica apolar ou hidrofóbica, sendo que a
cabeça pode ser carregada positiva ou negativamente, catiônica ou aniônica,
respectivamente, pode ser dipolar (zwitteriônica) ou não carregada. A palavra
surfactante é originada de “surface-active agent” (agente que atua na superfície), pois
estes compostos apresentam a propriedade de formar filme molecular ordenado nas
interfaces, reduzindo a tensão interfacial e superficial [29].
Os surfactantes são classificados de acordo com a carga do grupo polar, podendo
ser catiônicos quando possuem carga positiva, aniônicos quando possuem a carga
negativa, neutros quando não possuem carga e zwiteriônicos quando a carga líquida é
nula em virtude destas moléculas possuírem dois grupos na cabeça polar, um positivo e
outro negativo [30].
34
Entre os surfactantes sintéticos, os aniônicos são mais largamente produzidos,
sendo os catiônicos produzidos em menor escala, uma razão para o menor uso dos
surfactantes catiônicos é a sua alta toxicidade em água quando comparada com a de
outros surfactantes. Os surfactantes zwiteriônicos são amplamente utilizados na
fabricação de cosméticos, pois não irritam a pele e os olhos. Os surfactantes não iônicos
são tão produzidos quanto os aniônicos e, geralmente, são compatíveis com outros tipos
de surfactantes [30]. Além desta classificação, os surfactantes podem ser divididos em
dois grandes grupos: os surfactantes sintéticos e os naturais [30].
Quando as moléculas do surfactante são dissolvidas em água em concentrações
maiores que a concentração micelar crítica (CMC), elas formam as micelas. Micelas são
agregados moleculares, possuindo regiões estruturais hidrofílicas e hidrofóbicas,
formando grandes agregados moleculares de dimensões coloidais, chamados micelas
[30]. Abaixo da CMC, o surfactante está predominantemente na forma de monômeros e
quando a concentração do surfactante está abaixo, porém próxima da CMC, existe um
equilíbrio dinâmico entre monômeros e micelas (Fig. 10).
Figura 10. Formação do agregado micelar [30].
35
A termodinâmica da formação micelar é regida por forças eletrostáticas entre as
moléculas, forças de solvatação (ou da estrutura do líquido), hidrofóbicas e de tensão
superficial, que determinam o melhor empacotamento das moléculas que dependem
também da geometria e da estrutura do solvente, sendo a formação das micelas
predominantemente um efeito entrópico [29]. Estes sistemas micelares tendem a se
associar em aglomerados (Fig. 11) na forma de esferas, cilindros, lamelas entre outros.
esfera cilindro lamelas
Figura 11. Diferentes aglomerados de sistemas micelares [29].
Cada micela é composta por um número determinado de moléculas de
surfactante, denominado número de agregação, que rege o tamanho e a geometria do
sistema micelar. O termo “micela normal” é utilizado para se referir aos agregados de
surfactantes em meio aquoso, isto indica que a cabeça hidrofílica está direcionada para a
solução aquosa formando uma superfície polar, enquanto que a cadeia linear (cauda)
está em sentido inverso ao da água, formando um núcleo central não polar [30].
A formação de associações de colóides pode também ocorrer em vários
solventes não-polares; neste caso, os agregados dos surfactantes são denominados
“micelas reversas” ou “micelas invertidas”. Nos sistemas de micelas reversas, as
cabeças polares anfifílicas estão concentradas no interior do agregado e por esta razão
formam um núcleo central hidrofílico [30].
Uma propriedade importante das micelas é o seu poder de solubilizar os mais
variados solutos ou espécies pouco solúveis. A quantidade de soluto solubilizada é, em
geral, diretamente proporcional à concentração do surfactante, desde que a concentração
36
do surfactante seja igual ou superior que a CMC e que existam várias possibilidades de
solubilização no sistema da micela [30]. As micelas são termodinamicamente estáveis e
facilmente reprodutíveis e são destruídas pela diluição com água quando a concentração
do surfactante fica abaixo da CMC [30].
Nas últimas décadas, o uso de surfactantes teve um aumento significativo em
praticamente todos os campos da química analítica onde são frequentemente
empregados para modificar o meio reacional permitindo solubilizar espécies polares e
de baixa polaridade ou promover um novo meio que altere a velocidade reacional. Estes
compostos também podem propiciar um aumento de sensibilidade e seletividade em um
grande número de reações [30]. Outros fatores positivos dos surfactantes é que podem
ser adicionados ou substituir os solventes orgânicos e serem biodegradáveis o que os
inclui no conceito da “Química Limpa”.
2.7. Química Limpa
Química limpa ou química verde pode ser definida como desenvolvimento e
implementação de produtos químicos e processos para reduzir ou eliminar o uso ou
geração de substâncias nocivas à saúde humana e ao ambiente [31]. Esta idéia, ética e
politicamente poderosa, representa a suposição de que processos químicos que geram
problemas ambientais possam ser substituídos por alternativas menos poluentes ou não
poluentes [31]. Tecnologia limpa, prevenção primária, redução na fonte, química
ambientalmente benigna, ou ainda “green chemistry”, são termos que surgiram para
definir esta importante idéia. “Green Chemistry”, o termo mais utilizado atualmente, foi
37
adotado pela IUPAC, pois visa o desenvolvimento auto-sustentável aliado à redução do
impacto da atividade química ao meio ambiente [31].
A filosofia da Química Limpa está baseada atualmente em doze princípios,
sendo estes:
1. Prevenção – evitar a produção do resíduo é melhor do que tratá-lo ou “limpá-lo”
após sua geração [31-32].
2. Economia de Átomos - deve-se procurar desenvolver metodologias sintéticas que
possam maximizar a incorporação de todos os materiais de partida no produto final [31-
32].
3. Síntese de Produtos Menos Perigosos - sempre que praticável, a síntese de um
produto químico deve utilizar e gerar substâncias que possuam pouca ou nenhuma
toxicidade à saúde humana e ao ambiente [31-32].
4. Desenvolvimento de Produtos Seguros - os produtos químicos devem ser
desenvolvidos de tal modo que realizem a função desejada e ao mesmo tempo não
sejam tóxicos [31-32].
5. Solventes e Auxiliares mais Seguros - o uso de substâncias auxiliares (solventes,
agentes de separação, secantes e entre outros) precisa, sempre que possível, tornar-se
desnecessário e quando utilizadas, estas substâncias devem ser inócuas [31-32].
6. Busca pela Eficiência de Energia - a utilização de energia pelos processos químicos
precisa ser reconhecida pelos seus impactos ambientais e econômicos e deve ser
minimizada. Se possível, os processos químicos devem ser conduzidos à temperatura e
pressão ambientes [31-32].
7. Uso de Fontes Renováveis de Matéria-Prima - sempre que a técnica possibilitar e
for economicamente viável, a utilização de matérias-primas renováveis deve ser
escolhida em detrimento de fontes não renováveis [31-32].
38
8. Evitar a Formação de Derivados - a derivatização desnecessária (uso de grupos
bloqueadores, proteção, desproteção, modificação temporária por processos físicos e
químicos) deve ser minimizada ou, se possível, evitada, porque estas etapas requerem
reagentes adicionais e podem gerar resíduos [31-32].
9. Catálise - reagentes catalíticos (tão seletivos quanto possível) são melhores que
reagentes estequiométricos [31-32].
10. Planejamento para a Degradação - os produtos químicos precisam ser
desenvolvidos de tal modo que, ao final de sua função, se fragmentem em produtos de
degradação inócuos e não persistam no ambiente [31-32].
11. Prevenção da Poluição - desenvolvimento de metodologias analíticas que
viabilizem um monitoramento e controle dentro do processo, em tempo real, antes da
formação de substâncias nocivas [31-32].
12. Prevenção de Acidentes - as substâncias, bem como a maneira pela qual uma
substância é utilizada em um processo químico, devem ser escolhidas a fim de
minimizar o potencial para acidentes químicos, incluindo vazamentos, explosões e
incêndios [31-32].
Cada vez que conseguimos cumprir com alguns dos quesitos da Química Limpa,
estamos caminhando para uma utilização mais consciente dos nossos recursos naturais e
para a manutenção da vida no planeta [32].
2.8. Parâmetros Cromatográficos
Os parâmetros cromatográficos são utilizados para comprovar a eficiência de
uma separação, estes parâmetros são obtidos a partir de um cromatograma (Fig.12) e
são calculados para os picos mais retidos [24].
39
Para avaliar a força cromatográfica da fase móvel, ou seja, sua capacidade de
separação dos componentes de uma mistura, os parâmetros cromatográficos que podem
ser analisados são:
Resolução – é calculada a partir da distância que separa os pontos máximos dos
picos e da média das larguras de suas respectivas bases, ou seja, para a medida da
largura da base toma-se sempre à distância entre as tangentes traçadas nas laterais do
pico (Fig.12) [6].
Figura 12. Medidas relacionadas à determinação da resolução [6].
A resolução é um termo sem unidades, o que implica na necessidade de utilizar
sempre as mesmas unidades para as distâncias (tempos) de retenção e para as larguras
de base [6], assim temos:
(t R2 - t R1)
Rs = 2
(wb2 + wb1)
A resolução entre dois picos depende das características de retenção de cada
componente, a capacidade da fase estacionária reter seletivamente cada componente e
também da eficiência da coluna (N). Para fins quantitativos, a resolução mínima
requerida é de 1,5 para todos os picos de interesse [24].
40
Simetria dos picos – o fator de assimetria, As, é normalmente calculado a 10,0% da
altura do pico; e o fator de alargamento, TF, é calculado a 5,0% de sua altura (Fig.13)
[6].
Figura 13. Medidas relacionadas ao cálculo do fator de assimetria e fator de
alargamento [6].
Assim temos que As e TF são calculados da seguinte forma:
b
As =
a
(a + b)
TF =
2a
Picos com uma baixa simetria podem resultar em (a) análises quantitativas
imprecisas; (b) menor resolução e bandas menores não detectadas na cauda de outro
pico e (c) problemas com reprodutibilidade na retenção [24].
Fator de retenção – também conhecido como fator de capacidade, que
corresponde à máxima quantidade a ser injetada. Este fator é determinado pela razão das
quantidades das suas moléculas que ficam retidas na fase estacionaria (nS) ou
41
percorrendo a coluna na fase móvel (nM)[6]. O fator de retenção também é relacionado à
razão dos tempos que as moléculas ficam na fase estacionária e na fase móvel [6]. Esse
termo é calculado por:
nS (t R - t M)
k= =
nM tM
Este parâmetro é importante para avaliar o tempo de retenção de um pico no
sistema cromatográfico em relação ao tempo de retenção de um composto não retido no
processo cromatográfico (tM), valores pequenos de k indicam que o soluto é pouco
retido na fase estacionária [24].
Constante de distribuição – está relacionado à distribuição do soluto entre a fase
estacionária e a fase móvel, onde CFE é a concentração do soluto na fase estacionária e
CFM é a concentração do soluto na fase móvel [24], assim temos:
C FE
K=C
FM
Os fatores que influenciam a constante de distribuição (K) de um soluto no
sistema cromatográfico são: (a) forças intermoleculares entre o soluto e as fases móvel e
estacionária; (b) composição e propriedade da fase móvel; (c) tipo e propriedades da
fase estacionária e (d) temperatura [24].
Eficiência da coluna – a eficiência representada por um cromatograma é medida
em termos do número de pratos (N) gerados. Um prato pode ser considerado
equivalente a uma etapa de equilíbrio entre as duas fases, quanto maior o número de
pratos mais equilíbrios existirão, maior será a eficiência e, portanto melhor a separação
[6]. Assim temos a seguinte equação:
42
2
tR
N = 16
w
O número de pratos obtidos pode ser afetado por vários fatores, incluindo as
condições de análise, o tamanho da amostra, o tipo de soluto e principalmente o
comprimento da coluna, fato que torna difícil uma comparação do número de pratos
entre diferentes colunas. Por isso, que a avaliação comparativa entre colunas é feita
utilizando a medida da altura equivalente da coluna (L) e o número de pratos,
eliminando a influência dos diferentes comprimentos da coluna [6]. O valor da altura
equivalente a um prato (H) é dado por:
L
H=
N
A finalidade mais importante de qualquer separação cromatográfica é o de
considerar os parâmetros experimentais que influenciam a resolução. Desta forma, uma
má eficiência e seletividade resultam em uma má resolução. Já quando a seletividade é
boa, pode-se compensar a má eficiência, obtendo uma boa resolução. O ideal é uma boa
resolução conquistada com boa eficiência e seletividade [6].
2.9. Planejamento fatorial
O planejamento fatorial permite avaliar simultaneamente a influência de uma ou
mais variáveis sobre um determinado sistema em estudo. Este é estabelecido a partir de
fatores e níveis pré-determinados pelo experimentador, atribuindo k fatores e n níveis e
fazendo-se experimentos cujo número total deve contemplar todas as combinações
possíveis entre os níveis e fatores [24].
43
Nos planejamentos temos os níveis superiores e inferiores, os quais podem ser
quantitativos ou qualitativos. Normalmente, atribui-se para o nível superior o sinal (+) e
para o nível inferior o sinal de (-) [24].
Por exemplo, em um experimento que possui dois fatores e dois níveis pode ser
definido como um planejamento fatorial 22 e o estabelecimento de todas as combinações
possíveis nos fornecerão quatro ensaios diferentes (Tab. 03). No caso deste tipo de
planejamento teremos os efeitos principais representados por k1 e k2 e o efeito de
interação entre k1k2 que permitirá otimizar cada variável e calcular a interação entre
elas, ou seja, neste tipo de experimento pode-se avaliar o efeito do concomitante o que
ajuda no processo de otimização e no entendimento dos processos químicos envolvidos
[24].
Tabela 03. Combinação dos ensaios de um planejamento fatorial 22 [24].
Ensaio k1 k2
1 - -
2 + -
3 - +
4 + +
Adicionando-se mais um fator ao planejamento fatorial k3, tem-se o
planejamento fatorial 23. Assim o planejamento fatorial completo passará a requerer a
realização de oito ensaios (Tab. 04). No caso de um planejamento fatorial 23, além dos
efeitos principais k1, k2 e k3 tem-se os efeitos de interação de dois fatores k1k2, k1k3 e
k2k3 e o efeito de interação de três fatores k1k2k3 [24].
44
Tabela 04. Combinação dos ensaios de um planejamento fatorial 23 [24].
Ensaio k1 k2 k3
1 - - -
2 + - -
3 - + -
4 + + -
5 - - +
6 + - +
7 - + +
8 + + +
Considerando as características dos métodos baseados em cromatografia líquida
de alta eficiência que utilizam solventes orgânicos como fase móvel e as características
dos ambientes micelares, pode-se prever que a exploração da CLAE associada a
ambientes micelares pode dar origem a métodos cromatográficos que utilizem reagentes
de baixa toxicidade como fase móvel. Neste trabalho específico, será priorizado o
desenvolvimento de método analítico para a determinação de vitaminas lipossolúveis
em alimentos, complexo vitamínico e similares, sempre utilizando como fase
estacionária uma coluna cromatográfica C18 que será temporariamente modificada,
durante a análise química, pelos constituintes da própria fase móvel, o que poderá
ampliar as possibilidades de aplicação da estratégia e possibilitar o desenvolvimento de
métodos analíticos limpos explorando a CLAE. Deve ser enfatizado que a otimização da
fase móvel será feita utilizando-se planejamento fatorial.
45
Capítulo 3 – Objetivos
3. Objetivos
3.1. Objetivo Geral
Desenvolver método cromatográfico utilizando cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) associada a fases móveis de baixa toxicidade explorando ambientes
micelares. Visualiza-se o desenvolvimento de método analítico seletivo, sensível,
robusto, simples, apresentando alta freqüência analítica e que possa ser classificado
como limpo, visto que os reagentes utilizados apresentam baixo grau de toxicidade.
Será utilizada a coluna cromatográfica C18 em todos os procedimentos, pois esta é a
coluna mais utilizada em laboratórios de cromatografia dedicados a análise de rotina.
3.2. Objetivo Específico
Desenvolver método cromatográfico limpo utilizando CLAE para determinar as
vitaminas lipossolúveis A, D3, E, K1 em amostras de alimento, complexos vitamínicos
e similares.
46
Capítulo 4 – Materiais e Métodos
4. Materiais e Métodos
4.1. Reagentes e Soluções
4.1.1.Reagentes
Todos os reagentes e solventes utilizados foram de grau analítico e água
desionizada foi utilizada no preparo das soluções aquosas. Como fase móvel foram
utilizados soluções contendo CH3OH (metanol-grau HPLC/SPECTRO), CH3CN
(acetonitrila-grau HPLC/SPECTRO), C2H5OH (álcool etílico), C4H9OH (álcool
butílico), C6H14 (hexano), Triton X-100 (polioxietileno (9-10) p-tercotil fenol), CTAB
(brometo de cetiltrimetil amônio), SDBS (dodecil benzeno sulfanato de sódio), SDS
(dodecil sulfato de sódio), KOH (hidróxido de potássio), C6H8O6 (ácido ascórbico),
N(CH2CH2OH)3 (trietanolamina), Na2HPO4 (fosfato dibásico de sódio anidro) e NH4Cl
(cloreto de amônio) em diferentes concentrações e composições.
Para o preparo das soluções padrão das vitaminas lipossolúveis A (acetato de
retinol) e E (α-acetato de tocoferol) foram utilizados reativos da Merck, enquanto que
paras as vitaminas D3 (colecalciferol) e vitamina K1 (filoquinone) as soluções padrão
foram preparadas a partir de purificação de preparações farmacêuticas.
47
4.1.2.Soluções
Soluções padrão das vitaminas A, E, D3 e K1 foram preparadas dissolvendo-se
os respectivos reativos em álcool etílico absoluto. Desta forma, foram preparadas
soluções padrão das vitaminas lipossolúveis A, D3, E, K1 nas concentrações de 40,0;
11,0; 60,0 e 10,0 mg/L, respectivamente. As vitaminas A e E apresentaram uma
concentração maior, pois estas são provenientes da amostra padrão, o que possibilitou
uma concentração maior além disso estas duas vitaminas são bastante viscosas. Já as
vitaminas D3 e K1 são provenientes de preparações farmacêuticas que apresentam uma
concentração menor em relação ao padrão, além disso, o volume de álcool etílico
utilizado foi o mesmo para todas as vitaminas o que fez com que estas apresentassem
uma concentração mais baixa.
Após a solubilização das vitaminas, as soluções foram filtradas através de
membrana millipore 0,45 μm com auxílio de vácuo, sendo armazenadas em temperatura
abaixo de 0º C.
As soluções das fases móveis utilizadas foram preparadas diariamente
adicionando as percentagens estabelecidas de cada reagente (C2H5O, C4H9OH, SDS,
N(CH2CH2OH)3, Na2HPO4 e NH4Cl ) conforme a composição de cada fase móvel em
100,0 mL de água desionizada, ou seja, para uma fase móvel contendo 12,0% (v/v) de
álcool butílico, 2,20% (m/v) de SDS, 0,02 mol/L de Na2HPO4 e pH 7,00 foi preparada
pela dissolução de 12,00 mL de álcool butílico em aproximadamente 60,00 mL de água
desionizada, após foi acrescentado a solução 2,20 g de SDS e 0,280 g de Na2HPO4
mantendo o sistema sob agitação para a homogeneização da solução. Com a solução
homogeneizada foi realizado o ajuste do pH para 7,00 com NaOH ou HCl mantendo
sempre o sistema sob agitação. Na seqüência o volume foi completado para 100,0 mL
48
em balão volumétrico, sendo as soluções filtradas através de membrana millipore 0,45
μm com auxílio de vácuo e mantidas a temperatura ambiente. Todas as demais fases
móveis utilizadas neste trabalho foram preparadas seguindo-se estas mesmas etapas;
apenas modificando as percentagens de cada reagente.
Soluções dos surfactantes: CTAB (brometo de cetiltrimetil amônio) 0,50 %
(m/v) e SDS (dodecil sulfato de sódio) 0,50 % (m/v) foram preparadas pela dissolução
de 0,500 g dos surfactantes em 100,0 mL de água desionizada, SDBS (dodecil benzeno
sulfanato de sódio) 0,50 % (v/v) e Triton X-100 (polioxietileno (9-10) p-tercotil fenol)
0,50 % (v/v) foram preparadas pela dissolução de 0,50 mL dos surfactantes em 100,0
mL de água desionizada.
4.2. Equipamentos e acessórios
4.2.1.Espectrofotômetro
Para a obtenção de espectros de UV-Vis das diferentes espécies químicas foi
utilizado um espectrofotômetro de varredura marca Varian modelo Cary -50.
4.2.2.Cromatógrafo
Para a obtenção dos cromatogramas, foi utilizada uma Estação de Trabalho
Cromatográfica Star (Fig.14) com programa de gerenciamento Varian Instrumentos
contendo:
49
bomba de pistão reciprocante com três vias, modelo 240 série 00752;
injetor automático Varian (Auto Sample ProStar 410) com alça de amostragem
de 100 μL;
coluna cromatográfica C18 (microsorb 250 x 4,6 mm com partículas de 5 μm);
detector espectrofotométrico com arranjo de fotodiodos modelo ProStar 350
com programa Polyview e Aurora.
Os sinais dos compostos eluídos da coluna cromatográfica foram monitorados
em 230, 280 e 300 nm para todas as vitaminas. A aquisição de dados foi feita utilizando
um microcomputador com programa de aquisição de dados da Varian.
Figura 14. Cromatógrafo líquido de alta eficiência: (a) reservatório da fase móvel, (b) bomba de alta
pressão, (c) válvula de injeção, (d) coluna cromatográfica, (e) detector e (f) microcomputador. (Fonte:
[23]).
Demais materiais e vidrarias utilizados são de uso comum em laboratórios de
Química Analítica.
50
4.3. Métodos
4.3.1. Espectros UV-Vis
A primeira etapa do trabalho consistiu em obter os espectros eletrônicos nas
regiões do ultravioleta e visível para as vitaminas lipossolúveis objetivando verificar a
região de absorção de cada vitamina, o grau de pureza e as possibilidades de
monitoramento dos sinais cromatográficos.
Na etapa seguinte foi realizada a escolha do agente surfactante mais adequado
para ser utilizado como componente da fase móvel através da realização de espectros na
região do UV-Vis de soluções contendo diferentes agentes surfactantes (Triton X-100 -
surfactante não iônico, CTAB - surfactante catiônico, SDBS e SDS - ambos surfactantes
aniônicos).
4.3.2. Testes preliminares
Diversas soluções contendo reagentes como: álcool etílico, álcool butílico, SDS,
N(CH2CH2OH)3, Na2HPO4 e NH4Cl em diferentes concentrações e composições foram
testadas como fase móvel objetivando verificar aquelas que poderiam apresentar maior
eficiência de separação das vitaminas para possibilitar que, na seqüência, experimentos
sistemáticos pudessem ser planejados. Deve ser ressaltado que nesta fase parâmetros
como pH, vazão e composição das diferentes fases móveis foram investigados.
51
4.3.3. Planejamento fatorial para otimização do método
cromatográfico para determinação das vitaminas lipossolúveis
Após os estudos preliminares, foi realizada a otimização dos parâmetros
experimentais utilizando-se planejamento fatorial 23 (Tab. 05). Nesta fase as variáveis
selecionadas foram: concentração de álcool butílico, concentração de SDS e vazão.
Tabela 05. Fatores utilizados no planejamento fatorial 23 para a separação das
vitaminas lipossolúveis*.
Ensaio Álcool butílico SDS Vazão
1 - - -
2 + - -
3 - + -
4 + + -
5 - - +
6 + - +
7 - + +
8 + + +
*
Dados obtidos para uma concentração de Na2HPO4 de 0,02mol/L e
pH=7,00. Níveis: álcool butílico (- corresponde à solução contendo 10,0%
(v/v) e + a solução contendo 15,0% (v/v ); SDS (- corresponde a solução
contendo 1,50 % (m/v) e + a solução contendo 3,00 % (m/v); vazão (-
corresponde a vazão de 1,0 mL/min e + a vazão de 2,0 mL/min).
52
4.3.4. Método Convencional
As principais características do método analítico limpo para determinação das
vitaminas lipossolúveis foram comparadas com o método cromatográfico convencional
que utiliza coluna cromatográfica C18, detector de arranjo de diodos com medidas em
280 nm e como fase móvel gradiente de dois solventes (solução A: acetonitrila; solução
B: álcool metílico) [4].
O gradiente de eluição foi conduzido iniciando-se com 50,0% (v/v) de álcool
metílico e 50,0% (v/v) de acetonitrila chegando-se em 25,0 min com a composição da
fase móvel sendo constituída por 30,0% (v/v) de álcool metílico e 70,0% (v/v) de
acetonitrila, a vazão constante de 1,3 mL/min e com um volume de injeção de amostra
de 20,0 µL a temperatura ambiente [4].
Além deste método convencional existem outros que demonstram a
possibilidade de determinação das vitaminas lipossolúveis dentre estes métodos temos:
O método que utiliza coluna cromatográfica C18, detector de arranjo de diodos
com medidas em 285 nm, fase móvel álcool metílico e acetonitrila (95:5 (v/v)),
associado a uma vazão de 2,0 mL/min, com um volume de injeção de amostra de 20,0
µL a temperatura ambiente [33].
Outro método utiliza também coluna cromatográfica C18, detector de arranjo de
diodos com medidas em 292 e 325 nm, fase móvel álcool metílico, associada a uma
vazão de 1,0 mL/min a temperatura de 50,0ºC [34].
Um outro método utiliza coluna cromatográfica C18, detector de arranjo de
diodos com medidas em 245, fase móvel constituída por álcool metílico e álcool etílico
(85:15 v/v) com 0,10% de trietilamina associado a uma vazão de 1,0 mL/min, com um
volume de injeção de amostra de 20,0 µL a temperatura ambiente [35].
53
Uma outra forma de análise consiste na utilização de uma coluna Nucleosil C18,
detector de fluorescência, fase móvel acetonitrila, álcool metílico e diclorometano
(50:45:5 v/v/v), associada a uma vazão de 0,7 mL/min e com um volume de injeção de
amostra de 50,0 µL [36].
Além destes métodos de determinação citados, existe grande variedade de
formas de análise e de fases móveis utilizadas, no entanto a grande maioria utiliza
solventes orgânicos potencialmente tóxicos e com um alto custo de análise.
4.4. Aplicações
4.4.1. Extração das vitaminas lipossolúveis (A, D3, E e K1)
de alimentos
Amostras de leite fortificado, leite em pó integral, óleo de soja e repolho
(supermercado), foram pesadas ca 30,0 g em um béquer. A amostra de repolho foi
previamente lavada, cortada em pequenos pedaços e macerada antes da etapa de
pesagem.
As amostras foram transferidas para um erlemneyer de 125,0 mL, sendo
adicionadas 3,00 g de ácido ascórbico, para evitar a oxidação das vitaminas, e 65,0 mL
de uma solução hidroalcóolica (1:3,3 água-álcool etílico) de hidróxido de potássio
(KOH) 77,0% (m/v). As amostras foram mantidas sob agitação durante 60,0 min, sendo
que o processo de saponificação foi realizado durante toda a noite, a temperatura
ambiente e na ausência de luz [37].
54
Após este processo, as amostras foram filtradas através de papel de filtro e
posteriormente colocadas num funil de separação juntamente com 15,0 mL de hexano
(C6H14) para extrair as vitaminas, sendo este processo repetido por duas vezes. Após, a
fase hexânica foi colocada em funil de separação juntamente com 25,0 mL de água
desionizada, sendo repetido este procedimento por duas vezes. Na seqüência, a fase
hexânica foi evaporada em rotavapor em aproximadamente 50,0ºC, e o resíduo foi
dissolvido em 5,00 mL de álcool etílico. Esta solução final foi filtrada através de
membrana Millipore 0,45 μm e em seguida 50,0 µL desta solução foi injetada no
cromatógrafo [37]. Todas as fases necessárias para extrair as vitaminas podem ser
resumidas através de um diagrama (Fig. 15)
Amostra Alimento 30,0 g
1-Proteção com ácido ascórbico 3,00 g. 1- Extração 2 x 15,0 mL hexano.
2-Saponificação com 65,0 mL de uma solução 2- Lavagem 2 x 25,0 mL água
hidroalcóolica (1:3,3 água-álcool etílico) de KOH desionizada.
77,0% (m/v). 3-Evaporação em rotavapor (50,0ºC)
3-A saponificação realizada durante toda a noite.
1-Resíduo dissolvido em 5,00 mL de álcool etílico. Cromatográfo (CLAE)
2-Filtração utilizando-se membrana Millipore 0,45μm. Volume de amostra injetado
3-Amostras estocadas a 0º C. de 50,0 μL.
Figura 15. Esquema da extração das vitaminas lipossolúveis das amostras de alimentos e complexos
vitamínicos (Fonte: [37]).
55
4.4.2. Extração das vitaminas lipossolúveis (A, D3, E e K1)
dos complexos vitamínicos
Os complexos vitamínicos na forma de ampola e cápsulas foram juntados e
pesados ca 3,00 g, sendo adicionado 0,50 g de ácido ascórbico e 15,0 mL de solução
solução hidroalcóolica (1:3,3 água-álcool etílico) de hidróxido de potássio (KOH)
77,0% (m/v). A amostra foi mantida em agitação durante 60,0 min, sendo que o
processo de saponificação foi realizado durante toda à noite, a temperatura ambiente e
na ausência de luz [37].
Após este processo de saponificação a amostra foi transferida para um funil de
separação juntamente com 5,00 mL de hexano (C6H14) para extrair as vitaminas, sendo
este processo repetido por duas vezes. Após, em um funil de separação foi colocado à
fase hexânica obtido no processo de separação e foram adicionados 15,0 mL de água
desionizada, sendo repetido este processo por duas vezes. A fase hexânica foi evaporada
em rotavapor em aproximadamente 50,0ºC e o resíduo foi dissolvido em 5,00 mL de
álcool etílico conforme (Fig. 15). Esta solução final foi filtrada através de membrana
Millipore 0,45 μm e em seguida foi injetada 50,0 µL no cromatógrafo [37].
Uma outra forma de extração utilizada consistiu na dissolução do complexo
vitamínico em apenas álcool etílico, mas precisamente, 3,00 g de complexo vitamínico
foi dissolvido em 25,0 mL de álcool etílico. Após esta solução foi condicionada a
temperatura abaixo de 0º C para que o óleo não dissolvido na solução precipitasse e
fosse retirado da solução. Esta solução final foi filtrada utilizando-se membrana
Millipore 0,45 μm e em seguida foi injetada 50,0 µL no cromatógrafo.
56
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
5. Resultados e Discussão
5.1. Espectros de UV-Vis
Para a caracterização das vitaminas lipossolúveis foram obtidos espectros de
radiação eletromagnética nas regiões do ultravioleta e visível. Os espectros das
vitaminas lipossolúveis (A, D3, E, K1) mostram que estas moléculas absorvem
fortemente radiação eletromagnética na região do ultravioleta (Fig. 16), sendo muito
difícil proceder à determinação destes compostos sem uma separação prévia devido à
interferência espectral, uma vez que, as vitaminas A, D3, E, K1 apresentam máximo de
absorção na região de 325; 265; 290 e 250 nm, respectivamente e espectro na forma de
bandas muito largas, ocorrendo sobreposição dos espectros.
2 ,5
2 ,0
Absorbância
1 ,5
1 ,0 (b )
(a )
0 ,5 (d )
0 ,0 (c )
200 250 300 350 400
λ (n m )
Figura 16. Espectro eletrônico das vitaminas lipossolúveis em solução de álcool etílico. (a) Vitamina
A, (b) Vitamina D3, (c) Vitamina E, (d) Vitamina K1; (C = 5,0 mg/L).
57
Analisando o espectro eletrônico de cada vitamina, pode-se verificar que a
análise das vitaminas está sujeita a uma série de erros, pouco freqüentes em outras
substâncias, inclusive pela facilidade de isomerização destes compostos que conduz à
perda total ou parcial do valor vitamínico em condições extremas de pH, temperaturas
elevadas e alto poder de oxi-redução, fatores que devem ser considerados pelos métodos
analíticos [2]. Entre os métodos químicos de identificação e quantificação, os de maior
eficiência envolvem a separação analítica por cromatografia líquida de alta eficiência
através da fase normal ou reversa, as quais são acoplados detectores espectrofotométrico
com arranjo de diodos ou de fluorescência [2].
A CLAE é o método mais adequado para determinação destas espécies
químicas, pois promove a separação das vitaminas antes da etapa de detecção evitando
interferências espectrais e permite que seja efetuada a determinação de compostos não
voláteis e solúveis na fase móvel.
Após a escolha da técnica analítica que seria utilizada, foram realizadas medidas
dos espectros eletromagnéticos na região do ultravioleta (Fig. 17) dos surfactantes, pois
o método escolhido estaria associado a ambientes micelares.
A utilização de soluções dos surfactantes Triton X-100 (surfactante não iônico),
CTAB (surfactante catiônico) e SDBS (surfactante aniônico) foram descartadas devido
ao intenso espalhamento de luz que estes compostos provocavam na região do
ultravioleta (Fig. 17), o que impossibilitava qualquer determinação analítica das
vitaminas em estudo, já que estas vitaminas também apresentam absorção de radiação
eletromagnética nesta mesma região do espectro. Desta forma, por exclusão, o
surfactante SDS (surfactante aniônico), foi escolhido como agente modificador da fase
móvel e da fase estacionária, por apresentar uma baixa absorção na região do
ultravioleta.
58
4 ,0
3 ,5
3 ,0
(a )
2 ,5
Absorbância
2 ,0
(b )
1 ,5
(c )
1 ,0
0 ,5
(d )
0 ,0
200 250 300 350 400
λ (n m )
Figura 17. Espectro eletrônico da mistura dos surfactantes: (a) SDBS, (b) Triton X-100 (C=0,5%
(v/v)), (c) CTAB, (d) SDS (C = 0,5% (m/v)).
5.2. Determinação de vitaminas utilizando cromatografia líquida
de alta eficiência em ambientes micelares
5.2.1. Testes preliminares
Estudos preliminares demonstraram não ser possível conduzir a separação
cromatográfica das vitaminas lipossolúveis utilizando-se apenas solução aquosa com
diferentes percentagens do agente surfactante SDS (Fig. 18) principalmente devido à
baixa afinidade que vitaminas apresentaram pela fase móvel, fato que promoveu a
eluição de apenas parte das vitaminas em estudo, não promovendo a separação das
vitaminas lipossolúveis de uma forma efetiva e apresentando baixos valores de
resolução cromatográfica, impedindo que medidas quantitativas fossem realizadas.
59
Figura 18. Efeito da utilização de soluções aquosas do surfactante SDS na separação das vitaminas
lipossolúveis. Dados obtidos para concentrações das vitaminas A, D3, E, K1 de 40,0; 11,0; 60,0 e 10,0
mg/L, respectivamente. Volume de solução padrão injetado de 20,0 μL com fase móvel contendo SDS
nas concentrações de 0,10; 0,20 e 1,00% (m/v), sob vazão de 1,0 mL/min e pH 7,00 .
Considerando que soluções de SDS em meio aquoso não possibilitaram a
separação das vitaminas, soluções de álcool etílico foram testadas como fase móvel
objetivando melhorar a interação desta com as vitaminas lipossolúveis. Quando foram
utilizadas como fase móvel soluções aquosas contendo 10,0; 20,0 e 30,0% (v/v) de
álcool etílico, sem a presença de surfactante, foi verificado que apenas parte das
vitaminas apresentaram afinidade pela fase móvel, sendo eluidas rapidamente da coluna
cromatográfica, enquanto que a maior parte das vitaminas não podiam ser eluidas
quando da utilização destas fases móveis devido à baixa afinidade pelo solvente e alta
afinidade pela fase estacionária (Fig. 19), não possibilitando a separação conjunta das
quatro vitaminas lipossolúveis de uma forma efetiva e com boas resoluções
cromatográficas.
60
Figura 19. Efeito da utilização de soluções aquosas de álcool etílico na separação das vitaminas
lipossolúveis. Dados obtidos para concentrações das vitaminas A, D3, E, K1 de 40,0; 11,0; 60,0 e 10,0
mg/L, respectivamente. Volume de solução padrão injetado de 20,0 μL com fase móvel contendo álcool
etílico nas concentrações de 10,0; 20,0 e 30,0% (v/v), sob vazão de 0,8 mL/min e pH 7,00 .
Com o objetivo de ajustar a polaridade da fase móvel para que esta apresentasse
afinidade média para todas as vitaminas permitindo que houvesse interação efetiva e
reversível com a fase estacionária, o que consequentemente, possibilitaria a completa
eluição dos compostos em estudo em diferentes tempos de retenção e com resolução
cromatográfica adequada para fins analíticos, foi utilizado como fase móvel uma
solução aquosa contendo álcool etílico 20,0 % (v/v) com percentagens variadas de SDS.
Embora possa ser verificada uma melhora na interação das vitaminas com as
fases móvel e estacionária (Fig. 20), fato evidenciado pelo perfil dos picos
cromatográficos, os resultados obtidos nesta nova condição não podem ser considerados
satisfatórios, pois apenas parte das vitaminas foram eluidas da coluna cromatográfica.
Contudo, este experimento preliminar (Fig. 20) indica claramente que a concentração do
surfactante é importante no processo de separação, pois ocorre aumento da área do pico
em função da concentração de SDS, mesmo não sendo possível obter resoluções
cromatográficas que permitissem a utilização dos dados para fins analíticos, devido à
61
rápida coeluição de apenas parte dos compostos, devido ainda, a deficiente afinidade
das vitaminas pela fase móvel.
Figura 20. Efeito da concentração do surfactante SDS na separação das vitaminas lipossolúveis.
Dados obtidos para concentrações das vitaminas A, D3, E, K1 de 40,0; 11,0; 60,0 e 10,0 mg/L,
respectivamente. Volume de solução padrão injetado de 20,0 μL com fase móvel contendo álcool etílico
20,0% (v/v), SDS nas concentrações de 0,01; 0,02; 0,20; 0,50 e 1,00% (m/v), sob vazão 0,70 mL/min, pH
7,00.
Como a resolução cromatográfica não era adequada buscou-se uma explicação
teórica para explicar os dados obtidos e obter uma solução para este problema.
Considerando que as vitaminas lipossolúveis e a fase estacionária não possuem carga e
que o surfactante SDS é aniônico, provavelmente a falta de interação com a coluna
cromatográfica estaria relacionada a este fator, pois o surfactante pode ser adsorvido
pela fase estacionária (C18 – baixa polaridade) através de interação com a sua cauda
lipofílica, deixando exposto para interação com as vitaminas a sua cabeça polar, que
apresenta baixa afinidade por estas. Idealmente a escolha de um surfactante não iônico
seria mais apropriada, no entanto, como explicado anteriormente, o surfactante não
iônico, Triton X-100, provoca intenso espalhamento de luz na região do ultravioleta
(Fig. 17), impedindo o monitoramento das vitaminas nesta região. Como alternativa
62
restou neutralizar as cargas do surfactante SDS através da adição de uma solução
tampão. Assim, foi adicionado ao meio um sal de fosfato e a fase móvel passou a ser
constituída por uma solução aquosa contendo álcool etílico 20,0% (v/v), SDS 1,0%
(m/v) e Na2HPO4 a 0,10 mol/L em diferentes valores de pH (4,00; 5,00; 6,00; 7,00;
8,00).
Apesar de serem observadas algumas mudanças no cromatograma (Fig. 21)
indicando uma provável melhora na separação das vitaminas, os picos não apresentam
uma boa simetria e as resoluções cromatográficas são baixas, não apresentando melhora
com a variação de pH. Sob esta nova condição novamente apenas parte das vitaminas
foram eluidas da coluna cromatográfica, demonstrando o baixo grau de interação com a
fase móvel, pois a maior parte das vitaminas apresentou uma afinidade maior pela fase
estacionária (Fig. 21).
Figura 21. Efeito da composição da fase móvel na separação das vitaminas lipossolúveis. Dados
obtidos para concentrações das vitaminas A, D3, E, K1 de 40,0; 11,0; 60,0 e 10,0 mg/L, respectivamente.
Volume de solução padrão injetado de 20,0 μL com fase móvel contendo álcool etílico 20,0% (v/v), SDS
1,0% (m/v), Na2HPO4 0,10 mol/L sob vazão 0,70 mL/min em diferentes valores de pH (4,00; 5,00; 6,00;
7,00 e 8,00)
63
Na tentativa de melhorar estas características, foi testada a adição de outros
modificadores químicos como N(CH2CH2OH)3 e NH4Cl. Sob estas condições, a maioria
das vitaminas não são eluidas da coluna cromatográfica (Fig. 22), evidenciando a
impossibilidade de se determinar às vitaminas utilizando estas fases móveis.
0 ,0 2 5
0 ,0 2 0
Absorbância
0 ,0 1 5
0 ,0 1 0
0 ,0 0 5
0 ,0 0 0
r
do
ca
2
if i
od
3
M
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
T e m p o (m in )
Figura 22. Efeito da adição de modificadores químicos à fase móvel na separação das vitaminas
lipossolúveis. 1- Na2HPO4 0,1% (m/v); 2- N(CH2CH2OH)3 0,1% (v/v); 3-NH4Cl 0,1% (m/v). Dados
obtidos para concentração das vitaminas A, D3, E, K1 de 40,0; 11,0; 60,0 e 10,0 mg/L, respectivamente.
Volume de solução padrão injetado de 20,0μL com fase móvel contendo álcool etílico 20,0% (v/v), SDS
1,0% (m/v) sob vazão 0,70 mL/min em pH 7,00.
Com o intuito de melhorar a separação cromatográfica passou-se a realizar o
controle da temperatura do sistema, pois na otimização dos parâmetros envolvidos em
uma separação cromatográfica utilizando substâncias viscosas como fase móvel a
temperatura é uma variável importante. Este aspecto é mais evidente na cromatografia
líquida micelar porque a baixa eficiência da CLM quando comparada com a
cromatografia convencional pode ser creditada à alta viscosidade da fase móvel que
diminui a velocidade de difusão das moléculas do analito entre a fase móvel e
estacionária, o que colabora para diminuir a interação das vitaminas entre as fases,
fazendo com que a resolução cromatográfica seja baixa. Assim, tanto a resolução como
64
a eficiência da separação podem ser melhoradas aumentando-se a transferência de
massa do soluto entre as fases cromatográficas, ou seja, aumentando-se a temperatura
[4].
A primeira vantagem observada quando se aumenta à temperatura em
cromatografia em ambiente micelar é a diminuição do tempo de análise devido à
possibilidade de usar vazões mais altas da fase móvel devido à diminuição na pressão
hidrodinâmica do sistema [6]. Ainda, o aumento da temperatura reduz o fator de
retenção dos solutos, provocando diminuição no espaçamento entre os picos, ou seja,
influencia na resolução cromatográfica do sistema, podendo ser um fator aplicável para
a otimização nas separações cromatográficas [24]. A influência da temperatura na
coluna envolve dois parâmetros básicos da equação mestra de van Deemter, o número
de pratos teóricos (N) e o fator assimétrico (As) [6].
Neste sentido, novos estudos foram efetuados fixando-se a temperatura em
30,0°C, pois em temperaturas mais elevadas havia o risco de iniciar o processo de
degradação das vitaminas. A composição química das fases móveis, utilizadas
anteriormente, foi mantida variando apenas as percentagens de álcool etílico e
mantendo-se as concentrações de SDS, N(CH2CH2OH)3 e Na2HPO4 sob uma vazão
constante de 0,30 mL/min.
Similarmente aos estudos realizados anteriormente, não foram obtidos resultados
satisfatórios (Fig. 23), embora possa ser verificada uma tendência no aumento do tempo
de retenção, indicando que os analitos interagiram de forma mais efetiva com a fase
estacionária e a fase móvel, podendo este efeito ser interpretado como uma maior
difusão das vitaminas para estas fases, estando de acordo com a teoria cromatográfica.
65
Figura 23. Efeito da concentração de álcool etílico na separação das vitaminas lipossolúveis na
temperatura de 30,0 oC. Dados obtidos para concentração das vitaminas A, D3, E, K1 de 40,0; 11,0;
60,0 e 10,0 mg/L, respectivamente. Volume de solução padrão de 20,0μL com fase móvel contendo SDS
1,0% (m/v) e N(CH2CH2OH)3 0,01 %(v/v) sob vazão 0,30 mL/min e pH de 7,00.
Devido à alta viscosidade que o álcool etílico possui que é de 1,08 [6] a
concentração máxima utilizada deste reagente foi de 30,0 % (v/v), pois quanto mais
viscosa a fase móvel maior o aumento da pressão no sistema cromatográfico, o que
pode dificultar o bombeamento da fase móvel, podendo inclusive afetar o coeficiente de
difusão da substância analisada, acarretando em perda considerável do número de pratos
teóricos [25]. Mesmo com o aumento da concentração de álcool etílico não foi obtida
separação cromatográfica que pudesse ser utilizada para determinação quantitativa das
vitaminas lipossolúveis (Fig. 23).
Em virtude dos resultados obtidos anteriormente concluiu-se que não seria
possível desenvolver método analítico limpo para determinação de vitaminas
lipossolúveis empregando fase móvel que tivesse álcool etílico como modificador
químico orgânico. Os cromatogramas até aqui obtidos indicaram efeito benéfico do
SDS na separação cromatográfica, enquanto que o álcool etílico não foi muito efetivo
66
para aumentar a resolução cromatográfica. Assim, decidiu-se por substituir o álcool
etílico por outro modificador químico orgânico que também apresentasse baixa
toxicidade, mas que pudesse contribuir de forma efetiva para melhora da resolução.
Dentre os solventes avaliados o que apresentou melhores perspectivas foi o álcool
butílico, pois apresenta uma polaridade menor quando comparado com o álcool etílico,
podendo contribuir para a melhora na separação cromatográfica. No entanto, o álcool
butílico apresenta uma viscosidade de 2,54 [6] que é considerada relativamente alta para
ser utilizado como modificador químico orgânico na análise cromatográfica, por isso foi
utilizada uma percentagem menor deste modificador a fase móvel para que o álcool
butílico pudesse ser utilizado na composição da fase móvel.
Novas fases móveis foram preparadas, desta vez com a presença de álcool
butílico em substituição ao álcool etílico, SDS e um dos modificadores N(CH2CH2OH)3
(trietanolamina), Na2HPO4 (fosfato dibásico de sódio anidro) e NH4Cl (cloreto de
amônio). Os estudos foram iniciados com o Na2HPO4, pois quando fosse necessária a
correção do pH da fase móvel, este atuaria como uma solução tampão. Assim, a
composição da fase móvel foi constituída por solução aquosa contendo álcool butílico
12,0% (v/v), SDS 2,20% (m/v) e 0,02 mol/L de Na2HPO4 em pH 7,00 associada a uma
vazão de 0,50 mL/min em uma temperatura de 30,0° C.
Pode-se verificar que com esta fase móvel e com o controle da temperatura
houve melhora significativa na separação cromatográfica (Fig. 24), com expressivo
aumento no tempo de retenção das vitaminas, o que indica maior interação destas com a
fase móvel. Embora a resolução cromatográfica ainda não seja a ideal para algumas
vitaminas (Fig. 24), é possível verificar que com otimização destes parâmetros
experimentais, é possível conseguir determinar as vitaminas lipossolúveis utilizando
estes reagentes na composição da fase móvel. Ainda, é possível verificar que a vazão é
67
uma variável importante devido à excessiva distância entre algumas das vitaminas (Fig.
24) o que pode ser verificado quando a vazão foi aumentada ocorreu a eluição das
quatro vitaminas lipossolúveis em aproximadamente 70,0min e com melhores
resoluções cromatográficas do que foi apresentado anteriormente.
0 ,2 0
A b s o rb â n c ia
0 ,1 5
E
0 ,1 0
A
0 ,0 5
A
D3
0 ,0 0
)
in
0 ,5
m
D3
L/
K1
(m
ão
1 ,3
az
V
0 10 20 30 40 50 60 70
T e m p o (m in )
Figura 24. Efeito da vazão e da presença de álcool butílico na separação das vitaminas lipossolúveis.
Dados obtidos para concentrações das vitaminas A, D3, E, K1 de 40,0; 11,0; 60,0 e 10,0 mg/L,
respectivamente. Volume da solução padrão de 40,0μL e fase móvel contendo álcool butilíco 12,0%
(v/v), SDS 2,20% (m/v) e Na2HPO4 0,02mol/L em pH 7,00 e T 30ºC.
5.2.2. Planejamento fatorial e otimização das variáveis
Considerando-se que foi encontrada uma composição da fase móvel que indica
que as vitaminas lipossolúveis podem ser separadas, na seqüência foram realizados
experimentos para otimização das concentrações de álcool butílico e de SDS na fase
móvel e da vazão, sendo estes fatores considerados simultaneamente através da
realização de um planejamento fatorial 23 (Tab. 05 em Materiais e Métodos) partindo-se
de uma fase móvel contendo álcool butílico 12,0% (v/v), SDS 2,20% (m/v) e 0,02mol/L
68
Na2HPO4 em pH 7,00 associada a uma vazão de 1,30 mL/min a uma temperatura de
30,0°C. Inicialmente o volume de amostra foi fixado em 40,0 μL.
Através dos dados obtidos com este experimento (Fig. 25), pode-se verificar que
houve uma intensa modificação do cromatograma em função dos diferentes níveis de
álcool butílico, SDS e da vazão.
0 ,3 5
0 ,3 0
0 ,2 5
Absorbância
0 ,2 0
0 ,1 5
0 ,1 0
0 ,0 5
0 ,0 0
1
2
3
4
io
sa
5
En
6
7
8
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
T e m p o (m in )
Figura 25. Otimização dos parâmetros experimentais utilizando planejamento fatorial na

separação das vitaminas lipossolúveis. Dados obtidos para concentrações das vitaminas D3, A, E, K1
de 11,0; 40,0; 60,0 e 10,0 mg/L, respectivamente. Volume da solução padrão de 40,0 μL, pH 7,00 e
temperatura de 30ºC. Para dados da composição da fase móvel e de vazão vide Tabela 05.
Com relação à concentração do álcool butílico na fase móvel foi verificado que a
concentração mínima deste componente para obtenção de separação cromatográfica
com resolução adequada para fins quantitativos foi de 15,0 % (v/v) (Tab. 06). Para
valores de concentração de álcool butílico menores que 15,0% (v/v) foi verificado
alargamento dos picos e maior tempo de análise, sendo este efeito mais acentuado
quanto menor a concentração de álcool butílico na fase móvel. Para valores de
concentração de álcool butílico maiores que 15,0 % (v/v) há necessidade de se aumentar
também à concentração de SDS, pois o surfactante ajuda a promover a homogeneização
69
do álcool butílico no meio aquoso; indicando a correlação entre as variáveis e a
necessidade de estudá-las conjuntamente em experimento fatorial. Considerando-se
estes dados a concentração de álcool butílico foi fixada em 15,0 % (v/v).
A presença de SDS é indispensável na fase móvel, pois sem o SDS não há a
homogeneização entre o álcool butílico e o meio aquoso devido à baixa solubilidade
deste álcool na fase aquosa. A quantidade mínima de SDS para se conseguir uma
solução homogênea contendo 15,0% (v/v) de álcool butílico é de 1,50% (m/v). O SDS
também influencia na separação cromatográfica, principalmente devido à formação de
micelas no meio e à modificação da fase estacionária, pois parte do SDS é adsorvida nos
grupamentos C18 alterando a polaridade desta fase. Aumentando a concentração de
SDS verifica-se uma melhora na separação cromatográfica, aumento da resolução
cromatográfica e, conseqüente, diminuição no tempo de análise (Fig. 25 e Tab. 06),
mesmo nos casos em que a concentração de álcool butílico é inferior a 15,0% (v/v).
Assim, a concentração de SDS foi fixada em 3,00% (m/v) como melhor compromisso
entre tempo de análise, resolução cromatográfica e consumo de reagentes.
Verificou-se que a vazão possui papel fundamental na separação cromatográfica,
pois influencia tanto no tempo de análise quanto na resolução cromatográfica (Fig. 25,
Tab. 06). Para valores de vazão inferiores a 1,0 mL/min associado a baixas
concentrações de álcool butílico e SDS o tempo de análise pode ser superior a 90,0
minutos, fator que contribui para o alargamento dos picos. Para vazões superiores a 1,0
mL/min ocorre diminuição no tempo de análise e melhora significativa na resolução
cromatográfica (Fig. 25, Tab. 06), sendo que os melhores resultados foram obtidos para
vazão de 2,0 mL/min. Desta forma, a vazão foi fixada em 2,0 mL/min em função do
menor tempo de análise, menor consumo de reagentes e melhor resolução
cromatográfica.
70
Tabela 06. Resoluções cromatográficas para planejamento
fatorial 23 para determinação das vitaminas lipossolúveis.
Ensaio Rs (vita D3 - vita A) Rs (vita A - vita E) Rs (vita E - vita K1)
1 10,03 3,335 -
2 16,78 6,166 8,856
3 5,815 1,548 2,870
4 13,17 4,528 8,623
5 10,96 2,548 -
6 13,45 5,325 6,785
7 4,043 1,046 1,612
8 10,61 5,016 7,982
Desta forma, observa-se que as condições utilizadas no ensaio 08 do
planejamento fatorial (Tab. 05) são as que fornecem a melhor relação custo/benefício
para a determinação de vitaminas lipossolúveis (álcool butílico 15,0% (v/v), SDS 3,00
% (m/v) e vazão de 2,0 mL/min), pois os dados obtidos sob esta condição apresentaram
as melhores características analíticas com relação a resolução cromatográfica (Tab. 06),
ao menor consumo de reagentes, a sensibilidade e a freqüência analítica (Figs. 25 e 26).
Sob estas condições foi possível quantificar as vitaminas lipossolúveis em
aproximadamente 25,0 min (Fig. 26), com tempos de retenção de 4,00; 9,60; 13,00 e
22,70 min, para as vitaminas D3, A, E, K1, respectivamente.
71
0 ,4 0
0 ,3 5
0 ,3 0
V ita m in a A
V ita m in a E
Absorbância
0 ,2 5
0 ,2 0
0 ,1 5
0 ,1 0 V ita m in a D 3
V ita m in a K 1
0 ,0 5
0 ,0 0
0 5 10 15 20 25
T e m p o (m in )
Figura 26. Cromatograma de uma solução padrão contendo as vitaminas D3, A, E, K1. Nas
concentrações de 11,0; 40,0; 60,0 e 10,0 mg/L, respectivamente para D3, A, E e K1. Dados obtidos para
injeção de 40,0μL da solução padrão, vazão 2,0 mL/min, pH 7,00, álcool butílico 15,0%(v/v), SDS
3,00%(m/v), 0,02 mol/L Na2HPO4 e temperatura de 30,0° C.
Para certificação das condições ótimas também foi realizado experimento para
otimização da temperatura do sistema cromatográfico. Pôde-se verificar que
aumentando-se a temperatura de 25,0º C até 50,0º C nenhuma modificação expressiva
na separação cromatográfica ocorreu (Fig. 27). Deve-se enfatizar que, como esperado, o
aumento da temperatura promoveu uma diminuição da pressão do sistema
cromatográfico, no entanto, em temperaturas mais elevadas algumas reações
indesejáveis podem ocorrer como, por exemplo, a decomposição das vitaminas ou da
fase móvel, formação de bolhas no detector, influência no equilíbrio cromatográfico,
particularmente nos equilíbrios iônicos, e aumento da solubilidade da sílica [4]. Deve
ser ressaltado que a temperatura não pode ser aumentada indefinidamente em virtude da
deterioração da coluna cromatográfica, para as colunas de sílica a temperatura máxima
de operação é de 120°C e para fases quimicamente ligadas esta não deve exceder os
80°C [6]. Para temperaturas inferiores a 25,0° C ocorreu um aumento da pressão que
72
poderia inviabilizar a execução do método analítico. Considerando-se todos estes
fatores, a temperatura do sistema foi fixada em 30,0º C.
0 ,6
0 ,5
Absorbância
0 ,4
0 ,3
0 ,2
0 ,1
0 ,0
25
30
)
ºC
35
a(
tu r
40
e ra
mp
45
Te
50
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
T e m p o ( m in )
Figura 27. Efeito do controle de temperatura na separação das vitaminas lipossolúveis D3, A, E.
Nas concentrações de 30,0; 80,0 e 60,0 mg/L, respectivamente para D3, A, E. Dados obtidos para injeção
de 40,0μL da solução padrão, vazão 2,0 mL/min, pH 7,00, álcool butílico 15,0%(v/v), SDS 3,00%(m/v),
0,02 mol/L Na2HPO4 e T de 25,0°C a 50,0 º C.
5.2.3. Determinação das vitaminas utilizando o método
cromatográfico convencional
Testes utilizando-se o método convencional que utiliza coluna cromatográfica
C18, detector de arranjo de diodos com aquisição dos dados em 280 nm e fase móvel
constituída por dois solventes diferentes (solução A: acetonitrila; solução B: álcool
metílico) e gradiente da fase móvel iniciando-se com 50,0 % (v/v) de álcool metílico e
50,0 % (v/v) de acetonitrila e chegando em 25,0 min com 30,0% (v/v) de álcool
metílico e 70,0% (v/v) de acetonitrila sempre com vazão constante de 1,30 mL/min
demonstraram que as vitaminas lipossolúveis podem ser separadas em
73
aproximadamente 25,0 minutos (Fig. 28) com boa seletividade, sensibilidade e
freqüência analítica, no entanto consumindo solventes orgânicos considerados tóxicos.
Figura 28. Determinação de vitaminas lipossolúveis empregando-se método cromatográfico

convencional. 1-Vitamina A; 2-Vitamina A e D3; 3-Vitamina E; 4-Vitamina K1; 5-Mistura das vitaminas
A, D3, E, K1. Dados obtidos para concentrações das vitaminas A, D3, E , K1 de 40,0; 11,0; 60,0 e 10,0
mg/L, respectivamente. Volume de solução padrão injetado de 20,0μL e vazão de 1,30 mL/min.
5.3. Aplicações
5.3.1. Figuras de mérito do método proposto
Utilizando as condições otimizadas, fase móvel contendo: álcool butílico 15,0%
(v/v), SDS 3,00% (m/v), 0,02 mol/L de Na2HPO4, pH 7,00, associada a uma vazão de
2,00 mL/min e a uma temperatura de 30,0 ºC conseguiu-se obter as melhores
características analíticas com relação à resolução cromatográfica. As resoluções
cromatográficas obtidas foram de 10,6 (entre os picos das vitaminas D3 e A), 5,0 (entre
os picos das vitaminas A e E) e de 8,0 (entre os picos das vitaminas E e K1) (Tab. 06).
74
Ainda sob estas condições foram obtidos os melhores dados com relação ao menor
consumo de reagentes, sensibilidade e freqüência analítica (Fig.24).
Curvas analíticas (Figs. 29-32) obtidas para as quatro vitaminas lipossolúveis em
estudo foram lineares na faixa de concentração de interesse (1,00 – 60,0 mg/L para as
vitaminas A, E e K1 e de 1,00 - 40,0 mg/L para a vitamina D3) quando foram injetados
50,0 μL da solução padrão. Os limites de detecção e quantificação foram compatíveis
com as concentrações esperadas das vitaminas para as amostras de alimentos e
complexos vitamínicos (Tab. 07).
6
2 ,5 x 1 0
6
2 ,0 x 1 0
6
1 ,5 x 1 0
Area
6
1 ,0 x 1 0
5
5 ,0 x 1 0
0 ,0
0 10 20 30 40 50 60
C o n c e n tr a ç ã o ( m g /L )
Figura 29. Curva Analítica para a Vitamina A pelo método proposto. Nas concentrações de 60,0;
48,0; 32,0; 20,0; 10,0 e 1,00 mg/L.
75
6
1 ,4 x 1 0
6
1 ,2 x 1 0
6
1 ,0 x 1 0
5
8 ,0 x 1 0
Area
5
6 ,0 x 1 0
5
4 ,0 x 1 0
5
2 ,0 x 1 0
0 ,0
0 10 20 30 40
Figura 30. Curva Analítica para a Vitamina D3 pelo método proposto. Nas concentrações de 40,0;
35,0; 25,0; 15,0; 5,00 e 1,00 mg/L.
6
2 ,5 x 1 0
6
2 ,0 x 1 0
6
1 ,5 x 1 0
Area
6
1 ,0 x 1 0
5
5 ,0 x 1 0
0 ,0
0 10 20 30 40 50 60
Figura 31. Curva Analítica para a Vitamina E pelo método proposto. Nas concentrações de 60,0;
48,0; 30,0; 21,0; 12,0 e 1,00 mg/L.
76
6
5x10
6
4x10
6
3x10
Area
6
2x10
6
1x10
0
0 10 20 30 40 50 60
Figura 32. Curva Analítica para a Vitamina K1 pelo método proposto. Nas concentrações de 60,0;
48,0; 29,0; 20,0; 10,0 e 1,00 mg/L.
Deve ser ressaltado que os limites de detecção e quantificação (Tab. 07) foram
estimados considerando-se a relação sinal/ruído de 3,00 e 10,0 vezes, respectivamente.
Tabela 07. Características do método cromatográfico proposto para a
determinação das vitaminas lipossolúveis.
Vitamina A Vitamina D3 Vitamina E Vitamina K1
Equação da y =34852x +6290 y =30382x-794 y =36333x+4092 y=82621x-7175
reta R2 = 0,9999 R2 = 0,9999 R2 = 0,9999 R2 = 0,9998
Limite de
detecção 0,89 mg/L 0,94 mg/L 1,18 mg/L 0,87 mg/L
Limite de
quantificação 3,00 mg/L 3,12 mg/L 4,00 mg/L 2,90 mg/L
77
5.3.2. Figuras de mérito do método convencional
As curvas analíticas obtidas para o método convencional (Figs. 33-36) bem
como os limites de detecção e quantificação estimados (Tab. 08) indicam semelhanças
nas características analíticas dos dois métodos analíticos, sendo a substituição dos
solventes orgânicos tóxicos a principal diferença entre ambos. A exemplo do método
proposto, no método convencional as curvas analíticas puderam ser realizadas para as
mesmas faixas de concentração (1,00 – 60,0 mg/L para as vitaminas A, E e K1 e de
1,00 – 40,0 mg/L para a vitamina D3) com diferença apenas no volume de amostra
injetado 20,0 μL (Tab. 08).
6
9x10
6
8x10
6
7x10
6
6x10
6
5x10
Area
6
4x10
6
3x10
6
2x10
6
1x10
0
0 10 20 30 40 50 60
C o n c e n tra ç ã o (m g /L )
Figura 33. Curva Analítica para a Vitamina A pelo método convencional. Nas concentrações de 60,0;
40,0; 22,0; 10,0 e 1,00 mg/L.
78
6
2 ,5 x 1 0
6
2 ,0 x 1 0
6
1 ,5 x 1 0
Area
6
1 ,0 x 1 0
5
5 ,0 x 1 0
0 ,0
0 10 20 30 40
Figura 34. Curva Analítica para a Vitamina D3 pelo método convencional. Nas concentrações de
40,0; 21,0; 15,0; 8,00 e 1,00 mg/L.
6
7x10
6
6x10
6
5x10
6
4x10
Area
6
3x10
6
2x10
6
1x10
0
0 10 20 30 40 50 60
C o n c e n t r a ç ã o ( m g /L )
Figura 35. Curva Analítica para a Vitamina E pelo método convencional. Nas concentrações de
60,0; 40,0; 19,0; 9,0 e 1,00 mg/L.
79
6
9x10
6
8x10
6
7x10
6
6x10
6
5x10
Area
6
4x10
6
3x10
6
2x10
6
1x10
0
0 10 20 30 40 50 60
C o n c e n t r a ç ã o ( m g /L )
Figura 36. Curva analítica para Vitamina K1 pelo método convencional. Nas concentrações de 60,0;
40,0; 20,0; 12,0 e 1,00 mg/L.
Tabela 08. Características do método cromatográfico convencional para a
determinação das vitaminas lipossolúveis.
Vitamina A Vitamina D3 Vitamina E Vitamina K1
Equação da y =137185x - y = 61511x + y =113589x- y =137589x +
reta 5456 7729 16356 30631
R2 = 0,9999 R2 = 0,9998 R2 = 0,9999 R2 = 0,9999
Limite de
detecção 0,77 mg/L 0,92 mg/L 0,90 mg/L 0,63 mg/L
Limite de
quantificação 2,60 mg/L 3,10 mg/L 3,00 mg/L 2,10 mg/L
80
5.3.3. Comparação das características do método proposto
e do método convencional
Para a verificação dos resultados obtidos foi realizada a comparação das
características entre o método proposto e o convencional (Tab. 09). O que possibilitou
verificar que os métodos possuem características semelhantes quanto ao limite de
detecção e de quantificação, no entanto, o método proposto apresenta a vantagem de
utilizar reagentes de baixa toxicidade como fase móvel estando de acordo com a
Química Limpa.
Tabela 09. Comparação das características do método cromatográfico proposto e
do método convencional para a determinação das vitaminas lipossolúveis.
Método proposto Método convencional
(volume injetado de 50,0 μL) (volume injetado de 20,0 μL)
Vitaminas Área L. D L. Q Área L. D L.Q
(mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L)
A 2,1 x 106 0,89 3,00 8,2 x 106 0,77 2,60
D3 1,2 x 106 0,94 3,12 2,5 x 106 0,92 3,10
E 2,2 x 106 1,18 4,00 6,8 x 106 0,90 3,00
K1 4,9 x 106 0,87 2,90 8,3 x 106 0,63 2,10
L. D = limite de detecção
L. Q = limite de quantificação
81
5.3.4. Determinação de vitaminas em amostras de
alimentos e complexos vitamínicos
Alimentos
Quando o método proposto foi aplicado para determinação das vitaminas A, D3,
E e K1 em amostras de leite fortificado, óleo de soja, repolho e complexo vitamínico os
resultados obtidos foram concordantes com os resultados do método convencional e
ambos apresentaram desvio padrão de ca 5,0 %.
Para amostra de leite fortificado, empregando o método limpo, foram
encontradas concentrações de 0,19 mg/g e 0,86 mg/g das vitaminas A e E,
respectivamente. Para a amostra de óleo de soja foi encontrada concentração de 0,84
mg/g de vitamina E. Estes valores são concordantes com aqueles obtidos pelo método
convencional que apresentou concentrações de 0,18 mg/g e 0,74 mg/g das vitaminas A e
E, respectivamente para amostra de leite fortificado e 0,78 mg/g de vitamina E na
amostra de óleo de soja. Deve ser enfatizado que por ambos os métodos as vitaminas
D3 e K1 não foram detectadas em nenhuma das amostras, apesar de apresentarem
percentagens de recuperação semelhantes por ambos os métodos (Tab. 10).
A validação do método analítico foi realizada através de ensaios de recuperação
(Tab. 10) e também através de comparação dos resultados com aqueles obtidos quando
da utilização do procedimento convencional que emprega solvente orgânico. Os
resultados obtidos através do método proposto e do método convencional mostraram-se
concordantes, os valores médios das percentagens de recuperação não são
estatisticamente diferentes ao nível de 95 % (teste t de student), evidenciando assim a
exatidão dos resultados obtidos quando da utilização do método proposto, não
apresentando variação significativa entre dois métodos em teste t pareado.
82
Os ensaios de recuperação indicaram que o método proposto apresentou
percentagens de recuperação variando entre 85,0 e 95,0 % enquanto que o método
convencional apresentou percentagens de recuperação entre 81,0 e 92,0 %.
Tabela 10. Ensaio de recuperação das vitaminas lipossolúveis em amostras de leite
fortificado, leite em pó, óleo e repolho através do método proposto e método
convencional utilizando adição de padrão.
Concentração Método proposto Método convencional
(mg/L) (recuperação %) (recuperação %)
Amostras Adicionado A D3 E K1 A D3 E K1
Leite 20,0 85,00 ----- 95,00 ----- 83,00 ----- 82,00 -----
fortificado
Leite em 15,0 ----- 93,00 ----- ----- ----- 85,00 ----- -----
pó
Óleo 20,0 ----- ----- 88,00 ----- ----- ----- 81,00 -----
Repolho 20,0 ----- ----- ----- 89,00 ----- ----- ----- 92,00
A não detecção das vitaminas K1 e D3 pode ter ocorrido porque as
concentrações destas estavam abaixo do limite de detecção devido à influência do tipo
de cultivo ou estocagem do alimento. Deve ser considerado que a distribuição de
vitamina K1 nas plantas não é uniforme, as maiores concentrações da vitamina são
encontradas nas folhas externas quando comparadas às folhas mais internas. As cascas
das frutas e dos vegetais possuem maiores concentrações da vitamina do que a polpa.
Fatores como a estação do ano, o clima, local geográfico e a fertilização do solo afetam
as concentrações de vitamina K1 nos alimentos [38].
Ainda, a determinação de vitamina D3 e combinações na forma de vitamina D é
uma tarefa difícil e laboriosa devido às baixas concentrações destas nos alimentos. A
83
maioria dos métodos de extração e análise utiliza a saponificação, purificação
cromatográfica e quantificação através da CLAE, utilizando a adição de padrão interno
[39].
Complexos Vitamínicos
As amostras de complexos vitamínicos e preparações farmacêuticas foram
analisadas apenas pelo método proposto, pois as concentrações esperadas das vitaminas
foram fornecidas pelo fabricante.
Para estas amostras foi verificada maior eficiência de extração quando as
amostras foram submetidas à etapa de saponificação (Fig. 37), principalmente quando a
preparação possuía como excipiente óleo, que é o caso das vitaminas D3 e E. Para as
vitaminas A e K1 que possuem como excipiente uma solução de micelas mistas que se
dissolve facilmente em solventes orgânicos polares a maior eficiência ocorreu quando a
dissolução da preparação farmacêutica foi feita apenas em álcool etílico (Fig. 37) e,
neste caso, a excessiva preparação da amostra adicionava reativos que contribuem para
alargamento dos picos. No entanto, a dissolução de amostras de vitaminas em álcool
etílico não permite a solubilização da vitamina D3.
Assim, foi verificado que procedimentos de extração que possuem etapa de
saponificação são indicados para extração de vitaminas lipossolúveis de amostras
contendo óleo (Fig. 37).
84
0 ,2 5
0 ,2 0
Absorbância
D3 0 ,1 5
K1
0 ,1 0
0 ,0 5
K1
E
0 ,0 0
A
a
ti c
A
êu
E
ac
a rm
2
.F
ep
Pr
0 5 10 15 20 25
T e m p o ( m in )
Figura 37. Cromatograma de amostras de preparações farmacêuticas. 1-Extração utilizando

saponificação e 2-Extração sem saponificação. Dados obtidos para injeção de 50,0 μL do extrato da
amostra, vazão 2,0 mL/min, pH 7,00, álcool butílico 15,0% (v/v), SDS 3,00% (m/v), 0,02 mol/L
Na2HPO4 e T 30,0º C.
Deve ser ressaltado que os dados da (Fig. 37) referem-se a quatro amostras de
preparações farmacêuticas cada uma contendo apenas uma das vitaminas que foram
juntadas antes da etapa de extração. Foram obtidos concentrações de 5,70; 3,40; 3,00 e
8,50 mg/mL para as vitaminas D3, A, E, K1, respectivamente na extração utilizando a
saponificação. Para a extração que foi realizada sem saponificação as concentrações
obtidas foram de 4,60; 1,23 e 9,0 mg/mL para as vitaminas A, E, K1, respectivamente
Estes valores estão de acordo com os descritos pelos fabricantes que foram de 6,00
mg/mL para a vitamina D3; 5,00 mg/mL para a vitamina A; 4,00 mg/L para a vitamina
E e 10,00 mg/mL para a vitamina K1.
85
Capítulo 6 – Conclusões
6. Conclusões
É possível desenvolver métodos cromatográficos limpos explorando ambientes
micelares e sem utilizar solventes orgânicos de alta toxicidade.
O método cromatográfico desenvolvido para a determinação das vitaminas
lipossolúveis utiliza como fase móvel álcool butílico 15,0 % (v/v), SDS 3,00 % (m/v),
0,02 mol/L Na2HPO4, pH 7,00 em água desionizada, associada a uma vazão de 2,0
mL/min e a uma temperatura de 30,0°C como fase estacionária uma coluna C18. O
método mostrou-se seletivo, sensível, robusto, simples, de alta frequência analítica,
sendo os resultados obtidos comparáveis àqueles fornecidos quando da utilização do
procedimento convencional, mas com a vantagem de utilizar reagentes orgânicos de
baixa toxicidade.
Deve ser ressaltado que as características analíticas do método proposto são
superiores ao método convencional, pois o tempo de análise é praticamente o mesmo, a
seletividade são similares e o método analítico pode ser considerado limpo.
Apesar das vitaminas K1 e D3 não serem determinadas nas amostras de
alimentos sem adição de padrão, fica evidente que o método proposto pode ser utilizado
para determinação das quatro vitaminas lipossolúveis, pois apresentou resultados
concordantes com os do método convencional, o que era o objetivo desta presente
dissertação, desenvolver método analítico limpo para determinação de vitaminas em
alimentos, complexos vitamínicos e similares.
Finalmente, deve ser enfatizado que o método analítico necessita ser utilizado
para determinação de vitaminas em outras amostras. Neste trabalho esta tarefa não foi
realizada porque o objetivo principal era desenvolver método analítico limpo para
determinação de vitaminas utilizando CLAE e ambientes micelares e o tempo exíguo
86
Capítulo 6 – Conclusões
para a conclusão de um mestrado não permitiu um estudo mais completo sobre
aplicação do método às amostras reais.
87
Capítulo 7 – Referências
7. Referências
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92

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

“Desenvolvimento de método cromatográfico limpo para a

Dissertação apresentada por

Orientador : Prof. Dr. Cláudio Celestino de Oliveira.

1. CLAE. 2. Vitaminas lipossolúveis. 3. Química limpa. I. Universidade

CDD 21.ed. - 543.089

Desenvolvimento de método cromatográfico limpo para a determinação de

vitaminas lipossolúveis em alimentos explorando a cromatografia líquida de

alta eficiência (CLAE) e ambientes micelares.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós

Graduação em Química, da Universidade

Estadual de Maringá, como parte dos requisitos

para obtenção do título de Mestre em Química.

Orientador: Prof. Dr Cláudio Celestino de Oliveira

Maringá, março de 2007.

sempre ou jamais. Digamos, simplesmente: ainda!...

Ainda nos veremos um dia. Ainda nos encontraremos

na estrada da vida. Ainda encontraremos a pousada, o

afeto almejado, a guarida. Ainda haverá tempo de

amar, sem medo, totalmente... infinitamente... sem ter

medo de pedir, de implorar, ou chorar... Ainda haverá

tempo, para ser feliz novamente. Ainda haverá

tristeza, ainda haverá saudade, ainda haverá

primavera, o sonho, a quimera. Ainda haverá alegria,

apesar das cicatrizes. Ainda haverá esperança, porque

amanhã será um novo dia!...”.

A Deus, por ter estar sempre ao meu lado iluminando

o meu caminho, por me dar forças para vencer todos os

obstáculos e por conceder a serenidade necessária para aceitar

as coisas que não podemos mudar; coragem para mudar

aquelas que podemos e sabedoria para distinguir uma das

Aos meus pais, pois de vocês recebi o dom mais

precioso a Vida. Já por isso sou infinitamente grata. Mas

vocês não se contentaram em presentear-me apenas com ela,

mas sim revestiram minha existência com amor, carinho,

incentivo, compreensão e dedicação.

Aos meus familiares e amigos, pelo amor e incentivo

em todos os momentos de minha vida.

ensinamentos no laboratório e na vida.

A Profa. Maria Helena pela amizade, ajuda e incentivo;

Ao Prof. Nilson e Jesuí pela amizade, colaboração e incentivo;

Ao Programa de Pós Graduação em Química pela oportunidade;

incentivo e por me ajudar sempre nas horas em que mais precisei;

A CAPES pela concessão da bolsa de estudos;

Aos meus pais, Waldemiro e Lia pelo carinho, incentivo e compreensão;

Tatiana e Vânia pela amizade, incentivo, carinho e compreensão.

desenvolvimento deste trabalho.

Índice de Figuras........................................................................................................... viii

2.1. Vitaminas Lipossolúveis...................................................................................... 05

2.1.1. Vitamina A.................................................................................................... 06

2.1.2. Vitamina D.................................................................................................... 10

2.1.3. Vitamina E.................................................................................................... 12

2.2. Análise química das vitaminas lipossolúveis...................................................... 18

2.3. Formas de extração das vitaminas lipossolúveis................................................. 21

2.4.1.Classificação pela forma física...................................................................... 25

2.4.2.Classificação cromatográfica pela fase móvel............................................... 25

2.4.3.Classificação pela fase estacionária............................................................... 26