Universidade Estadual de Maringá: Centro de Ciências Exatas Departamento de Química
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Universidade Estadual de Maringá: Centro de Ciências Exatas Departamento de Química
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
MARINGÁ, MARÇO/2007
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
Kienen, Vanessa
K47d Desenvolvimento de método cromotográfico limpo para a determinação de
vitaminas lipossolúveis em alimentos explorando a cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE) e ambientes micelares / Vanessa Kienen. --
Maringá : [s.n.], 2007.
92 f. : il.
Vanessa Kienen
Paulo Coelho
ii
DEDICATÓRIA
outras.
iii
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Cláudio, pela orientação, paciência, confiança, amizade, incentivo
e por compartilhar não apenas seus conhecimentos acadêmicos, mas também suas
experiências de vida;
Ao Prof. e amigo Willian, pelo incentivo, ajuda, colaboração, pelas idéias e pelos
Aos amigos Ana Cláudia, Ana Paula Ozima, Ana Paula, Ângela, André, Augusto,
Cristiano, Danielle, Eliane, Elidia, Elisa, Flávia, Gisele, Higo, Lílian, Marcela, Marina,
Milton, Rúbia, Simone, Silvia, Solange, Patrícia, Valquíria e Vanessa pela amizade,
Ao Claudemir, Cristina, Edson e Moacir pela amizade e disposição em ajudar sempre que
necessário;
As minhas amigas Adriana, Daniele, Flávia, Francieli, Francielle, Juliana, Michely, Paula,
A toda minha família, amigos e a todas as pessoas que de alguma forma colaboraram no
iv
SUMÁRIO
Páginas
Índice de Tabelas.......................................................................................................... xi
Resumo........................................................................................................................... xii
Abstract......................................................................................................................... xiv
1.INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 01
2.REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................. 05
2.1.4.Vitamina K..................................................................................................... 16
2.4. Cromatografia...................................................................................................... 23
v
2.7. Química Limpa.................................................................................................... 37
3.OBJETIVOS.............................................................................................................. 46
3.1.Objetivo Geral...................................................................................................... 46
3.2.Objetivo Específico.............................................................................................. 46
4.MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 47
4.1.Reagentes e Soluções............................................................................................ 47
4.1.1.Reagentes....................................................................................................... 47
4.1.2.Soluções......................................................................................................... 48
4.2.Equipamentos e Acessórios.................................................................................. 49
4.2.1.Espectrofotômetro.......................................................................................... 49
4.2.2.Cromatógrafo................................................................................................. 49
4.3.Métodos................................................................................................................ 51
4.3.4.Método convencional..................................................................................... 53
4.4. Aplicações............................................................................................................ 54
vi
4.4.2. Extração das vitaminas lipossolúveis (A, D3, E e K1) dos complexos
vitamínicos.............................................................................................................. 56
5.RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................. 57
5.1.Espectros de UV-Vis............................................................................................ 57
em ambientes micelares.............................................................................................. 59
convencional........................................................................................................... 73
5.3. Aplicações............................................................................................................ 74
convencional........................................................................................................... 81
vitamínicos.............................................................................................................. 82
6. CONCLUSÕES......................................................................................................... 86
7. REFERÊNCIAS........................................................................................................ 88
vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Páginas
etílico.............................................................................................................................. 57
viii
Figura 19. Efeito da utilização de soluções aquosas de álcool etílico na separação das
vitaminas lipossolúveis................................................................................................... 61
lipossolúveis................................................................................................................... 62
lipossolúveis................................................................................................................... 63
vitaminas lipossolúveis................................................................................................... 68
K1................................................................................................................................... 72
cromatográfico convencional.......................................................................................... 74
ix
Figura 32. Curva Analítica para a Vitamina K1 pelo método proposto......................... 77
x
ÍNDICE DE TABELAS
Páginas
vitaminas lipossolúveis................................................................................................... 52
xi
Desenvolvimento de método cromatográfico limpo para a determinação
Resumo
potencialmente tóxicos como fase móvel. Como aplicação foi selecionada a determinação
sempre utilizando como fase estacionária uma coluna cromatográfica C18, sendo esta
fase móvel álcool butílico 15,0 % (v/v), SDS 3,00 % (m/v) e solução tampão fosfato 0,02
mol/L, pH 7,00, temperatura de 30,0ºC, associada a uma vazão de 2,00 mL/min e como
fase estacionária uma coluna C18. A metodologia mostrou-se seletiva, sensível, robusta,
simples, alta frequência analítica, com tempos de retenção de 4,0; 9,6; 13,0 e 22,7 min e
limites de detecção e quantificação de 0,94: 0,89; 1,18 e 0,87 mg/L e 3,12; 3,00; 4,00 e 2,90
xii
mg/L respectivamente para as vitaminas D3, A, E e K1 com desvio padrão de ca 5,0 %.
Quando o método proposto foi aplicado a amostras reais os resultados obtidos foram
xiii
Development of a green chromatographic method for determination of fat
Abstract
In the present work is proposed the separation and determination of fat soluble
vitamins by using HPLC associated to micelar media, without usage of potentially toxic
reagents as mobile phase. The determination of fat soluble vitamins in food, vitamin
complex and similar samples were selected as application, always using a RP-18 column as
stationary phase, which was temporary modified during the chemical analysis by the
mobile phase constituents, increasing the applicability of the strategy and becoming
possible the development of green analytical methods exploiting HPLC. The proposed
method for determination of fat soluble vitamins was carried out by using 15.0 % (v/v)
butyl alcohol, 3.00 % (w/v) SDS and 0.02 mol/L phosphate buffer, pH 7.00, temperature of
30.0º C, associated to a flow rate of 2.00 mL/min and a RP-18 as stationary phase. The
analytical method is selective, sensitive, robust, simple, presents high analytical frequency,
with retention times of 4.0; 9.6; 13.0 e 22.7 min, detection and quantification limits of 0.94:
0.89; 1.18 e 0.87 mg/L and 3.12; 3.00; 4.00 and 2.90 mg/L, respectively for D3, A, E and
K1 vitamins with standard deviation of ca 5.0 %. When the proposed method was applied
xiv
to real samples the obtained results were in agreement with those obtained by the
conventional method.
xv
Capítulo 1 – Introdução
1. Introdução
químicas como contaminantes, nutrientes, vitaminas e dentre outras. Assim, existe uma
de amostras e obter resultados com um maior grau de confiabilidade que possam ajudar
Durante muito tempo o valor nutritivo de um alimento foi definido com base no
seu teor de proteínas, carboidratos, gorduras e sais minerais, uma vez que unicamente
alimentos com as doenças carências, estas substâncias foram sendo designadas por
letras em ordem alfabética [3]. Assim o fator encontrado na manteiga e que tinha
1
Capítulo 1 – Introdução
partir de então, muitos fatores foram descobertos, sendo a eles atribuídas letras do
alfabeto [3].
Apesar deste sistema descritivo ter sido abandonado porque muitos destes
nestas primeiras designações, ainda hoje se utilizam letras para designar as vitaminas ou
grupos de compostos com atividades vitamínicas, colocando-se após a letra que indica a
vitamina, índices numéricos que identificam estes fatores, assim tem-se a vitamina D2 e
grupo do complexo B (B1, B2, B3, B5, B6, B8, B9, B12) e a Vitamina C, de acordo
de sintetizá-las por via anabólica, razão pela qual as vitaminas precisam ser incluídas na
A estreita relação entre dieta e saúde faz com que aumente a preocupação dos
1
Doença provocada por carência de vitamina B1, provoca desordens do sistema nervoso, fraqueza
muscular, dificuldades respiratórias e também pode afetar o coração.
2
Escorbuto - doença provocada por carências graves de vitamina C, provoca hemorragias nas gengivas,
inchaço, dores nas articulações e enfraquecimento das estruturas de colágeno.
2
Capítulo 1 – Introdução
[5]. Isto faz com que os organismos oficiais de fiscalização e a própria indústria fiquem
nos produtos desenvolvidos [2]. Além disso, um outro fator determinante na análise de
vitaminas são os erros nas análises, pouco freqüentes com outras substâncias, devido à
oxi-redução, fatores que devem ser considerados pelos métodos analíticos [2].
separação prévia, antes de sua quantificação. Porém, esta técnica analítica normalmente
está associada a solventes orgânicos que são utilizados como fase móvel, provocando a
3
Capítulo 1 – Introdução
geração de resíduos tóxicos após a análise química, sendo que estes solventes nem
móvel são alguns dos fatores que favorecem a utilização da técnica [4]. Deve-se
potencialmente tóxicos, mas não os eliminam completamente, pois muitas vezes, estes
solventes são utilizados como modificadores químicos. Assim, esta técnica analítica não
utilizando como fase estacionária uma coluna cromatográfica C18, sendo esta,
4
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
2. Revisão Bibliográfica
solvatar moléculas orgânicas de baixa polaridade em meio aquoso, é possível prever que
a união destas duas ferramentas possa dar origem a sistemas cromatográficos com
e planejamento fatorial.
5
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
sendo geralmente armazenadas no organismo nos mesmos locais das células adiposas
[3].
consumidas, pois elas estão naturalmente presentes nas plantas, animais e também
podem ser adicionadas na fortificação dos alimentos. Uma outra fonte de vitamina são
[7].
dos maiores problemas de saúde do ser humano, por isso, a adição destas substâncias
promove uma melhora nutricional na qualidade dos alimentos industrializados. Deve ser
salientado que no caso de alimentos fortificados deve-se adicionar vitaminas nas formas
estáveis [7].
2.1.1. Vitamina A
6
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
contida no oxigênio singlete que é tido como forte agente mutagênico em razão da
vitamina A, sendo que uma molécula de β-caroteno pode ser clivada por uma enzima
acetato de retinol (Fig. 02) e palmitato de retinol são, também, utilizadas na fabricação
CH2OH
CH2 O C CH3
espaciais, estes isômeros são formados por modificações da cadeia lateral da forma
demanda pode ser liberada na corrente sanguínea. Esta vitamina é essencial para o bom
7
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
xeroftalmia, uma doença degenerativa da córnea do olho que se não tratada pode causar
vitamina A no organismo ainda não está completamente esclarecido, mas existem claras
[11].
ter uma função anticâncer. Experimentos em laboratórios com altas doses da vitamina
mostram alguns resultados promissores, mas ainda não existem provas concretas de seu
hipervitaminose, mas não aumentam a concentração da vitamina nos tecidos alvo [11].
antioxidante, pois tanto o retinol quanto o β-caroteno são antioxidantes fracos, que
escuros (agrião, brócolis, repolho), vegetais e frutas amarelas (banana, laranja, cenoura)
8
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
Deve ser considerado que o excesso de vitamina A pode ser tóxico ao ser
podendo provocar efeitos adversos como cefaléia (dor de cabeça), descamação da pele,
aumento do baço e dos rins, espessamento dos ossos e dores articulares [11]. Por outro
sendo a perda de sua atividade acelerada pelo calor e pela exposição à luz [7]. Por serem
acetato de retinol e o palmitato de retinol, são utilizados nos alimentos fortificados [3].
dos lipídios insaturados. Assim, fatores que promovem a oxidação dos lipídios
oxidação direta ou por efeitos indiretos dos radicais livres [7]. As perdas da atividade da
9
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
2.1.2. Vitamina D
CH3
CH3 CH3
CH3
CH2
HO
CH3 CH3
CH3
CH2
HO
10
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
formas desta vitamina são utilizadas na forma sintética para a produção de alimentos
fortificados [7].
grosso, para a sua mobilização a partir dos ossos e na reabsorção nos rins. Através
vitamina, mas diferentemente das outras vitaminas lipossolúveis, ela não é armazenada
no fígado, mas nas células lipídicas da maioria dos tecidos, sobretudo no tecido adiposo
[11].
vitamina D, ambas caracterizadas pela perda de mineral a partir dos ossos, resultando
do esmalte dos dentes e da dentina [12]. Na osteoporose, ocorre uma perda óssea e não
11
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
sobretudo nos rins e pulmões, podendo causar a calcificação dos tecidos moles.
2.1.3. Vitamina E
sintetizados pelos vegetais, os quais podem ser divididos em duas classes: os tocoferóis
tocotrienóis [9-10].
12
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
R1
HO
CH3
R2 O
CH3 CH3 CH3 CH3
CH3
Tocoferol R1 R2
α CH3 CH3
β CH3 H
γ H CH3
δ H H
livres e também de atenuar o efeito físico do oxigênio singlete, assim, níveis elevados
ricas em substâncias que atuam como antioxidantes; como a ingestão de frutas, vegetais,
célula de alterações oxidativas [8]. De uma forma geral, estas substâncias não tornarão
13
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
somente no número e nas posições de radicais metila (-CH3) da sua molécula, embora
químico [8]. Sua reatividade frente ao oxigênio singlete está relacionada com a
atividade da vitamina E, sendo a forma alfa 100,0 % reativa enquanto as formas beta,
gama e delta são 50,0; 26,0 e 10,0 % reativas, respectivamente. A atividade biológica
dos tocoferóis está relacionada com a habilidade de inibir a oxidação de ácidos graxos
fortificados. Dentre essas formas temos o α - acetato de tocoferol (Fig. 06), no entanto
O
CH3
CH3C O
CH3
CH3 O
CH3 CH3 CH3 CH3
CH3
14
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
(espinafre e alface), leite fortificados e ovos [1]. As fontes sintéticas de vitamina E são
suplementos multivitamínicos.
oxigênio, calor e longos períodos de armazenagem [7]. Deve-se ter muito cuidado para
estável, a menos que existam condições que permitam a auto-oxidação dos ácidos
graxos [11]. Sua presença nos óleos impede o início do processo de rancificação do
15
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
2.1.4.Vitamina K
vegetais de folhas verde enquanto a vitamina K2 (Fig. 08) é formada pela ação de
O
CH3
CH3 CH3
CH2 CH C CH2 (CH2 CH2 CH CH2) 3
O
O
CH3
CH3
(CH2 CH C CH2)N
O
O
CH3
H
O
16
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
abundante presença de vitamina K1 presente nos alimentos e por causa das bactérias da
flora intestinal que sintetizam a vitamina K2 [7]. No entanto, a deficiência pode estar
anticoagulantes [7]. Esta deficiência pode resultar numa redução do nível de protombina
vitamina K [3]. Os recém nascidos podem sofrer da deficiência desta vitamina que se
(espinafre, brócolis, couve, repolho e alface), fígado bovino, leite fortificado e ovo [1],
multivitamínicos.
17
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
alimentos era feita de maneira empírica face à inexistência de técnicas confiáveis para
18
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
diretamente [2].
[2]. Estes agentes de derivatização também reagem com carotenóides, com produtos da
da simplicidade desta técnica, do bom limite de detecção e da boa sensibilidade [15] ela
não é a mais indicada para a identificação das vitaminas lipossolúveis, pois estas
absorção.
19
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
para que se minimizem problemas inerentes à estabilidade das reações envolvidas [2].
como em alimentos, pois estas amostras na maioria das vezes apresentam uma baixa
concentração [16].
problema sério, pois fatores que limitam a utilização dos métodos analíticos envolvem a
medidas incompletas das formas dos complexos vitamínicos [7]. Assim, o método de
substâncias com ou sem função vitamínica como, por exemplo, produtos de degradação
pode ser conseguida por meio de reações pós-coluna ou diretamente na coluna (com os
20
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
nuclear, que fornecem dados concludentes sobre a identificação dos picos, quando
Além destes métodos outras técnicas analíticas são utilizadas em menor escala
nas análises das vitaminas como a polarografia e voltametria [17], fluorescência [18],
geral, não é realizada diretamente, pois esta requer algumas etapas prévias como a
compostos de interesse.
misturas, apresentando uma grande solubilidade dos compostos durante as análises [10].
em muitos casos, os solventes utilizados são compatíveis com as fases móveis utilizadas
sólida, possui o papel principal de promover a separação prévia. Muitas vezes, esta
21
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
como substância extratora [8]. Esta técnica tem se apresentado eficiente para a extração
alterações de temperatura ou pressão quando perto da região do seu ponto crítico [8].
aumentar com a temperatura e pressão de operação [8]. A temperatura deve ser mantida
22
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
A extração em fase sólida (EFS) tem sido a técnica mais utilizada para a
este está presente em pequenas quantidades [10]. O uso da EFS tem se apresentado
2.4. Cromatografia
uma única análise pode-se separar uma mistura de substâncias em seus componentes
química presente na amostra [21]. As amostras podem ser gasosas, líquidas ou sólidas e,
atribuídos ao botânico russo Mikhael Semenovich Tswett, que em 1906, descreveu suas
experiências com colunas de vidro recheadas com vários sólidos, finamente divididos,
para separar componentes de extrato de folhas e gema de ovo que eram arrastados
através da coluna com éter de petróleo. O nome deriva-se das palavras gregas “chrom”
(cor) e “graphe” (escrever), embora hoje seja sabido que o processo não depende da cor,
exceto para facilitar a identificação dos componentes separados [22]. Paralelamente aos
23
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
outros anteriores, que também poderiam ser considerados precursores do uso dessa
técnica, a cromatografia foi praticamente ignorada até a década de 30, quando foi
ciência [23].
distribuição destes componentes entre duas fases, que estão em contato íntimo. Uma das
são distribuídos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes da
estacionária) apresentarão tempo de retenção mais elevado, enquanto que aqueles que
24
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
cromatografia.
diversos critérios como a classificação pela forma física, pela fase móvel, pela fase
cromatografia: a cromatografia gasosa (CG) que utiliza como fase móvel um gás inerte,
cromatografia líquida clássica (CLC), na qual a fase móvel (líquido) é arrastada através
25
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
quimicamente ligada. No caso da fase estacionária ser constituída por um líquido, este
pode estar suportado sobre um sólido ou imobilizado sobre este [23]. A imobilização
pode envolver ligações químicas entre o líquido e o suporte, ou somente entre as cadeias
separação, como fases quimicamente ligadas, esta distinção justifica-se pelo fato de seu
Cromatografia por adsorção - utiliza uma fase estacionária sólida e uma fase móvel
26
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
Cromatografia por partição - utiliza uma fase estacionária líquida que forma um filme
suporte sólido, geralmente uma resina. Os íons de carga oposta do soluto são atraídos
Cromatografia por exclusão molecular - esta técnica separa as moléculas pelo tamanho,
com os solutos maiores passando por ela com maior velocidade enquanto os analitos de
menor tamanho passam pelos poros da fase estacionaria sendo retidos na coluna por
diâmetros pequenos, que foi responsável por melhores separações quando comparado
bombas de alta pressão para vencer a alta pressão hidrodinâmica gerada devido à baixa
27
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
permeabilidade da fase móvel [23] é que se passou a fazer a distinção entre CLAE e
CLC.
[6]. Devido a sua versatilidade e confiabilidade, a CLAE tem sido amplamente utilizada
como técnica de análise em várias áreas da ciência. As colunas analíticas mais utilizadas
são de dois tipos: as de fase normal e as de fase reversa [2]. As de fase normal são
polaridade, enquanto as de fase reversa são revestidas em grau variável (de 6,0 a 18,0%)
(C8 e C18) aumenta a área superficial e modifica a polaridade da coluna, sendo eficazes
Uma das etapas mais importantes na CLAE é a seleção da fase móvel e, para se
físicas, além da pureza dos solventes [24]. Ainda, fatores como a compatibilidade com o
28
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
de diodos. Sendo assim, deve ser avaliada a absorbância do solvente na região UV-Vis e
cuidar para que este não absorva no mesmo comprimento de onda dos componentes da
Um outro fator determinante é quanto à forma de eluição utilizada que pode ser
pode ser isocrática ou por gradiente [6]. A eluição isocrática é aquela na qual a
enquanto na eluição por gradiente a composição da fase móvel varia durante o processo
repetibilidade das análises e menor custo. Além disso, comparando a eluição isocrática e
a por gradiente temos que na eluição por gradiente não pode ser utilizada com alguns
eluição por gradiente os ruídos da linha base são mais comuns, sendo recomendado o
cromatográfica, pois o equilíbrio na troca de massa do soluto entre a fase móvel e a fase
29
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
propriedade que afeta a queda de pressão dentro da coluna e a eficiência, pois quanto
mais viscosa for a fase móvel mais será afetado o coeficiente de difusão da substância,
Uma outra variável determinante é o ponto de ebulição que está relacionado com
solventes, requer que eles sejam miscíveis entre si. A insolubilidade leva à formação de
solubilização dos componentes da fase móvel deve ser adicionado ao sistema [24].
Um outro caso importante é a adição de solução tampão à fase móvel que com o
da adição de solução tampão a concentração desta não deve ser muito alta e as colunas
nunca devem ser guardadas antes da limpeza para retirar fases tamponadas [24].
30
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
solvente que pode estar próximo ao comprimento de onda utilizado na detecção [24].
fabricação, assim estas variações podem afetar a reprodutibilidade nas separações [24].
9 Toxicidade
possuem um baixo valor de limite de toxidez e uma alta pressão de vapor sendo
toxicidade e que sejam degradáveis no meio ambiente para substituírem as fases móveis
31
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
com ratos.
Acetonitrila
Caso haja contato com uma fonte de ignição pode provocar a combustão do solvente. O
mutagênica [27]. A inalação do vapor pode causar fadiga, náusea, diarréia e dor
Álcool Metílico
Clorofórmio
vivos. Na forma de vapor é irritante para os olhos, nariz, garganta e se inalado pode
32
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
Tetraidrofurano
alta toxicidade aos organismos e ao ambiente [27]. O vapor é irritante para os olhos e ao
Álcool Butílico
não cancerígeno e mutagênico [27]. Deve se tomar cuidado para o produto não
contaminar o solo e a água, por não ser totalmente solúvel. É esperada uma rápida
33
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
cromatografia líquida micelar pode-se ter uma alta precisão na retenção dos compostos
que apresentam uma baixa toxicidade e são menos inflamáveis quando comparado com
fases móveis tradicionais. Estes ainda apresentam características como baixo custo,
cabeça polar ou hidrofílica e uma cadeia carbônica apolar ou hidrofóbica, sendo que a
ser catiônicos quando possuem carga positiva, aniônicos quando possuem a carga
negativa, neutros quando não possuem carga e zwiteriônicos quando a carga líquida é
nula em virtude destas moléculas possuírem dois grupos na cabeça polar, um positivo e
34
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
sendo os catiônicos produzidos em menor escala, uma razão para o menor uso dos
fabricação de cosméticos, pois não irritam a pele e os olhos. Os surfactantes não iônicos
são tão produzidos quanto os aniônicos e, geralmente, são compatíveis com outros tipos
maiores que a concentração micelar crítica (CMC), elas formam as micelas. Micelas são
35
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
associar em aglomerados (Fig. 11) na forma de esferas, cilindros, lamelas entre outros.
sistema micelar. O termo “micela normal” é utilizado para se referir aos agregados de
surfactantes em meio aquoso, isto indica que a cabeça hidrofílica está direcionada para a
solução aquosa formando uma superfície polar, enquanto que a cadeia linear (cauda)
está em sentido inverso ao da água, formando um núcleo central não polar [30].
cabeças polares anfifílicas estão concentradas no interior do agregado e por esta razão
36
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
do surfactante seja igual ou superior que a CMC e que existam várias possibilidades de
facilmente reprodutíveis e são destruídas pela diluição com água quando a concentração
de baixa polaridade ou promover um novo meio que altere a velocidade reacional. Estes
grande número de reações [30]. Outros fatores positivos dos surfactantes é que podem
geração de substâncias nocivas à saúde humana e ao ambiente [31]. Esta idéia, ética e
problemas ambientais possam ser substituídos por alternativas menos poluentes ou não
ambientalmente benigna, ou ainda “green chemistry”, são termos que surgiram para
definir esta importante idéia. “Green Chemistry”, o termo mais utilizado atualmente, foi
37
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
sendo estes:
32].
produto químico deve utilizar e gerar substâncias que possuam pouca ou nenhuma
desenvolvidos de tal modo que realizem a função desejada e ao mesmo tempo não
agentes de separação, secantes e entre outros) precisa, sempre que possível, tornar-se
precisa ser reconhecida pelos seus impactos ambientais e econômicos e deve ser
38
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
químicos) deve ser minimizada ou, se possível, evitada, porque estas etapas requerem
9. Catálise - reagentes catalíticos (tão seletivos quanto possível) são melhores que
12. Prevenção de Acidentes - as substâncias, bem como a maneira pela qual uma
incêndios [31-32].
Cada vez que conseguimos cumprir com alguns dos quesitos da Química Limpa,
estamos caminhando para uma utilização mais consciente dos nossos recursos naturais e
39
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
picos e da média das larguras de suas respectivas bases, ou seja, para a medida da
largura da base toma-se sempre à distância entre as tangentes traçadas nas laterais do
(t R2 - t R1)
Rs = 2
(wb2 + wb1)
40
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
altura do pico; e o fator de alargamento, TF, é calculado a 5,0% de sua altura (Fig.13)
[6].
alargamento [6].
b
As =
a
(a + b)
TF =
2a
Picos com uma baixa simetria podem resultar em (a) análises quantitativas
imprecisas; (b) menor resolução e bandas menores não detectadas na cauda de outro
corresponde à máxima quantidade a ser injetada. Este fator é determinado pela razão das
quantidades das suas moléculas que ficam retidas na fase estacionaria (nS) ou
41
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
razão dos tempos que as moléculas ficam na fase estacionária e na fase móvel [6]. Esse
nS (t R - t M)
k= =
nM tM
C FE
K=C
FM
sistema cromatográfico são: (a) forças intermoleculares entre o soluto e as fases móvel e
equivalente a uma etapa de equilíbrio entre as duas fases, quanto maior o número de
pratos mais equilíbrios existirão, maior será a eficiência e, portanto melhor a separação
42
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
2
tR
N = 16
w
O número de pratos obtidos pode ser afetado por vários fatores, incluindo as
comprimento da coluna, fato que torna difícil uma comparação do número de pratos
entre diferentes colunas. Por isso, que a avaliação comparativa entre colunas é feita
L
H=
N
boa, pode-se compensar a má eficiência, obtendo uma boa resolução. O ideal é uma boa
43
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
Por exemplo, em um experimento que possui dois fatores e dois níveis pode ser
possíveis nos fornecerão quatro ensaios diferentes (Tab. 03). No caso deste tipo de
interação entre k1k2 que permitirá otimizar cada variável e calcular a interação entre
elas, ou seja, neste tipo de experimento pode-se avaliar o efeito do concomitante o que
[24].
Ensaio k1 k2
1 - -
2 + -
3 - +
4 + +
realização de oito ensaios (Tab. 04). No caso de um planejamento fatorial 23, além dos
efeitos principais k1, k2 e k3 tem-se os efeitos de interação de dois fatores k1k2, k1k3 e
44
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
Ensaio k1 k2 k3
1 - - -
2 + - -
3 - + -
4 + + -
5 - - +
6 + - +
7 - + +
8 + + +
de alta eficiência que utilizam solventes orgânicos como fase móvel e as características
ambientes micelares pode dar origem a métodos cromatográficos que utilizem reagentes
de baixa toxicidade como fase móvel. Neste trabalho específico, será priorizado o
durante a análise química, pelos constituintes da própria fase móvel, o que poderá
métodos analíticos limpos explorando a CLAE. Deve ser enfatizado que a otimização da
45
Capítulo 3 – Objetivos
3. Objetivos
robusto, simples, apresentando alta freqüência analítica e que possa ser classificado
como limpo, visto que os reagentes utilizados apresentam baixo grau de toxicidade.
e similares.
46
Capítulo 4 – Materiais e Métodos
4. Materiais e Métodos
4.1.1.Reagentes
desionizada foi utilizada no preparo das soluções aquosas. Como fase móvel foram
butílico), C6H14 (hexano), Triton X-100 (polioxietileno (9-10) p-tercotil fenol), CTAB
47
Capítulo 4 – Materiais e Métodos
4.1.2.Soluções
concentração maior, pois estas são provenientes da amostra padrão, o que possibilitou
uma concentração maior além disso estas duas vitaminas são bastante viscosas. Já as
utilizado foi o mesmo para todas as vitaminas o que fez com que estas apresentassem
abaixo de 0º C.
100,0 mL de água desionizada, ou seja, para uma fase móvel contendo 12,0% (v/v) de
álcool butílico, 2,20% (m/v) de SDS, 0,02 mol/L de Na2HPO4 e pH 7,00 foi preparada
homogeneizada foi realizado o ajuste do pH para 7,00 com NaOH ou HCl mantendo
sempre o sistema sob agitação. Na seqüência o volume foi completado para 100,0 mL
48
Capítulo 4 – Materiais e Métodos
móveis utilizadas neste trabalho foram preparadas seguindo-se estas mesmas etapas;
(m/v) e SDS (dodecil sulfato de sódio) 0,50 % (m/v) foram preparadas pela dissolução
sulfanato de sódio) 0,50 % (v/v) e Triton X-100 (polioxietileno (9-10) p-tercotil fenol)
0,50 % (v/v) foram preparadas pela dissolução de 0,50 mL dos surfactantes em 100,0
mL de água desionizada.
4.2.1.Espectrofotômetro
4.2.2.Cromatógrafo
contendo:
49
Capítulo 4 – Materiais e Métodos
bomba de pistão reciprocante com três vias, modelo 240 série 00752;
injetor automático Varian (Auto Sample ProStar 410) com alça de amostragem
de 100 μL;
em 230, 280 e 300 nm para todas as vitaminas. A aquisição de dados foi feita utilizando
Figura 14. Cromatógrafo líquido de alta eficiência: (a) reservatório da fase móvel, (b) bomba de alta
pressão, (c) válvula de injeção, (d) coluna cromatográfica, (e) detector e (f) microcomputador. (Fonte:
[23]).
Química Analítica.
50
Capítulo 4 – Materiais e Métodos
4.3. Métodos
para ser utilizado como componente da fase móvel através da realização de espectros na
surfactante não iônico, CTAB - surfactante catiônico, SDBS e SDS - ambos surfactantes
aniônicos).
Diversas soluções contendo reagentes como: álcool etílico, álcool butílico, SDS,
testadas como fase móvel objetivando verificar aquelas que poderiam apresentar maior
sistemáticos pudessem ser planejados. Deve ser ressaltado que nesta fase parâmetros
como pH, vazão e composição das diferentes fases móveis foram investigados.
51
Capítulo 4 – Materiais e Métodos
vitaminas lipossolúveis*.
1 - - -
2 + - -
3 - + -
4 + + -
5 - - +
6 + - +
7 - + +
8 + + +
*
Dados obtidos para uma concentração de Na2HPO4 de 0,02mol/L e
pH=7,00. Níveis: álcool butílico (- corresponde à solução contendo 10,0%
(v/v) e + a solução contendo 15,0% (v/v ); SDS (- corresponde a solução
contendo 1,50 % (m/v) e + a solução contendo 3,00 % (m/v); vazão (-
corresponde a vazão de 1,0 mL/min e + a vazão de 2,0 mL/min).
52
Capítulo 4 – Materiais e Métodos
que utiliza coluna cromatográfica C18, detector de arranjo de diodos com medidas em
280 nm e como fase móvel gradiente de dois solventes (solução A: acetonitrila; solução
fase móvel sendo constituída por 30,0% (v/v) de álcool metílico e 70,0% (v/v) de
com medidas em 285 nm, fase móvel álcool metílico e acetonitrila (95:5 (v/v)),
associado a uma vazão de 2,0 mL/min, com um volume de injeção de amostra de 20,0
diodos com medidas em 292 e 325 nm, fase móvel álcool metílico, associada a uma
diodos com medidas em 245, fase móvel constituída por álcool metílico e álcool etílico
(85:15 v/v) com 0,10% de trietilamina associado a uma vazão de 1,0 mL/min, com um
53
Capítulo 4 – Materiais e Métodos
Uma outra forma de análise consiste na utilização de uma coluna Nucleosil C18,
(50:45:5 v/v/v), associada a uma vazão de 0,7 mL/min e com um volume de injeção de
4.4. Aplicações
de alimentos
pesagem.
adicionadas 3,00 g de ácido ascórbico, para evitar a oxidação das vitaminas, e 65,0 mL
(KOH) 77,0% (m/v). As amostras foram mantidas sob agitação durante 60,0 min, sendo
54
Capítulo 4 – Materiais e Métodos
(C6H14) para extrair as vitaminas, sendo este processo repetido por duas vezes. Após, a
fase hexânica foi colocada em funil de separação juntamente com 25,0 mL de água
desionizada, sendo repetido este procedimento por duas vezes. Na seqüência, a fase
dissolvido em 5,00 mL de álcool etílico. Esta solução final foi filtrada através de
cromatógrafo [37]. Todas as fases necessárias para extrair as vitaminas podem ser
Figura 15. Esquema da extração das vitaminas lipossolúveis das amostras de alimentos e complexos
55
Capítulo 4 – Materiais e Métodos
77,0% (m/v). A amostra foi mantida em agitação durante 60,0 min, sendo que o
separação juntamente com 5,00 mL de hexano (C6H14) para extrair as vitaminas, sendo
este processo repetido por duas vezes. Após, em um funil de separação foi colocado à
desionizada, sendo repetido este processo por duas vezes. A fase hexânica foi evaporada
álcool etílico conforme (Fig. 15). Esta solução final foi filtrada através de membrana
foi dissolvido em 25,0 mL de álcool etílico. Após esta solução foi condicionada a
fosse retirado da solução. Esta solução final foi filtrada utilizando-se membrana
56
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
5. Resultados e Discussão
vitaminas lipossolúveis (A, D3, E, K1) mostram que estas moléculas absorvem
difícil proceder à determinação destes compostos sem uma separação prévia devido à
absorção na região de 325; 265; 290 e 250 nm, respectivamente e espectro na forma de
2 ,5
2 ,0
Absorbância
1 ,5
1 ,0 (b )
(a )
0 ,5 (d )
0 ,0 (c )
200 250 300 350 400
λ (n m )
Figura 16. Espectro eletrônico das vitaminas lipossolúveis em solução de álcool etílico. (a) Vitamina
A, (b) Vitamina D3, (c) Vitamina E, (d) Vitamina K1; (C = 5,0 mg/L).
57
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
análise das vitaminas está sujeita a uma série de erros, pouco freqüentes em outras
elevadas e alto poder de oxi-redução, fatores que devem ser considerados pelos métodos
químicas, pois promove a separação das vitaminas antes da etapa de detecção evitando
Após a escolha da técnica analítica que seria utilizada, foram realizadas medidas
dos espectros eletromagnéticos na região do ultravioleta (Fig. 17) dos surfactantes, pois
surfactante SDS (surfactante aniônico), foi escolhido como agente modificador da fase
ultravioleta.
58
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
4 ,0
3 ,5
3 ,0
(a )
2 ,5
Absorbância
2 ,0
(b )
1 ,5
(c )
1 ,0
0 ,5
(d )
0 ,0
200 250 300 350 400
λ (n m )
Figura 17. Espectro eletrônico da mistura dos surfactantes: (a) SDBS, (b) Triton X-100 (C=0,5%
(v/v)), (c) CTAB, (d) SDS (C = 0,5% (m/v)).
baixa afinidade que vitaminas apresentaram pela fase móvel, fato que promoveu a
eluição de apenas parte das vitaminas em estudo, não promovendo a separação das
59
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
Figura 18. Efeito da utilização de soluções aquosas do surfactante SDS na separação das vitaminas
lipossolúveis. Dados obtidos para concentrações das vitaminas A, D3, E, K1 de 40,0; 11,0; 60,0 e 10,0
mg/L, respectivamente. Volume de solução padrão injetado de 20,0 μL com fase móvel contendo SDS
nas concentrações de 0,10; 0,20 e 1,00% (m/v), sob vazão de 1,0 mL/min e pH 7,00 .
separação das vitaminas, soluções de álcool etílico foram testadas como fase móvel
utilizadas como fase móvel soluções aquosas contendo 10,0; 20,0 e 30,0% (v/v) de
álcool etílico, sem a presença de surfactante, foi verificado que apenas parte das
vitaminas apresentaram afinidade pela fase móvel, sendo eluidas rapidamente da coluna
cromatográfica, enquanto que a maior parte das vitaminas não podiam ser eluidas
quando da utilização destas fases móveis devido à baixa afinidade pelo solvente e alta
afinidade pela fase estacionária (Fig. 19), não possibilitando a separação conjunta das
cromatográficas.
60
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
Figura 19. Efeito da utilização de soluções aquosas de álcool etílico na separação das vitaminas
lipossolúveis. Dados obtidos para concentrações das vitaminas A, D3, E, K1 de 40,0; 11,0; 60,0 e 10,0
mg/L, respectivamente. Volume de solução padrão injetado de 20,0 μL com fase móvel contendo álcool
etílico nas concentrações de 10,0; 20,0 e 30,0% (v/v), sob vazão de 0,8 mL/min e pH 7,00 .
Com o objetivo de ajustar a polaridade da fase móvel para que esta apresentasse
afinidade média para todas as vitaminas permitindo que houvesse interação efetiva e
cromatográfica adequada para fins analíticos, foi utilizado como fase móvel uma
solução aquosa contendo álcool etílico 20,0 % (v/v) com percentagens variadas de SDS.
Embora possa ser verificada uma melhora na interação das vitaminas com as
fases móvel e estacionária (Fig. 20), fato evidenciado pelo perfil dos picos
cromatográficos, os resultados obtidos nesta nova condição não podem ser considerados
satisfatórios, pois apenas parte das vitaminas foram eluidas da coluna cromatográfica.
Contudo, este experimento preliminar (Fig. 20) indica claramente que a concentração do
cromatográficas que permitissem a utilização dos dados para fins analíticos, devido à
61
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
rápida coeluição de apenas parte dos compostos, devido ainda, a deficiente afinidade
Figura 20. Efeito da concentração do surfactante SDS na separação das vitaminas lipossolúveis.
Dados obtidos para concentrações das vitaminas A, D3, E, K1 de 40,0; 11,0; 60,0 e 10,0 mg/L,
respectivamente. Volume de solução padrão injetado de 20,0 μL com fase móvel contendo álcool etílico
20,0% (v/v), SDS nas concentrações de 0,01; 0,02; 0,20; 0,50 e 1,00% (m/v), sob vazão 0,70 mL/min, pH
7,00.
teórica para explicar os dados obtidos e obter uma solução para este problema.
cromatográfica estaria relacionada a este fator, pois o surfactante pode ser adsorvido
pela fase estacionária (C18 – baixa polaridade) através de interação com a sua cauda
lipofílica, deixando exposto para interação com as vitaminas a sua cabeça polar, que
apresenta baixa afinidade por estas. Idealmente a escolha de um surfactante não iônico
(Fig. 17), impedindo o monitoramento das vitaminas nesta região. Como alternativa
62
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
tampão. Assim, foi adicionado ao meio um sal de fosfato e a fase móvel passou a ser
constituída por uma solução aquosa contendo álcool etílico 20,0% (v/v), SDS 1,0%
(m/v) e Na2HPO4 a 0,10 mol/L em diferentes valores de pH (4,00; 5,00; 6,00; 7,00;
8,00).
indicando uma provável melhora na separação das vitaminas, os picos não apresentam
uma boa simetria e as resoluções cromatográficas são baixas, não apresentando melhora
com a variação de pH. Sob esta nova condição novamente apenas parte das vitaminas
fase móvel, pois a maior parte das vitaminas apresentou uma afinidade maior pela fase
Figura 21. Efeito da composição da fase móvel na separação das vitaminas lipossolúveis. Dados
obtidos para concentrações das vitaminas A, D3, E, K1 de 40,0; 11,0; 60,0 e 10,0 mg/L, respectivamente.
Volume de solução padrão injetado de 20,0 μL com fase móvel contendo álcool etílico 20,0% (v/v), SDS
1,0% (m/v), Na2HPO4 0,10 mol/L sob vazão 0,70 mL/min em diferentes valores de pH (4,00; 5,00; 6,00;
7,00 e 8,00)
63
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
das vitaminas não são eluidas da coluna cromatográfica (Fig. 22), evidenciando a
0 ,0 2 5
0 ,0 2 0
Absorbância
0 ,0 1 5
0 ,0 1 0
0 ,0 0 5
0 ,0 0 0
r
do
ca
2
if i
od
3
M
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
T e m p o (m in )
Figura 22. Efeito da adição de modificadores químicos à fase móvel na separação das vitaminas
lipossolúveis. 1- Na2HPO4 0,1% (m/v); 2- N(CH2CH2OH)3 0,1% (v/v); 3-NH4Cl 0,1% (m/v). Dados
obtidos para concentração das vitaminas A, D3, E, K1 de 40,0; 11,0; 60,0 e 10,0 mg/L, respectivamente.
Volume de solução padrão injetado de 20,0μL com fase móvel contendo álcool etílico 20,0% (v/v), SDS
1,0% (m/v) sob vazão 0,70 mL/min em pH 7,00.
cromatografia convencional pode ser creditada à alta viscosidade da fase móvel que
estacionária, o que colabora para diminuir a interação das vitaminas entre as fases,
fazendo com que a resolução cromatográfica seja baixa. Assim, tanto a resolução como
64
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
[4].
possibilidade de usar vazões mais altas da fase móvel devido à diminuição na pressão
coluna envolve dois parâmetros básicos da equação mestra de van Deemter, o número
satisfatórios (Fig. 23), embora possa ser verificada uma tendência no aumento do tempo
de retenção, indicando que os analitos interagiram de forma mais efetiva com a fase
estacionária e a fase móvel, podendo este efeito ser interpretado como uma maior
difusão das vitaminas para estas fases, estando de acordo com a teoria cromatográfica.
65
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
Figura 23. Efeito da concentração de álcool etílico na separação das vitaminas lipossolúveis na
temperatura de 30,0 oC. Dados obtidos para concentração das vitaminas A, D3, E, K1 de 40,0; 11,0;
60,0 e 10,0 mg/L, respectivamente. Volume de solução padrão de 20,0μL com fase móvel contendo SDS
1,0% (m/v) e N(CH2CH2OH)3 0,01 %(v/v) sob vazão 0,30 mL/min e pH de 7,00.
Devido à alta viscosidade que o álcool etílico possui que é de 1,08 [6] a
concentração máxima utilizada deste reagente foi de 30,0 % (v/v), pois quanto mais
teóricos [25]. Mesmo com o aumento da concentração de álcool etílico não foi obtida
separação cromatográfica que pudesse ser utilizada para determinação quantitativa das
lipossolúveis empregando fase móvel que tivesse álcool etílico como modificador
SDS na separação cromatográfica, enquanto que o álcool etílico não foi muito efetivo
66
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
etílico por outro modificador químico orgânico que também apresentasse baixa
toxicidade, mas que pudesse contribuir de forma efetiva para melhora da resolução.
butílico, pois apresenta uma polaridade menor quando comparado com o álcool etílico,
butílico apresenta uma viscosidade de 2,54 [6] que é considerada relativamente alta para
ser utilizado como modificador químico orgânico na análise cromatográfica, por isso foi
utilizada uma percentagem menor deste modificador a fase móvel para que o álcool
Novas fases móveis foram preparadas, desta vez com a presença de álcool
amônio). Os estudos foram iniciados com o Na2HPO4, pois quando fosse necessária a
correção do pH da fase móvel, este atuaria como uma solução tampão. Assim, a
composição da fase móvel foi constituída por solução aquosa contendo álcool butílico
12,0% (v/v), SDS 2,20% (m/v) e 0,02 mol/L de Na2HPO4 em pH 7,00 associada a uma
Pode-se verificar que com esta fase móvel e com o controle da temperatura
aumento no tempo de retenção das vitaminas, o que indica maior interação destas com a
fase móvel. Embora a resolução cromatográfica ainda não seja a ideal para algumas
vitaminas (Fig. 24), é possível verificar que com otimização destes parâmetros
estes reagentes na composição da fase móvel. Ainda, é possível verificar que a vazão é
67
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
uma variável importante devido à excessiva distância entre algumas das vitaminas (Fig.
24) o que pode ser verificado quando a vazão foi aumentada ocorreu a eluição das
0 ,2 0
A b s o rb â n c ia
0 ,1 5
E
0 ,1 0
A
0 ,0 5
A
D3
0 ,0 0
)
in
0 ,5
m
D3
L/
K1
(m
ão
1 ,3
az
V
0 10 20 30 40 50 60 70
T e m p o (m in )
Figura 24. Efeito da vazão e da presença de álcool butílico na separação das vitaminas lipossolúveis.
Dados obtidos para concentrações das vitaminas A, D3, E, K1 de 40,0; 11,0; 60,0 e 10,0 mg/L,
respectivamente. Volume da solução padrão de 40,0μL e fase móvel contendo álcool butilíco 12,0%
(v/v), SDS 2,20% (m/v) e Na2HPO4 0,02mol/L em pH 7,00 e T 30ºC.
Considerando-se que foi encontrada uma composição da fase móvel que indica
de uma fase móvel contendo álcool butílico 12,0% (v/v), SDS 2,20% (m/v) e 0,02mol/L
68
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
Através dos dados obtidos com este experimento (Fig. 25), pode-se verificar que
0 ,3 5
0 ,3 0
0 ,2 5
Absorbância
0 ,2 0
0 ,1 5
0 ,1 0
0 ,0 5
0 ,0 0
1
2
3
4
io
sa
5
En
6
7
8
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
T e m p o (m in )
Com relação à concentração do álcool butílico na fase móvel foi verificado que a
com resolução adequada para fins quantitativos foi de 15,0 % (v/v) (Tab. 06). Para
valores de concentração de álcool butílico menores que 15,0% (v/v) foi verificado
alargamento dos picos e maior tempo de análise, sendo este efeito mais acentuado
69
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
deste álcool na fase aquosa. A quantidade mínima de SDS para se conseguir uma
solução homogênea contendo 15,0% (v/v) de álcool butílico é de 1,50% (m/v). O SDS
micelas no meio e à modificação da fase estacionária, pois parte do SDS é adsorvida nos
mesmo nos casos em que a concentração de álcool butílico é inferior a 15,0% (v/v).
Assim, a concentração de SDS foi fixada em 3,00% (m/v) como melhor compromisso
pois influencia tanto no tempo de análise quanto na resolução cromatográfica (Fig. 25,
Tab. 06). Para valores de vazão inferiores a 1,0 mL/min associado a baixas
concentrações de álcool butílico e SDS o tempo de análise pode ser superior a 90,0
minutos, fator que contribui para o alargamento dos picos. Para vazões superiores a 1,0
cromatográfica (Fig. 25, Tab. 06), sendo que os melhores resultados foram obtidos para
vazão de 2,0 mL/min. Desta forma, a vazão foi fixada em 2,0 mL/min em função do
cromatográfica.
70
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
1 10,03 3,335 -
5 10,96 2,548 -
planejamento fatorial (Tab. 05) são as que fornecem a melhor relação custo/benefício
para a determinação de vitaminas lipossolúveis (álcool butílico 15,0% (v/v), SDS 3,00
% (m/v) e vazão de 2,0 mL/min), pois os dados obtidos sob esta condição apresentaram
aproximadamente 25,0 min (Fig. 26), com tempos de retenção de 4,00; 9,60; 13,00 e
71
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
0 ,4 0
0 ,3 5
0 ,3 0
V ita m in a A
V ita m in a E
Absorbância
0 ,2 5
0 ,2 0
0 ,1 5
0 ,1 0 V ita m in a D 3
V ita m in a K 1
0 ,0 5
0 ,0 0
0 5 10 15 20 25
T e m p o (m in )
Figura 26. Cromatograma de uma solução padrão contendo as vitaminas D3, A, E, K1. Nas
concentrações de 11,0; 40,0; 60,0 e 10,0 mg/L, respectivamente para D3, A, E e K1. Dados obtidos para
injeção de 40,0μL da solução padrão, vazão 2,0 mL/min, pH 7,00, álcool butílico 15,0%(v/v), SDS
3,00%(m/v), 0,02 mol/L Na2HPO4 e temperatura de 30,0° C.
Para certificação das condições ótimas também foi realizado experimento para
na separação cromatográfica ocorreu (Fig. 27). Deve-se enfatizar que, como esperado, o
ser ressaltado que a temperatura não pode ser aumentada indefinidamente em virtude da
de operação é de 120°C e para fases quimicamente ligadas esta não deve exceder os
80°C [6]. Para temperaturas inferiores a 25,0° C ocorreu um aumento da pressão que
72
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
0 ,6
0 ,5
Absorbância
0 ,4
0 ,3
0 ,2
0 ,1
0 ,0
25
30
)
ºC
35
a(
tu r
40
e ra
mp
45
Te
50
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
T e m p o ( m in )
Figura 27. Efeito do controle de temperatura na separação das vitaminas lipossolúveis D3, A, E.
Nas concentrações de 30,0; 80,0 e 60,0 mg/L, respectivamente para D3, A, E. Dados obtidos para injeção
de 40,0μL da solução padrão, vazão 2,0 mL/min, pH 7,00, álcool butílico 15,0%(v/v), SDS 3,00%(m/v),
0,02 mol/L Na2HPO4 e T de 25,0°C a 50,0 º C.
cromatográfico convencional
C18, detector de arranjo de diodos com aquisição dos dados em 280 nm e fase móvel
metílico) e gradiente da fase móvel iniciando-se com 50,0 % (v/v) de álcool metílico e
50,0 % (v/v) de acetonitrila e chegando em 25,0 min com 30,0% (v/v) de álcool
metílico e 70,0% (v/v) de acetonitrila sempre com vazão constante de 1,30 mL/min
73
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
5.3. Aplicações
(v/v), SDS 3,00% (m/v), 0,02 mol/L de Na2HPO4, pH 7,00, associada a uma vazão de
cromatográficas obtidas foram de 10,6 (entre os picos das vitaminas D3 e A), 5,0 (entre
os picos das vitaminas A e E) e de 8,0 (entre os picos das vitaminas E e K1) (Tab. 06).
74
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
Ainda sob estas condições foram obtidos os melhores dados com relação ao menor
estudo foram lineares na faixa de concentração de interesse (1,00 – 60,0 mg/L para as
vitaminas A, E e K1 e de 1,00 - 40,0 mg/L para a vitamina D3) quando foram injetados
6
2 ,5 x 1 0
6
2 ,0 x 1 0
6
1 ,5 x 1 0
Area
6
1 ,0 x 1 0
5
5 ,0 x 1 0
0 ,0
0 10 20 30 40 50 60
C o n c e n tr a ç ã o ( m g /L )
Figura 29. Curva Analítica para a Vitamina A pelo método proposto. Nas concentrações de 60,0;
75
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
6
1 ,4 x 1 0
6
1 ,2 x 1 0
6
1 ,0 x 1 0
5
8 ,0 x 1 0
Area
5
6 ,0 x 1 0
5
4 ,0 x 1 0
5
2 ,0 x 1 0
0 ,0
0 10 20 30 40
C o n c e n tr a ç ã o ( m g /L )
Figura 30. Curva Analítica para a Vitamina D3 pelo método proposto. Nas concentrações de 40,0;
6
2 ,5 x 1 0
6
2 ,0 x 1 0
6
1 ,5 x 1 0
Area
6
1 ,0 x 1 0
5
5 ,0 x 1 0
0 ,0
0 10 20 30 40 50 60
C o n c e n tr a ç ã o ( m g /L )
Figura 31. Curva Analítica para a Vitamina E pelo método proposto. Nas concentrações de 60,0;
76
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
6
5x10
6
4x10
6
3x10
Area
6
2x10
6
1x10
0
0 10 20 30 40 50 60
C o n c e n tr a ç ã o ( m g /L )
Figura 32. Curva Analítica para a Vitamina K1 pelo método proposto. Nas concentrações de 60,0;
Deve ser ressaltado que os limites de detecção e quantificação (Tab. 07) foram
Limite de
Limite de
77
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
nas características analíticas dos dois métodos analíticos, sendo a substituição dos
1,00 – 40,0 mg/L para a vitamina D3) com diferença apenas no volume de amostra
6
9x10
6
8x10
6
7x10
6
6x10
6
5x10
Area
6
4x10
6
3x10
6
2x10
6
1x10
0
0 10 20 30 40 50 60
C o n c e n tra ç ã o (m g /L )
Figura 33. Curva Analítica para a Vitamina A pelo método convencional. Nas concentrações de 60,0;
78
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
6
2 ,5 x 1 0
6
2 ,0 x 1 0
6
1 ,5 x 1 0
Area
6
1 ,0 x 1 0
5
5 ,0 x 1 0
0 ,0
0 10 20 30 40
C o n c e n tr a ç ã o ( m g /L )
Figura 34. Curva Analítica para a Vitamina D3 pelo método convencional. Nas concentrações de
6
7x10
6
6x10
6
5x10
6
4x10
Area
6
3x10
6
2x10
6
1x10
0
0 10 20 30 40 50 60
C o n c e n t r a ç ã o ( m g /L )
Figura 35. Curva Analítica para a Vitamina E pelo método convencional. Nas concentrações de
79
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
6
9x10
6
8x10
6
7x10
6
6x10
6
5x10
Area
6
4x10
6
3x10
6
2x10
6
1x10
0
0 10 20 30 40 50 60
C o n c e n t r a ç ã o ( m g /L )
Figura 36. Curva analítica para Vitamina K1 pelo método convencional. Nas concentrações de 60,0;
Limite de
Limite de
80
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
e do método convencional
utilizar reagentes de baixa toxicidade como fase móvel estando de acordo com a
Química Limpa.
L. D = limite de detecção
L. Q = limite de quantificação
81
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
Alimentos
Quando o método proposto foi aplicado para determinação das vitaminas A, D3,
mg/g de vitamina E. Estes valores são concordantes com aqueles obtidos pelo método
convencional que apresentou concentrações de 0,18 mg/g e 0,74 mg/g das vitaminas A e
amostra de óleo de soja. Deve ser enfatizado que por ambos os métodos as vitaminas
(Tab. 10) e também através de comparação dos resultados com aqueles obtidos quando
82
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
Amostras Adicionado A D3 E K1 A D3 E K1
Leite 20,0 85,00 ----- 95,00 ----- 83,00 ----- 82,00 -----
fortificado
Leite em 15,0 ----- 93,00 ----- ----- ----- 85,00 ----- -----
pó
Óleo 20,0 ----- ----- 88,00 ----- ----- ----- 81,00 -----
Repolho 20,0 ----- ----- ----- 89,00 ----- ----- ----- 92,00
encontradas nas folhas externas quando comparadas às folhas mais internas. As cascas
das frutas e dos vegetais possuem maiores concentrações da vitamina do que a polpa.
Fatores como a estação do ano, o clima, local geográfico e a fertilização do solo afetam
uma tarefa difícil e laboriosa devido às baixas concentrações destas nos alimentos. A
83
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
[39].
Complexos Vitamínicos
analisadas apenas pelo método proposto, pois as concentrações esperadas das vitaminas
preparação possuía como excipiente óleo, que é o caso das vitaminas D3 e E. Para as
vitaminas A e K1 que possuem como excipiente uma solução de micelas mistas que se
dissolução da preparação farmacêutica foi feita apenas em álcool etílico (Fig. 37) e,
neste caso, a excessiva preparação da amostra adicionava reativos que contribuem para
84
Capítulo 5 – Resultados e Discussão
0 ,2 5
0 ,2 0
Absorbância
D3 0 ,1 5
K1
0 ,1 0
0 ,0 5
K1
E
0 ,0 0
A
a
ti c
A
êu
E
ac
a rm
2
.F
ep
Pr
0 5 10 15 20 25
T e m p o ( m in )
Deve ser ressaltado que os dados da (Fig. 37) referem-se a quatro amostras de
preparações farmacêuticas cada uma contendo apenas uma das vitaminas que foram
juntadas antes da etapa de extração. Foram obtidos concentrações de 5,70; 3,40; 3,00 e
obtidas foram de 4,60; 1,23 e 9,0 mg/mL para as vitaminas A, E, K1, respectivamente
Estes valores estão de acordo com os descritos pelos fabricantes que foram de 6,00
mg/mL para a vitamina D3; 5,00 mg/mL para a vitamina A; 4,00 mg/L para a vitamina
85
Capítulo 6 – Conclusões
6. Conclusões
lipossolúveis utiliza como fase móvel álcool butílico 15,0 % (v/v), SDS 3,00 % (m/v),
0,02 mol/L Na2HPO4, pH 7,00 em água desionizada, associada a uma vazão de 2,0
mL/min e a uma temperatura de 30,0°C como fase estacionária uma coluna C18. O
baixa toxicidade.
alimentos sem adição de padrão, fica evidente que o método proposto pode ser utilizado
Finalmente, deve ser enfatizado que o método analítico necessita ser utilizado
para determinação de vitaminas em outras amostras. Neste trabalho esta tarefa não foi
realizada porque o objetivo principal era desenvolver método analítico limpo para
86
Capítulo 6 – Conclusões
87
Capítulo 7 – Referências
7. Referências
[1] BOBBIO, F. O.; BOBBIO, P. A. Introdução à química dos alimentos. 2ª Ed., São
Ed., São Paulo-SP, Editora Livraria Nobel, 1983. p. 17, 25, 30-31, 50, 64. 86-87.
[4] MOMENI, Z.; KHORASANI, J.H. Separation and determination of Vitamins E and
analysis, Deustch, M. J.; 19 th ed., Washington: D.C., cap. 45, p.1-79, 1998.
367.
[7] FENNEMA, O. R.; Food Chemisttry. Publishing Marcel Dekker, Nova Yorque -
88
Capítulo 7 – Referências
2005.
[16] ZAMARRENO, M.M. D.; MAZA, I. G.; PEREZ, A. S.; MARTINEZ, R. C.;
257, 2002.
p. 581–582, 1999.
89
Capítulo 7 – Referências
[24] Ribeiro, R. L. V. Uso de etanol como modificador orgânico da fase móvel para
90
Capítulo 7 – Referências
2007.
[28] ROMERO, J.E.; PEIRO, M.E.C.; PONS, L. M.; AGUSTI, M.G. Micellar liquid
87-92, 2001.
inserção nas atividades de ensino e pesquisa. Quím. Nova, v. 26, nº.1, p.123-
124, 2003.
[34] MENDOZA, B. R.; PONS, S. M.; BARGALLÓ, A.I. C.; SABATER, M.C. L.
91
Capítulo 7 – Referências
[35] PO, E S. M.; HO, J. W.; GONG, B. Y., Simultaneous chromatographic analysis of
101, 1997.
[37] ZAMARRENO, M.M.D.; PEREZ, A. S.; RODRIGUEZ, M. S.; PEREZ, M.C. G.;
New analytical aspects of vitamin D in foods. Food Chem., v. 57, No. 1, p. 95,
1996.
92