UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

ESTUDO CLÍNICO E ETIOLÓGICO DA DIARREIA

EM POTROS

GIOVANE OLIVO

Botucatu, SP
Julho 2013
 i

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

ESTUDO CLÍNICO E ETIOLÓGICO DA DIARREIA

EM POTROS

GIOVANE OLIVO

Dissertação apresentada junto ao

Programa de Pós-graduação em
Medicina Veterinária para obtenção do
título de Mestre.

Orientador: Prof. Adj. Alexandre

Secorun Borges.

Botucatu, SP
Julho 2013
 ii

Nome do autor: Giovane Olivo

Título: Estudo clínico e etiológico da diarreia em potros

COMPOSIÇÃO DA BANCA EXAMINADORA

Prof. Adj. Alexandre Secorun Borges

Presidente e orientador
Departamento de Clínica Veterinária
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP – Botucatu
_______________________________________________________________

Prof. Adj. Marcio Garcia Ribeiro

Membro
Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública
FMVZ – UNESP – Botucatu, SP.
_______________________________________________________________

Profa. Dra. Carla Bargi Belli

Membro
Departamento de Clínica Médica
FMVZ – USP – São Paulo, SP.
_______________________________________________________________

Data da Defesa: 01 de julho de 2013.

 iii

Dedicatória

Aos meus pais, Nerio Olivo e Maria Adriana da Silva, pelo amor e
compreensão, por me apoiarem e orientarem em todas as decisões e caminhos
tomados por mim.

Ao meu irmão Leandro Olivo, por toda amizade e bons momentos vividos ao
seu lado.

“In Memorian”,

Ao meu avô e grande amigo Angelo Olivo, por me incentivar na profissão de

Médico Veterinário e por fazer de minha infância algo bom em se recordar.
 iv

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, que sempre me deu forças, levando-me a

crer em dias melhores.

Em especial:

 Ao Professor Dr. Alexandre Secorun Borges, pela amizade e orientações

durante a residência e pela oportunidade concedida para realizar o curso de
mestrado sob sua orientação;

 Ao Professor Dr. Marcio Garcia Ribeiro, pela “co-orientação”, amizade e

por nunca medir esforços para que este projeto fosse realizado;

 Ao então Professor Dr. José Paes de Oliveira Filho (ex-integrante da

salinha), pela convivência e colaboração técnica de grande importância ao
projeto;

 Aos meus amigos da “salinha”: Aline Angela, Cesar Irineudo Araújo, Diego
José Zanzarini Delfiol, Didier Cagnini, Juliana Almeida, Mariana Isa Poci
Palumbo e Peres Ramos Badial, pela amizade, pela convivência salutar e
por me ajudarem durante a pós-graduação;

 Aos meus amigos, Carlos Ramires Neto, Dietrich Pizzigatti, Emiliano

Cisneros, Leandro Américo e Rodrigo Cavalcanti por todo apoio e ajuda
durante a residência e pós-graduação;

 Aos meus amigos e funcionários da Clínica de Grandes Animais, Cesar

Leme e Marco Antônio Simão pela ajuda durante a residência e pelos
momentos de prosa.
 v

Agradeço com simples palavras aos que tornaram este trabalho possível de ser
realizado.

 Aos Médicos Veterinários que permitiram a nossa pesquisa e coleta de

dados nos haras, sendo essencial para que este trabalho se tornasse
realidade;
 Ao Prof. Dr. Paulo Eduardo Brandão e equipe, do Departamento de
Medicina Veterinária Preventiva, Universidade de São Paulo, pela
realização do diagnóstico de Coronavírus;
 Ao Prof. Dr. Fábio Gregory e equipe, do Departamento de Medicina
Veterinária Preventiva, Universidade de São Paulo, pela realização do
diagnóstico de Rotavírus;
 Ao prof. Dr. Shinji Takay e equipe, do Departamento de Higiene Animal da
Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Kitasato, Japão,
pela realização do diagnóstico molecular do perfil de virulência dos isolados
de Rhodococcus equi;
 Ao prof. Dr. Domingos da Silva Leite e Pós-doutoranda Amanda Keller
Ciqueira, do Departamento de Genética, evolução e Bioagentes da
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), realização do diagnóstico
e identificação do perfil de virulência dos isolados de Escherichia coli;
 Ao prof. Dr. Francisco Carlos Faria Lobato, pós-doutorando Rodrigo Otávio
Silveira Silva do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, pela
realização do diagnóstico e detecção de toxinas de Clostridium difficile e
Clostridium perfringens;
 Ao técnico Fernando José Paganini Listoni e a mestranda Thays Mizuki
Lucas do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública, pelo
profissionalismo ao isolarem e estocarem as linhagens bacterianas e pela
amizade e disponibilidade em elucidar qualquer dúvida apresentada;
 Ao prof. Dr. Roberto Maurício Carvalho Guedes do Departamento de Clínica
e Cirurgia Veterinárias da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG),
MG, por disponibilizar amostras positivas de Lawsonia intracellularis,
permitindo a padronização da técnica de diagnóstico molecular (PCR) e
possibilitando o desenvolvimento deste trabalho;
 A profa. Dra Andrea Micke Moreno, do Departamento de Medicina
Veterinária Preventiva e Saúde Animal, da Faculdade de São Paulo (USP),
SP, por disponibilizar amostras positivas de Lawsonia intracellularis,
permitindo a padronização da técnica de diagnóstico molecular (PCR) e
possibilitando o desenvolvimento deste trabalho;
 vi

 Ao Prof. Dr. Marcelo Vasconcelos Meireles, do Departamento de Clínica e

Cirurgia e Reprodução Animal, da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia de Araçatuba (UNESP), por disponibilizar amostras positivas de
Giardia sp., permitindo a padronização da técnica de diagnóstico molecular
(PCR) e possibilitando o desenvolvimento deste trabalho;
 Ao Prof. Dr. João Pessoa de Araújo Júnior, do Depto de Microbiologia e
Imunologia, Instituto de Biociencias, Universidade Estadual Paulista Júlio de
Mesquita Filho (Unesp), pela disponibilidade em nos atender e colaborar
com o projeto;
 Ao Dr. Flávio Medeiros Paz e Silva por estar disponível em elucidar as
dúvidas com a extração de DNA das amostras de fezes;
 A Doutoranda Érica Boarato David, do Departamento de Parasitologia do
Instituto de Biociências (Unesp, Campus de Botucatu), por sempre estar
sempre disposta a colaborar, esclarecendo as dúvidas sobre o diagnóstico
de Giardia sp.(“todo pós graduando poderia ser assim...”).

 Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico -

CNPq pelo auxílio à pesquisa (processo: 478293/2012-7) e pela
concessão da bolsa (processo: 130591/2011-4), sem a qual a
dedicação exclusiva ao projeto não seria possível.
 vii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Número de potros com (n = 56) ou sem (n = 60) diarreia, distribuídos em

três diferentes faixas etárias, provenientes de diferentes regiões do estado de São
Paulo (2011 – 2012). ...................................................................................................34

Tabela 2. Média, mediana e desvio padrão dos valores referentes ao exame físico e
tempo de evolução da diarreia em 56 potros, provenientes de diferentes regiões do
estado de São Paulo (2011 – 2012). ...........................................................................35

Tabela 3. Média, mediana e desvio padrão dos valores referentes ao exame físico dos
potros sem (n = 60) diarreia, provenientes de diferentes regiões do estado de São
Paulo (2011 – 2012). ...................................................................................................35

Tabela 4. Média, mediana e desvio padrão dos valores hematimétricos referente aos
56 potros com diarreia, provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo
(2011 – 2012). .............................................................................................................37

Tabela 5. Média e desvio padrão dos valores hemogasométricos referente aos 56

potros com diarreia, provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo. ......37

Tabela 6. Avaliação do escore fecal em 116 potros com e sem diarreia, provenientes
de diferentes regiões do estado de São Paulo (2011 – 2012). ....................................38

Tabela 7. Característica da coloração das fezes e a presença ou não da diarreia em

116 potros, provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo (2011 – 2012).
....................................................................................................................................38

Tabela 8. Característica das fezes avaliando-se a relação do odor e a presença ou

não da diarreia em 116 potros, provenientes de diferentes regiões do estado de São
Paulo (2011 – 2012). ...................................................................................................39

Tabela 9. Avaliação da frequência de defecação de 116 potros (56 com diarreia e 60

sem diarreia), provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo (2011 –
2012). ..........................................................................................................................39

Tabela 10. Detecção de enteropatógenos em amostras de fezes de potros com e ou

sem diarreia, provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo (2011 –
2012). ..........................................................................................................................40

Tabela 11. Frequência de monoinfecção e coinfecção de enteropatógenos em potros

com e sem diarreia, provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo (2011
– 2012). .......................................................................................................................40

Tabela 12. Frequência de enteropatógenos isolados em amostras de fezes diarreicas

de 56 potros distribuídos em três diferentes faixas etárias, provenientes de diferentes
regiões do estado de São Paulo (2011 – 2012)...........................................................41
 viii

Tabela 13. Frequência de enteropatógenos isolados em amostras de fezes não

diarreicas de 60 potros distribuídos em três diferentes faixas etárias, provenientes de
diferentes regiões do estado de São Paulo (2011 – 2012). .........................................41

Tabela 14. Frequência de sorotipos em isolados do gênero Salmonella em 56 potros

com diarreia, provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo (2011 –
2012). ..........................................................................................................................42

Tabela 15. Frequência de sorotipos do gênero Salmonella spp. e suas subespécies

em 60 potros sem diarreia, provenientes de diferentes regiões do estado de São
Paulo (2011 – 2012). ...................................................................................................43

Tabela 16. Detecção de enteropatógenos em monoinfecções e em coinfecções de

amostras de fezes diarreicas de 56 potros, distribuídos em três diferentes faixas
etárias, provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo (2011 – 2012)....44

Tabela 17. Detecção de enteropatógenos em monoinfecções e em coinfecções de

amostras de fezes não diarreicas de 60 potros distribuídos em três diferentes faixas
etárias, provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo (2011 – 2012)....45

Tabela 18. Identificação dos endoparasitas e o total da contagem de ovos por grama
de fezes de 20 potros* com diarreia, divididos em três faixas etárias, provenientes de
diferentes regiões do estado de São Paulo (2011 – 2012). .........................................46

Tabela 19. Identificação dos endoparasitas e o total da contagem de ovos por grama
de fezes de 25 potros* sem diarreia, divididos em três faixas etárias, provenientes de
diferentes regiões do estado de São Paulo. ................................................................47

Tabela 20. Micro-organismos, entéricos menos comuns em potros, isolados de 5

animais com diarreia, provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo
(2011 – 2012). .............................................................................................................48

Tabela 21. Micro-organismos, menos comuns em potros, isolados de 6 animais sem

diarreia, provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo (2011 – 2012). .49

Tabela 22. Frequência de mortalidade em 56 potros com diarreia e 60 sem sinais

entéricosem criatórios de diferentes regiões do estado de São Paulo (2011 – 2012). .50

Tabela 23. Relação entre o número de potros com (n = 56) e sem diarreia (n = 60),
raças acometidas e taxa de mortalidade dos animais, provenientes de diferentes
regiões do estado de São Paulo (2011 – 2012)...........................................................50

Tabela 24. Número de potros com (6) e sem (2) diarreia que vieram a óbito e os
respectivos enteropatógenos isolados, em diferentes propriedades do interior do
Estado de São Paulo (2011 – 2012). ...........................................................................51
 ix

LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

- = negativo
% = porcentagem
® = marca registrada
µg = micrograma
< = menor
> = maior
µL = microlitro
°C = graus Celsius
A = nucleotídeo adenina
afa = gene codificador de adesina fimbrial
ag 43 = antígeno 43
APEC = Escherichia coli patogênica para aves
ATP = adenosina trifosfato
BHI = caldo cérebro-coração
bpm = batimentos por minuto
C = nucleotídio citosina
cnf = fator necrosante citotóxico
DAEC = Escherichia coli de aderência difusa
DEC = Escherichia coli diarreiogênica
DNA = ácido desoxirribonucleico
EDTA = ácido etilenodiamino tetra-acético
EHEC = Escherichia coli enterohemorrágica
EIEC = Escherichia coli enteroinvasora
ELISA = Enzyme linked immunosorbment assay
EPEC = Escherichia coli enteropatogênico
ETEC = Escherichia coli enterotoxigênica
F = fatores de colonização
FC = frequência cardíaca
fimH = gene codificador da fímbria H/pili tipo I
FR = frequência respiratória
FV = fator de virulência
G = nucleotídio guanina
 x

GI, GII, GIII = variantes da papG

H = antígeno flagelar
hly = gene codificador de hemolisina
hlyA = alfa-hemolisina
iuc = gene codificador de aerobactina
g = grama
K = antígeno capsular
kDa = quilo dálton
Kb = quilo base
LEE = Locus of enterocyte effacement
LT = termolábil
mg/kg = miligramas por quilo
MILI = Motilidade, Indol e Lisina
mL = mililitros
mm = milímetros
mpm = movimentos por minuto
NaCL = cloreto de sódio
NetB = toxina necrótica B-like
O = antígeno somático
P = pili
PAI = ilha de patogenicidade
papC = subunidade C de fímbria P
papG = subunidade G de fímbria P
pb = pares de base
PCR = reação em cadeia pela polimerase
pH = potencial de hidrogênio
rpm = rotações por minuto
RTX = Repeat Toxin
sfa = gene codificador de fímbria S
SS = ágar Salmonella Shiguella
Stx = toxina de Shiga
T = nucleotídio timina
TA = temperatura de anelamento
 xi

TPC = tempo de preenchimento capilar

TT = tetrationato
TSA = ágar tríplice de soja
UV = Ultra violeta
Vero = células de linhagem do rim de macaco
VTEC/STEC = linhagens verotoxigênicas
vt = verotoxina/verocitotoxina
 xii

SUMÁRIO

RESUMO ..................................................................................................................... 1
ABSTRACT .................................................................................................................. 2
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 3
2. REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................... 5
2.1. Escherichia coli .................................................................................................. 5
2.2. Salmonella sp. ................................................................................................... 5
2.3. Clostridium difficile ............................................................................................. 7
2.4. Clostridium perfringens ...................................................................................... 8
2.5. Rhodococcus equi ............................................................................................. 9
2.6. Lawsonia intracellularis .....................................................................................10
2.7. Coronavírus ......................................................................................................12
2.8. Rotavírus ..........................................................................................................13
2.9. Cryptosporidium spp. ........................................................................................15
2.10. Giardia sp. ......................................................................................................17
2.11. Helmintos ........................................................................................................18
3. OBJETIVOS ............................................................................................................19
3.1. Geral .................................................................................................................19
3.2. Específicos .......................................................................................................20
4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................20
4.1. Seleção dos animais .........................................................................................20
4.2. Avaliação clínica dos animais ...........................................................................20
4.3. Colheita das amostras ......................................................................................21
4.4. Exames microbiológicos e detecção molecular .................................................23
4.4.1. Diagnóstico de E. coli .................................................................................23
4.4.1.1. Caracterização microbiológica .............................................................23
4.4.1.2. Detecção fenotípica de hemolisinas em E. coli no meio de ágar sangue
.........................................................................................................................23
4.4.1.3. Detecção molecular dos fatores de virulência de E. coli pela reação em
cadeia pela polimerase (PCR) ..........................................................................24
4.4.2. Diagnóstico de Salmonella spp. .................................................................25
4.4.2.1. Caracterização microbiológica .............................................................25
4.4.3. Diagnóstico de Clostridium spp. .................................................................26
4.4.3.1. Caracterização microbiológica .............................................................26
4.4.3.1.1. Detecção molecular de toxinas de C. difficile.................................26
 xiii

4.4.3.1.2. Isolamento microbiano e detecção molecular de C. perfringens ....26

4.4.4. Diagnóstico de Rhodococcus equi..............................................................27
4.4.4.1. Caracterização microbiológica de Rhodococcus equi ..........................27
4.4.4.2. Determinação de linhagens virulentas (VapA) .....................................27
4.4.2.1. Extração de DNA plasmidial.................................................................28
4.4.2.2. Reação em cadeia pela polimerase .....................................................28
4.5. Exames para identificação de Rotavírus e Coranavírus ....................................29
4.5.1. Detecção de Coronavírus ...........................................................................29
4.5.2. Detecção de Rotavírus ...............................................................................29
4.6. Diagnóstico de Lawsonia intracellularis, Cryptosporidium parvum e Giardia
duodenalis ...............................................................................................................30
4.6.1. Diagnóstico de Lawsonia intracellularis ......................................................30
4.6.2. Detecção de Protozoários ..........................................................................31
4.6.2.1. Detecção molecular de Cryptosporidium spp. ......................................31
4.6.2.2. Detecção molecular de Giardia duodenalis ..........................................31
4.6.3. Amplificação do DNA de Lawsonia intracellularis, Cryptosporidium spp. e
Giardia spp. ..........................................................................................................32
4.6.4. Eletroforese em gel de agarose ..................................................................33
4.7. Exames parasitológicos ....................................................................................33
4.8. Análise dos resultados ......................................................................................33
5. RESULTADOS ........................................................................................................34
6. Discussão................................................................................................................52
7. CONCLUSÕES .......................................................................................................62
8. REFERÊNCIAS .......................................................................................................64
ANEXO I .....................................................................................................................80
 1

OLIVO, G. Estudo clínico e etiológico da diarreia em potros. Botucatu,

2013. 98p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de
Mesquita Filho”.

RESUMO
A diarreia é um grave problema em potros até seis meses de vida, acarretando
em prejuízos na equideocultura. Sendo assim os objetivos desta pesquisa
foram realizar o estudo clínico e a identificação dos principais enteropatógenos
e fatores de virulência, responsáveis pela diarreia em potros. Foram avaliados
56 potros com diarreia (GD) e 60 sem diarreia (GC) até 90 dias de vida. Foram
realizados hemogasometria e hemograma dos animais do GD. Amostras fecais
dos potros do GD e GC foram utilizadas para a identificação dos
enteropatógenos. As principais alterações clínicas nos animais GD foram
aumento da peristalse e da frequência de defecação (100,0%) e desidratação
(67,8%). A hiperfibrinogenemia (26,8%), leucocitose (12,5%), linfocitose
(37,5%) e neutrofilia (17,8), acidose metabólica (16%) e diminuição de
bicarbonato (16%) foram os principais achados hematológicos. Ao menos um
dos enteropatógenos pesquisados foi detectado no GD (50/56) e GC (48/60).
Em 32% (16/50) das amostras positivas foi identificado um único
enteropatógeno, enquanto que dois ou mais enteropatógenos foram detectados
em 68% (34/50) das amostras. E. coli apresentou a maior frequência nos
isolamentos dos potros com diarreia (62,5%), seguida da Salmonella spp.
(25%); Strongyloides (25%); estrongilídeos (10,7%); Clostridium perfringens
(10,7%); Rhodococcus equi (7,1%); Cryptosporidium spp. (5,4%); Clostridium
difficile (1,8%); coronavírus (1,8%); Giardia sp. (1,8%). Conclui-se que a
identificação dos animais desidratados e com graves alterações
hidroeletrolíticas, bem como a necessidade de se detectar os agentes
etiológicos e seus fatores de virulência, são importantes para direcionar o
médico veterinário a definir medidas de controle e terapêutica adequados.

Palavras chave: diarreia, etiologia, enteropatógenos, fatores de virulência,

potros.
 2

OLIVO, G. Clinical and etiological study of diarrhea in foals. Botucatu,

2013. 98p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de
Mesquita Filho”.

ABSTRACT

Diarrhea is a serious problem in foals up to six months old, resulting in losses in

equine business. The aims of this research were to perform the clinical study
and the identification of main pathogens and virulence factors responsible for
diarrhea in foals. A total of 56 foals with diarrhea (DG) and and 60 without
diarrhea (CG) up to 90 days old were evaluated. Fecal samples of a (DG) and
60 without diarrhea (GC) up to 90 days old were evaluated. Hemogram and
hemogasometry were performed in the animals of DG. Fecal samples of DG
and GC were used to identify the enteropathogens. The main clinical findings in
animals of GD were increased peristalsis and defecation frequency (100,%) and
dehydration (67.8%). Hyperfibrinogenemia (26.8%), leukocytosis (12.5%),
lymphocytosis (37.5%) and neutrophilia (17.8%), metabolic acidosis (16%) and
decreased bicarbonate (16%) were the main hematologic findings. At least one
of the enteropathogens studied was detected in DG (50/56) and in CG
(48/60). In 32% (16/50) of positive samples was identified
a single enteropathogen, while two or more enteropathogens were detected in
68% (34/50) of samples. E. coli showed the highest frequency in the
isolations of foals with diarrhea (62.5%), followed by Salmonella spp. (25%);
Strongyloides (25%); Strongyles (10.7%); C. perfringens (10.7%), Rhodococcus
equi (7.1%); Cryptosporidium spp. (5.4%); C. difficile (1.8%), coronavirus (1.8),
Giardia sp. (1.8%). In conclusion the identification of dehydrated animals and
animals with severe electrolyte alterations as well as the need to detect the
etiologic agents and their virulence factors are important to conduct the
veterinarian to define control measures and appropriate therapy.

Key words: diarrhea, etiology, enteropathogens, foal, virulence factors.

 3

1. INTRODUÇÃO
A criação de equinos se expande cada vez mais no território nacional,
fazendo com que o Brasil se destaque entre os maiores criadores de equídeos
do mundo (IBGE, 2010). Apesar do desenvolvimento técnico das criações,
problemas relacionados a doenças dos equinos ainda persistem ocasionando
perdas econômicas significativas. Dentre as doenças, a diarreia tem grande
relevância, acometendo animais de diferentes idades, porém, com maior
gravidade nos animais jovens.
As causas de diarreia podem ter origem infecciosa, parasitária e não
infecciosa. As causas infecciosas são representadas principalmente pela ação
dos vírus e bactérias, enquanto as parasitárias pelos helmintos, coccídeos e
protozoários como principais agentes. As causas não infecciosas da doença
como a intolerância por lactose e altas concentrações de carboidratos, uso
irracional de antimicrobianos, ulcerações gástricas, síndrome da asfixia
perinatal (PAS) e adaptações à dieta culminando em mudanças da microbiota
intestinal (“diarreia do cio do potro”). As alterações clínicas do potro com
diarreia tais como a desidratação grave, acidose metabólica, distúrbios
eletrolíticos, hipoproteinemia e bacteremia, podem levá-lo a morte curto espaço
de tempo.
Na diarreia, a grande perda de líquido, eletrólitos e alterações ácido-
base estão associadas diretamente à severidade das lesões intestinais e à
ingestão inadequada de leite ou água pelo paciente durante o curso da doença.
No entanto, a acidose metabólica é dentre as alteração ácido-bases, a mais
comum em cavalos acometidos pela diarreia (MAIR et al., 2002). Dentre os
exames complementares, a hemogasometria possibilita a caracterização e
avaliação da intensidade dos desequilíbrios hidro-eletrolíticos e ácido-base
(RIBEIRO FILHO et al., 2007), e quando realizada logo no início dos sinais
clínicos, permite uma rápida e adequada intervenção, aumentando as chances
de sobrevida do potro (PEIRÓ et al., 2010).
A necessidade de identificar o paciente de risco e decidir qual o melhor
momento para intervir no plano terapêutico depende dos exames
complementares a serem realizados e do diagnóstico etiológico. O isolamento
de um agente das amostras fecais pode não ser indicativo direto de sua
 4

participação na diarreia, pois este pode ser integrante da microbiota ou, ainda,
outros agentes podem estar presentes nos casos de coinfecções dificultando a
interpretação de resultados laboratoriais isolados. Entre os diversos patógenos
entéricos, os principais agentes causadores de diarreia são: Escherichia coli,
Salmonella spp., Rhodococcus equi, Clostridium difficile e perfringens,
Lawsonia intracellularis; Rotavírus, Coronavírus; Strongyloides westeri,
Strongylus vulgaris, Cryptosporidium spp. e Giardia sp. (MEIRELLES et al.,
2008; SLOVIS et al., 2010).
O presente estudo investigou os principais enteropatógenos
relacionados a casuística da diarreia em potros, assim como as principais
alterações clínicas decorrente da perda excessiva de líquido e bacteremia.
 5

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) é agente causal de enterite em diversas

espécies, como equinos, bezerros, cordeiros, leitões, e humanos. Este micro-
organismo provoca diarreia aquosa e profusa, acometendo potros com menos
de um mês de vida (HOLLAND et al., 1996). A desidratação grave e o
desequilíbrio eletrolítico são as principais consequências que contribuem para
a alta mortalidade de neonatos com colibacilose (HOLLAND et al., 1989).
O diagnóstico presuntivo da infecção por E. coli é baseado no histórico e
sinais clínicos, e confirmado pela presença da bactéria nas fezes após cultivo,
(KRIEG & HOLT, 1994). Esta bactéria é comumente isolada nas fezes de
cavalos normais e potros diarreicos. No entanto, para determinar a participação
de micro-organismos como causa da diarreia, se faz necessário a realização de
técnicas diagnósticas que comprovem a patogenicidade e identifique os fatores
de virulência, tais como identificação das fímbrias, hibridização em colônia e a
identificação do gene pelo método da PCR (HOLLAND et al., 1996).

2.2. Salmonella sp.

A salmonelose é uma doença que gera distúrbios entéricos e/ou

sistêmicos, ocasionada por bactéria do gênero Salmonella, Gram negativa,
anaeróbica facultativa (CARTER et al., 2007; SLOVIS, 2007; SLOVIS, 2009).
Salmonella enterica subsp. enterica possui seis subespécies com mais de
2.000 sorovares que são potencialmente patogênicas. Porém a maioria dos
casos clínicos está associada a uma única subespécie, S. enterica subsp.
enterica (TRAUB-DARGATZ & BESSER, 2007). Durante 1990 e 1991, 380
amostras fecais foram coletadas diretamente da ampola retal ou durante a
necropsia de cavalos de diferentes idades, com queixa de diarreia. Destas
amostras, 18% (69/380) foram positivas para Salmonella spp., e grande parte
das linhagens identificadas como Salmonella Typhimurium (43/69). Outros
sorotipos menos encontrados foram: S. hadar (3/69), S. arizona (2/69), S.
 6

enteritidis (2/69), S. virchow (1/69), S. blockey (1/69) e S. bareilly (1/69) (VAN

DUIJKEREN et al., 1994).
Infecções por Salmonella sp. podem ser a etiologia primária em equinos
doentes, principalmente em potros com menos de seis meses de idade (12
horas a quatro meses), os quais sucumbem a uma septicemia aguda (MORSE
et al., 1976; SLOVIS, 2007; SLOVIS, 2009). A provável via de infecção é a oral,
existindo várias vias de transmissão para equinos, incluindo o consumo de
água ou alimento contaminado, contato com animais e ambiente infectados,
como também mãos e equipamentos utilizados pelo tratador (SLOVIS, 2007).
Os fatores estressantes como excesso de treinamento, desmame precoce,
privação de água ou alimento e cirurgias de grande porte com anestesia geral,
contribuem para a infecção (MORSE et al., 1976; CARTER et al., 2007).
A bactéria invade as células do epitélio intestinal por um processo de
endocitose, fazendo com que ocorra a reorganização do citoesqueleto das
células epiteliais (SLOVIS, 2009). As enterotoxinas e citotoxinas da Salmonella
juntamente com a inflamação generalizada, causam o aumento da secreção
pelo epitélio intestinal (SLOVIS, 2007; SLOVIS, 2009). Os cavalos infectados
podem apresentar desde enterite leve até choque septicêmico (SLOVIS, 2007).
Em potros mais jovens, os sinais da enfermidade são mais graves do que em
potros acima de quatro meses de idade, causando severa diarreia, febre,
cólica, anorexia e hipertermia (MORSE et al., 1976; WALKER et al., 1991).
As culturas bacterianas seriadas em placas contendo ágar em meio de
cultura seletivo é o método de eleição para estabelecer a presença de
Salmonella (TRAUB-DARGATZ & BESSER, 2007). A cultura sanguínea é um
método particularmente utilizado em potros com menos de um mês de idade,
por apresentarem maiores chances após a infecção de desenvolverem uma
bacteremia (ZIMMEL, 2008; SLOVIS, 2009). A reação em cadeia da polimerase
(PCR) é considerada técnica altamente sensível e os resultados positivos
podem apresentar maior importância em potros do que em cavalos adultos com
diarreia (ZIMMEL, 2008).
 7

2.3. Clostridium difficile

Clostridium difficile (C. difficile) é uma bactéria anaeróbica, Gram-

positiva e importante causa de doenças entéricas em humanos e animais
(WEESE & PRESCOTT, 2001; RADOSTITS et al., 2007; WEESE, 2007). O
isolamento do C. difficile foi relatado pela primeira vez em potros com diarreia,
por Jones et al. (1987), onde 62,7% (27/43) dos animais foram diagnosticados
com a doença.
C. difficile produz ao menos cinco toxinas (BORRIELO, 1998), entretanto
somente o efeito das toxinas A e B são melhor compreendidas (WEESE &
PRESCOTT, 2001). A toxina A é uma potente enterotoxina com rápida
atividade citotóxica (LYERLY et al., 1998), que ao contrário da toxina B, causa
ainda acúmulo de fluído no intestino (BORRIELO, 1998). A toxina B possui até
100 vezes mais citotoxicidade quando comparada a toxina A (GUERRANT et
al., 1999), mas não causa qualquer alteração da permeabilidade intestinal,
migração de neutrófilos para o lúmen ou alteração da morfologia intestinal
(LIMA et al., 1988).
Os sinais clínicos de C. difficile podem variar de enterite leve a colite
fulminante com hemorragia e necrose do epitélio intestinal (RADOSTITS et al.,
2007; SLOVIS, 2009). A apresentação clínica pode não ser diferente das
outras causas de enterocolite ocasionando diarreia aquosa e profusa, cólica,
fraqueza e desidratação. Ainda pode ser observado aumento da frequência
cardíaca e respiratória, bem como acidemia atribuída à acidose metabólica
(RADOSTITS et al., 2007).
O diagnóstico é realizado em meios de cultura seletivos.
Comercialmente, o teste de ensaio imunoenzimático em placa (ELISA) está se
tornando padrão para o diagnóstico devido ao baixo custo, resultado rápido, e
por se constituir em uma técnica padronozada, de boa sensibilidade e
especificidade para detecção da toxina (WHITTIER et al., 1993; LYERLY et al.,
1998). A diferenciação de estirpes toxigênicas e não toxigênicas podem ser
realizadas por reprodução da toxina “in vitro” ou pela análise da PCR, que
identifica a presença dos genes que regulam a produção das toxinas (KATO, et
al., 1991; ZIMMEL, 2008).
 8

2.4. Clostridium perfringens

Clostridium perfringens (C. perfringens) é uma bactéria anaeróbica,

Gram-positiva, que tem sido associada à enterocolite em cavalos, cães,
bezerros, cordeiros, coelhos, suínos e humano (SONGER, 1996). Os tipos de
C. perfringens são diferenciados com base na produção de quatro principais
toxinas. As toxinas alpha, beta e épsilon são produzidas por C. perfringens tipo
B. As toxinas alpha e beta pelo C. perfringens tipo C, enquanto as toxinas
alpha e iota pelo C. perfringens tipo E (RADOSTITS et al., 2002). Em humanos
a enterotoxina de C. perfringens tem sido associado a diarreias esporádicas,
intoxicação alimentar e diarreias associadas ao uso indevido de
antimicrobianos (BRETT et al., 1992). Em equinos a enterocolite tem sido
associada ao C. perfringens toxina A (BUESCHEL et al., 1998; EAST et al.,
1998) e C (SIMS et al., 1985; HOWARD-MARTIN et al., 1986; EAST et al.,
1998). Radostits et al. (2002), relataram ainda C. perfringens produtores de
toxina B e C como causadores de enterotoxemia em potros.
Alguns fatores levam ao desenvolvimento da doença, incluindo a
mudança da dieta, antibioticoterapia, estresse, ou infecções concomitantes.
Outros estão, ligados diretamente ao hospedeiro e podem ser determinantes,
como idade, estado imune e a presença ou ausência de receptores para as
toxinas de C. perfringens (SLOVIS, 2009).
A doença geralmente é observada em animais com menos de cinco dias
de idade (SLOVIS, 2009). Os potros com enterotoxemia associada ao C.
perfringens toxina B ou C apresentam evidências de depressão acentuada,
pronunciada toxemia, intensa dor abdominal, fezes sanguinolentas, frequência
respiratória e pulso acelerado (RADOSTITS et al., 2007). O curso clínico é
muito curto, sendo que a diarreia pode não ser observada em alguns casos
(RADOSTITS et al., 2007; WEESE, 2007).
Os exames laboratoriais revelam acidose na maioria dos animais,
azotemia e, ocasionalmente, hipoglicemia. O leucograma indica leucopenia
com desvio a esquerda regenerativo (SLOVIS, 2009).
Doenças entéricas associadas ao C. perfringens são de difícil
diagnóstico, já que o micro-organismo pode ser facilmente encontrado nas
 9

fezes de animais sadios (PRINCEWEL & AGBA, 1982; MIWA et al., 1997). A
cultura quantitativa tem sido sugerida como uma forma de diagnóstico de
doenças entéricas em equinos por C. perfringens (WIERUP & DIPIETRO,
1981). A detecção de toxinas específicas nas fezes é o método de diagnóstico
de escolha (WEESE, 2007; SLOVIS, 2009). Com o uso da PCR, é possível
ampliar e separar os genes que codificam as toxinas (ZIMMEL, 2008; SLOVIS,
2009). A hemocultura é altamente recomendada em potros neonatos, que
comumente apresentam bacteremia por C. perfringens e raramente por C.
difficile (ZIMMEL, 2008). Os testes comerciais são uma opção para o
diagnóstico, identificando enterotoxinas do C. perfringens (C. perfringens
enterotoxin test e ELISA) [SLOVIS, 2009].

2.5. Rhodococcus equi

A infecção por Rhodococcus equi (R. equi) apresenta distribuição

mundial refletindo em grandes perdas econômicas nos haras de criação
(HEIDMANN et al., 2006; MUSCATELLO et al., 2007). As infecções ocorrem
logo após o parto até o sexto mês de vida, porém com maior frequência entre
45 e 60 dias (COHEN et al.,2001), sendo atribuída ao período de transição de
imunidade passiva e o início da imunidade ativa (COHEN, 2008). As vias
inalatória e/ou digestória são as principais vias de infecção nestes animais,
embora a maioria dos animais torna-se imune ao longo da vida (HEIDMANN,
2006; COHEN, 2008). A viabilidade do micro-organismo no trato gastrintestinal
de animais jovens e adultos favorece a sua disseminação nos criatórios
(RADOSTITS et al., 2007).
Embora o micro-organismo tenha distribuição mundial, o impacto está
relacionado a grandes fazendas de criação, devido ao aumento da prevalência,
resultando em altas taxas de mortalidade. Ribas et al. (2009) afirmaram que R.
equi apresenta 17% de frequência de isolados em propriedades e possui taxa
de letalidade de 50% dos animais acometidos.
Os sinais entéricos são menos frequentes, ocorrendo isoladamente ou
em conjunto com os respiratórios, representados por diarreia, desidratação,
 10

cólica, perda de peso e retardo no crescimento, decorrentes de grave colite e

linfadenite mesentérica (RIBEIRO et al., 2007). Heidmann (2006) citou ainda
manifestações menos comuns como uveíte séptica, enterocolite ulcerativa,
osteomielite, fisite séptica ou artrite. Na prática clínica, o diagnóstico da
rodococose nos animais fundamente-se na associação de dados clínico-
epidemiológicos, aliados aos resultados de exames complementares como
radiografia, ultrassonografia, citologia e cultivo a partir do lavado
traqueobronquico (RADOSTITS et al., 2007).
O isolamento de R. equi do ambiente é determinado com o emprego de
meios especiais, que contenham fármacos com a capacidade de impedir o
crescimento de micro-organismos ambientais e fecais, como o meio NANAT
(TAKAI et al., 1996; MUSCATELLO et al., 2007).
O sorodiagnóstico da rodococose tem sido utilizado no plano
diagnóstico, apoiado nas técnicas de imunodifusão em gel de ágar, inibição de
hemólise sinérgica, imunodifusão radial e ELISA. Essas técnicas são de alta
sensibilidade e permitem o diagnóstico mais preciso nos estágios mais
avançados de evolução, mas como inconveniente podem apresentar reações
falso-positivas (anticorpos de origem materna) e falso-negativas (potros com
infecção precoce), não sendo útil para diagnóstico definitivo da rodococose
(RIBEIRO, 2007).
A padronização da técnica da PCR possibilitou o avanço no diagnóstico
da doença (SELLON et al., 2000). Possui a capacidade de identificar a doença
na sua fase inicial e a presença de linhagens patogênicas em diferentes
espécimes clínicas (FORTIER et al., 2006).

2.6. Lawsonia intracellularis

Lawsonia intracellularis (L. intracellularis) é uma bactéria Gram negativa,

intracelular obrigatória que afeta principalmente potros desmamados, causando
doença crônica, caracterizada principalmente por uma enteropatia proliferativa
equina (EPE), acometendo também espécies de animais domésticos e
selvagens (PUSTERLA & GEBHART, 2009). Nos últimos anos observou-se
aumento no número de potros acometidos pela doença, apresentando idade
 11

inferior a um ano de vida (DUHAMEL & WHEELDON, 1982; FRANK et al.,

1998; SCHUMACHER et al., 2000; LAVOIE et al., 2000; BIHR, 2003;
GUIMARÃES-LADEIRA et al., 2009). No Brasil, Guimarães-Ladeira et al.
(2009) relataram a existência da L. intracellularis no estado de Minas Gerais,
acometendo potros clinicamente saudáveis e com histórico de diarreia,
ressaltando a importância deste agente no diagnóstico diferencial para as
enterites nos equinos.
Os fatores predisponentes como o estresse do desmame e o parasitismo
tem ocasionado o desenvolvimento de EPE em potros (PUSTERLA &
GEBHART, 2009). A via de infecção é fecal-oral, atribuindo aos alimentos e a
água a principal forma de disseminação deste micro-organismo (LAVOIE &
DROLET, 2007; WILSON & GEBHART, 2008). A gravidade da doença
depende do número de organismos ingeridos pelo hospedeiro e o grau de
imunidade. Após a ingestão, a bactéria invade as vilosidades intestinais e
através de vacúolos parasitam os enterócitos, multiplicando-se livremente no
citoplasma. A EPE se desenvolve originando uma proliferação progressiva de
células imaturas do epitélio, abrigando inúmeras bactérias, causando lesões
extensas e com isso a incapacidade de digerir e absorver nutrientes, levando a
quadros de diarreia e perda de peso (LAVOIE & DROLET, 2007). Em casos
mais severos ocorrem ulcerações da mucosa intestinal, culminando em perda
de sangue, ou até a formação de microabscessos intraepiteliais, causadores de
gastrite e colite (BREES et al., 1999; WILSON & GEBHART, 2008).
Nas formas subclínicas da doença observa-se a diminuição do ganho de
peso. Os sinais clinicopatológicos atribuídos a fase aguda incluem enteropatia
hemorrágica e, na forma crônica, adenomatose intestinal, enterite necrótica e
ileíte (LEMARCHAND et, al. 1997).
Os sinais clínicos são atribuídos à quantidade de bactérias ingeridas, a
idade do animal, estresse concomitante, resposta imune individual e outros
fatores que influenciem alterações na microbiota intestinal, causando, quadros
de apatia, hiporexia, diarreia, desidratação, cólica e perda de peso (WILSON &
GEBHART, 2008).
A EPE é considerada um diagnóstico diferencial em qualquer potro com
hipoalbuminemia, com idade igual ou superior a dois meses de vida. Para o
 12

diagnóstico das infecções causadas por L. intracellularis é recomendado o

exame sorológico (imunofluorescência de anticorpo ou ensaio de
imunoperoxidase em camada) e a PCR das amostras fecais. Porém, resultados
falsos negativos podem ocorrer em estágios iniciais da EPE. Dentre as duas
técnicas mais utilizadas para o diagnóstico da doença, a PCR mostra maior
sensibilidade, permitindo melhor entendimento epidemiológico da doença em
diferentes espécies e regiões (SMITH & LAWSON, 2001).
Os diagnósticos diferenciais incluem enterites imunomediadas, úlceras
gastrintestinais, parasitismo e neoplasia (BIHR, 2003). Outras causas de
diarreia em equinos também devem ser investigadas como a salmonelose,
clostridiose, rodococose equina e endoparasitas (WILSON & GEBHART, 2008).

2.7. Coronavírus

Coronavírus é um vírus RNA da família Coronaviridae, causador de

doenças em humanos e animais domésticos, incluindo bovinos, suínos, gatos,
coelhos, aves domésticas e camundongos (DAVIS et al., 2000). Acredita-se
que a transmissão do vírus em equinos seja pela via fecal-oral. Contudo, outras
formas de contágio também podem ser possíveis, como por via respiratória e
por fômites. A infecção “in vivo” pode ser disseminada, causando infecções
sistêmicas, ou restritas a alguns tipos de células, como células epiteliais do
sistema respiratório ou entérico e macrófagos (ARGUEDAS, 2007). Partículas
do vírus têm sido observadas por microscopia eletrônica de contraste negativo
em amostras de fezes de cavalos adultos, potros sadios e com diarreia (GUY et
al., 2000). Infecções concomitantes por coronavírus e Cryptosporidium spp.
tem sido descritas (ARGUEDAS, 2007). O Coronavírus age como patógeno
primário em potros jovens imunocompetentes (MEIRELLES et al., 2008;
ZIMMEL, 2008). A patogenicidade deste agente resulta em danos as
vilosidades da mucosa intestinal, levando a diminuição da capacidade
absortiva. A alteração no transporte eletrolítico e na secreção de enzimas
intestinais ocorre secundariamente ao dano do epitélio contribuindo na má
absorção dos nutrientes, agravando ainda mais o quadro de diarreia (DAVIS et
al., 2000; MEIRELLES et al., 2008).
 13

Os potros apresentam geralmente quadros febris, desidratação e

anormalidades eletrolíticas, podendo estes sinais clínicos permanecer de 1 a
12 dias (MEIRELLES et al., 2008). As infecções entéricas geralmente são auto
limitantes. Contudo, complicações secundárias podem ocorrer como dificuldade
respiratória resultante de doenças pulmonares devido à hipóxia causada pela
intensa anemia (DAVIS et al., 2000).
No Brasil, levantamentos epidemiológicos apontaram morbidade
superior a 58% dos animais acometidos com enterite, onde a faixa etária mais
susceptível era de 30 a 90 dias de vida, justificado pelo intervalo de queda da
imunidade passiva e estabelecimento da imunidade ativa. Dentre as formas de
infecção, práticas como a coprofagia ou ingestão de alimentos contaminados e
a presença de potros doentes e/ou animais saudáveis eliminando o vírus, são
fatores de risco para animais imunologicamente deficientes. O estresse intenso
atua como fator predisponente para o desenvolvimento dos sinais clínicos em
animais infectados (MEIRELLES et al., 2008).
O histórico de diarreia aquosa, hipoproteinemia e desidratação levam a
diagnósticos diferenciais que incluem agentes virais e bacterianos, causadores
de enterocolite (DAVIS et al., 2000). O método diagnóstico de escolha é a
demonstração direta de antígenos de coronavírus em amostras biológicas
(ARGUEDAS, 2007). O diagnóstico baseia-se nas técnicas de ELISA
(identificação de antígeno), microscopia eletrônica das fezes de potros com
diarreia (GUY et al., 2000; ZIMMEL, 2008) e teste de aglutinação para
identificar se há presença de outros patógenos causadores de infecção
(MEIRELLES et al., 2008).

2.8. Rotavírus

A enterite causada pelo rotavirus é uma preocupação para potros recém-

nascidos, causada por um vírus RNA fita dupla, não envelopado, pertencente
ao gênero Rotavirus (FLORES et al., 2007). Esta manifestação clínica ocasiona
grandes alterações metabólicas, como rápida desidratação, desequilíbrio ácido
 14

básico e hidroeletrolítico, podendo levar o potro a morte (MEIRELLES et al.,

2008).
A transmissão do vírus ocorre pela via fecal-oral pelaas fezes ou fômites
altamente contaminados. O período de incubação é de 12 a 24 horas. Cavalos
adultos não são afetados clinicamente durante surtos de diarreia em potros,
embora algumas éguas com potros infectados irão soroconverter, indicando
infecção subclínica (DWYER, 2001). A idade média dos potros com diarreia por
rotavírus é de 75 dias, ocorrendo diarreia por um período de 1 a 9 dias
(DWYER, 2001). Comumente, vários potros são afetados em um espaço curto
de tempo, sendo uma doença altamente contagiosa e que apresenta um
período muito curto de incubação (1-2 dias) [SLOVIS, 2000]. Os animais
infectados têm a capacidade de eliminar o micro-organismo por um período de
10 dias a 8 meses, podendo este persistir no ambiente por até nove meses
(SLOVIS, 2000).
Após o vírus ingressar no trato gastrintestinal, invade e se replica
rapidamente nas vilosidades intestinais, especificamente do duodeno e jejuno
(DWYER, 2001). O resultado da infecção é a diminuição das vilosidades e do
epitélio celular, resultando em ausência de dissacaridases, especialmente
lactase, fazendo com que este alimento ingerido permaneça no lúmen
intestinal, como uma solução hiperosmótica, levando a má digestão, deficiência
na absorção dos nutrientes e diarreia aguda. As células intestinais da cripta
não são afetadas, apenas as células do ápice das vilosidades (DWYER, 2001).
Os achados clínicos da infecção por rotavírus dependem da idade do
potro, do estado imune, da virulência do vírus e da quantidade inoculada
(ZIMMEL, 2008). Após 18 a 24 horas da ingestão do material infectado o
animal apresenta sinais de letargia, diminuição do reflexo de sucção, e diarreia,
podendo variar de fezes pastosas a aquosas. Slovis (2009) descreve o
timpanismo também como achado clínico em potros infectados. A febre pode
estar ou não presente. Potros jovens apresentam maior susceptibilidade a
apresentar problemas graves devido a sua limitação em corrigir desequilíbrios
hidroeletrolíticos mais graves. O diagnóstico é muitas vezes realizado com
base nos achados epidemiológicos e exame físico. O envio de amostras fecais
 15

para a microscopia eletrônica, ELISA, são também meios eficazes para

estabelecer o diagnóstico (SLOVIS, 2000; ZIMMEL, 2008).

2.9. Cryptosporidium spp.

Cryptosporidium parvum (C. parvum) é caracterizado como um

coccídeo, parasita da subordem Eimeriorina. Infectam as células do epitélio
intestinal de muitas espécies de animais domésticos e selvagens, incluindo
cavalos e humanos (VERONESI et al., 2008; TOSCAN et al., 2010). O primeiro
relato de infecção em equinos ocorreu em potros da raça Árabe, combinado a
doenças imunodepressoras (XIAO & HERD, 1994). Os equinos tornam-se
infectados com C. parvum após ingerirem oocistos com a forma infectante do
parasita. O desenvolvimento ocorre na superfície apical das células epiteliais
parasitadas, mas separado do citoplasma da célula hospedeira. Os danos nas
microvilosidades intestinais resultam em má absorção, má digestão e diarreia
(XIAO & HERD, 1994; COLE, 1997; TOSCAN et al., 2010). A infecção pelo
micro-organismo torna-se cada vez mais reconhecida como causa de surtos de
diarreia em potros (COLE, 1997), afetando animais de 3 a 15 semanas de vida,
como também potros mais velhos com até dez meses de idade (XIAO & HERD,
1994). A infecção no hospedeiro ocorre tanto pelo contato direto (fecal-oral),
quanto pela ingestão de alimentos e água contaminados (VERONESI et al.,
2008).
No Brasil, foi descrita a prevalência de oocistos do parasita em 80,8%
(42/52) das amostras fecais de equinos atletas, mostrando grande número de
animais portadores e assintomáticos, capazes de excretarem o micro-
organismo (TOSCAN et al., 2010). Gomes et al. (2008) obtiveram resultados
semelhantes em animais atletas. Neste estudo, os potros de até dois anos de
idade apresentaram frequência de 83,3% (15/18) de Cryptosporidium spp. nas
amostras fecais, mostrando ampla disseminação na população equina.
A infecção por Cryptosporidium spp. em potros apresentam prevalência
mais baixa, ocorrendo mais tardiamente que em ruminantes, atingindo maior
eliminação entre 5 a 8 semanas de vida. A diarreia é verificada mais facilmente
em potros de cinco dias até seis semanas de idade (RADOSTITS et al., 2007).
 16

A infecção também é atribuída a animais cujo sistema imune está

comprometido (MAYER & PALMER, 1996). As éguas podem ser portadoras
assintomáticas, capazes de infectar potros ao contaminarem o ambiente com
oocistos. O período de incubação de C. parvum é de aproximadamente 3 a 7
dias. O primeiro sinal clínico associado à criptosporidiose é severo e inclui
diarreia persistente levando a desidratação, fraqueza e morte quando não
tratado. Em animais imunocompetentes as infecções tornam-se comuns, com a
presença dos sinais clínicos entre 5 a 14 dias pós infecção (NETHERWOOD et
al., 1996; SELLON, 2007).
A excreção dos oocistos do gênero Cryptosporidium por potros pode ser
precoce se os animais forem infectados pelas éguas, pois o período pré-
patente é considerado curto quando comparado a Giardia spp. (1-2 semanas)
[XIAO & HERD, 1994].
O diagnóstico de infecção por Cryptosporidium spp. em animais
suspeitos é realizada pela detecção dos oocistos diretamente das amostras
fecais (XIAO & HERD, 1994). As técnicas de identificação de protozoários têm
sido descritas incluindo a coloração de esfregaços de amostras fecais ou
flutuação usando soluções saturadas de sacarose ou solução de sulfato de
zinco (BROUSSARD, 2003). Também podem ser realizados métodos
imunológicos incluindo ensaios de imunofluorescência (IFA) e a técnica ELISA
(COLE, 1997; BROUSSARD, 2003).
A técnica de coloração rápida por ácido (“acid-fast stain”) é apontada
como método de maior sensibilidade quando comparada a IFA, pois não
requerer uma preparação especial do esfregaço das fezes e podendo ser
facilmente empregada à rotina clínica devido ao baixo custo (COLE, 1997;
ZIMMEL, 2008). Apesar de sensível, esta técnica apresenta baixa
especificidade, diminuindo a possibilidade em detectar infecções por
Cryptosporídium spp. (XIAO & HERD, 1994b). Outro método de triagem para
oocistos de Cryptosporidium spp., é baseado no uso de metodologias
moleculares, aplicadas com uso do PCR, representando uma ferramenta útil
para a detecção de patógenos de amostras ambientais (MAYER & PALMER,
1996).
 17

2.10. Giardia sp.

Giardia intestinalis (G. intestinalis) é um protozoário flagelado, intestinal,

capaz de infectar uma série de vertebrados, como mamíferos, aves e répteis
(BROUSSARD, 2003). G. intestinalis possui dois ciclos de vida, consistindo em
trofozoíto e cisto. Os cistos são ingeridos pelo hospedeiro e transforma-se em
trofozoítos, que se reproduzem por fissão binária, após parasitarem o epitélio
intestinal (duodeno). Os trofozoítos tornam-se inativos e resistentes, e os cistos
são eliminados no ambiente (SELLON, 2007).
A infecção não é relatada com frequência em equinos, mas algumas
descrições indicam que animais infectados possuem sinais compatíveis à
diarreia ou cólica, com eliminação de grande número de cistos nas fezes
(NETHERWOOD et al., 1996; TRAUB et al., 2005). Animais clinicamente
sadios, porém infectados, possuem também a capacidade de eliminar grande
quantidade de cistos junto às fezes (SELLON, 2007).
No Brasil, Vargas & Rigolon (1998), relataram a ocorrência de G.
duodenalis utilizando a técnica de centrifugação-flutuação de Faust com sulfato
de zinco em 21,1% (26/123) dos equinos do Noroeste e Norte do estado do
Paraná. Destes, 18,2% (8/44) eram animais com idade ≤ 1 um ano e não
apresentavam sinais de diarreia.
A excreção de cistos de Giardia sp. começa quando o potro ainda tem
duas semanas de vida, sendo maior antes da nona semana, onde a eliminação
declina gradualmente (XIAO & HERD, 1994b). O diagnóstico se baseia na
identificação dos cistos por flutuação em sulfato de zinco, considerado método
diagnóstico de escolha. O método ELISA é utilizado para detectar o antígeno
presente nas fezes. A mobilidade dos trofozoítos flagelados pode ser detectada
por citologia de fezes frescas (<5 minutos) ou fluido duodenal (BROUSSARD,
2003). Entretanto, outro método de triagem para cistos de Giardia sp., é
baseado em técnicas moleculares, aplicadas com uso da PCR, mostrando-se
útil para a detecção de patógenos em amostras ambientais (MAYER &
PALMER, 1996).
 18

2.11. Helmintos

Os equinos apresentam uma grande variedade de parasitas e algumas

espécies ou gêneros são de grande importância, como Parascaris equorum (P.
equorum), Strongylus vulgaris (S. vulgaris) e Strongyloides westeri (S. westeri)
(MOLENTO, 2005). Os potros até dois anos de idade são os mais acometidos
com essas infecções requerendo preocupação constante quanto ao
desenvolvimento e saúde geral (ALMEIDA, 2009). Infecções causadas por S.
vulgaris são consideradas um fator negativo para o sucesso no manejo com
equinos, causando debilidade e morte. Nos casos de cargas parasitárias leves,
pode afetar o desenvolvimento e o desempenho animal. S. vulgaris está entre
os principais parasitas, pois a larva se desenvolve no sistema arterial
mesentérico, causando elevação da temperatura corpórea, diminuição na
ingestão de alimentos, emagrecimento, apatia, diarreia profusa, cólica e até
mesmo a morte entre 14 a 20 dias (FORTES, 2004).
A infecção causada por S. westeri (Strongyloides) ocorre através das
larvas infectantes após sua liberação nas fezes, penetrando na pele e
membranas da mucosa oral. Os ovos de S. westeri são encontrados quase que
exclusivamente em potros lactentes e recém-desmamados infectados também
pelo leite materno. A infecção em potros ocorre geralmente entre o 9° e 13° dia
causando diarreia por até dez semanas (BOWMAN, 2010).
Parascaris equorum é um nematódeo. A ingestão dos ovos infectantes
no ambiente é a principal via de infecção. Níveis moderados a altos de infecção
causam sinais respiratórios, enterite, diminuição do apetite, fraqueza e
emagrecimento (LINDGREN et al., 2008) .
Os pequenos estrôngilos (Cyathostominae) são parasitas do intestino
delgado, representando cerca de 75 a 100% dos ovos liberados nas fezes de
equinos naturalmente infectados. Diferentemente dos Strongylus sp., as larvas
de ciatostomíneos não migram pela membrana mucosa do ceco e do cólon,
porém causa uma doença clínica distinta, caracterizada por diarreia aquosa
associada à inflamação grave da mucosa do ceco e cólon (MARTINS et al.,
2005, BOWMAN, 2010).
 19

3. OBJETIVOS

Veterinários de campo e a rotina de hospitais veterinários no Brasil e no

exterior ressaltam a diarreia como uma das principais enfermidades dos potros
nos primeiros seis meses de vida, prejudicando o desenvolvimento do animal e
dificultando que este expresse todo seu potencial genético na fase adulta
(HOLLAND et al., 1989; MELO et al., 2007; FREDERICK et al., 2009). A
literatura nacional apresenta trabalhos referentes à diarreia em equinos.
Porém, estes estudos geralmente estão restritos a relatos de caso ou abordam
o diagnóstico e a prevalência de surtos de um único agente (VARGAS &
RIGOLON, 1998; MELO et al., 2007; GOMES et al., 2008; MEIRELES et al.,
2008; GUIMARÃES-LADEIRA et al., 2009; TOSCAN et al., 2010). Em
contraste, muitos destes agentes atuam sob a forma de coinfecções, podendo
potencializar o efeito dos sinais entéricos. Assim, faz se necessário abordar a
diarreia infecciosa em potros sob a forma de síndrome, devido ao grande
número de patógenos envolvido na gênese da doença.
O diagnóstico baseado em informações obtidas a partir das alterações
clínicas e laboratoriais, associadas à identificação precoce do(s) agente(s)
etiológico(s) da diarreia em potros, evitam gastos desnecessários com
tratamentos inadequados, subdesenvolvimento e até a morte dos animais,
além de permitir a implantação de medidas de controle e a prevenção da
reincidência de surtos.
O objetivo deste estudo foi investigar a ocorrência da diarreia e suas
principais causas em potros até três meses de vida, em animais provenientes
do estado de São Paulo.

3.1. Geral

Determinar a ocorrência dos principais enteropatógenos, bem como

avaliar as alterações clínicas em potros de até três meses de idade, com ou
sem diarreia, provenientes de diversas regiões do estado de São Paulo.
 20

3.2. Específicos

 Avaliar as alterações clínicas observadas no exame físico geral e específico

(sistema gastrintestinal) dos potros com e sem diarreia;
 Avaliar as alterações físicas das fezes dos potros com e sem diarreia, tais
como consistência, cor e odor;
 Detectar as alterações hemogasométricas e hematimétricas dos potros com
diarreia;
 Verificar a ocorrência de enteropatógenos (Escherichia coli, Salmonella
spp., Rhodococcus equi, Clostridium difficile e Clostridium perfringens,
Lawsonia intracellularis; Rotavírus, Coronavírus; Strongyloides westeri,
Strongylus vulgaris, Cryptosporidium parvum e Giardia duodenalis) em
animais com e sem diarreia.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Seleção dos animais

Foram colhidas 116 amostras de fezes de potros das raças Puro Sangue
Inglês, Brasileiro de Hipismo, Quarto de Milha, Manga Larga Paulista, Paint
Horse e mestiços, machos e fêmeas, provenientes de haras de criação da
região centro-oeste do estado de São Paulo, em perímetro de até 200 Km do
município de Botucatu, SP, entre julho de 2011 a outubro de 2012. As amostras
foram colhidas de potros com até três meses de idade, foram obtidas de 56
potros com diarreia e 60 potros sem sinais de alterações entéricas até o
momento da colheita (grupo controle), com idade equivalente a dos animais
com diarreia.

4.2. Avaliação clínica dos animais

Os animais foram submetidos ao exame físico segundo Koterba et al.

(1990), Feitosa (2004) e Lohmann & Barton (2007). Os dados clínicos foram
anotados em fichas individuais com base nos seguintes aspectos:
posicionamento (postura), tempo de preenchimento capilar (TPC), presença ou
 21

não de halo endotoxêmico e grau de desidratação. Também foram avaliados

parâmetros vitais, a saber: temperatura corpórea, frequência cardíaca,
frequência respiratória e motilidade intestinal. Informações epidemiológicas
foram colhidas durante a anamnese, tais como, idade, sexo, raça, número total
de animais com e sem diarreia, e número de mortes por distúrbios entéricos.
O grau de desidratação foi avaliado em leve (6-8% de perda de água),
moderado (8-10% de perda de água) e grave (10-12% de perda de água),
segundo Feitosa (2004).
A diarreia foi definida naqueles animais que apresentaram
anormalidades na consistência (aumento da porcentagem de água nas fezes) e
na frequência de defecação (RIBEIRO et al., 2000).
O exame hemogasométrico e hemograma completo foram realizados
apenas nos animais com diarreia (PEIRÓ et al., 2010).
Para um melhor entendimento das alterações encontradas nos exames
físico e laboratorial, bem como o diagnóstico do agente etiológico e a
frequência com que os enteropatógenos foram encontrados, os animais foram
subdivididos em três faixas etárias, do nascimento ao primeiro mês de vida (0 –
30 dias), do trigésimo primeiro ao sexagésimo dia (31 – 60) e do sexagésimo
primeiro ao nonagésimo dia de vida (61 – 90).

4.3. Colheita das amostras

As amostras de fezes dos animais com diarreia foram colhidas em no

máximo 24 horas após o responsável da propriedade comunicar a equipe
integrante do projeto. A condição para que os potros com diarreia fossem
inclusos no projeto, era de não serem tratados previamente com nenhum
antimicrobiano. A primeira amostra foi colhida com uso de suabe estéril
friccionando-o na mucosa retal com três a quatro movimentos. O material
colhido foi mantido em meio de transporte Stuart. Outra amostra foi colhida
(aproximadamente 50 gramas), por estimulo da ampola retal, utilizando luvas
de látex descartáveis, armazenada em pote plástico estéril, acondicionado em
caixa térmica sob refrigeração (4 a 8ºC) até a chegada, em no máximo cinco
horas ao Laboratório de Doenças Infecciosas dos Animais da FMVZ –
 22

Unesp/Botucatu-SP. No laboratório, as amostras colhidas da ampola retal

foram separadas em alíquotas (duplicata) de aproximadamente 2 mL de fezes
em criotubos, e mantidas em temperaturas de -20ºC e -80ºC para detecção
bacteriana (Lawsonia intracellularis), viral (rotavírus e coronavírus) e
parasitológica (Cryptosporidium spp. e Giardia sp.). As demais amostras foram
processadas imediatamente (coproparasitológico e cultivo bacteriano). A
amostra colhida com suabe foi cultivada com vistas ao isolamento de E. coli e
Salmonella spp.
Alíquotas de fezes foram enviadas sob refrigeração para o Laboratório
de Anaerobiose da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte,
visando a realização do isolamento do gênero Clostridium, identificação de
espécies e detecção de toxinas, sob a responsabilidade do professor Dr.
Francisco Carlos Faria Lobato.
Os isolados caracterizados fenotipicamente como R. equi (QUINN et al.,
1994, 2005) foram enviadas a Universidade de Kitasato, Japão, identificação
dos fatores de virulência da bactéria.
O exame hemogasométrico foi realizado, na propriedade, com o
aparelho portátil i-STAT 1®. O cartucho utilizado foi o i-STAT EG7+® que afere
pH sanguíneo, pressão de CO2 sanguíneo (PCO2), pressão de O2 sanguíneo
(PO2), sódio (Na), potássio (K), cálcio ionizado (iCa), hematócrito (Hct),
bicarbonato (HCO3), total de dióxido de carbono sanguíneo (tCO2), excesso de
base (BE), saturação do oxigênio (sO2) e hemoglobina (Hb) , a amostra foi
colhida por venopunção da jugular externa com uma seringa de 1 ml
heparinizada acoplada a uma agulha hipodérmica 21G. O sangue colhido por
venopunção da veia jugular externa com uso de sistema a vácuo (BD,
Vacutainer®) O material foi armazenado em recipiente contendo EDTA e
encaminhado para o Laboratório de Patologia Clínica do Departamento de
Clínica Veterinária FMVZ – UNESP, Botucatu-SP, para realização do
hemograma completo avaliando-se o número de hemácia (He), hemoglobina,
hematócrito (Ht), volume corpuscular médio (VCM), concentração de
hemoglobina corpuscular média (CHCM), número de plaquetas, proteína
plasmática total (PT), distribuição de células vermelhas no sangue (RDW),
fibrinogênio, leucócitos, metamielócitos, bastonetes, neutrófilos segmentados,
 23

linfócitos, eosinófilos, monócitos e basófilos, possibilitando identificar possíveis

alterações nos pacientes com diarreia.

4.4. Exames microbiológicos e detecção molecular

4.4.1. Diagnóstico de E. coli

4.4.1.1. Caracterização microbiológica

Todas as amostras de fezes colhidas por suabe foram semeadas no

meio de ágar acrescido de sangue ovino (5%) desfibrinado e ágar MacConkey,
mantidas em condições de aerobiose a 37°C, por 72 horas, avaliadas a cada
24 horas, com vistas ao isolamento de E. coli e demais enteropatógenos
bacterianos.
Colônias sugestivas de E. coli foram identificadas segundo
características morfotintoriais, bioquímicas (Citrato EPM e Mili) e de cultivo
(KRIEG & HOLT, 1994; TRABULSI, 2005), no laboratório de Doenças
Infecciosas dos animais da FMVZ – UNESP, Botucatu-SP. Após a identificação
fenotípica foi realizado o armazenamento das linhagens em meio de estoque
Lignièris, mantidas em temperatura ambiente (25°C) até o encaminhamento
para o Laboratório de Antígenos Bacterianos II, do Departamento de Genética,
Evolução e Bioagentes da UNICAMP, Campinas, SP, sob a responsabilidade
do professor Dr. Domingos da Silva Leite, objetivando a detecção dos
diferentes fatores de virulência.

4.4.1.2. Detecção fenotípica de hemolisinas em E. coli no meio de ágar

sangue
A detecção foi realizada semeando todas as amostras de material no
meio de ágar acrescido sangue ovino desfibrinado (5%), mantidas em
condições de aerobiose, a 37°C, por três dias. As linhagens que apresentaram
halo de hemólise total ao redor das colônias no meio de ágar sangue, com
identificação concomitante de E. coli no ágar MacConkey e caracterizadas
bioquimicamente, foram considerados como hemolíticas.
 24

4.4.1.3. Detecção molecular dos fatores de virulência de E. coli pela

reação em cadeia pela polimerase (PCR)

A PCR foi realizada no Laboratório de Antígenos Bacterianos II, do

Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes da Unicamp, Campinas,
SP, visando o diagnóstico dos seguintes fatores de virulência dos isolados de
E. coli: FVL2 (sfa, pap, iuc, hly, cnf-1), FVL8 (sfa, papGII, hly, iuc, usp, cnf-1) e
O157 (vt1, vt2 e eae), além de k88, k99, CNF2, LT, fimH, ag43, iuc e pap (C,
E).
O método para a detecção de DNA foi previamente descrito por Blanco
et al. (1997) e consistiu inicialmente na inoculação das linhagens em caldo
cérebro coração (BHI), a 37°C, “overnight”. Após este período, as estirpes
foram semeadas em ágar TSA (Tryptic Soy Agar), a 37 °C, por 24 horas. Em
seguida, duas ou três colônias típicas foram suspensas em 100 µL de água
ultra pura estéril. Estas suspensões foram fervidas por 10 minutos e
centrifugadas (9676,8 g) por três minutos. Os sobrenadantes destes materiais
foram utilizados para as reações de PCR.
As reações de PCR das soluções foram realizadas em termocicladores
programados para pré-aquecimento a 94 °C/10 minutos e 30 ciclos de 94 °C/1
minuto, temperatura de anelamento de acordo com o gene pesquisado,
temperatura de extensão de 72 °C/2 minutos. Após realizadas as amplificações
do DNA bacteriano, foi adicionado às soluções 5 µL de tampão de amostra
(0,25% de azul de bromoferol, 0,25% de xilenocianol e 25% de ficoll). O gel de
agarose foi preparado em concentração 2% em TAE (tampão Tris 2M, ácido
acético 0,04M, EDTA 0,01M e pH 8,0). Em cada poço do gel foram dispostos
10µL da mistura.
Em seguida foi realizada a eletroforese com 100mV por 40 minutos e
amperagem variável. As bandas foram identificadas após incubação em
solução de brometo de etídio (1,5 µg/mL), por 15 minutos, e visualizadas em
transluminador de luz UV. Os géis foram fotografados e as imagens
capturadas, respectivamente pelo sistema Image Master® VDS e programa
LISCAP-Capture Application.
 25

4.4.2. Diagnóstico de Salmonella spp.

As 116 amostras de fezes foram encaminhadas refrigeradas para o

Laboratório de Microbiologia da FMVZ – UNESP, Botucatu-SP, sob
responsabilidade técnica de Fernando José Pagnini Listoni (Técnico
responsável pelo Laboratório) e Thays Mizuki Lucas (Mestranda do
Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública), onde foram realizados
todos os procedimentos para o diagnóstico de Salmonella spp.

4.4.2.1. Caracterização microbiológica

Para o diagnóstico do gênero Salmonella as amostras de fezes colhidas

nos suabes foram transferidas para tubos de ensaio contendo 10 mL de caldo
Tetrationato, e incubadas a 37 °C, “overnight”. Em seguida, as amostras foram
cultivadas na superfície de placas contendo ágar Salmonella-Shiguella (SS),
com incubação a 37 °C por 18-24 horas. Colônias características do gênero
Salmonella (de centro enegrecido no SS), foram submetidas a testes
bioquímicos: produção de indol, utilização de citrato, lisina, H2S, produção de
urease, utilização de glicose e lactose, observação da motilidade e produção
de fenilalanina desaminase, nos meios de MILI, EPM, e Citrato (TRABULSI et
al., 1999). As linhagens de Salmonella sp. foram submetidas ao teste de
aglutinação gênero-específica em lâmina, utilizando soro polivalente comercial
anti-Salmonella flagelar e somático, de acordo com as recomendações do
fabricante.
As linhagens caracterizadas como gênero Salmonella nos testes
bioquímicos, e com aglutinação positiva em lâmina, foram acondicionadas em
tubos de vidro vedados com tampa de borracha, no meio de Lignièris, em
temperatura ambiente (25°C), em duplicata, até o processamento para a
classificação dos sorotipos. No momento do envio foram repicadas para o meio
ágar nutriente (POPOFF & LE MINOR, 1992). Estas linhagens foram
encaminhadas em refrigeração (4 - 8°C) para a caracterização dos sorotipos no
Laboratório de Enterobactérias do Instituto Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) do Rio de
Janeiro, RJ.
 26

4.4.3. Diagnóstico de Clostridium spp.

As 116 amostras de fezes foram encaminhadas refrigeradas para o

Laboratório de Anaeróbios da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo
Horizonte, para o diagnóstico de Clostridium, particularmente C. perfringens e
C. difficile, e das toxinas A e/ou B de C. difficile.

4.4.3.1. Caracterização microbiológica

O diagnóstico microbiológico para C. difficile foi baseado na cultura

anaeróbica das amostras fecais em ágar acrescido de sangue ovino (5%)
desfibrinado, mantidas por três a cinco dias, a 37°C. Colônias sugestivas, com
halo hemolítico, foram submetidas a coloração de Gram para confirmação a
microscopia de bacilos Gram-positivos (QUINN et al., 1994).

4.4.3.1.1. Detecção molecular de toxinas de C. difficile

A detecção das toxinas A e/ou B de C. difficile foi realizada utilizando um

kit comercial de ELISA e pela cultura de células Vero (DELMÉE, 2001). Para
selecionar os esporos de C. difficile, volumes iguais de amostras de fezes e
etanol a 96% foram misturados, e após a incubação durante 30 minutos à
temperatura ambiente, alíquotas de 50µL foram inoculadas em placas
contendo cicloserina-cefoxitina ágar frutose, suplementada com sangue de
cavalo a 7% e taurocolato de sódio a 0,1%. Após a incubação anaeróbica, a
37°C durante 72 horas, todas as colônias sugestivas (FEDORKO & WILLIAMS,
1997) foram submetidas a um multiplex-PCR para um gene de limpeza (tpi) e
detecção das toxinas A (TCDA), B (tcdB) e genes de toxinas binárias (gene
cdtB) [SILVA et al., 2011].

4.4.3.1.2. Isolamento microbiano e detecção molecular de C. perfringens

Para o isolamento de C. perfringens, foi utilizado 0,08 a 0,12g de fezes.

As amostras fecais foram diluídas em série utilizando fator 10 (10-1 a 10-6).
 27

Alíquotas de 50 µL de cada diluição foram plaqueadas em ágar sulfito

polimixina sulfadiazina, incubadas anaerobicamente a 37 °C durante 24 horas.
Após a incubação, as colônias características foram submetidas a PCR
(VIEIRA et al., 2008).
Foram investigados os genes que codificam a toxina beta-2 (cpb2),
enterotoxina (cpe) e as principais toxinas de C. perfringens (alfa, beta, épsolon
e iota). A PCR foi anteriormente realizada para a detecção do gene de
codificação NetB-(rede) (KEYBURN et al., 2008). Todas as reações de PCR, e
amplificações foram realizadas em termociclador e os produtos foram
visualizados sob luz UV em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio
(SILVA et al., 2011).

4.4.4. Diagnóstico de Rhodococcus equi

As 116 amostras de fezes foram encaminhadas refrigeradas para o

Laboratório de Microbiologia da FMVZ – UNESP, Botucatu-SP, sob a
responsabilidade técnica de Fernando José Pagnini Listoni e Thays Mizuki
Lucas, onde foram realizados todos os procedimentos para o diagnóstico de R.
equi.

4.4.4.1. Caracterização microbiológica de Rhodococcus equi

O diagnóstico de R. equi, foi realizado a partir do cultivo de amostras

fecais em ágar sangue ovino (5%) desfibrinado (QUINN et al., 1994, 2005) e
no meio seletivo CAZ-NB (ceftazidima, novobiocina e ciclohexamida), este
último com vistas ao isolamento seletivo da bactéria.

4.4.4.2. Determinação de linhagens virulentas (VapA)

A totalidade das linhagens foi submetida à avaliação de virulência,

mediante a detecção do perfil plasmidial, realizado pelo professor Shinji Takai
do Departamento de Higiene Animal da Faculdade de Medicina Veterinária da
 28

Universidade de Kitasato, no Japão. Os isolados de R. equi foram enviados ao

Japão no meio de Lignièris, em temperatura ambiente (25°C), em frascos
estéreis, devidamente embalados, identificados e com autorização de
exportação pelo Serviço de Defesa Animal do MAPA, Brasil, e permissão de
importação do Ministério da Agricultura, Reflorestamento e Pesca do Japão.

4.4.2.1. Extração de DNA plasmidial

A obtenção de DNA plasmidial foi realizado pelo método de lise alcalina.

O material gnético extraído foi analisado pela digestão com enzimas de
restrição: HindIII, BamHI, EcoRI e EcoT22I, visando a determinação dos
plasmídios 85 a 90kb para as linhagens virulentas (VapA) e de 79 a 100kb para
as linhagens de virulência intermediária (VapB) [BIRNBOIM & DOLY, 1979;
TAKAI et al., 1993]

4.4.2.2. Reação em cadeia pela polimerase

A amplificação do material genético dos isolados foi realizada utilizando

10µL de DNA preparado em 50µL de volume contendo 10mM de Tris-HCl (pH
8,3 a 25°C), 50mM de KCl, 0,2mM de desoxinucleotídeos trifosfatos, 1,5mM de
MgCl2, 2,5U de Taq DNA polimerase e 1mM de cada primer. As linhagens
foram submetidas a 30 ciclos de amplificação, nas seguintes condições:
desnaturação por 90 segundos a 94°C, anelamento por um minuto a 55°C e
extensão por 2 minutos a 72°C.

A detecção das sequências de genes de antígenos virulentos (15 –

17kDa) foi realizado utilizando os primers Forward 5’-GAC TCT TCA CAA GAC
GGT-3’ e Reverse 5’-TAG GCG TTG TGC CAG CTA-3’, visando a amplificação
de sequências entre 569 e 552 pares de base. Para as linhagens de virulência
intermediária (20kDa) foram utilizados os primers Forward 5’-AAC GTA GTC
GCG GTG AGAA-3’ e Reverse 5’-ACC GAG ACT TGA GCG ACTA-3’, para
amplificação gênica entre 240 e 258 pares de base (Takai et al., 1995a,b). As
linhagens que não apresentaram. As linhagens que não apresentaram o perfil
 29

plasmidial para VapA ou VapB foram consideradas avirulentas. Como controle

foram utilizados cepas de referência para os diferentes tipos de plasmídios.

4.5. Exames para identificação de Rotavírus e Coranavírus

4.5.1. Detecção de Coronavírus

O diagnóstico de coronavírus foi realizado no Laboratório de Virologia,

do Departamento de Medicina Preventiva e Saúde Animal da Universidade de
São Paulo – USP, sob responsabilidade do professor Dr. Paulo Eduardo
Brandão, com intuito de identificação do vírus na totalidade das amostras
fecais.
O método utilizado para extração do ácido nucleico viral seguido por
reação em cadeia pela polimerase (nested RT-PCR), para a identificação e
diagnóstico foi realizado conforme metodologia descrita por Brandão et al.
(2005).

4.5.2. Detecção de Rotavírus

O diagnóstico de rotavírus foi realizado no Laboratório de Virologia, do

Departamento de Medicina Preventiva e Saúde Animal da Universidade de São
Paulo – USP, sob responsabilidade do professor Dr. Fábio Gregori, com intuito
de identificação do vírus na totalidade das amostras fecais.
O método utilizado para extração do ácido nucleico viral e eletroforese
em gel de poliacrilamida (PAGE) para a identificação e diagnóstico foi realizado
conforme metodologia empregada com referência ao trabalho de Herring et al.
(1982).
 30

4.6. Diagnóstico de Lawsonia intracellularis, Cryptosporidium parvum e

Giardia duodenalis

4.6.1. Diagnóstico de Lawsonia intracellularis

A extração do DNA foi realizada diretamente das fezes, utilizando-se de

um kit comercial para extração de DNA de amostras fecais [Qiagen DNA Stool
Mini kit (QIAGEN®)]. As modificações incluíram 3 ciclos de congelamento em
nitrogênio líquido e descongelamento em banho maria após a adição do
tampão de lise contido no kit (ASL Buffer). As amostras foram colocadas em
nitrogênio líquido durante um minuto, seguido de banho maria a 90° C durante
cinco minutos (nos primeiros dois ciclos). Em seguida, no terceiro e último ciclo,
o material foi congelado em nitrogênio líquido por um minuto e em seguida
descongelado e mantido em banho maria a 90° C por dez minutos. O DNA
extraído a partir das amostras fecais foi armazenado a -20 °C até o uso nas
análises moleculares. O DNA resultante deste protocolo de extração foi
utilizado para a realização das demais técnicas de diagnóstico
(Cryptosporidium spp. e Giardia sp.).
O diagnóstico da L. intracellularis foi realizado através da reação em
cadeia de polimerase (PCR), segundo metodologia descrita por Jones et al.
(1993) e Guimarães-Ladeira et al. (2009).
Para o diagnóstico de Lawsonia intracellulris as amostras foram
submetidas a amplificação do DNA da bactéria. O primeiro produto de PCR foi
de aproximadamente 304 a 323 pares de base, amplificado usando os primers
5’-TGA AGG TAT TGG TAT TCT CC-3’ (Forward) e 5’-TGA AGG TAT TGG
TAT TCT CC-3’ (Reverse). Para a segunda fase da reação (Nested) um
produto de amplificação de aproximadamente 285 a 304 pares de base foi
detectado pelos primers 5’-TTA CAG GTG AAG TTA TTG GG-3’ (Forward) e
5’-CTT TCT CAT GTC CAT AAG C-3’ (Reverse) (JONES, et al. 1993;
GUIMARÃES-LADEIRA et al., 2009).
 31

4.6.2. Detecção de Protozoários

O método diagnóstico empregado para a detecção de Cryptosporidium

spp. e Giardia spp. foram com base na reação em cadeia de polimerase (PCR),
segundo metodologia descrita por Hopkins et al. (1997), Xiao et al. (2001),
Read et al. (2002).

4.6.2.1. Detecção molecular de Cryptosporidium spp.

Para o diagnóstico de Cryptosporidium spp. As amostras foram

submetidas ao isolamento e amplificação do DNA do parasita visando a
detecção do gene 18S small Subunit (SSU) rRNA (XIAO et al., 2001; PAZ e
SILVA, et al., 20013). O primeiro produto de PCR foi de aproximadamente
1.325 pares de base foi amplificado usando os primers 5’- TTC TAG AGC TAA
TAC ATG CG-3’ (Forward) e 5’-CCC ATT TCC TTC GAA ACA GGA-3’
(Reverse) para a reação inicial da PCR.
Para a segunda fase da reação (Nested) um produto de amplificação de
aproximadamente 826 a 864 pares de base (dependendo da espécie/genótipo)
foi detectado pelos primers 5’-GGA AGG GTT GTA TTT ATT AGA TAA AG-3’
(Forward) e 5’-AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA-3’ (Reverse) (XIAO et al.,
2001; PAZ e SILVA et al., 2013).

4.6.2.2. Detecção molecular de Giardia duodenalis

Para o diagnóstico molecular de G. duodenalis foi utilizado um protocolo

baseado em uma reação de Nested-PCR. Uma região de aproximadamente
292 pares de base do gene SSU r-DNA, amplificada inicialmente segundo a
reação descrita por Hopkins et al., (1997) para uma reação única de PCR. Com
o produto obtido da reação de PCR, foi realizado uma reação de Nested-PCR
de acordo com o protocolo descrito por Read et al. (2002) e Macglade et al.
(2003).
Foram utilizados inicialmente os primers 5’-CAT CCG GTC GAT CCT
GCC-3’ (Forward) e 5’-AGT CGA ACC CTG ATT CTC CGC CAG G-3’
 32

(Reverse) (HOPKINS et al., 1997). Para a segunda fase da reação (nested) os

primers utilizados foram GiarF 5’-GAC GCT CTC CCC AAG GAC-3’ (Forward)
e GiarR 5’-CTG CGT CAC GCT GCT CG-3’ (Reverse) como descrito por Read
et al. (2002).

4.6.3. Amplificação do DNA de Lawsonia intracellularis, Cryptosporidium

spp. e Giardia spp.

As reações de PCR foram realizadas utilizando-se uma solução de

reagentes que já contém em seu interior o tampão de reação, DNTPS, MgCl2 e
a enzima DNA Polimerase (Go Taq® Green Master Mix), bastando apenas ao
usuário acrescentar à reação os primers e o DNA da amostra. Neste caso, de
forma semelhante as descrita acima, foram usados os primers específicos de
Lawsonia intracelullaris, Giardia duodenalis (gene SSU) e Cryptosporidium
parvum (gene SSU) para cada uma das reações com volume final de 25 µL,
contendo 12,5 µL de GoTaq® Green Master Mix buffer, 10 ρmol/µL de cada
primer (1µL do primer) e 5µL do DNA da amostra. As condições de
amplificação para cada um dos parasitas seguiram os seguintes protocolos: um
ciclo de incubação inicial a 98°C por 30 segundos, para desnaturação das fitas
de DNA, seguidos de 40 ciclos de 94°C por 30 segundos, 56°C por 30
segundos, 72°C por 30 segundos e uma extensão final de 72°C por 5 minutos
(L. intracellularis); um ciclo de incubação inicial a 96°C por 2 minutos, para
desnaturação das fitas de DNA, seguidos de 35 ciclos de 96°C por 20
segundos, 59°C por 20 segundos, 72°C por 30 segundos e uma extensão final
de 7 minutos a 72°C (G. duodenalis). Para C. parvum, foi realizado um ciclo de
incubação inicial a 98°C por 3 minutos, para desnaturação das fitas de DNA,
seguidos de 39 ciclos de 94°C por 45 segundos, 59,1°C por 45 segundos, 72°C
por 60 segundos e uma extensão final de 7 minutos a 72°C.
 33

4.6.4. Eletroforese em gel de agarose

Os produtos das reações de PCR foram submetidos à eletroforese em

gel de agarose a 1,5% em TBE (EDTA – tris bórico tamponado) e revelados
com Syber safe. Os fragmentos de DNA foram analisados comparativamente
com marcadores de 100 pares de base (bp), sendo analisadas e fotografados
em analisador de imagem ImageQuant 300 (GE).

4.7. Exames parasitológicos

O diagnóstico dos parasitas intestinais (helmintos) foi realizado a partir

da contagem e identificação dos ovos dos parasitas (OPG) pelo método de
Gordon & Whitlock (1939) modificado, utilizando-se a câmara de McMaster.

4.8. Análise dos resultados

Os resultados obtidos após a realização das técnicas diagnósticas para

identificação dos enteropatógenos e micro-organismos nas amostras fecais dos
animais estudados, bem como a avaliação macroscópica das fezes e das
respectivas alterações clinicopatológicas encontradas nos exames de
hemogasometria e hemograma foram analisadas descritivamente.
 34

5. RESULTADOS

Avaliando-se a distribuição dos potros com diarreia verificou-se que

33,93% (19/56) dos potros estavam distribuídos na primeira faixa etária (0-30
dias), 30,36% (17/56) se encontravam na segunda faixa etária (31-60 dias) e
35,71% (20/56) na terceira faixa etária (61-90 dias) [Tabela 1]. Os potros sem
sinais entéricos, 16,67% (10/60) estavam dentro da primeira faixa etária,
21,67% (13/60) na segunda faixa etária e 61,67% (37/60) na terceira faixa
etária (Tabela 1).

Tabela 1. Número de potros com (n = 56) ou sem (n = 60) diarreia, distribuídos

em três diferentes faixas etárias, provenientes de diferentes regiões do estado
de São Paulo (2011 – 2012).

Faixas etárias (dias)

0 – 30 31 – 60 61 - 90
Potros com diarreia 19 (33,93%) 17 (30,36%) 20 (35,71%)
Potros sem diarreia 10 (16,67%) 13 (21,67%) 37 (61,67%)
n = número de amostras

O exame físico dos 56 potros com diarreia, cujo tempo de evolução dos
sinais clínicos eram de 8,1 dias, revelaram em média, frequência cardíaca (FC)
de 87,6 batimentos por minuto (bpm), frequência respiratória (FR) de 41,8
movimentos por minuto (mpm) e temperatura média de 38,5 graus Celsius (°C)
(Tabela 2). O tempo de preenchimento capilar (TPC) do grupo dos animais com
diarreia foi 67,9% (38/56) com o TPC de um segundo; 23,2% (13/56) com o
TPC de dois segundos e 8,9% (5/56) com o TPC de três segundos. O grupo
dos potros sem diarreia apresentou, 86,7% (52/60) animais com o TPC de um
segundo e 13,33% (8/60) com o TPC de dois segundos. A avaliação do grau de
desidratação foi realizada nos dois grupos, dos quais 68% (38/56) dos potros
do grupo com diarreia apresentaram desidratação de leve a grave. O grau de
desidratação dos 38 potros com alterações clínicas evidentes, mostrou que
48,2% (27/56) dos potros com grau leve, 16% (9/56) grau moderado e 3,6%
(2/56) grau grave.
 35

A avaliação dos parâmetros clínicos, durante exame físico geral e

específico revelou que no grupo dos potros com (56) e sem diarreia (60), não
foram visualizados, halo endotoxêmico, nem mesmo alteração na coloração
das mucosas e postura. Portanto, todos os animais apresentavam coloração de
mucosas (oculopalpebrais e bucal) róseas e posição quadrupedal (FEITOSA,
2004).

Tabela 2. Média, mediana e desvio padrão dos valores referentes ao exame

físico e tempo de evolução da diarreia em 56 potros, provenientes de diferentes
regiões do estado de São Paulo (2011 – 2012).

Tempo de evolução (dias) FC (bpm) FR (mpm) Temperatura (°C)

Média 8,1 87,6 41,8 38,5
Mediana 2 84 36 38,7
Desvio padrão 20,4 24,1 20,3 1,5
bpm = batimentos por minuto
mpm = movimentos por minuto

O grupo sem (60) diarreia com idade média de 73,1 dias, apresentaram
frequência cardíaca de 85,7 batimentos por minuto (bpm), frequência
respiratória de 42 movimentos por minuto e temperatura média de 38,7 graus
Celsius (°C) [Tabela 3].

Tabela 3. Média, mediana e desvio padrão dos valores referentes ao exame

físico dos potros sem (n = 60) diarreia, provenientes de diferentes regiões do
estado de São Paulo (2011 – 2012).

FC (bpm) FR (mpm) Temperatura (°C)

Média 85,7 42,0 38,7
Mediana 80,0 36,0 38,7
Desvio padrão 30,6 18,8 0,6
bpm = batimentos por minuto
mpm = movimentos por minuto

A média dos valores hematimétricos obtidos, referente ao grupo dos 56

potros com diarreia, foram, 9,3x106 hemácia/µl, 10,0 hemoglobina g/dl, 35,2%
hematócrito, 37,5 fL volume corpuscular médio (VCM), 34,3% concentração de
hemoglobina corpuscular média (CHCM), 6,8 g/dL proteína plasmática, 23,2
distribuição de células vermelhas no sangue (RDW), 58,6x103 plaquetas por
 36

microlitro (µL) (5,4%, 4/56 com trombocitopenia), 492,1 gramas por decilitro
(g/dL) de fibrinogênio (26,8%, 15/56 com hiperfibrinogenemia), 10148,1
leucócitos por microlitro (12,5%, 7/56 com leucocitose), 75,0 metamielócitos por
microlitro, 199,8 bastonetes por microlitro, 4331,0 neutrófilos segmentados por
microlitro (17,8%, 10/56 com leucocitose), 4.331 linfócitos por microlitro (37,5%,
21/56 com neutrofilia), 87,5 eosinófilos por microlitro, 64,0 basófilos por
microlitro, 500 monócitos por microlitro (Tabela 4).
Os valores das médias, referente a hemogasometria realizada nos 56
potros com diarreia, apresentaram 7,3 de pH sanguíneo (16%, 9/56 com
acidose); 41,4 mm Hg de pressão de CO2 sanguíneo (PCO2); 35,8 mmHg de
pressão de O2 sanguíneo (PO2); 133,4 mmol/L de sódio (Na) (66%, 37/56 com
hiponatremia), 3,1 mmol/L de potássio (K) (39,3%, 22/56 com hipocalemia); 1,3
mmol/L de cálcio ionizado (iCa) (5,3%, 3/56 com hipocalemia); 31,7% de
hematócrito (Hct); 22,8 mmol/L de bicarbonato (HCO3) (16%, 9/56 com
diminuição do bicarbonato); 24,5 mmHg do total de dióxido de carbono
sanguíneo (tCO2), -2,1 mmol/L de excesso de base (BE), 59,4% de saturação
do oxigênio (sO2) e 10,8 g/dL de hemoglobina (Hb) (Tabela 5).
 37

Tabela 4. Média, mediana e desvio padrão dos valores hematimétricos referente aos 56 potros com diarreia, provenientes de
diferentes regiões do estado de São Paulo (2011 – 2012).

Hemácia/µL Hemoglobina g/dL Hematócrito % VCM (fL) CHCM % PT (plasma) g/dL RDW Plaquetas/µL Fibrinogenio (mg/dL) Leucócitos/µL Metamielócitos/µL Bastonetes/µL Segmentados/µL Linfócitos/µL Eosinófilos/µL Basófilos/µL Monócitos/µL

6 3 3 3 3
9,3x10 10,0 35,2 37,5 34,3 6,8 23,2 58,6x10 492,1 10,1x10 75,0 199,8 4,3x10 1,8x10 87,5 64,0 0,5x103

9,5x106 12,2 35,5 36,2 34,5 6,7 23,0 17675,0 600,0 9,3x103 76,0 110,5 1,6x103 1,7x103 19,0 42,5 288,0

1609641,7 4,8 5,9 4,8 2,1 0,9 1,8 100433,6 237,5 4973,1 69,1 237,2 4987,6 1728,9 148,1 77,8 633,4

Valores de referência:
Hemácia Hemoglobina Hematócrito Plaquetas Fibrinogenio Leucócitos Segmentados Linfócitos Eosinófilos Basófilos Monócitos
(x106/µL) g/dL % VCM (fL) CHCM % PT (plasma) g/dL RDW (x103/µL) (mg/dL) (x103/µL) Metamielócitos/µL Bastonetes/µL (x103/µL) (x103/µL) (x103/µL) (x103/µL) (x103/µL)

7,9 – 12 10,9 – 15,3 33,0 – 48,0 33,0 – 38,0 34,0 - 40 4,3 – 7,0 - 38,0 – 53,0 200 - 500 6,2 – 15,0 - - 4,1 – 5,4 1 – 4,9 0 – 0,55 0 – 0,07 0,07 – 0,76
Fonte: Koterba, A. M.; Drumond, W. H.; Koseh, P. C. Equine Clinical Neonatology, Philadelphia, 1990, Lea & Febier

Tabela 5. Média e desvio padrão dos valores hemogasométricos referente aos 56 potros com diarreia, provenientes de diferentes
regiões do estado de São Paulo.

pH PCO2 (mm Hg) PO2 (mm Hg) BE (mmol/L) HCO3 (mmol/L) tCO2 (mm Hg) SO2 (%) Na (mmol/L) K (mmol/L) iCa (mmo/L) Htc (%) Hb (g/dL)

7,3 ± 0,1 41,4 ± 5,5 35,8 ± 9,1 -2,1 ± 7,5 22,8 ± 5,4 24,5 ± 6,4 59,4 ± 11,7 133,4 ± 7,3 3,1 ± 0,7 1,3 ± 0,3 31,7 ± 6,7 10,8 ± 2,3

Valores de referência:
pH PCO2 (mm Hg) PO2 (mmHg) BE (mmol/L) HCO3 (mmol/L) tCO2 (mm Hg) SO2 (%) Na (mmol/l) K (mmol/l) iCa (mmol/L) Hb (g/dL)

7,32 – 7,44 52,7 – 114,2 15 – 42 -7,33 – 3,9 19 – 27,4 31 - 33 - 148 ± 12 4,8 ± 1 0,68 ± 0,6 10,9 – 15,3
Fonte: Koterba, A. M.; Drumond, W. H.; Koseh, P. C. Equine Clinical Neonatology, Philadelphia, 1990, Lea & Febier
 38

A avaliação macroscópica das fezes colhidas de 116 potros permitiu

constatar que, dos 56 animais que apresentavam diarreia, 64,29%
apresentavam fezes líquidas e 35,71% fezes pastosas amolecidas, com
predomínio da coloração esverdeada das fezes (60,71%), seguida da
coloração amarelada (28,7%), amarronzada (8,93%) e avermelhada (1,79%)
(Tabelas 6 e 7). O odor fétido das fezes foi observado em 64,29%, enquanto
que o restante dos animais 20 (35,71%) não apresentava alterações no odor
das fezes (Tabela 8). Foi observada a presença de sangue nas fezes de 1,79%
(1/56) deste grupo. Dos 60 potros sem sinais entéricos, 1,67% apresentaram
fezes pastosas, 96,67% apresentaram coloração esverdeada, seguidas de
1,67% (1/60), amareladas e 1,67% (1/60) amarronzadas (Tabelas 6 e 7). O
odor fétido das fezes foi observado em apenas 1 (1,66%) dos animais (Tabela
8).

Tabela 6. Avaliação do escore fecal em 116 potros com e sem diarreia,

provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo (2011 – 2012).

Consistência
Líquida Pastosa Consistente
Potros com diarreia 36 (64,29%) 20 (35,71%) 0
n = 56
Potros sem diarreia 0 1 (1,67%) 59 (98,33%)
n = 60
n = amostras testadas

Tabela 7. Característica da coloração das fezes e a presença ou não da

diarreia em 116 potros, provenientes de diferentes regiões do estado de São
Paulo (2011 – 2012).

Cor
Amarelada Amarronzada Esverdeada Avermelhada
Potros com diarreia 16 (28,7%) 5 (8,93%) 34 (60,71%) 1 (1,79%)
n = 56
Potros sem diarreia 1 (1,67%) 1 (1,67%) 58 (96,67%) 0 (0%)
n = 60
n = número de amostras testadas
 39

Tabela 8. Característica das fezes avaliando-se a relação do odor e a presença

ou não da diarreia em 116 potros, provenientes de diferentes regiões do estado
de São Paulo (2011 – 2012).

Odor
Característico Fétido
Potros com diarreia 20 (35,71%) 36 (64,29%)
n = 56
Potros sem diarreia 59 (98,33%) 1 (1,67%)
n = 60
n = amostras testadas

Ao avaliar as características físicas das fezes, pode ser observado

também que, dos 56 potros com diarreia, 94,63% (53/56) apresentavam
aumento na frequência de defecação e apenas 5% apresentavam frequência
normal. Em contraste, nos 60 animais sem sinais entéricos, apenas 3,33%
(2/60) apresentavam um aumento na frequência de defecação (Tabela 9).

Tabela 9. Avaliação da frequência de defecação de 116 potros (56 com diarreia

e 60 sem diarreia), provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo
(2011 – 2012).

Frequência de defecação
Aumentada Normal
Potros com diarreia 53 (94,64%) 3 (5,36%)
n = 56
Potros sem diarreia 2 (3,33%) 58 (96,67%)
n = 60
n = amostras testadas

Observou-se que dos potros com diarreia, em 89,3% (50/56) foram

encontrados os agentes pesquisados em suas amostras fecais (Tabela 10),
constatando-se em 32% (16/50) a presença de um agente (monoinfecção) e
em 68% (34/50) de dois ou mais agentes (Tabela 11). No grupo sem sinais
entéricos a taxa de detecção dos enteropatógenos nas amostras fecais foi de
80% (48/60) (Tabela. 10). Destes foi verificada em 20% (12/48) a presença de
monoinfecção e em 58,33% (28/48) o isolamento de mais de um
enteropatógeno (Tabela 11).
 40

Tabela 10. Detecção de enteropatógenos em amostras de fezes de potros com

e ou sem diarreia, provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo
(2011 – 2012).
Diarreia (n = 56) Sem Diarreia (n = 60)
Enteropatógenos n (%) n (%)
Amostras positivas 50 (89,30) 48 (80,00)
Amostras negativas 6 (10,70) 12 (20,00)
Total 56 (100,00) 60 (100,00)
n = amostras testadas
p<0,05

Tabela 11. Frequência de monoinfecção e coinfecção de enteropatógenos em

potros com e sem diarreia, provenientes de diferentes regiões do estado de
São Paulo (2011 – 2012).
Diarreia (n = 46) Sem Diarreia (n = 49)
Enteropatógenos n (%) n (%)
Monoinfecção 16 (32,00) 12 (25,00)
Coinfecção 34 (68,00) 28 (58,33)
n = amostras testadas

Escherichia coli foi o micro-organismo mais frequentemente isolado

(62,5%, 35/56), seguido de Salmonella sp. (25%, 14/56), C. perfringens
(17,86%, 10/56), Strongyloides (25%, 14/56), Estrongilídeos (10,71%, 6/56), R.
equi (7,14%, 4/56), Cryptosporidium spp. (5,36%, 3/56), C. difficile (1,78%,
1/56) e Coronavírus (1,78%, 1/56) no grupo dos potros com diarreia (Tabela
12). No grupo sem sinais entéricos a ordem decrescente dos enteropatógenos
isolados foi E. coli (61,66%, 37/60), Strongyloides (25%, 15/60),
Estrongilídeos (16,66%, 10/60), R. equi (10%, 6/60), C. perfringens (10%,
6/60), Salmonella spp. (6,67%, 4/60), C. difficile (1,67%, 1/60), Coronavírus
(1,67%, 1/60) e Cryptosporidium spp. (1,67%, 1/60) (Tabela 13).
Lawsonia intracellularis e rotavírus não foram detectados no grupo com
diarreia tampouco nos animais sem sinais entéricos [Tabela 12 e 13].
 41

Tabela 12. Frequência de enteropatógenos isolados em amostras de fezes

diarreicas de 56 potros distribuídos em três diferentes faixas etárias,
provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo (2011 – 2012).

Faixa etária (dias)

0 – 30 (n = 19) 31 – 60 (n = 17) 61 – 90 (n = 20) Total

Enteropatógenos n (%) n (%) n (%) n (%)
Escherichia coli 14 (73,70) 11 (70,59) 10 (55,00) 35 (62,50)
Salmonella sp. 2 (10,53) 5 (29,41) 7 (35,00) 14 (25,00)
Clostridium perfringens 7 (36,84) 3 (17,65) ND 10 (17,86)
Clostridium difficile 1 (5,26) ND ND 1 (1,78)
Rhodococcus equi 2 (10,53) 2 (11,76) ND 4 (7,14)
Lawsonia intracellularis ND ND ND 0
Coronavírus 1 (5,26) ND ND 1 (1,78)
Rotavírus ND ND ND 0
Giardia duodenalis ND 1 (5,88) ND 1 (1,78)
Cryptosporidium parvum 1 (5,26) 1 (5,88) 1 (5,00) 3 (5,36)
Estrongilídeos 2 (10,53) 1 (5,88) 3 (15,00) 6 (10,71)
Strongyloides 3 (15,79) 3 (17,65) 8 (40,00) 14 (25,0)
n = amostras testadas
ND = enteropatógeno não detectado

Tabela 13. Frequência de enteropatógenos isolados em amostras de fezes não

diarreicas de 60 potros distribuídos em três diferentes faixas etárias,
provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo (2011 – 2012).

Faixa Etária (dias)

0 – 30 (n = 10) 31 – 60 (n = 13) 61 – 90 (n = 37) total
Enteropatógenos n (%) n (%) n (%) n (%)
Escherichia coli 6 (50,00) 8 (61,54) 23 (62,16) 37 (61,66 )
Salmonella sp. ND 1 (7,70) 3 (8,10) 4 (6,67)
Clostridium perfringens 2 (20,00) 2 (15,40) 2 (5,40) 6 (10,00)
Clostridium difficile 1 (10,00) ND ND 1 (1,67)
Rhodococcus equi 2 (20,00) 2 (15,40) 2 (10,81) 6 (10,00)
Lawsonia intracellularis ND ND ND 0
Coronavírus ND ND 1 (2,70) 1 (1,67)
Rotavírus ND ND ND 0
Giardia duodenalis ND ND ND 0
Cryptosporidium parvum 1 (10,00) ND ND 1 (1,67)
Estrongilídeos 2 (20,00) 1 (7,70) 7 (21,62) 10 (16,66)
Strongyloides 2 (20,00) 1 (7,70) 12 (32,43) 15 (25,00)
n = amostras testadas
ND = enteropatógeno não detectado
 42

A frequência dos isolados de Salmonella spp. e subespécies, nos potros

com (56) diarreia, divididos em três faixas etárias foi, respectivamente,
Salmonella Saintpaul 5,26% (1/19, 0 a 30 dias) e 5,88% (1/17, 31 a 60 dias);
Salmonella Panama 5,26% (1/19, 0 a 30 dias) e 5% (1/20, 61 a 90 dias);
Salmonella Infantis 17,65% (3/17, 31 a 60 dias) e 10% (2/20, 61 a 90 dias);
Salmonella Typhimurium 15% (3/20, 61 a 90 dias); Salmonella entérica subsp.
Entérica (5,88%, 31 a 60 dias); Salmonella Muechen 5% (1/20, 61 a 90 dias),
representados pela tabela 14.

Tabela 14. Frequência de sorotipos em isolados do gênero Salmonella em 56

potros com diarreia, provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo
(2011 – 2012).

Faixa etária (dias)

0 – 30 31 - 60 61 - 90 Total
Enteropatógeno n = 19 n = 17 n = 20 56
Salmonella sp. 2 (10,53%) 5 (29,41%) 7 (35%) 14 (25,00%)
Salmonella Saintpaul 1 (5,26%) 1 (5,88%) ND 2 (3,57%)
Salmonella Panama 1 (5,26%) ND 1 (5,00%) 2 (3,57%)
Salmonella Infantis ND 3 (17,65%) 2 (10,0%) 5 (8,92%)
Salmonella Typhimurium ND ND 3 (15,0%) 3 (5,36%)
Salmonella subsp. Enterica ND 1 (5,88%) ND 1 (1,78%)
Salmonella Newport ND ND ND 0
Salmonella Muechen ND ND 1 (5,0%) 1 (1,78%)
n = amostras testadas
ND = enteropatógeno não detectado

A frequência dos isolados de Salmonella spp. e subespécies, nos potros

sem diarreia, divididos em três faixas etárias foi respectivamente, Salmonella
Saintpaul 2,7% (1/37, 61 a 90 dias); Salmonella Infantis 7,7% (1/13, 31 a 60
dias); Salmonella Typhimurium 2,7% (1/37, 61 a 90 dias); Salmonella Newport
2,7% (1/37, 61 a 90 dias), representados pela tabela 15.
 43

Tabela 15. Frequência de sorotipos do gênero Salmonella spp. e suas

subespécies em 60 potros sem diarreia, provenientes de diferentes regiões do
estado de São Paulo (2011 – 2012).

Faixa etária (dias)

0 – 30 31 - 60 61 - 90 Total
Enteropatógeno n = 10 n = 13 n = 37 60
Salmonella sp. ND 1 (7,70%) 3 (8,10%) 4 (6,66%)
Salmonella Saintpaul ND ND 1 (2,70%) 1 (1,66%)
Salmonella panamá ND ND ND 0
Salmonella Infantis ND 1 (7,70%) ND 1 (1,66%)
Salmonella Typhimurium ND ND 1 (2,70%) 1 (1,66%)
Salmonella subsp. Enterica ND ND ND 0
Salmonella Newport ND ND 1 (2,70%) 1 (1,66%)
Salmonella Muechen ND ND ND 0
n = amostras testadas
ND = enteropatógeno não detectado

A detecção dos enteropatógenos em monoinfecção e coinfecções

diagnosticados nos animais com diarreia, por ordem decrescente, estão
listados juntamente com as frequências dentro de três faixas etárias distintas
(Tabela 16).
 44

Tabela 16. Detecção de enteropatógenos em monoinfecções e em coinfecções

de amostras de fezes diarreicas de 56 potros, distribuídos em três diferentes
faixas etárias, provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo
(2011 – 2012).

0 – 30 dias 31 – 60 dias 61 – 90 dias Total

Enteropatógeno n = 19 (%) n = 17 (%) n = 20 (%) n (%)
E. coli fimH 1 (5,26) ND 0 1 (5) 2 (3,57)
E. coli 3 (15,79) 1 (5,88) 4 (20) 8 (14,28)
R. equi vap A (plasmídio 85kb) tipo I 1 (5,26) ND 0 ND 0 1 (1,78)
E. coli fimH + Cryptosporidium spp. ND 0 ND 0 1 (5) 1 (1,78)
Salmonella Typhimurium ND 0 ND 0 1 (5) 1 (1,78)
E. coli papC + C. perfringens Toxina A 1 (5,26) ND 0 ND 0 1 (1,78)
E. coli + C. perfringens Toxina A +C. difficile 1 (5,26) ND 0 ND 0 1 (1,78)
E. coli + C. perfringens Toxina A 2 (10,53) ND 0 ND 0 2 (3,57)
E. coli + Strongyloides ND 0 1 (5,88) ND 0 1 (1,78)
E. coli papC + Strongyloides + Estrongilídeos ND 0 ND 0 1 (5) 1 (1,78)
Salmonella. Saintpaul ND 0 1 (5,88) ND 0 1 (1,78)
E. coli + Salmonella ser. Saintpaul 1 (5,26) ND 0 ND 0 1 (1,78)
E. coli + C. perfringens Toxina A + Salmonella
Panama + Strongyloides + Estrongilídeos 1 (5,26) ND 0 ND 0 1 (1,78)
C. perfringens Toxina A + R. equi vap A + R. equi
(87kb) tipo I + Strongyloides + Coronavírus 1 (5,26) ND 0 ND 0 1 (1,78)
Salmonella Panama + Strongyloides ND 0 ND 0 1 (5) 1 (1,78)
E. coli fimH + E. coli papC + Salmonella Infantis
+ Strongyloides ND 0 ND 0 1 (5) 1 (1,78)
Salmonella Typhimurium + Strongyloides ND 0 ND 0 2 (10) 2 (3,57)
Salmonella enterica subsp. enterica +
Strongyloides + Estrongilídeos ND 0 1 (5,88) ND 0 1 (1,78)
Salmonella Muechen + Strongyloides ND 0 ND 0 1 (5) 1 (1,78)
Salmonella ser. Infantis + Strongyloides ND 0 1 (5,88) ND 0 1 (1,78)
E. coli fimH + E. coli ag43 + Salmonella Infantis +
C. perfringens Toxina A ND 0 1 (5,88) ND 0 1 (1,78)
Salmonella ser. Infantis + Strongyloides +
Estrongilídeos ND 0 ND 0 1 (5) 1 (1,78)
E. coli fimH + Salmonella Infantis ND 0 1 (5,88) ND 0 1 (1,78)
E. coli fimH + Strongyloides + Estrongilídeos 1 (5,26) ND 0 ND 0 1 (1,78)
E. coli fimH + E. coli ag43 1 (5,26) ND 0 ND 0 1 (1,78)
E.coli fimH + E. coli ag43 + C. perfringens
Toxina A + R. equi vap A + R. equi (85kb) tipo I +
R. equi (87kb) tipo I ND 0 1 (5,88) ND 0 1 (1,78)
E.coli + Strongyloides ND 0 ND 0 1 (5) 1 (1,78)
E. coli fimH + E. coli ag43 2 (10,53) 2 (11,76) 1 (5) 5(8.93)
E.coli fimH + E. coli ag43 + C. perfringens
Toxina A + R. equi (85kb) tipo I + Giardia sp. ND 0 1 (5,88) ND 0 1 (1,78)
E.coli hemol 1 (5,26) 1 (5,88) ND 0 2 (3,57)
E. coli fimH + E. coli ag43 + E. coli hemol +
Estrongilídio ND 0 ND 0 1 (5) 1 (1,78)
C. perfringens Toxina A ᵦ2 1 (5,26) ND 0 ND 0 1 (1,78)
E. coli fimH + E. coli ag43 + Cryptosporidium
spp. ND 0 1 (5,88) ND 0 1 (1,78)
E.coli fimH + E. coli ag43 e papC + E. coli hemol. ND 0 1 (5,88) ND 0 1 (1,78)
Cryptosporidium spp. 1 (5,26) ND 0 ND 0 1 (1,78)
n = amostras testadas
ND = enteropatógeno não detectado
 45

No grupo controle foram observadas monoinfecções e coinfecções, as

quais estão listadas na tabela 17, juntamente com a subdivisão dos animais
acometidos em três diferentes faixas etárias.

Tabela 17. Detecção de enteropatógenos em monoinfecções e em coinfecções

de amostras de fezes não diarreicas de 60 potros distribuídos em três
diferentes faixas etárias, provenientes de diferentes regiões do estado de São
Paulo (2011 – 2012).

0 – 30 dias 31 – 60 dias 61 – 90 dias Total

Enteropatógeno n = 10 (%) n = 13 (%) n = 37 (%) n (%)
E. coli fimH + E. coli ag43 + Salmonella
Typhimurium ND 0 ND 0 1 (2,70) 1 (1,67)
E. coli ND 0 2 (15,38) 5 (13,51) 7 (11,7)
E. coli + C. perfringens Toxina A + C. perfringens
toxina A β 2 ND 0 1 (7,7) ND 0 1 (1,67)
E. coli + Strongyloides ND 0 ND 0 2 (5,40) 2 (3,33)
R. equi avirulento + Strongyloides ND 0 ND 0 1 (2,70) 1 (1,67)
Strongyloides ND 0 ND 0 1 (2,70) 1 (1,67)
E. coli ag43 + Salmonella Saintpaul + R. equi vap
A ND 0 ND 0 1 (2,70) 1 (1,67)
E. coli ag43 ND 0 1 (7,7) 3 (8,11) 1 (1,67)
E.coli + Coronavírus ND 0 ND 0 1 (2,70) 1 (1,67)
E. coli + Salmonella ser. Infantis ND 0 1 (7,7) ND 0 1 (1,67)
E. coli fimH + E. coli ag43 + Salmonella Newport
+ Strongyloides ND 0 ND 0 1 (2,70) 1 (1,67)
E. coli fimH + E. coli ag43 + Strongyloides 2 (20) ND 0 1 (2,70) 3 (5)
E. coli fimH + E. coli ag43 ND 0 1 (7,7) 3 (8,11) 4 (6,67)
E.coli fimH + E. coli ag43 + C. perfringens Toxina
A + Estrongilídeos ND 0 ND 0 1 (2,70) 1 (1,67)
C. perfringens Toxina A 1 (10) ND 0 ND 0 1 (1,67)
E. coli fimH ND 0 1 (7,7) ND 0 1 (1,67)
E.coli + C. perfringens Toxina A +C. difficile A/B +
R. equi 1 (10) ND 0 ND 0 1 (1,67)
E.coli fimH + E. coli ag43 + E. coli papC + C.
perfringens Toxina A + ND 0 ND 0 1 (2,70) 1 (1,67)
E.coli hemol 1 (10) 1 (7,7) ND 0 2 (3,33)
Estrongilídio ND 0 ND 0 1 (2,70) 1 (1,67)
E.coli fimH + E. coli ag43 + E. coli papC ND 0 ND 0 1 (2,70) 1 (1,67)
C. perfringens Toxina A β 2+ C. perfringens
toxina A + R. equi vap A + R. equi (plasmídio
87kb) tipo I + Strongyloides + Estrongilóides ND 0 1 (7,7) ND 0 1 (1,67)
R. equi avirulento 1 (10) 1 (7,7) ND 0 2 (3,33)
E.coli ag43 + Strongyloides ND 0 ND 0 1 (2,70) 1 (1,67)
E.coli ag43 + Strongyloides + Estrongilídeos ND 0 ND 0 1 (2,70) 1 (1,67)
Strongyloides + Estrongilídeos ND 0 ND 0 3 (8,11) 3 (5)
E. coli fimH + E. coli ag43 + Estrongilídeos 1 (10) ND 0 ND 0 1 (1,67)
Estrongilídio ND 0 ND 0 1 (2,70) 1 (1,67)
E. coli fimH + E. coli ag43 + Cryptosporidium spp. 1 (10) ND 0 ND 0 1 (1,67)
n = amostras testadas
ND = enteropatógeno não detectado
 46

A identificação e contagem de ovos por grama de fezes do grupo dos

potros com diarreia revelou 20 animais positivos. Destes, 6 foram positivos
para S. westeri, correspondendo a 10,53% (0 a 30 dias), 6,0% (31 a 60 dias) e
15% (61 a 90 dias) no total de animais por cada faixa etária do estudo (Tabela
18). Os 14 animais infectados por Strongyloides apresentaram uma ocorrência
de 15,80% (0 a 30 dias), 15,80% (31 a 60 dias) e 40% (61 a 90 dias) (Tabela
18).

Tabela 18. Identificação dos endoparasitas e o total da contagem de ovos por

grama de fezes de 20 potros* com diarreia, divididos em três faixas etárias,
provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo (2011 – 2012).

Faixa etária (dias)

0 - 30 (n = 19) 31 - 60 (n = 17) 61 - 90 (n = 20)
Enteropatógeno n n n
Estrongilídeos 2 (10,53%) 1 (6,0%) 3 (15%)
Potro 3 (O.P.G) 800
Potro 7 (O.P.G) 50
Potro 14 (O.P.G) 8500
Potro 17 (O.P.G) 3100
Potro 18 (O.P.G) 50
Potro 24 (O.P.G) 350
Strongyloides (S. westeri) 3 (15,80%) 3 (15,80%) 8 (40%)
Potro 1 (O.P.G) 500
Potro 3 (O.P.G) 450
Potro 7 (O.P.G) 550
Potro 8 (O.P.G) 38550
Potro 9 (O.P.G) 250
Potro 10 (O.P.G) 50
Potro 11 (O.P.G) 1500
Potro 12 (O.P.G) 400
Potro 14 (O.P.G) 10900
Potro 15 (O.P.G) 1250
Potro 16 (O.P.G) 400
Potro 17 (O.P.G) 400
Potro 18 (O.P.G) 550
Potro 21 (O.P.G) 750
Potro* = animais positivos para endoparasitas, testados pelo método de Gordon & Whitlock (1939) modificado
n = amostras testadas
O.P.G = ovos por grama de fezes
 47

A identificação e contagem de ovos por grama de fezes do grupo dos

potros sem diarreia revelou 25 animais positivos, destes, 10 estavam positivos
para S. westeri, correspondendo a 20% (0 a 30 dias), 7,7% (31 a 60 dias) e
18.9% (61 a 90 dias) no total de animais por faixa etária (Tabela 17). Os 15
animais infectados por Strongyloides tiveram uma distribuição de 20% (0 a 30
dias), 7,7% (31 a 60 dias) e 32,43% (61 a 90 dias) (Tabela 19).

Tabela 19. Identificação dos endoparasitas e o total da contagem de ovos por

grama de fezes de 25 potros* sem diarreia, divididos em três faixas etárias,
provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo.

Faixa etária (dias)

0 - 30 (n = 10) 31 - 60 (n = 13) 61 - 90 (n = 37)
Enteropatógeno n n n
Estrongilídeos 2 (20%) 1 (7,70%) 7 (19%)
Potro 22 (O.P.G) 500
Potro 25 (O.P.G) 250
Potro 26 (O.P.G) 1100
Potro 28 (O.P.G) 50
Potro 31 (O.P.G) 18500
Potro 32 (O.P.G) 50200
Potro 34 (O.P.G) 2350
Potro 35 (O.P.G) 700
Potro 36 (O.P.G) 19500
Potro 37 (O.P.G) 20450
Strongyloides (S. westeri) 2 (20) 1 (7,70) 12 (32,43)
Potro 2 (O.P.G) 12000
Potro 4 (O.P.G) 3900
Potro 5 (O.P.G) 7500
Potro 6 (O.P.G) 11200
Potro 13 (O.P.G) 250
Potro 19 (O.P.G) 5000
Potro 20 (O.P.G) 30700
Potro 26 (O.P.G) 950
Potro 27 (O.P.G) 850
Potro 28 (O.P.G) 300
Potro 29 (O.P.G) 50
Potro 31 (O.P.G) 5000
Potro 33 (O.P.G) 500
Potro 35 (O.P.G) 50
Potro 37 (O.P.G) 50
Potro* = animais positivos para endoparasitas, testados pelo método de Gordon & Whitlock (1939) modificado
n = amostras testadas
O.P.G = ovos por grama de fezes
 48

O isolamento de micro-organismos considerados menos comum em

potros, tais como Hafnia alvei, Enterobacter aglomerans e Providencia rettgeri
(potro 41 dias a haras 11); Proteus vulgaris (potro 90 dias a haras 13);
Citrobacter freundi (potro 90 dias a haras 13); Citrobacter sp. (potro 60 dias –
haras 13); Proteus mirabilis (potro 2 dias a hospital veterinário) no grupo dos
animais com diarreia estão representados pela tabela 20.

Tabela 20. Micro-organismos, entéricos menos comuns em potros, isolados de

5 animais com diarreia, provenientes de diferentes regiões do estado de São
Paulo (2011 – 2012).

Isolalamento Idade (dias) Propriedade

Hafnia alvei + Proteus mirabilis 24 Haras 2
Hafnia alvei + Enterobacter agglomerans + Providencia rettgeri 41 Haras 11
Proteus vulgaris 90 Haras 13
Citrobcter freundi 90 Haras 13
Citrobacter sp. 60 Haras 13
ND 70 Haras 6
ND = micro-organismo não detectado

O grupo controle (60) permitiu o isolamento de Serratia rubidaea e

Edwardisiella aglomerans (potro 1 dia, haras 7); Edwardsiella tarda (potro 60
dias, haras 12); Citrobacter sp. e Hafnia alvei (potro 90 dias, haras 12);
Citrobacter spp. (potro 80 dias – haras 14); Edwardsiella tarda (potro 90 dias,
haras 15), como no grupo dos animais com diarreia, estes não possuíram
qualquer associação com micro-organismos patogênicos (Tabela 21).
 49

Tabela 21. Micro-organismos, menos comuns em potros, isolados de 6 animais

sem diarreia, provenientes de diferentes regiões do estado de São Paulo (2011
– 2012).

Isolalamento Idade (dias) Propriedade

Serratia rubidaea + Edwardsiella aglomerans 1 Haras 7

Enterobacter agglomerans 60 Haras 11
Edwardsiella tarda 60 Haras 12
Citrobacter sp. + Hafnia alvei 90 Haras 12
Citrobacter spp. 80 Haras 14
Edwardsiella tarda 90 Haras 15
ND 83 Haras 1
ND 68 Haras 6
ND 113 Haras 11
ND 1 Haras 12
ND 60 Haras 14
ND 80 Haras 14
nd = não detectado
ND = micro-organismo não detectado

A frequência de mortalidade durante a ocorrência dos surtos nos potros

com diarreia foi de 13,33% (6/56), já o grupo controle apresentou 3,33% (2/60)
de óbitos (tabela 22). A taxa de letalidade referente aos potros com diarreia foi
de 100% (1/1) no haras 5, 14,3% (1/7) no haras 8, 100% (2/2) no haras 9,
100% (2/2) no haras 10, 33,33% (1/3) no haras 14. Estes dados, o município
dos criatórios e a raça dos animais estão listados na tabela 23. Nos haras onde
ocorreram as mortes dos potros, os enteropatógenos isolados em
monoinfecção e coinfecções dos animais com diarreia foram, respectivamente,
E. coli juntamente com C. perfringens Toxina A e Salmonella Panama; E. coli
fimbria H, E. coli papC e Salmonella Infantis; Salmonella Typhimurium;
Salmonella entérica subsp. enterica; Salmonella Muechen. Dentre os animais
mortos apenas um não foi possível a identificação de qualquer enteropatógeno
estudado. O grupo dos animais sem diarreia que vieram a óbito foi possível
isolar E. coli e Salmonela Infantis; E. coli fimH, E. coli ag43 e Salmonella
Newport (Tabela 24).
 50

Tabela 22. Frequência de mortalidade em 56 potros com diarreia e 60 sem

sinais entéricosem criatórios de diferentes regiões do estado de São Paulo
(2011 – 2012).

Mortalidade
Não Sim
Potros com diarreia 39 (86,67%) 6 (13,33%)
n = 56
Potros sem diarreia 58 (96,66%) 2 (3,33%)
n = 60
n = amostras testadas

Tabela 23. Relação entre o número de potros com (n = 56) e sem diarreia (n =
60), raças acometidas e taxa de mortalidade dos animais, provenientes de
diferentes regiões do estado de São Paulo (2011 – 2012).
Total de Potros com Potros sem
potros diarreia diarreia Mortalidade Letalidade
Propriedade Município Raça n n n n (%) (%)
Haras 1 Americana Puro Sangue Inglês 10 7 3 ND ND
Haras 2 Orlândia Brasileiro de Hipismo 14 7 6 ND ND
Haras 3 Cesário Lange Puro Sangue Inglês 10 1 3 ND ND
Haras 4 Tupã Quarto de milha 14 2 0 ND ND
†
Haras 5 Botucatu Manga Larga Paulista NI 1 0 1 (100)
Haras 6 Arandu Puro Sangue Inglês NI 1 2 ND ND
Haras 7 Quadra Manga Larga Paulista 40 1 1 ND ND
†
Haras 8 Catanduva Manga Larga Paulista 60 7 1 1 (1,66) (14,8)
† †
Haras 9 Cerqueira César Manga Larga Paulista 30 2 1 2 (6,66) (100)
Haras 10 Bauru Quarto de Milha 12 2 †† 1† 3 (25) (100)
Haras 11 Bauru Quarto de Milha 22 7 9 ND ND
Haras 12 Brotas Quarto de Milha 62 9 19 ND ND
Haras 13 Bofete Quarto de Milha 10 3 0 ND ND
Haras 14 Botucatu Quarto de Milha 8 3† 4 1 (12,5) (33,33)
Haras 15 Avaré Paint Horse 20 0 10 ND ND
Hospital Botucatu Quarto de milha NI 1 ND ND ND
Veterinário
Botucatu Mestiço NI 2 ND ND ND
Total 56 60 8 8
† = indica o número de mortes nos grupos com e sem diarreia.
n = número de animais
ND = não detectado
NI = não informado
 51

Tabela 24. Número de potros com (6) e sem (2) diarreia que vieram a óbito e
os respectivos enteropatógenos isolados, em diferentes propriedades do
interior do Estado de São Paulo (2011 – 2012).

Agentes Isolados Idade (dias) Haras

 E. coli + C. perfringens Toxina A + Salmonella
Potros com diarreia Panama + Strongyloides + Estrongilídeos 9 5
 E. coli fimH + E. coli papC + Salmonella. Infantis +
Strongyloides 90 8
 Salmonella Typhimurium + Strongyloides 90 9
 Salmonella enterica subsp enterica +
Strongyloides + Estrongilídeos 40 10
 Salmonella ser. Muechen + Strongyloides 90 10
 ND 1 14
Potros sem diarreia  E. coli + Salmonella Infantis 60 9
 E. coli fimH + E. coli ag43 + Salmonella Newport +
Strongyloides 90 10
ND = não detectado
 52

6. Discussão
Estudos sobre os agentes etiológicos envolvidos na síndrome diarreia,
bem como as principais alterações clínicas dos potros acometidos tem sido o
foco de inúmeros pesquisadores, visando minimizar o custo com tratamentos
inadequados e subdesenvolvimento destes animais, além deste conhecimento
facilitar a adoção de medidas preventivas. No Brasil, esta pesquisa apresenta
como peculiaridade a abordagem de potros até o terceiro mês de vida,
investigando os principais agentes etiológicos de origem bacteriana, viral e
parasitária envolvidos na diarreia. Em contraste, estudos anteriores tinham
como objetivo determinar a prevalência de um único agente etiológico, restritos
a relatos de casos ou surtos ocorridos em regiões restritas ou em um criatório
(VARGAS & RIGOLON, 1998; MELO et al., 2007; GOMES et al., 2008;
MEIRELES et al., 2008; GUIMARÃES-LADEIRA et al., 2009; TOSCAN et al.,
2010). Em outros países, estudos retrospectivos e pesquisas para determinar
coinfecções entéricas em potros com diarreia já haviam sido realizados. No
entanto, estes estudos não apresentavam a variedade de espécies de
enteropatógenos investigados no presente trabalho (FREDERICK ET AL.,
2009; SLOVIS et al., 2010; HARRIS et al., 2012).
Durante a realização dos exames físicos dos potros nos grupos com e
sem diarreia, não foi observado halo endotoxêmico, tampouco alterações na
coloração das mucosas e postura. Assim, todos os animais apresentavam
coloração de mucosas (oculopalpebrais e bucal) róseas e estavam em posição
quadrupedal (FEITOSA, 2004). A auscultação do sistema digestório nos
animais amostrados permitiu identificar o aumento da motilidade intestinal no
grupo dos potros com diarreia, somado ao aumento da frequência de
defecação em 94,6% (53/56), consideradas anormalidades que caracterizam o
quadro de diarreia (RADOSTITS et al., 2002).
Ao avaliar a desidratação nos dois grupos estudados, constatou-se que
estes sinais foram observados somente no grupo dos animais com diarreia, dos
quais 48,2% (27/56) apresentaram grau leve, 16% (9/56) moderado e 3,6%
(2/56) grave, confirmando que a desidratação é um dos principais sinais
clínicos observados em potros com diarreia (FEITOSA, 2004). Em contraste,
dentre os animais desidratados, o TPC estava alterado em apenas 5,3% (2/38)
 53

dos animais, mostrando não ser um parâmetro passível de ser utilizado

exclusivamente para avaliar a presença ou não da desidratação (FEITOSA,
2004). Durante avaliação física dos potros com diarreia, não foram observadas
alterações nas médias da frequência cardíaca (84,6bpm ± 24,1), frequência
respiratória (36mpm ± 20,3) e temperatura (38,7°C ± 1,5), de maneira similar,
Frederick et al. (2009), também não identificou alterações significativas nestes
parâmetros em potros com diarreia.
As alterações macroscópicas das fezes de potros com diarreia
encontradas no presente estudo, coincidem com os achados de Oliveira Filho
et al. (2007) no Brasil, que avaliaram estas mesmas características em
bezerros nelores com diarreia e concluíram que as alterações do aspecto das
fezes são multifatoriais, decorrentes do manejo alimentar e da patogenicidade
dos enteropatógenos.
Os valores médios obtidos durante avaliação hematológica dos potros
com diarreia foram, hematócrito (35,2% ± 5,9), VCM (37,5fL ± 4,8), CHCM
(34,3% ± 2,1), eosinófilos (87,5/µL ± 77,8) e monócitos (0,5x103 ± 633,4) foram
observados dentro da normalidade para a espécie e idade dos animais
estudados. Em contraste, o valor médio das hemácias (9,3x106/µL ± 1,6x103)
estava diminuído, com 5,4% (3/56) dos potros com valor médio de 6,4x106/µL
(±1,3x106). O valor médio do número de plaquetas (58,6x103/µL ± 0,10x103)
também estava diminuído, com 5,4% (3/56) dos animais com trombocitopenia
(1,6x106/µL ± 1,2x106). O valor médio do fibrinogênio estava normal (492,1 ±
237,5), com 26,8% (15/56) dos potros com valores acima da referência
(600mg/dL ± 0,97). O valor médio de leucócitos estava dentro da normalidade
(10,1x103/µL ± 4973), embora, 12,5% (7/56) dos animais apresentavam
leucocitose (16,5x103/µL). De maneira similar aos leucócitos totais, o valor
médio de neutrófilos encontrava-se dentro da normalidade (4,3x103/µL ±
4987,6), com 17,8% (10/56) dos animais com neutrofilia (9,3 x103/µL ±
4,4x103). Igualmente, o valor médio dos linfócitos estava dentro da normalidade
(1,8x103/µL ± 1,7 x103), apesar de que 37,5% (21/56) dos potros acusavam
linfocitose (3,1x103/µL ± 1,5 x103) [KOTERBA & DRUMOND, 1990; ORSINI &
DIVERS, 2008; AOKI & ISHII, 2012]. Os valores hematológicos encontrados
nos potros amostrados são equivalentes aos obtidos por Frederick et al. (2009),
 54

que ao investigarem o número de leucócitos, linfócitos, neutrófilos, proteína

total e fibrinogênio de 192 potros com diarreia, que sobreviveram as infecções
e 31 potros mortos com diarreia, não observaram diferença significativa nos
valores hematológicos entre os grupos.
Durante exame hemogasométrico dos 56 potros com diarreia, foi
possível verificar que, apesar da média do pH sanguíneo (7,3 ± 1) apresentar-
se de acordo com os valores de referência para a espécie e idade dos potros
estudados, 16% (9/56) apresentaram acidose (7,25 ± 0,1) [KOTERBA &
DRUMOND, 1990; BROMMER et al., 2001]. O valor médio do bicarbonato
(22,8mmol/L ± 5,4) dos potros encontrava-se normal, embora 16% (9/56) dos
animais apresentavam diminuição do bicarbonato (15,1mmol/L ± 3,4). O valor
médio de sódio foi abaixo dos níveis normais (133,4mmol/L ± 7,3), com 66%
(37/56) dos animais com hiponatremia (131mmol/L ± 3,3). A diminuição do
sódio nos potros pode ser justificada pela perda provocada pela diarreia,
podendo levar a quadros neurológicos, com alteração do estado mental,
fraqueza, letargia e hipotensão e taquicardia (AYUS et al., 1982; SCHAER,
1999). O valor médio de potássio no sangue (3,1mmol/L ± 0,7) foi abaixo dos
níveis normais, com 39,3% (22/56) dos potros com hipocalemia (2,55mmol/L ±
0,3). Este achado também pode ser justificado pelo excesso de perda ou má
absorção provocada pela diarreia, causando fraqueza, redução da motilidade e
deficiência na função respiratória (BORER & CORLEY, 2006). O valor médio
de cálcio apresentado encontrava-se dentro da normalidade (1,3 mmol/L ± 0,3),
com apenas 5,3% (3/56) dos animais com hipocalcemia. Segundo Gasthuys et
al. (1991) e Grubb et al. (1996) a hipocalcemia é justificada pela perda de
cálcio em animais com diarreia, endotoxemia e septicemia, levando a fraqueza,
fasciculações e tetania. Os valores hemogasométricos encontrados corroboram
com os resultados obtidos por Frederick et al. (2009), que também obervaram
que os valores do pH, excesso de base, bicarbonato e os íons sódio e potássio
não diferiram entre grupos de potros com diarreia que vieram a óbito ou
sobreviveram.
No presente trabalho, foi possível a identificação de ao menos um dos
enteropatógenos estudados em 80% (48/60) das amostras de fezes dos potros
sem sinais entéricos e 89,3% (50/56) das amostras dos animais do grupo com
 55

diarreia. Esta frequência da detecção dos enteropatógenos nos dois grupos

difere da identificada por Frederick et al. (2009), que observou somente 55%
(122/223) de enteropatógenos em potros com diarreia. em estudo similar Slovis
et al. (2010), detectaram 48% de enteropatógenos no grupo sem diarreia e
71% nos potros com diarreia. A maior frequência de enteropatógenos
detectados no presente estudo pode ser justificado pelo maior número de
micro-organismos investigados, particularmente, E. coli, Giardia sp.,
Estrongilídeos e Strongyloides, os quais com exceção da Giardia sp., foram
detectados com frequência nos isolados dos animais com e sem diarreia.
A alta frequência no isolamento de micro-organismos nos grupos
estudados ocorreu principalmente pela alta taxa de detecção da E. coli e certos
fatores de virulência, correspondendo a 62,5% de isolados dos 56 potros com
diarreia e 61,66% dos 60 potros sem diarreia. A alta ocorrência de, E. coli era
prevista devido ao fato desta bactéria pertencer a microbiota intestinal de
potros (HOLLAND et al., 1989; HOLLAND et al., 1996; VAN DUIJKEREN et al.,
2000).
De maneira igual, a detecção de enteropatógenos nos potros com
diarreia foi mais elevada se comparada aos animais sem sinais entéricos, em
relação ao número de isolados por faixa etária. Neste contexto E. coli foi
isolada com maior frequência nas duas primeiras faixas etárias do grupo com
diarreia (73,3% dos potros de 0 a 30 dias e 70,59% entre 31 a 60 dias) quando
comparada ao grupo controle (50% entre 0 a 30 dias e 61,5% dos animais com
31 a 60 dias). De maneira similar, Holland et al. (1989) observou 61,6%
estirpes de E. coli foram detectadas de 61 potros com diarreia e 38,4% de 38
potros sem diarreia. Harris et al. (2012) relataram o isolamento de 100% (9/9)
de E. coli de amostras de fezes de potros com diarreia e 84,1% (127/151) em
amostras de animais sem sinais entéricos, reforçando a alta frequência do
patógeno em potros com e sem diarreia, visto que a bactéria é integrante da
microbiota normal de diversas espécies, incluindo equinos (QUINN et al., 1994;
HOLLAND et al., 1996).
Apesar da diversidade de fatores de virulência investigados nas
linhagens de E. coli, a identificação de isolados potencialmente patogênicos
ocorreu tanto em potros normais quanto em potros diarreicos (HOLLAND et al.,
 56

1996; Van DUIJKEREN et al., 2000). Entretanto, a detecção dos genes fimH e
ag43 de E. coli foi identificada com maior frequência nos potros com diarreia
quando comparados ao grupo controle. Curiosamente, não foram encontrados
na literatura consultada estudos que relacionem estes genes diretamente na
diarreia em potros, visto que, comumente estão associados às infecções
urinárias em humanos e animais (GYLES, 1992; LÜTHJE & BRAUNER, 2010).
O gene papC de E. coli foi detectado em seis isolados de E. coli (quatro no
grupo com diarreia e um sem sinais entéricos). Apesar da baixa frequência nos
isolados, este gene está relacionado diretamente a infecções do sistema
urinário em humanos e animais, podendo estar relacionado a causa da diarreia
(NORGREN et al., 1984).
Neste estudo, avaliando-se os isolados de E. coli, não houve a detecção
das fímbrias F4 (K88) e F41, já isoladas anteriormente em potros com diarreia,
relatados por Ward et al. (1986).
Salmonella spp. foi detectada em 25% (14/56) dos dos potros
amostrados com diarreia e 4% no grupo sem diarreia. A alta detecção do
gênero Salmonella spp. nos potros com diarreia corroboram com os achados
de East et al. (1998) que obtiveram 22% (12/54) de isolamento de Salmonella
sp., enquanto Van Duijkeren et al. (1994) isolaram 18% (69/380) de Salmonella
spp. das fezes diarreicas de equinos de diferentes idades. Neste último estudo
foram identificados S. Typhimurium (62,31% - 43/69), S. Hadar (4,35% - 3/69),
S. Arizona (2,90% - 2/69), S. enteretidis (2,90% - 2/69), S. virchow (1,45% -
1/69), S. blockey (1,45% - 1/69) e S. bareilly (1,45% - 1/69). No presente
estudo, foi possível identificar, S. Saintpaul (3,57% - 2/56), S. Panama (3,57% -
2/56), S. Infantis (8,92% - 5/56), S. Typhimurium (5,36% - 3/56), S. entérica
subsp enterica (1,78% - 1/56) e S. Muechen (1,78% - 1/56) no grupo dos poros
com diarreia. A maior frequência dos isolados de Salmonella spp. no grupo
com diarreia e também em todos os potros que vieram a óbito dentre os
animais amostrados reforça a importância deste enteropatógeno como agente
causal de doença em potros até três meses de vida.
Estudos realizados por McDonough et al. (1999) mostram que a S.
enterica Typhimurium é o sorotipo mais comumente encontrado em bezerros
de 2 a 8 semanas de vida. Em humanos Beltran et al. (1988) mostram que S.
 57

Infantis e S. Typhimurium apresentam-se com uma maior frequência de

isolados em casos de diarreia, semelhantemente aos resultados encontrados
nos potros estudados, indicando os reflexos em saúde pública de isolamento
destes sorotipos, devido ao fato do contato de humanos com potros e seu
ambiente nos criatórios.
No presente estudo, foi identificado 2,6% (3/116) de S. Saintpaul.
Relatos de Hird et al. (1984), descrevem as infecções por S. Saintpaul em 20%
(33/165) dos equinos hospitalizados. Destes a grande maioria foram animais
intubados com sonda nasogástrica e/ou submetidos a antibioticoterapia,
mostrando a patogenicidade deste sorotipo na espécie equina.
O sorotipo Newport não foi identificado nos animais com diarreia. No
entanto, foi isolado em um potro sem sinais entéricos, o qual veio a óbito no
período de ocorrência do surto no haras. Relatos de surtos por Salmonella
Newport, descritos por Schaer et al. (2010), mostraram que além de
patogenicidade e capacidade de infecção, apresenta taxa de letalidade de
36,1%, em um estudo realizado com diversas epécies de animais, onde a
maioria (n=54) eram equinos.
O sorotipo Muechen foi detectado apenas no grupo de animais com
diarreia representando 1,78% (1/56) dos isolados, corroborando com os
resultados obtidos por Piddock et al. (1998), que identificou S. Muechen
somente em 1,88% (2/108) dos isolados onde foram avaliados algumas
espécies de animais de produção, selvagens e de companhia, mostrando a
baixa frequência deste sorotipo nas infecções em animais.
A detecção C. perfringens apresentou maior frequência no grupo com
diarreia (10/56) comparado ao grupo sem sinais entéricos (6/60), ambos
enterotoxigênicos. Estudo prospectivo realizado por Weese et al. (2001),
identificou de forma similar 28,6% (8/28) de C. perfringens enterotoxigênico em
potros diarreicos.
Foram isoladas 19 linhagens de C. perfringens nos animais amostrados,
das quais, duas produtoras da toxina beta-2 e 16 linhagens com presença da
toxina A, representando 17,86% (10/56) dos isolamentos em animais com
diarreia. Estes resultados assemelham-se encontrados por Netherwood et al.
(1998), os quais obtiveram 34,8% (184/529) de C. perfringes isolados de potros
 58

com diarreia, dos quais 90% eram C. perfringens produtores da toxina Tipo A,
reforçando a alta frequência deste patógeno, particularmente nos isolados
produtores de toxina A, na gênese da casuística de diarreia em potros.
C. difficile foi detectado em igual proporção nos potros com e sem
diarreia, totalizando 1,7% (2/116) dos isolados. Apesar do número de
isolamentos serem proporcionalmente menores do que os encontrados por
Baverud et al. (2003), que em 777 cavalos (277 potros), identificaram 9% (2/22)
dos isolados como C. difficile em potros com diarreia (5 dias a 7 meses) e 8%
(17/226), não tratados previamente com antimicrobianos); o baixo número de
isolamentos de C. difficile em potros mostra que, a frequência dos isolamentos
desta bactéria não difere entre os animais do grupo com e sem diarreia e
provavelmente exerça menor influência como patógeno das infecções
entéricas.
A frequência de R. equi nos isolamentos do grupo com diarreia foi de
7,14% (4/56) e do grupo sem diarreia de 10% (6/60). No grupo com diarreia
foram observados 4 linhagens de R. equi vapA 85k ou 87kb tipo I, enquanto
que nos potros sem sinais entéricos foi detectado apenas 1 isolado 85 ou 87kb
tipo I. Apesar da distribuição semelhante entre o grupo com diarreia e o grupo
controle, Takai et al. (1996) mostram grande número de isolamentos (até
40,9%) de R. equi avirulento nas amostras de fezes de potros sadios. No
presente trabalho, pôde ser observado que, dos animais com diarreia, a faixas
etárias acometidas com isolamento de linhagens virulentas (vap A 85 e 87kb
tipo I), foram entre 0 a 30 (10,53%, 2/19) e 31 a 60 (11,76%, 2/17) dias de vida,
que coincide com a faixa etária com maior ocorrência de potros doentes
(COHEN et al., 2008).
Não foi possível detectar a bactéria Lawsonia intracellularis, nos animais
amostrados. Slovis et al. (2010) da mesma forma não detectaram o micro-
organismo nas fezes de potros. Tal resultado pode ser creditado a idade dos
animais, visto que a detecção desta bactéria em potros, geralmente ocorre em
animais acima dos seis meses de vida, coincidindo com o período de desmame
(PUSTERLA & GEBHART, 2009).
Coronavírus foi detectado em 5,26% dos animais entre 0 e 30 dias de
vida e em 2,7% dos animais entre 61 e 90 dias (sem diarreia), corroborando
 59

com o estudo de prevalência realizado por Harris et al. (2012), que

identificaram o vírus em 3% (2/41) dos animais do grupo sem diarreia. No
Brasil, a diarreia por coronavírus foi relatada em um surto no Rio Grande do
Sul. Foi possível identificar o vírus por microscopia eletrônica, com uma maior
frequência de 58,5% (69/118) dos potros com diarreia (MEIRELLES et al.,
2008). Este resultado indica que o coronavírus provavelmente necessita de
condições predisponentes específicas para acometer os potros, gerando
situações pontuais de casos ou surtos.
A ausência de rotavírus nos animais amostrados contrapõem os estudos
realizados por Slovis et al. (2010), que obteve prevalência de 35% nos animais
com diarreia e 3% no grupo controle. Hardy et al. (1991), identificaram rotavírus
em 37,21% (32/86) dos potros com diarreia, utilizando a eletroforese em gel de
poliacrilamida (PAGE). No Brasil há apenas dois casos de diarreia em potros
por rotavírus relatados por Racz et al. (1993), onde detectaram o vírus
utilizando ensaio imunoenzimático e PAGE. De maneira similar ao coronavírus,
a ausência de detecção de rotavírus nos potros estudados sinaliza a menor
participação deste enteropatógeno na gênese da diarreia na região estudada.
A detecção de Giardia sp. foi de 1,78% (1/56) no grupo dos potros com
diarreia. No Brasil, Vargas & Rigolon (1998) relataram a ocorrência deste
protozoário em equinos utilizando a técnica de centrifugação-flutuação de
Faust com sulfato de zinco, detectando 21,1% (26/123) como positivos. Destes,
18,2% (8/44) dos animais apresentavam idade inferior a um ano. O baixo
número de animais parasitados no presente estudo pode ser explicado pela
liberação intermitente dos cistos junto às fezes em até 40% dos animais (XIAO
& HERD, 1994) e pela maior frequência dos casos em animais
imunossuprimidos (WEESE, 2009).
A presença de Cryptosporidium spp. no grupo com diarreia
correspondeu a 5,4% (3/56) dos animais distribuídos igualmente nas três faixas
etárias, fato que difere sem sinais entéricos, onde 1,67% (1/60) das amostras
foram positivas. Destas, 10% dos potros estavam entre 0 e 30 dias de vida,
período considerado de maior ocorrência do enteropatógeno (XIAO & HERD,
1994). Grimberg et al. (2009), identificaram por microscopia eletrônica 18%
(12/67) de Cryptosporidium spp. em amostras de fezes de potros com diarreia,
 60

enquanto Harris et al. (2012), detectaram este protozoário principalmente em

animais sem sinais entéricos (67%, 92/137), quando comparado ao grupo dos
animais com diarreia (25% , 2/8).
A pesquisa de helmintos no presente estudo teve como principais
parasitas os Estrongilídeos (grandes e pequenos estrongilídeos) e
Strongyloides (Strongyloides westeri), foi observado que em 25% (14/56) dos
animais apreswentaram S. westeri no grupo dos potros com diarreia, não
diferindo sem sinais entéricos com 25% (15/60) parasitados. De maneira similar
Harris et al. (2012), detectaram 35,7% (30/84) dos potros com diarreia e 36,7%
(29/79) dos potro sem diarreia, infectados pelo parasita, não havendo diferença
significativa entre os grupos com e sem diarreia. Ao contrário, Netherwood et
al. (1996) no Canadá e Lyons & Tolliver (2004) nos EUA relataram menor
infestação de S. westeri, com frequência de respectivamente 1,4% (5/365) e
1,5% (11/733) de potros com diarreia.
Os Estrongilídeos foram detectados em 10,7% (6/56) dos animais
amostrados com diarreia, não diferindo sem sinais entéricos om 10,67%
(10/60), já Lyons & Tolliver (2004) obtiveram maior número de animais
identificados, identificando 27,6% (202/733) de potros parasitados. Não foi
possível a classificação entre grandes e pequenos estrôngilos devido ao fato
de que a diferenciação entre S. vulgaris e Cyatostomíneos é fidedigna somente
se realizada a cultura larvar para identificação de L3 (UMUR & AÇICI, 2009;
TAYLOR et al., 2010).
A ocorrência da monoinfecção em 32% das amostras diarreicas
positivas para enteropatógenos neste estudo é equivalente aos resultados
obtidos por Slovis et al. (2010) que observou a participação de um único
enteropatógeno em 29% das amostras fecais dos potros com diarreia. Giguère
e Sanchez (2009) identificaram maior frequência de monoinfecções, em 78%
(95/122) dos potros acometidos por diarreia. No entanto, o simples isolamento
de ao menos um agente etiológico não permite necessariamente prova de este
ser o causador da doença, visto que para muitos enteropatógenos há a
necessidade de determinar os fatores de virulência, particularmente os de
origem bacteriana. Adicionalmente, frequentemente estes patógenos entéricos
 61

promovem infecções combinadas, potencializando os efeitos entéricos nos

animais infectados.
A ocorrência da coinfecção em 68% das amostras positivas para
enteropatógenos neste estudo coincide com os resultados descritos por Slovis
et al. (2010), que observaram alta ocorrência de associações entre patógenos
nas amostras de fezes diarreicas. Giguère e Sanchez (2009) também
identificaram coinfecções, em 22% (25/122) dos isolamentos de
enteropatógenos (2 ou mais enteropatógenos) em potros até dez meses de
vida. O conjunto destes resultados reafirma a complexidade etiológica na
casuística da diarreia em potros, a ocorrência frequente de coinfecções entre
os patógenos entéricos e a necessidade de investigar os principais patógenos
e fatores de virulência de origem bacteriana, viral e parasitária para firmar o
diagnóstico da diarreia em potros.
Outras espécies de bactéria como Hafnia alvei, Proteus mirabilis,
Proteus vulgaris, Enterobacter aglomerans, Providência rettigeri, Citrobacter
sp., foram isolados de animais com diarreia que não tiveram a detecção de
qualquer enteropatógeno. Os animais sem sinais entéricos apresentaram
isolamento de Serratia rubidaea, Edwardsiella aglomerans, Edwardsiella tarda,
Citrobacter spp. e Hafnia alvei. A baixa frequência de isolamentos destas
bactérias indica a baixa influência destes micro-organismos na gênese da
diarreia em potros.
A mortalidade de 10,7% (6/56) dos potros amostrados com diarreia e
3,3% (2/60) do grupo sem diarreia coincidem com o isolamento de Salmonella
spp. e Clostridium perfringens indicando a alta severidade e letalidade em
potros infectados por estes micro-organismos como descrito por Netherwood et
al. (1996). Este resultado reforça a necessidade do diagnóstico precoce e
tratamento emergencial de potros infectados por estes enteropatógenos,
visando aumentar as taxas de sobrevida ou cura dos animais.
 62

7. CONCLUSÕES

Frente os resultados apresentados, pode-se concluir que o exame físico

nos potros com diarreia foi de suma importância na identificação da
desidratação em 67,8% dos animais, independente do agente etiológico
diagnosticado.
Embora não haja relação entre o hemograma e o agente etiológico
detectado, as presenças de hiperfibrinogenemia, leucocitose, neutrofilia e
linfocitose, mostraram ser uma importante ferramenta na identificação dos
animais gravemente acometidos.
A hemogasometria identificou potros com acidose metabólica,
hiponatremia e hipocalemia, confirmando que este exame fornece ao Médico
Veterinário subsídios para a correta correção ácido-básica e hidroeletrolítica
nos potros com diarreia.
A alta ocorrência de coinfecções (68%) observadas entre agentes
bacterianos, virais e parasitários confirmam a complexidade etiológica na
casuística da diarreia em potros.
O isolamento de linhagens de E. coli nos potros com diarreia (fímbrias H
e ag43), indica a possibilidade que estes fatores de virulência possam estar
relacionados com a patogenicidade deste micro-organismo.
O isolamento de Salmonella spp. nos animais com e sem diarreia, e o
predomínio deste micro-organismo nos potros que vieram a óbito reforça a
necessidade de medidas de controle, bem como o diagnóstico e tratamento
precoce da salmonelose em potros.
Observando a distribuição dos isolados de Clostridium perfringens,
passa a ser notória a importância deste agente nas três faixas etárias
estudadas.
O isolamento de Clostridium difficile em um potro de um dia de vida,
enfatiza os cuidados que devem ser estabelecidos para o controle e tratamento
de potros neonatos.
O isolamento de linhagens de R. equi 85kb tipo I e 87kb tipo I em potros
diarreicos de mesmo perfil plasmidial encontrado em lavados traqueais de
 63

pulmão de potros no Brasil confirma estes tipos de plasmídeos como os mais

virulentos para potros;
Giardia sp. esteve presente em apenas 1,78% dos potros com diarreia,
não mostrando ter grande relevância nos quadros de diarreia em potros na
região estudada.
A ocorrência de Cryptosporidium spp., detectado em 5,36% dos animais
com diarreia, indica a baixa influência deste enteropatógeno na região
estudada.
Estrongylídeos e Strongyloides foram detectados independentemente da
ocorrência de diarreia, sendo os potros entre 61 e 90 dias de vida mais
acometidos, o que reintera a importância da desverminação nos animais desta
faixa etária.
As causas dos óbitos ocorridos em potros com e sem diarreia, ressalta a
importância na identificação dos sorotipos de Salmonella spp., bem como a
pesquisa das toxinas de Clostridium perfringens.
 64

8. REFERÊNCIAS

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 80

ANEXO I

ARTIGO CIENTÍFICO

TRABALHO CIENTÍFICO PUBLICADO NA REVISTA EQUINE VETERINARY

JOURNAL

Detection of A/B toxin and isolation of Clostridium difficile and

Clostridium perfringens from foals
R. O. S. SILVA, M. G. RIBEIRO†, M. S. PALHARES, A. S. BORGES†, R. P. A.
MARANHÃO, M. X. SILVA, T. M. LUCAS†, G. OLIVO† and F. C. F. LOBATO*

Veterinary School, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Brazil

†
School of Veterinary Medicine and Animal Sciences, Universidade Estadual
Paulista – UNESP, Brazil.
*Correspondence email: flobato@vet.ufmg.br; Received: 21.07.12; Accepted:
29.12.12

Summary
Reasons for performing the study: Toxin detection and screening could
contribute to knowledge of the transmission patterns, risk factors and
epidemiology of Clostridium difficile and Clostridium perfringens.

Objective: To isolate C. difficile and C. perfringens and to detect A/B toxins in

faecal samples from diarrhoeic and nondiarrhoeic foals.

Study design: Cross-sectional observational study.

 81

Methods: A total of 153 samples from foals were collected: 139 samples from
farms and 14 samples from diarrhoeic foals admitted to a veterinary hospital.
The A/B toxins were detected by cytotoxicity assay. All suspected colonies of C.
perfringens were subjected to polymerase chain reaction for detection of the
major toxin genes (a, b, e and i) and for detection of b2-, NetB- and enterotoxin-
encoding genes. Furthermore, C. difficile and C. perfringens isolates were
evaluated for in vitro antimicrobial susceptibility.
Results: Seven of 153 (4.6%) samples, all from diarrhoeic foals, were positive
for C. difficile A/B toxin. Of these, 5 of 14 (35.7%) were from hospitalised foals,
and only 2 of 63 (3.2%) diarrhoeic foal samples were from farms (P = 0.002).
Clostridium perfringens was isolated from 31 (20.3%) foals, of which 21 of 76
(27.6%) were diarrhoeic and 10 of 76 (13.2%)were nondiarrhoeic,
demonstrating a difference between these 2 groups (P = 0.045). Only 4
strainswere positive for the β2-encoding gene (cpb2). All C. difficile and C.
perfringens isolates were susceptible to metronidazole and vancomycin.

Conclusions: The present report highlights the need for laboratory diagnostics
to differentiate C. difficile-associated infection in foals from other causes of
diarrhoea to facilitate adequate antimicrobial therapy.

Potential relevance: More studies are needed to clarify the role of C.

perfringens as a primary agent of diarrhoea in foals.

Keywords: horse; colitis; nosocomial diarrhoea; A/B toxins

Introduction
Clostridium difficile is a spore-forming, anaerobic, Gram-positive bacillus
recognised as the pathogen responsible for most cases of antimicrobial-
associated diarrhoea in human patients [1]. In horses, C. difficile is responsible
for colitis in adults [2] and diarrhoea in foals, which can occur spontaneously or
may be associated with antimicrobial use [3,4]. Moreover, recent studies also
showed that isolates from human patients suffering from C. difficile infection
 82

(CDI) are highly related, genetically, to strains isolated from animals, suggesting
hypothetical zoonotic potential [5,6]. Clostridium perfringens is an anaerobic,
spore-forming, Gram-positive bacillus that has been associated with enteritis in
adult horses and foals [7,8]. Clostridium perfringens isolates are conventionally
classified as one of 5 toxigenic types (A–E) based on the capacity to produce
one or more of the 4 major toxins (a, b, e and i) [9]. In addition to the major
toxins, C. perfringens can produce additional virulence factors, such as b2 toxin,
which has been associated with diarrhoea in horses [10], and necrotic enteritis
toxin B-like (NetB), a pore-forming toxin recently described as an important
virulence factor for necrotic enteritis in broiler chickens [11]. Clostridium
perfringens is commonly found in the enteric microbiota of healthy animals,
complicating the laboratory diagnosis of infections caused by this
microorganism. In addition, owing to the absence of control case studies with
foals, the role of b2 toxin, enterotoxin and NetB in this species remains unclear.
Toxin detection and screening could contribute to the knowledge of C.
difficile and C. perfringens transmission patterns, risk factors and epidemiology
[12]. In light of this, the objective of this study was to detect C. difficile A/B
toxins and to identify C. perfringens and C. difficile strains in faecal samples
from diarrhoeic and nondiarrhoeic foals.

Materials and methods

Samples
A total of 153 samples from foals were collected from farms and from animals
admitted to the Veterinary Hospital of Universidade Federal de Minas Gerais. A
total of 139 samples from 17 different farms were cultured, comprising 63
samples from diarrhoeic foals and 76 samples from nondiarrhoeic foals.
Samples from foals collected at the veterinary hospital accounted for a total of
14 diarrhoeic faecal samples. The samples from hospitalised animals were
obtained at the time of clinical examination and were only collected from foals
with active diarrhoea. All specimens were collected in sterile containers and
were stored at -20°C until testing was performed.
 83

Cytotoxicity assay (CTA)

The CTA for the detection of C. difficile A/B toxins was performed with Vero
cells (Vero–ATCC CCL 81) as described earlier [13]. Briefly, faecal samples
were diluted 1:4 in phosphate-buffered saline (pH 7.0) and centrifuged at 3000
g for 5 min at 4°C. The resulting supernatant was filtered through a filter with a
pore size of 0.22 mm and diluted 2-fold until a dilution of 1:1024 was reached.
Serial dilutions and parallel samples with Clostridium sordellii antitoxina were
added onto Vero cell monolayers. The cells were examined after 24 h of
incubation at 37°C in an incubator containing air supplemented with 5% CO2. A
specimen was considered positive for the CTA if at least 90% of cells were
rounded and, at the same dilution of the parallel sample, the effect was
neutralised by antitoxin.

Isolation and polymerase chain reaction (PCR) of C. difficile

To select C. difficile spores, equal volumes of faecal samples and 96%
ethanol (v/v) were mixed and, after incubation for 30 min at room temperature,
aliquots of 50 ml were inoculated on plates containing cycloserine-cefoxitin
fructose agarb supplemented with 7% horse blood and 0.1% sodium
taurocholatec. After anaerobic incubation at 37°C for 72 h, all colonies with
suggestive morphology were subjected to a previously described multiplex-PCR
for a housekeeping gene (tpi), toxins A (tcdA) and B (tcdB) and a binary toxin
gene (cdtB) [12].

Isolation and PCR of C. perfringens

For isolation of C. perfringens, 0.08–0.12 g of faeceswas serially diluted

by factors of 10, ranging from 10-1 to 10-6. Aliquots of 50 ml of each dilution
were plated on sulfite polymyxin sulfadiazine agard and incubated anaerobically
at 37°C for 24 h. After incubation, characteristic colonies were subjected to
previously described PCR [14] for the detection of genes encoding the b2 toxin
(cpb2), enterotoxin (cpe) and major C. perfringens toxins (a, b, e and i). In
 84

addition, a previously described PCRwas applied for the detection of the Net B-
encoding gene (netb) [15]. For all PCRs, amplifications were carried out in a
thermocycler (Thermal Cycler Px2e), and the products were visualised under
ultraviolet light in a 2% agarose gel stained with ethidium bromidec.

Antimicrobial susceptibility

The minimal inhibitory concentration (MIC) for isolated C. difficile and C.

perfringens strains was determined by the agar dilution method, as
recommended by the Clinical and Laboratory Standards Institute [16]. The
following antimicrobials were evaluated: penicillin, florfenicol, oxytetracycline,
erythromycin, vancomycin, metronidazole and tylosin. Bacteroides fragillis
(ATCC 25285) was used as a control strain.
Data analysis
Fisher’s exact test was used to evaluate associations between variables.
Significance was set at a P value of 0.05 (Stata)f.

Results
Seven samples, all from diarrhoeic foals, were positive for C. difficile A/B toxins
(Table 1). Of these, 5 (35.7%) were from14 hospitalised foals and only 2
(3.2%)were from diarrhoeic samples from63 visited farms, demonstrating a
significant difference (P = 0.002). Two positive foals had a history of
antimicrobial treatment before diarrhoea, and 4 had a spontaneous onset of the
disease. There was no information about the clinical history for the remaining
A/B toxin-positive foal. None of the nondiarrhoeic foals was positive for A/B
toxins by CTA. Clostridium difficile was isolated from 7 animals: 5 isolates were
from diarrhoeic foals and 2 from nondiarrhoeic foals. Four of 7 strains were
toxigenic (A+B+), while the remaining 3 were nontoxigenic by PCR. Four
animals positive for A/B toxin were negative for C. difficile isolation, hereas a
toxigenic strain was isolated from a diarrhoeic foal that was negative by CTA.
Clostridium perfringens was isolated from31 (20.3%) foals, of which 21 of 76
(27.6%) were diarrhoeic and 10 of 76 (13.2%)were nondiarrhoeic animals,
 85

indicating a difference between these 2 groups (P = 0.045). Among the

diarrhoeic foals, 20 strains were isolated from samples from farms, while one of
14 (7.1%) was isolated from hospitalised foals. All C. perfringens isolates were
classified as type A, and 4 strains were positive for b2-encoding gene (cpb2),
with 3 strains coming from nondiarrhoeic foals and one strain from a diarrhoeic
foal. The Net-B-encoding gene (netb) and the enterotoxin-encoding gene (cpe)
were not detected. All C. difficile and C. perfringens isolates were susceptible to
metronidazole and vancomycin. Clostridium difficile isolates were also
susceptible to oxytetracycline and florfenicol, while 3 strains were resistant to
penicillin, and 2 were resistant to erythromycin and tylosin. Clostridium
perfringens strains were susceptible to penicillin (Table 2), while 3, 4 and 5
strains were resistant to oxytetracycline, florfenicol and tylosin, respectively. For
erythromycin, a clearly bimodal distribution was observed, with 17 (58.6%)
resistant strains, all with an MIC 256.0 mg/ml, and 12 susceptible strains, with
an MIC_2.0 mg/ml.

Discussion

Detection and isolation of C. difficile A/B toxin

The A/B toxinwas not observed in nondiarrhoeic foals in the present study,
suggesting that subclinical CDI in foals is not an important event, in contrast
with previous reports for dogs and piglets [12,17,18]. The absence of A/B toxin
in nondiarrhoeic foals has also been previously reported [19,20] and, although
this information has been established, a recent survey showed that clinicians
and pathologists commonly submit normal faecal samples from foals for
laboratory diagnosis of CDI [21]. Testing nondiarrhoeic foals might decrease the
positive predictive value if the test is not 100% specific and there is a low
prevalence of the organism, as shown in the present report. It is also important
to note that in the present study, A/B toxins were detected by CTA, which is
considered the ‘gold standard’ method; however, most laboratories report the
use of commercial enzyme immunoassays for A/B toxin detection in equine
 86

faecal samples, which are more rapid and economical but might have less
sensitivity and specificity [21]. The results of this study and previous reports
suggest that there is no justification for testing the faeces of nondiarrhoeic foals
for the presence of A/B toxins.
In the diarrhoeic group, 7 of 77 (9.1%) foals, of which 4were 5 months
old, one was 3 months and 2 were 13 days old, were positive for A/B toxin
detection. The prevalence found here is higher than the 5% reported by
Frederick et al. [22] in the USA but lower than the 16.7% reported by Weese et
al. [19] in Canada. It is also interesting to note the significant difference (P =
0.002) between the positive rate in animals from farms and animals from the
veterinary hospital; in the foals we examined, an animal sampled in the
veterinary hospital had 16 times greater probability of being positive for A/B
toxin than a diarrhoeic animal from a farm. This higher rate found in hospitalised
foals could not be interpreted as a nosocomial infection, because all samples
were collected at the time of clinical examination. However, foals admitted to
the veterinary hospital commonly have been treated previously with
antimicrobials on the farm but have not responded. In fact, in this report, all
positive animals from the veterinary hospital were initially diagnosed by
clinicians with causes of diarrhoea other than C. difficile. Indeed, the higher rate
of foals positive for A/B toxin at the veterinary hospital was most probably
caused by a lack of awareness of CDI by veterinarians on the farm, leading to
unsuccessful treatment andworsening of clinical signs. In addition, this report
highlights the need for laboratory diagnostics that differentiate enteropathogens
in foals, allowing for adequate antimicrobial therapy.
Two foals positive for A/B toxins had a history of diarrhoea 2 days after
antimicrobial treatment with penicillin G for clinical suspicion of pneumonia.
These cases were also the first confirmed description of C. difficile infection in
foals in Brazil [4]. Among the animals examined, there were no data about
antimicrobial administration or clinical history for one
positive foal that was sampled on a farm. However, 4 positive foals (3
hospitalised and one from a farm) had a history of spontaneous onset of the
diarrhoea. In addition, these 4 animals were negative for other enteropathogens
(Salmonella spp., rotavirus and Lawsonia intracellularis), suggesting that C.
 87

difficile was the aetiology of the diarrhoea in these cases. In these 4 cases, a
worsening of clinical signs was observed after antimicrobial therapy other than
metronidazole, which is considered the first choice for CDI in foals. Three foals
received metronidazole after diagnosis of CDI (by toxin detection) and
recovered well, although one foal that was treated with ceftiofur died [23].
Four toxigenic strains of C. difficile were isolated, all from diarrhoeic
foals. Of these foals, 3 were positive for A/B toxins, and one, aged one-day-old,
was negative. An asymptomatic carrier status must be considered for this
animal, because previous reports have shown that it is a common event in foals
younger than 14 days [20]. Moreover, it should be emphasised that the
incidence of carrier status among the young animals examined in the present
study was much lower than previously reported [20,24]. From a total of 16
animals younger than 14 days old, only 2 (12.5%) were positive for the isolation
of C. difficile, of which one strain was toxigenic and the otherwas nontoxigenic.
Another possible explanation for the presence of a toxigenic strain in a CTA-
negative foal is toxin degradation by proteases found in faeces [17], but this
suggestion must be considered with caution because studies have shown great
stability of the A/B toxins in equine faeces [20,25]. Three nontoxigenic strains
were also isolated from 2 nondiarrhoeic foals, aged 7 days and 12 months old,
and another from a diarrhoeic foal, aged 5 months. Notably, C. difficilewas
recovered from only one of 68 (1.5%) nondiarrhoeic foals older than one-month-
old, agreeing with previous studies that have shown that isolation in healthy
foals older than one month is rare but can sometimes occur, mainly after
antimicrobial treatment [3,20]. Unfortunately, there are no data regarding
antimicrobial administration in this healthy foal.
Four animalswere positive for A/B toxin detection, but C. difficile was not
isolated fromfaecal samples. However, there is no standard method for the
isolation of C. difficile, making it difficult to compare results from other studies,
although similar results have been described in foals [19,20,26,27], aswell as in
other species, such as dogs and piglets [12,17]. It is well known that some C.
difficile strains cannot grow due to susceptibility to one or both antimicrobials
used in medium [28]. In addition, the use of cycloserine-cefoxitin-frutose-agar
supplemented with taurocholate, even with the supplementation of taurocholate,
 88

could lead to variable sensitivity for C. difficile spore recovery when compared
with other media, such as TCCFB (cefoxitin-cycloserine-broth, supplemented
with taurocholate) [29].

Clostridium perfringens isolation and genotype

Clostridium perfringens strains were isolated from animals of all ages,

including one 1-day-old diarrhoeic foal, showing early colonisation by this
enteric agent. The high detection rate of C. perfringens type A is not surprising,
because this type is considered to be the most common in animal faeces and
also in the environment [9]. Clostridium perfringens type C was not detected,
and no strains were positive for cpe or netb genes. To our knowledge, the netb
gene has not been described in equine C. perfringens isolates [11], while the
absence of the cpe gene observed here contrasts with previous studies [19,22]
that have reported a low rate of the cpe gene (between 2 and 12.5%) in equine
C. perfringens isolates, commonly without association with diarrhoea or
worsening clinical signs.
Only one animal positive for C. difficile A/B toxins was also positive for C.
perfringens isolation, suggesting that an association between these 2
enteropathogens is uncommon, as previously reported [19]. Only 4 strains were
positive for the b2-encoding gene, suggesting that this gene is not a good
virulence factor marker for C. perfringens in foals. There are few data about the
role of cpb2 in foals, because the majority of studies focus on adult horses, and
the importance of b2 toxin remains controversial [30]. Disregarding the
genotyping, there was a significant association between the isolation of C.
perfringens and the presence of diarrhoea (P = 0.045), corroborating
Netherwood et al. [31]. These results suggest that, despite the presence cpb2,
cpe or netb genes, the isolation of C. perfringens from diarrhoeic foals could
implicate the involvement of this agent in diarrhoea. However, given that C.
perfringens could be recovered from nondiarrhoeic foals, a positive isolation of
C. perfringens cannot be interpreted alone, and the absence of other
enteropathogens might be necessary to confirm the diagnosis [10].
 89

Antimicrobial susceptibility of C. perfringens and C. difficile strains

All C. difficile isolates were susceptible to metronidazole and

vancomycin, which have been recommended for the treatment of CDI in horses
[3]. However, vancomycin is a critically important antimicrobial for human
medicine and thus, its use in horses should be restricted to life-threatening
situations where alternatives are not available [32]. These results are similar to
previous studies in various species [20,33] and, at present, metronidazole-
resistant isolates have been found only in American horses [34,35]. Likewise, all
C. difficile isolates were also susceptible to oxytetracycline. A wide range of
susceptibilities to tetracycline is commonly reported in C. difficile isolates from
human patients and swine, but in general, nearly all isolates are susceptible
[36,37]. Two C. difficile strains that were resistant to penicillin were isolated
from foals that had signs of diarrhoea before treatment with penicillin G for
pneumonia [4]. According to Båverud [38], b-lactams are commonly implicated
in C. difficile-associated diarrhoea after antimicrobial treatment in both foals and
adult horses. Two strains were resistant to erythromycin, which was previously
reported in horses by Båverud et al. [20] and is also commonly found among C.
difficile isolates from human patients [39]. All C. difficile isolates were
susceptible to florfenicol, while only one strain was resistant to enrofloxacin, but
no data regarding these 2 compounds were found for C. difficile isolates from
foals. With tylosin, only one strain showed an intermediate susceptibility,
whereas the remaining 6 C. difficile isolates were susceptible to the drug.
Previous studies reported in vitro tylosin activity against C. difficile isolates
frompiglets with enteritis, but in contrast with our findings, some strains were
also resistant [37]. The MIC results must be interpreted with caution because
most C. difficile isolates from cases of antimicrobial-induced CDI in humans
were susceptible to the implicated drug [40], suggesting that successful
treatment is most probably dependent on both the susceptibility of C. difficile
and other components of the enteric microbiota [19]. All C. perfringens strains
were susceptible to penicillin, vancomycin and metronidazole, corroborating
other studies with equine isolates and also other domestic animal species
[41,42]. In this report, resistance of C. perfringens strains was observed for 2
 90

macrolides tested, erythromycin and tylosin. Similar results were previously

reported for isolates from various sources [33,37,43]. A clear bimodal
distribution could also be observed for erythromycin, suggesting a genetic
mechanism of resistance, which is probably due to the presence of the ermQ
genes [44]. These resistance genes were previously described in C. perfringens
isolates from several domestic species [43], but until now, they were not found
in foal isolates. With oxytetracycline, 5 (17.2%) strains were also resistant. It
was previously reported that Clostridium species can carry tetracycline
resistance genes that encode a ribosome-protecting cytoplasmic protein that
mediates the active efflux of tetracycline from the cell [45]. As it is common to
see oxytetracycline-resistant C. perfringens, the resistance rate found in this
study is not surprising and is also lower than that of previous reports on C.
perfringens isolates from foals and other species,
including poultry, cattle, dogs, swine and man [46,47].

Conclusions

This report highlights the need for laboratory testing to differentiate C.

difficile-associated infection in foals from other causes of diarrhoea, allowing for
adequate antimicrobial therapy. More studies are needed to clarify the role of C.
perfringens as a primary agent of diarrhoea in foals, because there is no
consensus about the role of b2 toxin and other additional virulence factors.
Finally, although not routinely performed, the
evaluation of antimicrobial susceptibility of C. difficile and C. perfringens isolates
from foals might be useful in the treatment of the enteric diseases associated
with these pathogens in foals. The next step following this study is to evaluate
the presence of antimicrobial resistance genes in these isolates. In addition, the
ribotyping of the C. difficile strains would be interesting, because until now, it
has not been performed on C. difficile isolates from any animal source in Brazil.

Authors’ declaration of interests

 91

The authors declared no potential conflicts of interest with respect to the

research, authorship and publication of this article.

Ethical animal research

This study was approved by the Ethics Committee on Animal Experiments of

the Universidade Estadual Paulista Júlio Mesquita (CETEA-UNESP, protocol
number 150/2010).

Sources of funding

This work was supported by funds from Fapemig, Capes, PRPq-UFMG and
CNPq.

Acknowledgements

We thank Amanda N. Diniz and Carlos A. Oliveira Junior for the help with the
minimal inhibitory concentration assay.

Authorship

R.O.S.S. was responsible for A/B toxin detection and isolation of C. difficile.
M.S.P. and R.P.A.M. were responsible for the clinical selection and treatment of
the foals. A.S.B. and M.X.S. were responsible for visiting the farms and for the
statistical analysis. T.M.L. and G.O. were responsible for the isolation, PCR and
antimicrobial susceptibility of C. perfringens. F.C.F.L. and M.G.R. are the
coordinators of this experiment. F.C.F.L.was responsible for the UFMG team,
while M.G.R. was responsible for the UNESP team.
 92

Manufacturers’ addresses

aNIBSC, National Institute for Biological Standards and Control, London, UK.
bHi-media, Mumbai, India.
cSigma-Aldrich Co., St Louis, Missouri, USA.
dSPS, Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA.
eThermo Electron Corporation, Milford, Massacheusetts, USA.
fStata Corp., College Station, Texas, USA.

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