TESE Marcela Araújo Pereira

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
LABORATÓRIO DE IMUNOPATOLOGIA KEIZOASAMI
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA APLICADA À SAÚDE
MARCELA ARAÚJO PEREIRA
NANOVACINAS ALERGÊNICAS PARA IMUNOTERAPIA EM
ALERGIA A CASTANHA DE CAJU
Recife
2018
NANOVACINAS ALERGÊNICAS PARA IMUNOTERAPIA EM ALERGIA A

CASTANHA DE CAJU
Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia Aplicada à Saúde
(PPGBAS), como requisito para a obtenção do título
de Doutora em Biologia Aplicada à Saúde. Área de
Concentração: Biotecnologia.
Orientadora: Profa. Dra. Nereide Stela Santos Magalhães
Coorientador: Profa. Dra. Juliana de Souza Rebouças
Recife
2018
Catalogação na fonte:
Bibliotecária Claudina Queiroz, CRB4/1752
Pereira, Marcela Araújo

Nanovacinas alergênicas para imunoterapia em alergia a
castanha de caju / Marcela Araújo Pereira - 2018.
109 folhas: il., fig., tab.
Orientadora: Nereide Stela Santos Magalhães

Coorientadora: Juliana de Souza Rebouças
Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro
de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Biologia Aplicada
à Saúde. Recife, 2018.
Inclui referências
1. Castanha de caju 2. Nanopartículas 3. Polianidrido

I. Magalhães, Nereide Stela Santos (orient.) II. Rebouças, Juliana de
Souza (coorient.) III. Título
615.37 CDD (22.ed.) UFPE/CB-2019-098

NANOVACINAS ALERGÊNICAS PARA IMUNOTERAPIA EM ALERGIA A

CASTANHA DE CAJU
Tese de doutorado apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Biologia Aplicada à Saúde
(PPGBAS), como requisito para a obtenção do
título de Doutora em Biologia Aplicada à
Saúde. Área de Concentração: Biotecnologia.
Aprovada em: 26/02/2018
BANCA EXAMINADORA:
_______________________________________________________________
Profa. Dra. Nereide Stela Santos Magalhães – UFPE
(Orientadora)
_______________________________________________________________
Prof. Dr. Fabrício Oliveira Souto
(Titular – Membro interno)
_______________________________________________________________
Profa. Dra. Cláudia Ida Brodskyn
(Titular – Membro externo)
_______________________________________________________________
Profa. Dra. Juliana de Souza Rebouças
_______________________________________________________________
Prof. Dr. Fabio Rocha Formiga
Aos meus pais, Jaqueline e Sérgio, pelo amor, cuidado e dedicação imensuráveis; e a
Fernando, por me dar forças quando elas me faltaram.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por cumprir todas as promessas dele em minha vida, e permitir a realização
de mais essa etapa.
Aos meus pais, por perdoarem minha ausência ao longo dessa jornada. Todos os
abraços, carinho, conselhos e suporte foram os alicerces da construção desse trabalho.
À minha irmã, Daniela, que, mesmo ausente fisicamente, sempre se fez presente com
o seu amor incondicional.
A Fernando, palavras nunca poderiam descrever o meu sentimento de gratidão. Um

ombro amigo e companheiro fiel. Muito obrigada por me consolar nos momentos de tristeza,
por me fazer sentir especial nos momentos de solidão e, acima de tudo, por me erguer quando
já não tinha forças.
À minha Orientadora, Prof.ª. Drª. Nereide Magalhães, por me acolher em seu grupo de
pesquisa desde cedo, por me dar a oportunidade de fazer o que eu amo e, por me guiar quando
não sabia por onde seguir.
À minha coorientadora, Prof.ª. Dra. Juliana Rebouças. Os sonhos começam antes

mesmo da gente pensar em sonhar. Agradeço a você por ter me dado o presente de fazer esse
projeto, por ter me iniciado no mundo da imunologia, por confiar em mim, pela paciência e
por todo o apoio, ensinamentos e experiências. Nunca pensei conseguir realizar tanto e, devo
isso, em grande parte, a você.
Ao Prof. Dr. Juan Manuel Irache, por ter me acolhido tão bem e ter me dado a
liberdade de fazer ciência, de fato, buscando as respostas dos “por quês”.
Ao Prof. Dr. Carlos Gamazo. Você é meu exemplo de equilíbrio. Sempre tranquilo,
mas inquieto por respostas. Você realmente sabe despertar o melhor lado dos seus alunos e
incentiva o desenvolvimento da “intuição” de cientista.
À Profa. Dra. Claudia Brodskyn, por abraçar esse projeto como seu e investir em mim
como uma própria aluna. E, antes de tudo, pela confiança em mim depositada.
Aos meus amigos, Péxy, Rafa, Nessita, Julay, vocês são os irmãos que Deus me
permitiu escolher ao longo da vida. Mesmo de longe, sempre me incentivaram e enviaram
todo o carinho.
Ao grupo SLC. Minha segunda família. Toda família tem seus problemas, mas ela é
imperfeitamente perfeita assim. Meus dias se tornaram mais leves quando divididos com
vocês.
Um agradecimento especial à Rafa. Amiga, irmã e, às vezes, mãe. Nunca hesitou em

arregaçar as mangas e trabalhar. Nunca me negou ajuda. Sei que nunca estarei sozinha, pois
você sempre estará lá torcendo, incentivando e dividindo.
Á Lais, minha roomate preferida. Esses últimos meses foram vivenciados

intensamente e, só nos duas sabemos de tudo o que passamos e como fomos vitoriosas por
matar todos os leões, um por vez.
À Mi, Bella, Helena, Lari, Sarita e Clarete. Vocês são as florzinhas que embelezaram
o meu jardim ao longo desses anos.
Á minha querida e amada Ilminha. Meus cafés da manhã foram momentos que
realmente disfrutei ao seu lado. Muitíssimo obrigada pelos conselhos, puxões de orelha e
apoio. Você é a essência do LIKA.
Aos meus queridos Nanogalenic amigos. A Espanha só se tornou uma experiência

mágica por ter dividido com vocês. Meu doutorado não teria sido o mesmo.
Aos meus colegas do Laboratório de Imunopatologia Keiso-Asami (LIKA), por todo

suporte e colaboração na realização do projeto.
À Pri e Mila, que tornaram a Bahia um lugar bem mais amável, divertido e animado.
Com certeza, vocês fizeram meus dias mais alegres.
Ao CNPq e FACEPE pelo apoio financeiro.
A todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.

“Todas as vitórias ocultam uma abdicação”.
(BEAUVOIR, 1958, p. 243)
RESUMO
As alergias alimentares afetam entre 6-8% da população infantil e 3-4% dos adultos em todo o
mundo. No Brasil, apesar da inexistência de dados epidemiológicos robustos, estudos relatam
a prevalência de até 23% de alergia alimentar. Entre as alergias alimentares, a alergia aos frutos
secos (castanha de caju, amendoim, avelã, nozes, entre outros) é relativamente frequente em
países em que o seu consumo é elevado, como é o caso do Brasil. Entre elas, a alergia à castanha
de caju (A. occidentale) está descrita como a segunda mais comumente capaz de induzir reações
adversas severas, como a anafilaxia, o que demonstra sua alta capacidade alergênica.
Entretanto, ainda não existe tratamento efetivo disponível no âmbito clínico que seja capaz de
reverter a resposta alérgica induzida pela castanha de caju. Uma alternativa promissora para
modificar a resposta do paciente é a imunoterapia alérgeno-específica (SIT) com o uso de
sistemas nanoestruturados de liberação controlada. Dentre eles, as nanopartículas poliméricas
foram empregadas na SIT por serem capazes de modular e potencializar a resposta imune em
direção a uma resposta protetora mais duradoura e eficaz. Neste sentido, podemos destacar os
polímeros polianidridos e zeína para a preparação de nanopartículas para SIT por via oral. Neste
contexto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver nanopartículas poliméricas de polianidrido
(NPg) e zeína (NPz) contendo o extrato da castanha de caju encapsulado, para posterior
avaliação do efeito imunomodulador e eficácia terapêutica, através da realização de estudos in
vitro e in vivo. As nanopartículas foram produzidas com êxito pelo método de nanoprecipitação
(deslocamento do solvente), com tamanho de ≈ 200 nm, PDI de ≈ 0,2 e potencial zeta de ≈ –
40 mV. Ensaios de estabilidade e liberação in vitro demonstraram que as nanopartículas são
estáveis em meio gástrico simulado, permitindo que o conteúdo proteico seja liberado apenas
no meio intestinal. Macrófagos Raw 264.7 previamente tratados com NPg e NPz apresentaram
manutenção de viabilidade celular, acompanhada por uma redução significativa na produção de
IL-6 e TNF-α. Após imunização oral e intradérmica com NPg e NPz de camundongos Balb/c,
verificou-se um aumento significante na produção de citocinas secretadas por células Th1 (IL-
12 e INF-γ) e diminuição significativa na produção das citocinas secretadas por células Th2
(IL-4, IL-5 e IL-13). Também foi observada um incremento na ativação de células T
reguladoras (Treg) nos linfonodos mesentéricos, com aumento na produção de células Treg CD4+
Foxp3+ e CD4+ LAP+ e citocinas Treg (IL-10 e TGF-β1), avaliadas por citometria de fluxo.
Diante dos resultados obtidos, a imunização de animais com NPg e NPz foi responsável pela
indução de uma uma resposta imune de perfil Th1 e Treg, de maneira mais acentuada com NPg,
em ambas as vias de administração, comprovando assim suas propriedades imunomoduladoras.
Desta forma, estes sistemas poliméricos nanoestruturados se apresentam como alternativas
terapêuticas promissoras para o tratamento clínico da alergia à castanha de caju.
Palavras-chave: Nanopartículas. Polianidrido. Zeína. Castanha de caju. Imunização.

ABSTRACT
Food allergies affects 6-8% of childs and 3-4% of adults worldwide. In Brazil, despite the lack
of robust epidemiological data, studies reported that the prevalence is up to 23% of food allergy.
Among food allergies, allergy to nuts (cashew nuts, peanuts, hazelnuts, nuts, among others) is
relatively frequent in countries where consumption is high, as is the case in Brazil. Among
them, the allergy to cashew nut (A. occidentale) is described as the second most commonly food
allergy capable of inducing severe adverse reactions, such as anaphylaxis, which demonstrates
its high allergenic potential. However, there is still no effective treatment available in the
clinical that is capable of reverse the allergic response induced by cashew nuts. A promising
alternative able to modify the allergic patient response is allergen-specific immunotherapy
(SIT) with the use of nanostructured controlled release systems. Among them, polymer
nanoparticles were employed in SIT because they are able to modulate and potentiate the
immune response towards a more durable and effective protective response. In this sense, we
can highlight the poly(anhydride) and zein polymers for the preparation of nanoparticles for
SIT oral adminstration. In this context, the objective of this work was to develop polymeric
nanoparticles of poly(anhydride) (NPg) and zein (NPz) containing the cashew nut extract, for
further evaluation of the immunomodulatory effect and therapeutic efficacy, through in vitro
and in vivo studies. The nanoparticles were successfully produced by the nanoprecipitation
(solvent displacement) method, with a size of ≈ 200 nm, a PDI of ≈ 0.2 and a zeta potential of
≈ – 40 mV. In vitro stability and release kinetics assay showed that the nanoparticles are stable
in simulated gastric media, allowing the protein content to be released only in the intestinal
environment. Raw 264.7 macrophages previously treated with NPg and NPz showed cell
viability maintenance, accompanied by a significant reduction in the production of IL-6 and
TNF-α. After oral and intradermal immunization with NPg and NPz of BALB/c mice, there
was a significant increase in the production of cytokines secreted by Th1 cells (IL-12 and INF-
γ) and a significant decrease in the production of cytokines secreted by Th2 cells ( IL-4, IL-5
and IL-13). An increase in the activation of regulatory T cells (Treg) in mesenteric lymph nodes
was also observed, with increased production of CD4+ Foxp3+ and CD4+ LAP+ Treg cells and
Treg cytokines (IL-10 and TGF-β1) evaluated by flow cytometry. According to these results,
the immunization of animals with NPg and NPz was responsible for the induction of an immune
response of Th1 and Treg profile, more pronounced with NPg, in both administration routes,
thus confirming its immunomodulatory properties. Thus, these nanostructured polymer systems
are presented as promising therapeutic approaches for the clinical treatment of cashew nut
allergy.
Keywords: Nanoparticles. Poly(anhydride). Zein. Cashew nuts. Immunization.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Mecanismos imunológicos envolvidos na sensibilização

alergênica. Durante a sensibilização alérgica, as células
dendríticas (DCs) presentes na mucosa capturam, processam e
transportam os alérgenos para os linfonodos circulantes mais
próximos para promover a geração de células Th2 alérgeno-
específicas (um processo que depende parcialmente da IL-4).
Ocorre a expansão clonal e ativação de células Th2 alérgeno-
específicas, produzindo IL-4 e IL-13, favorecendo o a ativação das
células B e mudança de classe de anticorpo para IgE. Os anticorpos
IgE-alérgeno específicos se ligam à superfície das células efetoras
(mastócitos e basófilos) através de receptores de alta afinidade por
IgE (FcεRI), ocorrendo a sensibilização do paciente. Um pool de
memória de células Th2 alérgeno-específicas é células B são
gerados. Modificada de PALOMARES et al., 2017......................
24
Figura 2 Fase efetora característica das reações alérgicas. Ocorre a ligação

de moléculas de IgE a receptores de alta afinidade FcεRI, levando
à liberação de aminas vasoativas (como a histamina), mediadores
lipídicos (como prostaglandina D, fator ativador de plaquetas,
leucotrieno C4 (LTC4), LTD4 e LTE4), quimiocinas (CXCL8,
CXCL10, CCL2, CCL4 e CCL5) e outras citocinas (como IL-4,
IL-5 e IL-13), dando origem aos sintomas imediatos das doenças
alérgicas. Modificado de LARCHÉ et al., 2006............................
25
Figura 3 Fase tardia da reação alérgica. Após a migração para os locais de

exposição ao alérgenos, sob a influência de quimiocinas e outras
citocinas, as células T alérgenos-específicas são reativadas e
ocorre a expansão clonal. A produção local de IgE é vista na rinite
alérgica e asma, mas não nas dermatites atópicas. As células Th1,
que produzem interferon-γ (IFNγ) e o factor de necrose tumoral
(TNF), contribuem para a ativação e apoptose de queratinócitos
(na pele), células epiteliais brônquicas e células do músculo liso
pulmonar. Ativação de mastócitos e basófilos, que liberam
histamina, quimiocinas e outras citocinas, também contribuem
para a reação alérgica tardia. Modificado de LARCHÉ et al., 2006. 26
Figura 4 Os dois principais tipos de nanopartículas poliméricas conhecidas

como nanoesferas (sistema matriz) e nanocápsulas (sistema
reservatórios) com diferentes modalidades de carreamento de
princípios ativos. Modificado de AWAD et al., 2017.................... 43
Figura 5 Mecanismos imunológicos da imunoterapia alergênica com base

no uso de nanopartículas carreadoras de alérgenos. Modificada de
45
GAMAZO et al., 2017.....................................................................
Tabela 1 Alérgenos proteicos presentes na castanha de caju............................ 32

SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................................... 16
2 OBJETIVOS.................................................................................................... 20
2.1 OBJETIVOS GERAIS...................................................................................... 20
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................ 20
3 REVISÃO DA LITERATURA...................................................................... 21
4 CAPÍTULO 1. POLY(ANHYDRIDE) NANOPARTICLES
CONTAINING CASHEW NUT PROTEINS CAN INDUCE A STRONG
TH1 AND TREG IMMUNE RESPONSE AFTER ORAL
ADMINISTRATION………………………………………………………… 78
5 CAPÍTULO 2. TH1 AND TREG IMMUNE RESPONSE INDUCED BY
ORAL IMMUNIZATION WITH A SINGLE DOSE OF CASHEW NUT
ALLERGENS-LOADED ZEIN NANOPARTICLES……………………. 81
6 CONCLUSÕES............................................................................................... 85
16
1. INTRODUÇÃO
A alergia alimentar é definida como uma resposta imunológica adversa resultante do

consumo ou exposição a um determinado alimento (JONES; BURKS, 2017). Estima-se que
220-520 milhões de pessoas, no mundo, possam sofrer de alergia alimentar. Elas afetam entre
6-8% da população infantil e 3-4% dos adultos em todo o mundo. No Brasil, apesar da
inexistência de dados epidemiológicos robustos, estudos relatam a prevalência de 23% de
alergia alimentar (LONGO et al., 2013; GONÇALVES et al., 2016; GAGETE et al., 2017).
De acordo com a Rede de Alergia e Anafilaxia de Alimentos (FAAN), a alergia a

castanha de caju (Anacardium occidentale) é a segunda alergia mais comum, entre as nozes,
nos Estados Unidos (BOYCE et al., 2010). Outro fato relevante é que a castanha de caju pode
causar reações graves, podendo levar à anafilaxia, e, apresentam reatividade cruzada com
pacientes alérgicos à amendoim (CLARK et al., 2007). Com o aumento da sua popularidade
mundialmente e maior uso na culinária, o risco de exposição inadvertida a castanha de caju vem
crescendo rapidamente (MATTISON et al., 2016). Ao longo dos anos, pelo menos três
proteínas da castanha de caju foram relatadas como potenciais alérgenos, conhecidas por seu
potencial de sensibilização e capacidade de induzir reações alérgicas: Ana o 1 (WANG et al.,
2002b), Ana o 2 (WANG et al., 2003) e Ana o 3 (ROBOTHAM, JASON M. et al., 2005).
Apesar do alto potencial de indução de reações alérgicas, não há tratamento efetivo

disponível para a alergia a castanha de caju. Pacientes diagnosticados com alergias alimentares
mediadas por IgE podem receber medicamentos para reduzir seus sintomas (anti-histamínicos,
anti-leucotrienos, epinefrina, anti-IgE). Estes medicamentos podem impedir a degranulação dos
mastócitos e basófilos ou podem atuar nas células T, reduzindo a ativação de eosinófilos (Ex.
fármacos esteroides, anti-IL5) (VALENTA et al., 2015). Entretanto, a eliminação completa dos
alérgenos da dieta é a estratégia de manejo clínico mais relevante a longo prazo. Esta abordagem
não exclui o fato de possíveis exposições acidentais, quando os alimentos são contaminados
com alimentos alergênicos ou simplesmente incorretamente descritos ou rotulados (SILVA, DE
et al., 2014).
A imunoterapia alergênica específica (SIT) é, atualmente, o único tratamento específico

capaz de modificar o curso da resposta alérgica. Esta terapia é caracterizada pela administração
de doses crescentes dos alérgenos em solução, podendo ser administrada pelas vias oral,
subcutânea e sublingual (BERNSTEIN et al., 2010). As vias subcutânea e sublingual são
17
escolhidas, principalmente, para tratar alergias respiratórias e, menos frequentemente, para

tratar alergias alimentares, porque as vacinas padronizadas não estão disponíveis (VALENTA
et al., 2015). No caso de alergias alimentares, o SIT é realizado por via oral, através da
administração destes alimentos ao invés de uma vacina. Porém, doses mais altas do alérgeno
são necessárias para induzir uma desensibilização e, esta ingestão pode levar o paciente ao
desenvolvimento de reações adversas fatais (CABRERA; URRA, 2015). Neste contexto, novas
abordagens estão sendo investigadas no sentido de superar estas limitações clínicas do SIT.
O objetivo principal a ser alcançado no desenvolvimento da vacina alérgica é melhorar

a eficácia clínica e a segurança do paciente. Assim, vacinas eficazes e seguras com dose
reduzida de alérgenos vêm sendo utilizadas em associação com adjuvantes, substâncias que são
capazes de aumentar a resposta imune (WANG; SINGH, 2011). Adjuvante é qualquer
"substância" que possui a capacidade de aumentar a imunogenicidade do antígeno a ele
acompanhado e/ou modular a qualidade da resposta imune induzida. Eles têm sido amplamente
utilizados em vacinas profiláticas convencionais para prevenção de doenças infecciosas
(MOINGEON, 2012).
Idealmente, os adjuvantes para a imunoterapia alergênica devem estimular uma resposta

imune Th1 sem induzir auto-imunidade. Não devem ser mutagênicos, cancerígenos e
teratogênicos. Além disso, os adjuvantes ideais precisam ser apirogênicos e estáveis para a
formulação da vacina (FRANCIS; DURHAM, 2004). Muitos compostos e sistemas dispersos
têm sido extensivamente estudados como adjuvantes. Dentre eles, os sais de alumínio e as
emulsões são tradicionalmente utilizados como adjuvantes imunológicos no âmbito clínico.
Entretanto, o uso destes adjuvantes ainda apresenta várias desvantagens, o que limita a sua
utilização em vacinas humanas. Portanto, os benefícios e riscos relacionados ao seu uso na
imunoterapia alergênica precisam ser contrabalançados (WHEELER; WORONIECKI, 2001).
Os sais de alumínio, principal adjuvante aprovado para uso em vacinas para alergias,
potencializam a resposta imune de proteínas através de um forte efeito Th2, o que sugere que
novos adjuvantes poderiam ser mais adequados para induzir uma resposta do tipo Th1, de
maneira a contrabalancear a resposta Th2, exacerbada na reação alérgica (GUPTA, 1998).
Sendo assim, vários novos adjuvantes para imunoterapia com alérgenos estão atualmente sendo
investigados e desenvolvidos. Lipossomas, complexos imunoestimulantes (ISCOM),
oligonucleótidos e adjuvantes derivados de microorganismos (por exemplo, MPL®) estão
sendo avaliados como novos adjuvantes para ITE alergênica, tanto em fase experimental quanto
18
em fase clínica (WILCOCK et al., 2004; CRAMERI; RHYNER, 2006). Por outro lado, as novas
formas farmacêuticas, sobretudo as nanoparticulas poliméricas, têm sido descritas como
adjuvantes de vacinas e sistemas de liberação de alérgenos promissores para imunoterapia
alergênica (SOUZA REBOUÇAS, DE et al., 2012; DUSCHL, 2013; S. REBOUÇAS, DE et
al., 2014; BROTONS-CANTO et al., 2017).
Diferentes tipos de polímeros e copolímeros são utilizados no desenvolvimento de

nanopartículas. Entre eles, os polímeros biodegradáveis são os mais utilizados como grande
promessa na área de sistemas de liberação controlada. Esses tipos de nanopartículas fornecem
propriedades de liberação controlada, mantêm a integridade estrutural e a atividade dessas
biomoléculas, protegendo-as da exposição a condições extremas de pH, secreções de bile e
pancreática e aumenta o efeito imunopotenciador dos antígenos (SOUZA REBOUÇAS, DE et
al., 2012). Além disso, para alcançar o efeito terapêutico desejado, é importante selecionar o
polímero certo para ser usado, uma vez que sua natureza influencia significativamente o
tamanho e o perfil de liberação das nanopartículas (BRAMWELL; PERRIE, 2006). Estes
polímeros biodegradáveis podem ser de origem natural (zeína, quitosana, alginato, carragenina,
albumina, gelatina, colágeno, entre outros) ou sintéticos (a partir de ácidos lácticos, PLA; co-
polímeros de ácido lactico e glicólico, PLGA; polianidridos; poli(e-caprolactona), PCL; poli
alquil-cianoacrilatos, PACA; e outros copolímeros) (SOUZA REBOUÇAS, DE et al., 2012).
Estudos anteriores descreveram o potencial das nanopartículas de polianidrido em

incorporar alérgenos (como proteínas de amendoim (REBOUÇAS et al., 2012; S. REBOUÇAS,
DE et al., 2014) e Lollium perenne (GÓMEZ et al., 2009)), a fim de induzir uma resposta imune
protetora associada a um aumento de resposta Th1 (GAMAZO et al., 2015). Essas formulações
poliméricas também possuem propriedades bioadesivas na mucosa intestinal, um fator
importante para a indução de respostas imunes potentes nas mucosas após administração oral
(IRACHE et al., 2005; SALMAN et al., 2008).
Outro polímero promissor, a zeína, é o produto proteico mais abundante extraído das
sementes de milho. Ela foi investigada pelo seu potencial uso como excipiente farmacêutico,
bem como um biomaterial em engenharia de tecidos (ANDERSON; LAMSA, 2011; IRACHE;
GONZÁLEZ-NAVARRO, 2017). Além disso, sendo de origem natural, é classificado como
um dos excipientes mais seguros pelo órgão que regulamenta o uso de alimentos e fármacos
nos Estados Unidas (FDA) (GEORGET et al., 2008). Vários estudos descreveram que a zeína
apresenta uma característica promissora de liberação controlada de fármacos (PENALVA et
19
al., 2015, 2017; MORENO et al., 2017). Quando administrada oralmente, ela exibe um longo
tempo de permanência no intestino, devido à sua resistência às enzimas digestivas (PATEL;
VELIKOV, 2014), além da ausência de efeitos tóxicos (MORENO et al., 2017). A zeína já
começou a despertar interesse por seu potencial adjuvante. Microesferas de zeína exibiram um
potencial imunogênico, sendo uma ferramenta útil para a terapia com vacinas (HURTADO-
LÓPEZ; MURDAN, 2006; HOFBAUER et al., 2016).
Desta forma, o objetivo deste trabalho foi desenvolver dois tipos de formulações de
nanopartículas poliméricas para a encapsulação de alérgenos da castanha de caju, e avaliar o
potencial imunogênico destas formulações. Como polímeros, foram utilizados o polianidrido,
polímero sintético bioadesivo, amplamente utilizado em vacinas para imunoterapia
antialérgênica; e a zeína, polímero de origem natural, extraído do milho, que possui
características imunogênicas previamente relatadas. Estas formulações de nanopartículas foram
caracterizadas quanto aos parâmetros físico-químicos previamente estabelecidos para sua
possível utilização na imunoterapia clínica. Além disso, estudos in vitro, onde foram avaliados
sua toxicidade e ativação de macrófagos foram realizados. Para determinação da eficácia e
imunogenicidade destes sistemas na imunoterapia para a castanha de caju, foram utilizados
camundongos BALB/c. Estudos de imunização, oral e intradérmica, foram desenvolvidos, a
fim de avaliar o tipo de resposta imune desencadeado por uma única dose de nanopartículas, e
a eficácia foi determinada em um modelo de animal alérgico à castanha de caju.
20
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
 Desenvolver sistemas poliméricos nanoparticulados para encapsulação das

proteínas alergênicas, Ana o1, Ana o2 e Ana o3, presentes na castanha de caju
(Anacardium occidentale), como estratégia de vacinas alergênicas.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Preparação e caracterização físico-química de nanopartículas poliméricas para

encapsulação de proteínas alergênicas da castanha de caju;
 Análise das interações proteínas alergênicas/polímeros;
 Determinação da estabilidade físico-química das nanopartículas através de testes de
estabilidade acelerada e em longo prazo;
 Determinação da cinética de liberação in vitro das proteínas alergênicas
encapsuladas nas formulações de nanopartículas;
 Avaliação da integridade estrutural e imunogenicidade das proteínas alergênicas
liberadas das nanopartículas;
 Avaliação da biocompatibilidade e toxicidade in vitro das proteínas alergênicas
encapsuladas em nanopartículas;
 Avaliação das propriedades imunomoduladoras, através da realização de estudos de
imunogenicidade in vivo (determinação de anticorpos específicos, séricos e de
mucosa) em modelo murino de experimentação;
 Avaliação da eficácia terapêutica das vacinas alergênicas nanoparticuladas, através
da realização de estudos in vivo de proteção à anafilaxia induzida por castanha de
caju, em modelo murino de experimentação.
21
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
1. ALERGIAS ALIMENTARES
1.1.CONCEITO
A Academia Europeia de Alergologia e Imunologia Clinica (EAACI) denomina alergia

alimentar a todas as reações às proteínas alimentares, nas quais os mecanismos imunológicos
estão presentes. São reações mediadas por anticorpos IgE, em consequência da ingestão,
contato ou inalação de um alimento ou aditivo contido no mesmo. As demais reações, sem a
atuação do sistema imunitário, são denominadas intolerância alimentar (JOHANSSON et al.,
2001). Em geral, uma vez diagnosticadas, as alergias alimentares tendem a persistir durante a
vida inteira e estão associadas ao alto risco de indução de anafilaxia, a mais grave das condições
alérgicas (BERNSTEIN et al., 2010).
1.2. PREVALÊNCIA
Determinações precisas da prevalência de alergia alimentar são difíceis porque fatores

como: definições de alergia, populações de estudo, metodologias, variações geográficas, idades,
exposições dietéticas e outros fatores influenciam diretamente as estimativas (SICHERER,
2015).
Uma série de estudos recentes fornecem estimativas de alergia alimentar. Gupta e
colaboradores utilizaram uma pesquisa eletrônica domiciliar dos EUA (número de pacientes
538,480) em 2009 e 2010. Foi estimado que 8% das crianças têm algum tipo de alergia
alimentar; 2,4% têm múltiplas alergias alimentares e, aproximadamente, 3% já chegaram a
desenvolver reações graves (GUPTA et al., 2011). Soller e colaboradores pesquisaram a
presença de alergia alimentar auto relatada em 9667 indivíduos, de 10 províncias canadenses.
Eles encontraram uma taxa global de 8% de incidência. Quando excluíram os adultos que
relatavam alergias improváveis e ajustaram-se aos que não responderam, as estimativas finais
foram de 6,7% na população geral, com 7,1% das crianças e 6,6% dos adultos. Os alérgenos
mais comuns em crianças foram: leite de vaca (2,2%), amendoim (1,8%) e nozes (1,7%). Já em
adultos, os alérgenos mais presentes foram: mariscos (1,9%), frutas (1,6%) e vegetais (1,3%)
(SOLLER et al., 2012).
A Revista Nacional de Saúde e Nutrição (NHANES) dos Estados Unidos, avaliaram
resultados de IgE séricos específicos de alérgenos alimentares (sIgE) e consultas sobre alergias
22
alimentares auto relatadas, obtidos de 2007 a 2010, com 20.686 participantes. No geral, 8,96%
relataram alergia alimentar, com 6,53% entre as crianças (MCGOWAN; KEET, 2013). Osborne
e colaboradores avaliaram realizaram um estudo de coorte baseado na população de 2848 (73%
de taxa de participação), com 1 ano de idade em Melbourne, Austrália. Esse estudo encontrou
uma prevalência estimada de: amendoim, 3,0%; ovo cru, 8,9%; e gergelim, 0,8% (OSBORNE
et al., 2011).
No Brasil, apesar da inexistência de dados epidemiológicos confiáveis, se estimam que as
cifras de prevalência sejam similares. Apesar de qualquer alimento poder induzir alergia,
estudos relatam que os alimentos que produzem alergia com maior frequência estão diretamente
relacionados com os hábitos alimentares da população. Assim, as alergias alimentares mais
frequentes na infância são ao leite, ovo e peixe, assim como a cereais, legumes e frutas. Já na
idade adulta, destacam-se a alergia a frutos secos e a frutos do mar (ALVARADO
IZQUIERDO; PEREZ, 2006; SOLÉ et al., 2012; MA et al., 2014; NWARU et al., 2014;
GAGETE et al., 2017).
1.3. MECANISMOS IMUNOLÓGICOS ENVOLVIDOS NAS REAÇÕES ALÉRGICAS
A fisiopatologia das doenças alérgicas consiste na interação entre as respostas das células
do tecido residente e uma rede complexa de eventos imunológicos que interagem para o
desenvolvimento da inflamação, lesão tecidual e perda de função orgânica. Dentro de uma rede
complexa de mecanismos imunológicos de doenças alérgicas, a resposta imune do tipo 2
representa a maior e clinicamente mais relevante em doenças alérgicas. Geralmente, considera-
se que uma resposta imune de tipo 2 está presente na asma alérgica, dermatite atópica,
rinossinusite crônica com pólipos nasais e rinite alérgica. A resposta imune de tipo 2 envolve
células Th2, células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2), células B, uma pequena fração de
células NK (natural killer) secretoras de IL-4, basófilos, eosinófilos e mastócitos e suas
principais citocinas (AKDIS et al., 2016). De uma rede complexa de citocinas, IL-4, IL-5, IL-
9 e IL-13 são, principalmente, secretadas das células do sistema imune e IL-25, IL-31, IL-33 e
TSLP a partir de mastócitos, macrófagos e células epiteliais (EC) (AGACHE; AKDIS, 2016).
Os mecanismos imunológicos que atuam nas doenças alérgicas podem ser divididos em
duas principais fases: (i) sensibilização e memória e (ii) fase efetora. Durante a sensibilização
do paciente (Figura 1), os alérgenos são capturados nas vias aéreas, intestino ou pele pelas
células dendríticas (DCs) residentes na mucosa. As DCs internalizam e transportam o antígeno
para os linfonodos drenantes. Estes antígenos são processados e apresentados como peptídeos
23
associados a moléculas de MHC de classe II a células T CD4+ naïves, levando à geração de

células Th2 CD4+ alérgenos específicas. Estas células Th2 produzem altos níveis de IL-4 e IL-
13, que iniciam a ativação das células B, promovendo sua mudança de classe de anticorpo para
IgE. As células B de memória IgE amadurecem e diferenciam-se em células plasmáticas,
produzindo grandes quantidades de anticorpos IgE-alérgeno específicos, que se ligam com alta
afinidade à fração FCεRI, presente na superfície dos mastócitos e basófilos, levando assim à
sensibilização de indivíduos com IgE contra alérgenos (GALLI; TSAI, 2013).
Estudos recentes demonstraram que células do tecido residente também podem contribuir
para a sensibilização alergênica. As células epiteliais (ECs) são uma barreira impermeável, e
representam a primeira linha de defesa agressões. Em pacientes alérgicos, sua função de
barreira se encontra alterada, permitindo a penetração de alérgenos, patógenos e outras
partículas na submucosa, o que favorece a sensibilização alérgica e inflamação crônica
(WAWRZYNIAK et al., 2016). As ECs não devem ser consideradas apenas barreiras físicas,
mas também importante células imunoregulatórias capazes de produzir diferentes citocinas
após estimulação, tais como: IL-25, IL-33, IL-31, TSLP (que atua sobre DCs) e ILC2
(contribuindo para a geração Th2 e sensibilização alérgicas) (HAMMAD; LAMBRECHT,
2015).
24
Figura 1. Mecanismos imunológicos envolvidos na sensibilização alergênica. Durante a sensibilização alérgica,

as células dendríticas (DCs) presentes na mucosa capturam, processam e transportam os alérgenos para os
linfonodos circulantes mais próximos para promover a geração de células Th2 alérgeno-específicas (um processo
que depende parcialmente da IL-4). Ocorre a expansão clonal e ativação de células Th2 alérgeno-específicas,
produzindo IL-4 e IL-13, favorecendo o a ativação das células B e mudança de classe de anticorpo para IgE. Os
anticorpos IgE-alérgeno específicos se ligam à superfície das células efetoras (mastócitos e basófilos) através de
receptores de alta afinidade por IgE (FCεRI), ocorrendo a sensibilização do paciente. Um pool de memória de
células Th2 alérgeno-específicas é células B são gerados.
Fonte: Modificada de (PALOMARES et al., 2017).
A fase efetora da reação alérgica (Figura 2) é semelhante a uma reação de hipersensibilidade

do tipo I, iniciada quando uma reexposição ao alérgeno provoca a ligação da IgE com os
receptores FcεRI em basófilos e mastócitos sensibilizados.
A IgE ligada, desencadeia ativação e liberação de mediadores da anafilaxia, como
histamina, heparina ou proteases; promove a síntese de novos mediadores lipídicos, tais como
prostaglandinas, leucotrienos e citocinas. Estes, são responsáveis pelos sintomas da fase
imediata e inflamação aguda. Reações de fase tardia (Figura 3) ocorrem em tecidos quando
25
ocorre infiltração ou exposição de pele, com ativação de células T de memória e formação de

tecidos linfáticos terciários.
Figura 2. Fase efetora característica das reações alérgicas. Ocorre a ligação de moléculas de IgE a receptores de
alta afinidade FCεRI, levando à liberação de aminas vasoativas (como a histamina), mediadores lipídicos (como
prostaglandina D, fator ativador de plaquetas), leucotrieno C4, D4 e E4 (LTC4, LTD4 e LTE4), quimiocinas
(CXCL8, CXCL10, CCL2, CCL4 e CCL5) e outras citocinas (como IL-4, IL-5 e IL-13), dando origem aos
sintomas imediatos das doenças alérgicas.
Fonte: Modificado de (LARCHÉ et al., 2006).
A etiologia da resposta imune alérgica é muito complexa e é diretamente influenciada por

vários fatores, tais como: (1) equilíbrio do sistema imune (balanço Th1/Th2); (2) exposição
precoce a endotoxinas bacterianas e outros imunoestimulantes microbianos (teoria da higiene)
e (3) a interação entre fatores genéticos e ambientais. Além disso, outros fatores, como asma e
exposição precoce a alérgenos alimentares, também foram relatados para influenciar o
desenvolvimento da atopia (JANEWAY et al., 2001).
26
Figura 3. Fase tardia da reação alérgica. Após a migração para os locais de exposição ao alérgenos, sob a influência
de quimiocinas e outras citocinas, as células T alérgenos-específicas são reativadas e ocorre a expansão clonal. A
produção local de IgE é vista na rinite alérgica e asma, mas não nas dermatites atópicas. As células Th1, que
produzem interferon-γ (IFNγ) e o factor de necrose tumoral (TNF), contribuem para a ativação e apoptose de
queratinócitos (na pele), células epiteliais brônquicas e células do músculo liso pulmonar. Ativação de mastócitos
e basófilos, que liberam histamina, quimiocinas e outras citocinas, também contribuem para a reação alérgica
tardia.
Fonte: Modificado de (LARCHÉ et al., 2006).
1.3.1. Equilíbrio do sistema imune (balanço Th1/Th2)
Ambos os subconjuntos celulares Th1 e Th2 são produzidos a partir de uma população
precursora não diferenciada de células T - células T naive. A diferenciação ocorre em alguns
dias após o contato direto das células T naive com as células apresentadoras de antígenos
(APCs). Este processo é conhecido como polarização celular. As células T naive podem passar
27
por um estado transiente, de pré-ativação (T0) antes de se tornarem células Th1 ou Th2. Existem
evidências de que a polarização do tipo 1ou tipo 2 já começa a partir do primeiro contato das
células com os antígenos, incluindo as DCs, monócitos e macrófagos, e outras APCs. Este
processo de polarização é impulsionado, principalmente, por citocinas. O microambiente de
citocinas das células T, é uma matriz dinâmica de sinalização, que interage com receptores
presentes nas superfícies das células para determinar se a célula irá se diferenciar em Th1, Th2
ou outro tipo de célula T diferenciada (DONG; FLAVELL, 2000). Fatores como quimiocinas,
eicosanóides, radicais livres de oxigênio e vários mediadores inflamatórios contribuem para a
matriz de sinalização e influenciam o resultado final. As quimiocinas são substâncias que
atraem células para migrar em uma direção particular (quimiotaxia). Como citocinas, elas atuam
via ligação aos receptores presentes na superfície externa das células imunes. As várias
quimiocinas também têm efeitos sobrepostos nas células alvo. Quando comparamos s dois tipos
celulares, Th1 e Th2, podemos observar que eles expressam receptores de quimiocinas
diferentes nas superfícies de suas células, e elas estão envolvidas no início e ativação das
resposta do tipo 1 e 2 (MUQAKU et al., 2015).
O papel desempenhado pelas células T auxiliares (Th) na amplificação da resposta imune

já foi bem esclarecido. As células Th1 induzem a produção de interferon-gama (IFN-γ) e, em
menor grau, interleucina-2 (IL-2) e interleucina-12 (IL-12). As células Th2 dependem mais
fortemente da interleucina-4 (IL-4) e da interleucina-5 (IL-5). Funcionalmente, as células Th1
atuam no controle contra patógenos intracelulares ou contra células tumorais; Pelo contrário,
os linfócitos Th2 atuam em proteção contra patógenos extracelulares, incluindo parasitas
eucarióticos (DONG; FLAVELL, 2000). Uma das principais características da hipótese é que
as células Th1 e Th2 podem antagonizar as ações umas das outras, quer bloqueando a
polarização celular ou bloqueando as funções de seus receptores. Alguns exemplos, IFN-gama
secretado por células Th1 pode bloquear a proliferação de células Th2 e altas concentrações de
IL-4 ou IL-6 podem bloquear a geração de células Th1, a partir de células T naive. Contudo,
outros tipos de células imunes também podem intervir para bloquear a atividade Th1 ou Th2,
ou ambas. Estes são as células T reguladoras (KIDD, 2003).
1.3.2. Teoria da higiene
Sabe-se que duas respostas imunes provocadas por antígenos distintos que ocorrem
simultaneamente, tendem a inibir-se mutuamente. Numerosos mecanismos foram estudados
28
para explicar a concorrência antigênica que pode ser pertinente para a hipótese de higiene
(HWANG; IM, 2012; KONDRASHOVA et al., 2013). O desenvolvimento de respostas imunes
resistentes contra antígenos de agentes infecciosos pode inibir as respostas a antígenos "fracos",
tais como os antígenos e alérgenos. Entre os mecanismos de competição antigênica, tem-se
dado atenção a competição de linfócitos para citocinas, reconhecimento de complexos
principais de histocompatibilidade (MHC)/complexos de auto peptídeos e fatores de
crescimento necessários para a diferenciação e proliferação de células B e T, durante as
respostas imunes dentro do equilíbrio de produção de linfócitos. Da mesma forma que a massa
de glóbulos vermelhos, que é restaurada para níveis normais após uma hemorragia com a
eritropoietina, os linfócitos T CD4 e CD8 são restaurados para níveis normais após uma
linfopenia. Fatores homeostáticos que desempenham um papel equivalente ao da eritropoietina
não foram completamente esclarecidos; no entanto, as citocinas como IL-2, IL-7 e IL-15 são
conhecidas por desempenharem um papel crucial (KRAMER et al., 2013; LIU, 2015; UPHOFF
et al., 2015).
A "Teoria da Higiene", postulada em 1989 por Strachan, sugere que a redução da exposição
a agentes infecciosos durante a infância, como resultado do estilo de vida ocidental, contribui
para o aumento da prevalência de doenças alérgicas. A redução no contato com agentes
infecciosos pode levar à polarização da memória de células T específicas de antígenos para uma
resposta imune tipo Th2 ao invés de Th1. Além disso, uma menor estimulação do sistema
imunológico pode resultar em uma redução da ativação de células T reguladoras (OKADA et
al., 2010; LIU, 2015).
Vários estudos epidemiológicos investigaram o efeito protetor de agentes infecciosos em

doenças alérgicas e autoimunes. A presença de um, ou mais, irmãos mais velhos teve efeito
protetor contra o desenvolvimento de febre do feno e asma (STRACHAN, 1989), assim como
a frequência em creches durante os primeiros 6 meses de vida (no caso de dermatite atópica e
asma) (LIU, 2015; UPHOFF et al., 2015). Curiosamente, a exposição à agricultura e aos
estábulos no início da vida impede doenças atópicas, especialmente se a mãe é exposta durante
a gravidez (EGE et al., 2006; KALLIOMÄKI, 2009). Também foi demonstrado que a exposição
prolongada a altos níveis de endotoxinas, durante o primeiro ano de vida, protege de asma e
atopia. No entanto, esses dados foram contraditórios, pois outros estudos mostraram uma maior
prevalência de asma correlacionada com altos níveis de endotoxinas em habitação urbana
(TAVERNIER et al., 2006; MATRICARDI, 2010). O nível das endotoxinas é maior nas
29
fazendas em comparação com as cidades, e os indivíduos estão em contato com uma maior
variedade de compostos microbianos nas fazendas, o que poderia explicar essa discrepância.
Dados epidemiológicos de estudos transversais revelaram que as infecções por Schistossoma
têm um forte efeito protetor contra doenças autoimunes, conforme revisado recentemente
(FLOHR et al., 2006; ROOK, 2009). Os ancilostomídeos, como o Necator americanos, também
parece proteger contra a asma. Em contraste, Ascaris lumbricoides e Trichuris trichiura têm
um efeito significativo sobre estas doenças. As infecções parasitárias foram quase erradicadas
nos países europeus desde a Segunda Guerra Mundial, concomitante com o aumento dos índices
de desenvolvimento de alergia (OKADA et al., 2010; KONDRASHOVA et al., 2013; UPHOFF
et al., 2015).
2. ALERGIA A CASTANHA DE CAJU
2.1. PRINCÍPIOS E PREVALÊNCIA
A castanha de caju foi descoberta pelos portugueses, no Nordeste do Brasil, no século

XVI e, desde então, começaram a exporta-la para os outros continentes (OLOGUNDE et al.,
2011). A castanha de caju (Anacardium occidentale) pertence à família Ancardiaceae.
Botanicamente, a castanha de caju é, na verdade, uma semente e não uma noz, mas
historicamente é referida como uma noz. Ela tem forma de rim e cresce no fundo do caju. É
cercado por uma casca que contém uma camada de óleo tóxico. Devido à presença deste óleo
tóxico, a castanha de caju deve ser assada antes de comer. Aproximadamente, 60 % das
castanhas de caju são consumidas como lanche, e os 40% restantes são processados em produtos
como manteigas, pestos, panquecas, doces, sorvetes e chocolates (AZAM-ALI; JUDGE, 2001).
A castanha de caju é usada especialmente nas cozinhas indiana, tailandesa e chinesa. Na
produção mundial de nozes comestíveis, a castanha de caju ocupa o terceiro lugar com o Vietnã,
Nigéria, Índia e Brasil como os principais exportadores de castanha de caju. O cultivo de
castanha de caju não é organizado numa escala de plantação na maioria dos países produtores.
O preço das castanhas de caju é muito maior do que o amendoim e outras nozes, devido ao
modo de processamento intensivo em mão-de-obra necessária para transformar a noz bruta na
castanha de caju comestível (OLOGUNDE et al., 2011). A produção mundial de castanha de
caju experimentou um crescimento rápido. Um aumento de dez vezes foi observado nos últimos
50 anos. A produção mundial foi de, aproximadamente, 1,24 milhões de toneladas em 2000 e
30
aumentou para aproximadamente 3,58 milhões de toneladas em 2010 (AZAM-ALI; JUDGE,

2001).
Estudos publicados relataram a prevalência de alergia às nozes em geral. Embora a

alergia a castanha de caju seja relatada como uma alergia comum entre as nozes, apenas alguns
estudos abordam sobre a prevalência de alergia a castanha de caju (SICHERER et al., 2001).
Pesquisas sugerem um aumento da alergia a castanha de caju em crianças e um maior
reconhecimento da alergia à castanha de caju na prática clínica (RANCÉ et al., 2003;
DAVOREN; PEAKE, 2005). Tariq e colaboradores relataram que 0,08% das crianças com
menos de 4 anos, no Reino Unido, foram sensibilizadas para castanha de caju (TARIQ et al.,
1996). Moneret-Vautrin e colaboradores verificaram que 41% dos pacientes alérgicos a nozes
na França foram sensibilizados para castanha de caju (MONERET-VAUTRIN et al., 1998).
Hasegawa e colaboradores observaram que há, relativamente, mais alergia a castanha de caju
em adultos do sexo feminino (HASEGAWA et al., 2009a). O estudo de York e colaboradores
constatou que a alergia a castanha de caju pode ser mais prevalente na população asiática. De
100 pacientes de uma clínica de alergia pediátrica multicultural em Leicester (Reino Unido),
que relataram histórico clínico sugestivo de alergia a castanha de caju, 41 deles eram de origem
asiática/asiática britânica, em comparação com apenas 21% com história sugestiva de alergia a
outras nozes. Uma possível explicação para esta descoberta é que as crianças asiáticas têm uma
exposição anterior às castanhas de caju por causa de práticas alimentares que levam a mais
alergias a castanha de caju, em comparação com outras populações (BOYE, 2012).
No Brasil, há uma escassez de dados epidemiológicos relacionados a alergias

alimentares. Baldaçara e colaboradores, verificaram, em um estudo realizado com pacientes de
1 – 15 anos de idade, em Palmas, Tocantins, uma incidência de alergia alimentar de 28,9 %
(BALDACARA et al., 2013). Já Gonçalves e colaboradores, em um estudo realizado em
Uberlândia, Minas Gerais, encontraram uma prevalência de alergia alimentar de 23,5 % entre
adolescentes, e 17,6 % entre crianças (GONÇALVES et al., 2016). Uma pesquisa realizada por
Solé e colaboradores, constatou que, entre os pacientes de 12 a 17 anos que apresentaram
episódios de anafilaxia em países latino-americanos, cerca de 26,7 % desenvolveram reações
alérgicas graves às nozes, em geral (SOLÉ et al., 2012). Apesar de não haver dados de
prevalência nacionais, e considerando-se o alto perfil de consumo, estima-se uma alta
incidência de alergia a castanha de caju, principalmente em adultos. Além do aumento no
número de casos de alergia induzidos, a castanha de caju vem sendo descrita como um alimento
31
como alto potencial de induzir reações alérgicas graves, que podem levar ao óbito (RANCÉ et
al., 2003). Gagete e colaboradores verificaram que Brasil possui valores de anafilaxia
semelhantes a outras partes do mundo (6,2 %) e não existem medicamentos disponíveis para
evitar esta condição, uma vez que a epinefrina injetável não está disponível para compra
(GAGETE et al., 2017).
2.2. ALÉRGENOS PRESENTES NA CASTANHA DE CAJU
Atualmente, três proteínas presentes na castanha de caju apresentam potencial

sensibilizante, sendo descritas como responsáveis pela capacidade de indução de reação
alérgica do alimento (Tabela 1) (TEUBER et al., 2002; VALK, VAN DER et al., 2014). O
primeiro alérgeno identificado, o Ana o 1, apresenta duas isoformas – Ana o 1.0101 e Ana o
1.0102 - de aproximadamente 50 kDa. São proteínas da família das 7S vicilinas, que
demonstraram induzir IgE específica em até 50% dos pacientes alérgicos (WANG et al., 2002a).
Posteriormente, se identificou outro alérgeno da castanha de caju, o Ana o 2, uma globulina
com uma banda predominante de 33 kDa e outra minoritária de 53 kDa. Wang e colaboradores
identificaram anticorpos IgE específicos em 62% (16/21) dos pacientes estudados
(ROBOTHAM et al., 2003). O Ana o 3, último alérgenos descrito, pertence à família das
albuminas. Apresenta três isoformas, de pesos moleculares compreendidos entre 6 e 10 kDa.
Robotham e colaboradores estudaram 26 pacientes alérgicos à castanha de caju, dos quais 21
(81%) apresentaram IgE específica para Ana o 3, sendo este alérgenos também considerado que
grande relevância clínica (ROBOTHAM, JASON M et al., 2005).
32
Tabela 1. Alérgenos proteicos presentes na castanha de caju.
Alérgenos Família Peso molecular Referência
Ana o1 7S vicilina 50 kDa (WANG et al., 2002b)
Ana o2 11S globulina 33 – 53 kDa (WANG et al., 2003)
(ROBOTHAM, JASON M et
Ana o3 2S albumina 6 – 10 kDa
al., 2005)
Fonte: Autoria própria.
A castanha de caju, bem como a noz do pistache (Pistacia vera) e a manga (Mangifera
indica) pertencem à família Anacardiaceae e, portanto, são botanicamente relacionadas. Um
alto grau de reatividade cruzada sorológica foi estabelecido entre a castanha de caju e o pistache
(Pis v 1, Pis v 2 e Pis v 3) por testes de inibição de IgE específica. Isso pode ser explicado pela
estrutura primária e tridimensional altamente conservada desses pares de homólogos de
alérgenos, presentes tanto na castanha de caju quanto no pistache (NOORBAKHSH et al.,
2011). A reatividade cruzada clínica entre castanha de caju e pistache também foi relatada por
Willison e colaboradores (WILLISON, L N et al., 2008), Garcia e colaboradores (GARCIA et
al., 2000) e Quercia e colaboradores (FERNANDEZ et al., 1995). A reatividade cruzada entre
pistache e semente de manga também foi estabelecida por testes de inalação de sIgE. Alérgenos
com alto grau de homologia com castanha de caju em suas proteínas alergênicas incluem avelã,
mostarda, amendoim, pistache, gergelim, soja e noz (WILLISON, L. N. et al., 2008; BARRE
et al., 2008; ROBOTHAM et al., 2010). A co-sensibilização é vista entre a castanha de caju e
a amêndoa, avelã, semente de laranja, pistache, amendoim, pectina e noz (GARCIA et al., 2000;
RANCÉ et al., 2003; DAVOREN; PEAKE, 2005; HASEGAWA et al., 2009b; O’SULLIVAN;
SOMERVILLE, 2011).
33
3. DIAGNÓSTICO
Para se obter um diagnóstico fechado, é necessário obter o histórico detalhado do paciente,

ligado a uma compreensão das manifestações clínicas, compreensão da epidemiologia e da
causa imune, e incorporação e interpretação de testes adequados. O histórico familiar detalhado
com a gama de distúrbios alérgicos alimentares e sua fisiopatologia é necessária para alcançar
um diagnóstico bem-sucedido (JONES; BURKS, 2017).
A abordagem geral para o diagnóstico de alergia alimentar foi revisada. As recomendações

das Diretrizes do Painel de Especialistas de 2010 incluem: histórico médico e exame físico,
dietas de eliminação, testes cutâneos de sensibilização, medições de IgE específica e desafios
orais. Entre os testes não para uso de rotina foram testes intradérmicos, medições de IgE séricas
totais, testes de contato atópico e o uso destes em combinação. Além de uma série de testes não
padronizados e não provados foram especificamente não recomendados, incluindo a medição
da liberação de histamina basófilica, cinesiologia aplicada, medição de IgG4 específica, testes
eletrodérmicos e outros (NIAID, 2010; LUYT et al., 2016).
O histórico médico é usado para estimar a chance (probabilidade anterior) de alergia

alimentar e possíveis alérgenos. Quando apropriadamente selecionados e interpretados, são
usados testes minimamente invasivos para chegar a uma probabilidade pós-prova de alergia
(SICHERER; WOOD, 2013; PATEL; VOLCHECK, 2015). Após a chegada à uma conclusão,
pode ser necessário um desafio oral para um diagnóstico final. Os alergologistas evitam a
realização de desafios orais devido ao risco, ao custo, ao tempo e a outros fatores. É importante
garantir que uma parcela completa dos alimentos testados seja ingerida com sucesso para
reduzir o risco de que o desafio oral ocorra sem intercorrências e seja seguido por uma ingestão
crescente de alérgenos (PONGRACIC et al., 2012; TURNBULL et al., 2015).
A crescente disponibilidade do diagnóstico por proteínas recombinantes específicas está
refinando o diagnóstico de alergia mediada por IgE. Os motivos pelos quais a avaliação da
ligação de IgE a proteínas específicas dentro de um alimento pode fornecer informações de
diagnóstico adicionais, incluindo as seguintes possibilidades: (1) o reconhecimento de proteínas
específicas que se comportam como alérgenos potentes (ou seja, estáveis à digestão) podem ser
relevantes em comparação com o reconhecimento de proteínas que são termicamente instáveis
ou homólogas ao pólen; (2) a ligação de múltiplas proteínas dentro de um mesmo alérgeno pode
ter significância diagnóstica; e (3) a diferenciação dos graus de ligação às proteínas
componentes pode revelar reatividade relevante. No entanto, estes métodos apresentam
34
limitações semelhantes aos testes padrões. Por exemplo, o grau de ligação é relevante, as
plataformas de teste específicas podem variar e podem haver diferenças por localização, idade
e reatividade de órgãos alvo. Mais estudos são necessários para correlacionar os resultados do
teste com os resultados clínicos em várias populações de pacientes, mas a prova do conceito foi
atingida em alimentos, incluindo ovos (BARTNIKAS et al., 2013), leite (SICHERER; WOOD,
2013), trigo (PAHR et al., 2013), soja (EBISAWA et al., 2013), frutos (KOLLMANN et al.,
2013), camarões (SICHERER; WOOD, 2013), avelãs (MASTHOFF et al., 2013), amendoim
(SICHERER; WOOD, 2013) e outros.
4. TRATAMENTO
Nas últimas décadas, a alergia alimentar surgiu como um importante problema de saúde
pública em países com estilos de vida ocidentais. O padrão de cuidados atual para o
gerenciamento de alergias alimentares é a prevenção rigorosa e completa exclusão do alérgenos
da dieta e a disponibilidade pronta de epinefrina auto-injetável (KULIS et al., 2015). Esses
princípios de tratamento exigem uma educação significativa do paciente. Os aspectos do
cuidado que foram revisados recentemente incluem: circunstâncias que justificam a prescrição
de epinefrina auto-injetável, a importância da educação sobre o tratamento pré-hospitalar de
reações, educação sobre exclusão (por exemplo, contato cruzado, viagens, restaurantes,
questões escolares e leitura de rótulos), legislação sobre rotulagem, fabricação de alimentos e
aumento do acesso à epinefrina, disponibilidade de organizações de advocacia e numerosos
recursos para a educação desenvolvidos por vários grupos eleitorais (MURARO; AGACHE; et
al., 2014; SICHERER; SAMPSON, 2014). A recomendação de evitar potenciais alimentos
sensibilizadores cruzados deve ser avaliada para o paciente, levando em consideração seu nível
de risco, presença de asma e as implicações nutricionais da restrição extra. A lista final de
alimentos para eliminar precisa ser expandida para incluir outros alimentos que podem conter
esses ingredientes primários. O paciente e sua família precisarão de conselhos sobre como
verificar os rótulos dos alimentos, uma lista de termos alternativos utilizados para o seu
alérgeno (como a caseína para o leite) e conselhos sobre se a criança pode tolerar formas cozidas
ou formas processadas da comida (TURNBULL et al., 2015). Alguns estudos sugerem que a
exclusão prolongada dos alérgenos específicos não é protetora e pode ser um fator de risco em
relação a atopia ou a prevenção de alergia alimentar (FLEISCHER et al., 2013).
Os pacientes e suas famílias devem estar conscientes de que, apesar de suas medidas
cuidadosas, correm o risco de uma exposição acidental. Pequenas quantidades de alimentos
35
podem ser suficientes para causar uma reação grave, como a anafilaxia (SIMONS et al., 2014;
WORM et al., 2014). As reações significativas durante os desafios alimentares ocorrem com
apenas 1 mg de amendoim, 1 mg de ovo, 0,02 mL de leite, 5 mg de peixe e 1 mg de mostarda.
As ingestões acidentais dos alérgenos são comuns. Isso pode ser devido a suposições incorretas
sobre os conteúdos, a leitura incorreta de rótulos e a alimentação de um outro adulto (TAYLOR
et al., 2004).
Os medicamentos apropriados podem, até certo ponto, ajudar a aliviar os sintomas de

condições alérgicas e melhorar a qualidade de vida dos pacientes. Os anti-histamínicos têm um
papel de apoio no tratamento da anafilaxia. Eles reduzem o prurido e urticária, mas não são
capazes de reverter um quadro de reação alérgica grave. Desta forma, não devem atrasar a
injeção de adrenalina. A injeção intravenosa de anti-histamínicos pode causar hipotensão. Os
glicocorticoides também não são semelhantes à adrenalina, mas sua ação adiada pode reduzir
as reações bifásicas e prolongadas (SIMONS et al., 2013, 2014).
Atualmente, o único tratamento capaz de reverter o curso da reação alérgica é a

imunoterapia. A imunoterapia significa "agir especificamente" para dessensibilizar o paciente
para um alérgeno específico. Em outras palavras, o paciente desenvolve uma "tolerância" a esse
alérgeno. Assim, para uma desensibilização bem sucedida seria necessária uma maior
quantidade de alérgenos para induzir uma reação alérgica ou que o alérgeno não induza mais
uma reação (AKDIS; AKDIS, 2009; DHAMI et al., 2016). Dessa forma, há um século, Leonard
Noon começou a usar injeções subcutâneas de um extrato de pólen de capim para tratar febre
do feno (NOON, 2017). Porém, a imunoterapia é um tratamento longo, e as injeções
subcutâneas estão associadas a efeitos colaterais alérgicos locais e sistêmicos. Novos métodos
de imunoterapia com alérgenos foram posteriormente introduzidos para melhorar o perfil de
segurança desta técnica. As vias de administração e o número de injeções foram modificados
em alguns casos. Em outros casos, foram introduzidas modificações nos extratos alergênicos
(GAMAZO et al., 2017).
Em relação as vias de administração, a imunoterapia subcutânea é o método mais bem

estabelecido. No entanto, apesar da sua eficácia, existem limitações para o seu uso, como:
reações alérgicas locais, anafilaxia (ocasionalmente) e reações quase fatais (raramente) (AMIN
et al., 2006; NELSON et al., 2016). Além disso, é recomendado, pelo menos, de 3 a 5 anos de
tratamento, a fim de obter uma resposta imunológica a longo prazo, o que exige uma boa adesão
do paciente. Outra desvantagem é que alguns pacientes possuem "medo de agulhas e os riscos
36
associados ao uso deles” (CDC, 2011). O uso de imunoterapia sublingual (SLIT) tornou-se mais
comum ao passar dos anos. Em geral, o risco de reação anafilática é menor, em comparação
com SCIT e, portanto, pacientes podem se auto-administrar em casa. Porém, a imunoterapia
sublingual é menos eficaz que a imunoterpia subcutânea. A necessidade de administração diária
ou várias vezes na semana também resulta em baixa adesão ao tratamento (NELSON et al.,
2016; MOINGEON; MASCARELL, 2017).
A imunoterapia oral (OIT) foi introduzida com bons resultados em termos de eficácia, mas
com reações adversas sistêmicas mais frequentes, como sintomas gastrointestinais, urticárias e
anafilaxia (NOWAK-WEGRZYN; ALBIN, 2015). No entanto, ela está sendo usada para tratar
pacientes alérgicos a alimentos, especialmente para alergias ao leite, ovo ou amendoim. Ela está
estabelecida em uma fase de escalonamento da dose, em que uma dose oral crescente é
administrada semanalmente no hospital, seguida de uma fase de manutenção, na qual a dose
máxima (se for bem tolerada) é administrada diariamente em casa. A OIT é agora utilizada em
protocolos de pesquisa e pode induzir a dessensibilização (o alimento é tolerado enquanto
recebe tratamento) ou, em alguns pacientes, uma falta de resposta sustentada após a
descontinuação (DHAMI et al., 2016).
Estudos de OIT dão esperança de que um tratamento não intervencionista eficaz para alergia
alimentar esteja ao alcance. Resultados preliminares sugerem um efeito de tratamento benéfico;
no entanto, não pode haver uma declaração definitiva sobre a eficácia. Além disso, as reações
adversas significativas à imunoterapia oral são comuns. As metanálises que abordam
imunoterapia a alergia ao leite, ovo e amendoim indicaram limitações significativas dos estudos
publicados (DHAMI et al., 2016). Burks e colaboradores verificaram que uma alta proporção
de pacientes foi capaz de enfrentar um desafio alimentar oral à proteína do ovo após 1 a 4 anos
de duração, com um aumento de 20 a 100 vezes no limiar de reatividade e na ingestão diária de
doses de manutenção elevadas (300 - 4000 mg) da proteína alimentar. No entanto, a taxa de
reações sistêmicas que necessitaram do uso de epinefrina, observada em até 25% dos
participantes, especialmente aqueles que utilizam alimentos crus, ainda é muito alta para
recomendar a OIT na prática diária (BURKS et al., 2012). Jones e colaboradores alcançaram
uma desensibilização clínica (definida como a capacidade de tolerar 3,9 g de proteína do
amendoim durante um desafio alimentar oral) para 27 das 29 crianças que completou pelo
menos oito meses de tratamento. A regulação descendente da resposta de Th2 ao amendoim foi
documentada: de 6 a 12 meses, o tamanho do teste de punção cutânea de amendoim (SPT)
37
diminuiu, a diminuição da ativação de basófilos pelo amendoim e a produção de citocinas a

partir de células mononucleares de sangue periférico estimuladas com o amendoim foi
modulada e, por 12 a 18 meses, aumentou a IgE e a IgG4 especificas para amendoim. Eles
também demonstraram o alto risco de eventos adversos associados à OIT (JONES et al., 2009).
Keet e colaboradores demonstraram que, embora a maioria dos pacientes com alergia a leite,
mesmo severa, foram capazes de ser dessensibilizados com a imunoterapia oral e subcutânea a
leite. Ademais, embora a maioria dos eventos adversos experimentados pelos participantes do
estudo fosse leve, houve reações multi-sistêmicas ocasionais, mesmo em doses que foram
toleradas por algum tempo sem reação (KEET et al., 2012).
Apesar da eficácia comprovada em muitos estudos clínicos, preocupações quanto à eficácia

a longo prazo e à segurança da SIT limitam seu uso clínico. Como ela requer a aplicação de
altas doses de alérgenos e injeções repetidas, podem ocorrer efeitos secundários locais, mas
também reações alérgicas sistêmicas com risco de anafilaxia grave ou fatal. Para reduzir a dose
administrada de alérgenos, eles podem ser aplicados em combinação com um adjuvante, para
aumentar a resposta imunológica em relação ao alérgeno em solução (WANG; SINGH, 2011).
5. ADJUVANTES
Como muitos avanços médicos importantes, a descoberta dos efeitos imunológicos do uso
de adjuvantes em vacinas foi casual. Gaston Ramon, um veterinário francês, observou que o
rendimento de anti-soros do tétano e da difteria era maior em animais que desenvolveram um
abscesso no local da injeção [24]. Ao ingerir amido, pão ralado ou tapioca, ele induziu abscessos
estéreis no local de injeção com toxina inativada e, assim, conseguiu aumentar a produção de
anti-soro, confirmando a hipótese de que substâncias capazes de induzir inflamação local no
local da injeção também pudessem aumentar o rendimento anti-soro (PASQUALE et al., 2015).
No início do século XX, Glenny e colaboradores mostraram que a toxina da

Corynebacterium diphtheriae precipitada pelo alumínio era mais imunogênica em animais de
laboratório do que a mesma toxina apresentada na forma aquosa (GLENNY; POPE, 1926).
Desde então, os compostos de alumínio vêm sendo amplamente utilizados como adjuvantes
imunológicos em vacinas, tais como aqueles usados para proteger contra a difteria, o tétano, a
febre tifoide, a coqueluche e imunoterapias e são substâncias amplamente utilizadas para esse
fim (JENSEN-JAROLIM, 2015).
38
Os adjuvantes são tradicionalmente adicionados às vacinas para reduzir a frequência de

injeções e/ou a dose de antígeno devido à sua capacidade de potencializar e sustentar a resposta
imune contra patógenos (MURARO; WERFEL; et al., 2014). Adjuvante é qualquer composto
ou substância que possui a capacidade de aumentar a imunogenicidade do antígeno a ele
associado e/ou modular a qualidade da resposta imune induzida. Desta forma, eles podem ser
selecionados de acordo com a ação desejada, podendo favorecer o desenvolvimento de qualquer
um dos tipos específicos de células do sistema imune. Consequentemente, eles estão sendo
introduzidos na produção de vacinas alérgicas, a fim de melhorar e simplificar os protocolos de
imunização, além de melhorar o perfil de segurança de tratamentos de imunoterapia alergênica
(MOINGEON, 2012; GAMAZO et al., 2017).
A nível celular, sabe-se que a vacinação com alérgenos em solução induz a diferenciação
de células T não-diferenciadas em células Thelper (Th1, Th2, Tregs etc.). Na alergia, a co-
administração de antígenos (alérgenos) com adjuvantes pode conduzir as respostas do tipo Th1,
para competir com as reações de hipersensibilidade (mediadas por respostas do tipo Th2),
suprimindo ativamente a inflamação do tipo Th2 (PETROVSKY; AGUILAR, 2004; AWATE
et al., 2013). A escolha do adjuvante depende fundamentalmente do antígeno (alérgeno), bem
como a via de imunização e é limitada pela extensão das reações adversas em resposta à
combinação escolhida. De maneira ideal, um adjuvante deve ser rentável, biodegradável, não
tóxico, ter alta estabilidade in vivo e induzir uma resposta imune apropriada (PFAAR et al.,
2012). No entanto, o seu uso também levar ao aparecimento de efeitos adversos tais como....
(CHESNÉ et al., 2016), aumentando as preocupações sobre sua utilização na clínica. Avanços
no desenvolvimento de novas formas de adjuvantes para imunoterapia têm se concentrado na
redução de seus potenciais riscos, ao mesmo tempo em que melhoram a sua modulação na
imunogenicidade da imunoterapia alergênica (BREHLER, 2017).
5.1. MECANISMOS DE AÇÃO DOS ADJUVANTES
O objetivo primordial da imunoterapia é a indução de uma resposta imunológica protetora

e, em alguns casos, este alvo pode ser alcançado pela adição de adjuvantes. Diversas classes de
compostos foram estudadas e testadas como adjuvantes, incluindo sais minerais, produtos
microbianos, emulsões, saponinas, citocinas, micropartículas, nanopartículas e lipossomas
(GUY, 2007; PASQUALE et al., 2015). Apesar do extenso uso de adjuvantes de vacinas, os
mecanismos de ação pelos quais potencializam as respostas imunes não estão bem elucidados.
39
Os estudos atuais disponíveis sugerem que os adjuvantes desempenham um ou mais dos

seguintes mecanismos para induzir respostas imunes: (1) liberação de antígenos no local de
injeção (efeito de depósito), (2) estimulação da produção de citocinas e quimiocinas, (3)
recrutamento celular no local da injeção, (4) aumento da captação e apresentação do antígeno
às células apresentadoras de antígenos (APC), (5) ativação e maturação da APC [complexo
maior de histocompatibilidade (MHC) classe II e moléculas co-estimuladoras expressão] e
migração para os gânglios linfáticos drenantes e (6) ativação de inflamossomas (WANG;
SINGH, 2011; AWATE et al., 2013; MOJSILOVIĆ, 2017)
5.2. TIPOS DE ADJUVANTES
5.2.1. Sais de alumínio
O hidróxido de alumínio ou o fosfato de alumínio são os adjuvantes mais amplamente

utilizados na imunoterapia alergênica para potencializar as respostas imunes aos alérgenos
injetados (JENSEN-JAROLIM, 2015). Aproximadamente, 75% de todas as terapias baseadas
no uso de adjuvantes, incluem um tipo de sal de alumínio (EXLEY, 2014). A vacina é composta,
principalmente, por aglomerados de partículas de tamanho micrométrico do sal de alumínio, ao
qual o antígeno é adsorvido (KRAMER; HEATH, 2014). A aplicação de alérgenos adsorvidos
ao alumínio provou ser eficaz e segura em uma variedade de estudos que abordavam a
imunoterapia alergênica subcutânea e outras rotas parenterais (EXLEY, 2014). Várias hipóteses
sobre os mecanismos de ação dos sais de alumínio foram propostas (HOGENESCH, 2012). A
primeira imunização com o alérgeno adsorvido ao sal de alumínio demonstrou induzir uma
resposta precoce na produção de citocinas, incluindo a IL-18, facilitando a produção de IL-4
(KOOL et al., 2008; ARAGON et al., 2009). Após repetidas imunizações, estudos provaram
que os sais de alumínio apresentaram uma mudança na resposta imune, aumentando a resposta
do tipo Treg/Th1, e diminuindo a resposta do tipo Th2, com produção de anticorpos IgG
bloqueadores de IgE (HOGENESCH, 2012). Assim, o uso de sais de alumínio na imunoterapia
como adjuvantes, é uma ferramenta útil para estimular uma resposta imune modificada de Th2,
com perfil protetor (WILCOCK et al., 2004). Até o momento, o uso de extratos alergênicos
adsorvidos aos sais de alumínio tem melhorado os sintomas nos casos de aeroalérgenos e
alérgenos de venenos. No entanto, estes sais possuem algumas importantes limitações,
particularmente no que se refere aos seus efeitos em uma tendência a resposta Th2 e sua
potencial implicação em patologias neurológicas (SOLE, DE et al., 2013; KRAMER; HEATH,
40
2014). A indução de resposta Th2 é considerada um efeito colateral indesejável, possivelmente

relacionado a um aumento IgE-alérgeno específico, logo após o início da imunoterapia. Com o
seguimento do tratamento, ocorre uma diminuição da resposta Th2. Estudos na área de
imunoterapia visam desenvolver novas formas de adjuvantes capazes de induzir tolerância,
evitando a indução ou amplificação de respostas do tipo Th2 (CHESNÉ et al., 2016;
MOJSILOVIĆ, 2017).
5.2.2. Emulsões
Outro adjuvante clássico empregado na imunoterapia, o adjuvante de Freund completo

(CFA), descoberto por Jules Freund em 1951, é uma emulsão composta por antígenos solúveis
em óleo de parafina (emulsão água-em-óleo), com um surfactante e Mycobacteria inativada
(MOJSILOVIĆ, 2017). Devido à sua alta potência e eficácia, era utilizado para induzir resposta
imune em estudos experimentais, pois apresentava uma alta toxicidade para ser aplicado a
humanos. Uma variante menos potente, e mais fácil para a preparação e aplicação, é a emulsão
do tipo óleo-água, denominada adjuvante incompleto de Freund (IFA), pois não contém
Mycobacteria inativada. No entanto, mesmo sem a presença da Mycobactéria, o adjuvante
incompleto de Freund ainda é demasiado reatogênico para ser usado em vacinas humanas
(COFFMAN et al., 2010; PASQUALE et al., 2015). Atualmente, existem dois adjuvantes de
emulsão óleo-água licenciados para uso em vacinas humanas - MF59 (Novartis) e AS03
(GlaxoS-mithKline). Ambos são baseados na utilização do esqualeno como o componente de
óleo. O esqualeno é um óleo biodegradável, extraído do fígado do tubarão, e também é
encontrado naturalmente nos tecidos humanos. Além disso, o MF59 contém surfactantes, como
o polissorbato (Tween 80) e o sorbitol. Já o AS03, contém Tween 80 e alfa-tocoferol (vitamina
E). Eles são usados em vacinas contra a gripe sazonal e pandêmica, uma vez que provocam um
alto teor de anticorpos neutralizantes, bem como uma forte resposta de células T CD8+. Ambas
as emulsões têm bons registros de segurança, permitem menos doses, além de diminuir a
quantidade de doses de antígenos e geram respostas de memória marcadas, com fenótipos de
células Th1 e Th2 mesclados (FOX; HAENSLER, 2013).
5.2.3. Agonistas-TLR (receptores toll-like)
Desde a descoberta dos receptores do tipo toll-like (TLR) e seu papel fundamental na
imunidade inata, grande parte dos esforços são investidos no desenvolvimento de adjuvantes
que direcionariam diretamente a esses receptores de reconhecimento padrão (PRR).
Atualmente, apenas um adjuvante agonista-TLR foi licenciado, mas muitos estão em fases de
41
pesquisa pré-clínica ou ensaios clínicos. O monofosforil lipídio A (MPL), derivado de

lipopolissacarídeo, é um agonista de TLR4, sendo 10.000 vezes melhor tolerado do que o lipídio
original A (DIDIERLAURENT et al., 2009; KARCH; BURKHARD, 2016). Combinados aos
sais de alumínio, o composto AS04, está atualmente aprovado para uso em uma das vacinas
contra papilomavírus humano (Cervarix®). Foi demonstrado que ele possui a propriedade de
aumentar os títulos de anticorpos e induzir uma forte resposta imune celular.
Os análogos sintéticos de ácidos nucleicos bacterianos e virais também são candidatos

promissores para adjuvantes. Os oligodeoxinucleotídeos 5'-citosina-fosfato-guanina-3
sintéticos (CpG-ODN), são direcionados para TLR9. O CpG-ODN aumenta a resposta humoral
e polariza fortemente as resposta celular Th para Th1 (BODE et al., 2011). Outro análogo
sintético de ácido nucleico, poliinosinico:ácido poli (ácido poliédrico) (poli I:C), tem uma
estrutura semelhante ao de alguns vírus. Este composto liga dois tipos de PRR-TLR3 e MDA5
(um receptor semelhante à RIG – gene I induzido pelo ácido retinóico). A ativação de ambos
os receptores otimiza a magnitude e durabilidade da imunidade celular Th1 e CD8+, em
comparação com qualquer via isolada (LONGHI et al., 2009). A flagelina bacteriana, um
agonista de TLR5, também pode ser usada como adjuvante, seja em uma mistura com um
antígeno ou quando sintetizada como uma única proteína recombinante (HULEATT et al.,
2007). Ao contrário de muitos dos outros agonistas de TLR que polarizam fortemente a resposta
das células Th1, ela tende a produzir respostas de células Th1 e Th2 (MOJSILOVIĆ, 2017).
5.2.4. SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA
A nanotecnologia farmacêutica é a área das ciências farmacêuticas que está envolvida no

desenvolvimento, caracterização e aplicação de sistemas de liberação controlada em escala
nanométrica. Esta tecnologia surgiu na década de 60, com o desenvolvimento da
microencapsulação, técnica de transformação de líquidos (polímeros e outras substâncias) em
pó com tamanho das partículas em escala micrométrica. A microencapsulação é bastante
utilizada nas indústrias alimentícia, têxtil, farmacêutica e cosmética por permitir a proteção de
substâncias lábeis e voláteis, o controle da liberação do fármaco, contribuindo para a melhoria
da biodisponibilidade e redução da dose terapêutica e toxicidade. A microencapsulação serviu
de modelo para técnicas mais sofisticadas, agora em escala nanométrica, permitindo o
desenvolvimento de nanopartículas e nanoesferas (PIMENTEL et al., 2007; PARK, 2015).
42
Os sistemas de liberação controlada oferecem várias vantagens quando comparados aos

sistemas convencionais de administração de fármacos, dentre elas destacam-se: a proteção do
fármaco no sistema terapêutico contra possíveis instabilidades no organismo, promovendo
manutenção de níveis plasmáticos em concentração constante; o aumento da eficácia
terapêutica; a liberação progressiva e controlada do fármaco pelo condicionamento a estímulos
do meio em que se encontram (sensíveis a variação de pH ou de temperatura); a diminuição
expressiva da toxicidade pela redução de picos plasmáticos de concentração máxima; a
diminuição da instabilidade e decomposição de fármacos sensíveis; a possibilidade de
direcionamento a alvos específicos (sítioespecificidade); a possibilidade de incorporação tanto
de substâncias hidrofílicas quanto lipofílicas nos dispositivos; a diminuição da dose terapêutica
e do número de administrações e aumento da aceitação da terapia pelo paciente (PIMENTEL
et al., 2007; TORCHILIN, 2008, 2014).
Nas formas de administração convencionais (spray, injeção, pílulas), a concentração do

princípio ativo na corrente sanguínea apresenta um aumento, atinge um pico máximo e então
declina. Desde que cada princípio ativo possui uma faixa de ação terapêutica acima da qual ela
é tóxica e abaixo da qual ela é ineficaz, os níveis plasmáticos são dependentes das dosagens
administradas. Este fator é limitante quando a dose terapêutica é próxima à dose tóxica. O
objetivo dos sistemas de liberação controlada é manter a concentração do fármaco entre estes
dois níveis por um tempo prolongado, utilizando-se de uma única dosagem (TIWARI et al.,
2012).
Além disso, os sistemas de liberação controlada são considerados adjuvantes, pois são
capazes de potencializar a ação das células apresentadoras de antígeno, aumentando a duração
de contato entre o alérgeno e a mucosa do paciente. Eles são capazes de estender a duração do
contato através de diferentes mecanismos. Um desses mecanismos se deve a utilização de
nanopartículas constituídas por polímeros mucoadesivos que aumentam o influxo de células
apresentadoras de antígeno para o local da injeção, no caso da imunoterapia subcutânea. Os
sistemas de liberação controlada também mostraram ser eficazes em modelos animais que
visavam a imunoterapia através de vias de administração parenterais (SCHÖLL et al., 2004;
SANDERS et al., 2005; POHLIT et al., 2017).
5.2.4.1. Nanopartículas
As nanopartículas são partículas esféricas, variando em tamanho de 10 a 1000nm, que

podem ser produzidas a partir de copolímeros bio-compatíveis e biodegradáveis, naturais ou
43
sintéticos, com baixa solubilidade em água. Elas podem ser divididas em duas categorias:
nanocápsulas e nanoesferas. As nanocápsulas são sistemas vesiculares em que o fármaco é
encapsulado em uma cavidade cercada por uma membrana de polímero com um núcleo oleoso,
enquanto as nanoesferas são uma matriz polimérica em que o fármaco está disperso fisicamente
e uniformemente na malha polímerica (Figura 4). (COUVREUR et al., 2002; ZHAO et al.,
2014).
Figura 4. Os dois principais tipos de nanopartículas poliméricas conhecidas como nanoesferas (sistema matriz) e
nanocápsulas (sistema reservatórios) com diferentes modalidades de carreamento de princípios ativos.
Fonte: Modificado de (AWWAD et al., 2017).
As nanopartículas oferecem as seguintes vantagens como carreadores de alérgenos

(RIEUX, DES et al., 2006; DACOBA et al., 2017):
(i) Proteção contra hidrólise e/ou degradação enzimática;

(ii) Propriedades de liberação controlada de alérgenos;
(iii) Co-encapsulação de alérgenos e imunopotenciadores (LPS);
(iv) O aumento da biodisponibilidade;
(v) A redução de efeitos adversos e toxicidade.
(vi) Atuam como adjuvantes, sendo capazes de modular a resposta imune.
Sabe-se que as propriedades das nanopartículas como tamanho, carga de superfície,

hidrofobicidade/hidrofilicidade e efeitos estéreis do revestimento de partículas pode determinar
44
sua compatibilidade com o sistema imunológico (SOUZA REBOUÇAS, DE et al., 2012). Além
disso, as nanopartículas também podem ser projetadas para provocarem uma resposta imune,
quer por imunoestimulação direta de células apresentadoras de antígenos quanto por
fornecimento de antígenos a compartimentos celulares específicos (KALKANIDIS et al.,
2006). Para alcançar o efeito terapêutico desejado, é importante, selecionar o polímero certo
para ser usado como agente encapsulador, uma vez que sua natureza influencia
significativamente o tamanho e o perfil de liberação das nanopartículas(CRAPARO; BONDI,
2012).
As propriedades adjuvantes das nanopartículas poliméricas ocorrem através de diferentes

mecanismos: efeito de depósito, recrutamento de células apresentadoras de antígenos (APCs) e
modulação do sistema imunológico (Figura 5). A formação de depósito aprisiona os alérgenos
e permite sua lenta liberação a partir da matriz polimérica. A maior permanência do antígeno
no organismo aumenta o recrutamento de células apresentadoras de antígeno maduras para o
local da administração, desencadeando uma resposta inflamatória prolongada, seguida por
recrutamento de células competentes do sistema imunológico inato e adaptativo (REBOUÇAS
et al., 2012; GAMAZO et al., 2017). Neste sentido, na última década, uma grande variedade de
polímeros vem sendo empregada na fabricação de nanopartículas para a encapsulação de
proteínas alergênicas (SOUZA REBOUÇAS, DE et al., 2012).
45
Figura 5. Mecanismos imunológicos da imunoterapia alergênica com base no uso de nanopartículas carreadoras
de alérgenos.
Fonte: Modificada de (GAMAZO et al., 2017).
5.2.4.2. Nanovacinas
As nanopartículas vêm sendo exploradas com sucesso a fim de criar novas gerações de
medicamentos profiláticos versáteis e potentes, com o objetivo de fornecer proteção a curto ou
longo prazo (GAMAZO et al., 2017). Quando utilizadas como estimulantes imunes inatos, e
capaz de fornecer proteção a curto prazo contra a transmissão de patógenos, em caso de
exposição potencial conhecida, isto é, no trato reprodutivo feminino (CU; SALTZMAN, 2009;
HAM et al., 2009). Para proteção a longo prazo, estratégias de vacinação podem ser seguidas
visando induzir respostas de memória imunológica para prevenir infecções ou desenvolvimento
de tumores. Para gerar imunidade celular, a apresentação do antígeno no complexo principal de
histocompatibilidade (MHC) classe I ganha importância e a natureza particulada das
nanopartículas possui propriedades que são capazes de facilitar a apresentação do antígeno.
Vários métodos foram explorados a fim de aprimorar a apresentação do antígeno mediada por
nanopartículas (KWON et al., 2005; FLANARY et al., 2009). O direcionamento de
nanopartículas de forma específica a populações de células dendríticas especializadas pode ser
46
realizado através dos mecanismos de captura natural destes sitemas, isto é, por endocitose ou
pinocitose, ou até pelo desenvolvimento de nanopartículas com modificações na sua superfície,
tais como anticorpos, polissacarídeos, péptidos e fármacos, que permitem um reconhecimento
específico por receptores de superfície celular presentes nas células dendríticas (REDDY et al.,
2006; KLIPPSTEIN; POZO, 2010).
Shen e colaboradores mostraram que as nanopartículas PLGA melhoraram a apresentação e

liberação de ovalbumina (OVA) pela classe MHC I, quando comparado ao antígeno solúvel
(SHEN et al., 2006). Baba e colaboradores desenvolveram nanopartículas de g-PGA
biodegradáveis com a subunidade p24 do capsídeo de HIV encapsuladas a fim de aumentar as
respostas imunes celulares em uma vacina contra o HIV, provocando uma melhor resposta das
células T, quando comparadas a um adjuvante conhecido e potente, como adjuvante completo
de Freund (CFA) (WANG et al., 2007; BOBEK et al., 2010). Da mesma forma, a imunização
intranasal de camundongos com nanopartículas de g-PGA que encapsulam a proteína de
envenenamento de HIV gp120 induziu respostas de células T de efetor e memória CD8
específicas de antígeno (WANG et al., 2007). Para superar a estratégia de evasão imunológica
da variabilidade antigênica, as nanopartículas podem ser produzidas para vacinar com uma
combinação de múltiplos antígenos, utilizando uma vacina multivalente. Uma vacina multi-
antigénica do HIV foi realizada a partir da adsorção de proteínas do HIV-1 p24 e gp120 na
superfície das nanopartículas de PLA que, após a administração em camundongos, induziram
altos títulos de anticorpos contra ambos os antígenos (ATAMAN-ÖNAL et al., 2006;
LAMALLE-BERNARD et al., 2006). Sabe-se que o uso de nanomateriais pode facilitar a
administração de genes intracelulares, além de melhorar a apresentação do antígeno no MHC
de classe I (CRAPARO; BONDÌ, 2012).
Broos e colaboradores descreveram o potencial das nanopartículas de g-PGA como potentes

sistemas de libertação de alérgenos para células dendríticas humanas. Foi demonstrado que
estas partículas foram internalizadas eficientemente por células dendríticas derivadas de
monócitos imaturos e estimulam fortemente a produção de quimiocinas, bem como
interleucinas (BROOS et al., 2010). Recentemente, Scholl e colaboradores descreveram a
otimização da formulação de alérgenos parenterais através do uso de nanopartículas PLGA,
sugerindo que essas partículas podem ser ferramentas úteis para a terapia de alergia tipo I. Em
particular, o alérgeno do pólen de vidoeiro (Bet v 1) foi encapsulado em nanopartículas de
PLGA alteração na sua antigenicidade. Além disso, resultados demonstraram que a aplicação
47
subcutânea das nanopartículas contendo Bet v 1 encapsulado tende a modificar a resposta imune
em direção a uma resposta do tipo Th1 em camundongos alérgicos (reduzindo o predomínio da
resposta Th2) e, não desencadeou a formação de granulomas em camundongos e em voluntários
humanos (SCHÖLL et al., 2004, 2006). Outros autores relataram resultados obtidos com
nanopartículas produzidas com polianidridos, tais como o copolímero obtido entre metil vinil
éter e anidrido maléico (PVM/MA) (ARBÓS et al., 2002; GÓMEZ et al., 2009; CAMACHO
et al., 2013; S. REBOUÇAS, DE et al., 2014; BROTONS-CANTO et al., 2017).
5.2.4.2.1. Polímeros
5.2.4.2.1.1. Poliésteres
Poliéster é uma categoria de polímeros que contém o grupo funcional éster na sua cadeia
principal. Os polímeros de poliésteres são os mais utilizados como sistemas de administração
de fármacos e atraíram considerável atenção como devido à sua biocompatibilidade e
biodegradabilidade (SOPPIMATH et al., 2001; WASHINGTON et al., 2017).
Para fins de vacinação, os poliésteres, como o PLA e o PLGA (de peso molecular variável)
foram os materiais mais populares para a preparação de nanopartículas. Devido à sua bem
documentada biocompatibilidade, segurança e biodegradabilidade, estes polímeros são
aprovados pela FDA para várias aplicações clínicas em seres humanos (LA FUENTE, DE et
al., 2008). Apesar do seu interesse como adjuvantes nanoparticulados e sistemas de liberação
controlada para imunoterapia, o uso destes polímeros como carreadores de peptídeos ou
proteína pode afetar negativamente a estabilidade do composto carregado devido ao mecanismo
de degradação em massa do polímero e aos produtos obtidos pela degradação ácida. Outra
limitação desse polímero é a sua insuficiente estabilidade e capacidade de penetração na
administração mucosa .(GREGORY et al., 2013).
A poli(ε-caprolactona) (PCL) é um poliéster biocompatível, biodegradável, semicristalino

que pode ser utilizado para a formulação de nanopartículas (IRACHE et al., 2011). Devido à
semicristalinidade e à hidrofobicidade, a degradação in vivo do PCL é muito mais lenta do que
o PLGA, tornando-o mais adequado para sistemas de entrega a longo prazo, que se estendem
ao longo de mais de um ano. Além disso, as partículas de PCL, ao contrário das polilácticas,
não geram um ambiente ácido que possa afetar negativamente a antigenicidade dos antígenos
ou alérgenos encapsulados. No entanto, a maioria dos estudos PCL encontrados no campo de
imunoterapia foram realizados utilizando micropartículas/microesferas de PCL. Estudos que
48
utilizam este polímero como nanopartículas para imunoterapia com alérgenos não foram
encontrados e tem sido pouco utilizado como sistema de liberação controlada para o
desenvolvimento de vacinas (SINHA et al., 2004; FLORINDO et al., 2008, 2009).
Os poliésteres, como o PLGA (ácido poli lático-co-glicólico) e o PLA (poli ácido láctico),
aprovados pelo Órgão de administração de alimentos (FDA) para uso humano em diferentes
aplicações clínicas, vêm sendo utilizados para a encapsulação de alérgenos (PÉAN et al., 1998;
SCHÖLL et al., 2006; FECZKÓ et al., 2011; FAIRLEY et al., 2013). Schöll e colaboradores
descreveram a preparação de nanopartículas de PLGA contendo Bet v 1 (principal alérgeno do
pólen) e demonstraram uma redução na reposta alérgica Th2 em camundongos (BALB/c) que
receberam os alérgenos encapsulados nas nanopartículas (SCHÖLL et al., 2004). Além disso,
o PLGA também é utilizado na obtenção de micropartículas para a encapsulação de alérgenos.
Batanero e colaboradores empregaram micropartículas de PLGA contendo Ole e 1 (principal
alérgeno do pólen de oliveira, Olea europaea L.) no desenvolvimento de uma vacina alérgeno
específica (BATANERO et al., 2002). Além disso, outros trabalhos demonstraram que a
modificação da superfície das nanopartículas de PLGA e PLA, principalmente através da
associação com PEG (poli etileno-glicol), é capaz de aumentar a potência vacinal, já que
aumenta o seu tempo de permanência no organismo, favorecendo a indução de respostas
imunitárias protetoras (VILA et al., 2002, 2004, 2005; BHARALI et al., 2008).
Outros poliésteres, como a PCL (Poli-ε-caprolactona), podem ser utilizados na preparação

de sistemas carreadores de antígenos e proteínas para o desenvolvimento de vacinas (JESUS et
al., 2016). O PCL é um polímero biodegradável e biocompatível, que apresenta degradação in
vivo consideravelmente mais lenta que o PLGA. Além disso, partículas de PCL, ao contrário
dos poliláticos, não geram acidificação do meio, favorecendo a conservação da antigenicidade
dos antígenos e proteínas encapsulados (SINHA et al., 2004; GARG et al., 2017). Estudos
anteriores obtiveram resultados satisfatórios empregando nanoesferas de PCL recobertas com
polímeros mucoadesivos (alginato e quitosana) como adjuvante de antígenos (S. eqqui)
(FLORINDO et al., 2009), o que sugere que as naopartículas de PCL também possuem um
amplo potencial para imunoterapia alergênica.
5.2.4.2.1.2. Polissacarídeos
49
O polissacarídeo mais utilizado para a administração de vacinas orais é a quitosana, poli

(D-glucosamina). A quitosana é solúvel em soluções ácidas fracas, resultando na formação de
um polímero catiônico com alta densidade de carga e, portanto, pode formar complexos de
polieletrólitos com uma grande variedade de polímeros aniônicos (SOPPIMATH et al., 2001).
Além disso, devido à presença de grupos amino altamente reativos ao longo de sua estrutura, a
quitosana é susceptível à funcionalização química ou biológica e a preparação de nanopartículas
de quitosanoa pode ser facilmente feita sem o uso de solventes orgânicos, o que é interessante
para manter a imunogenicidade dos antígenos (ILLUM et al., 2001; JAYAKUMAR et al.,
2007). A quitosana possui outras propriedades vantajosas tais como: baixos custos de produção,
biocompatibilidade, biodegradabilidade e não toxicidade que, juntamente com sua capacidade
de aumentar a penetração de macromoléculas nas barreiras intestinais e nasais, a tornam uma
candidata adequada para o desenvolvimento de formulações de vacinas mucosas. No entanto,
apesar de todas as vantagens descritas, este polímero possui uma limitação importante: sua
baixa solubilidade em pH fisiológico e, portanto, perde sua capacidade de aumentar a
permeabilidade e a absorção de compostos bioativos (LUBBEN, VAN DER et al., 2001).
5.2.4.2.1.3. Polianidridos
Em contraste com as nanopartículas de ácidos polilácticos, os produtos de degradação dos

polianidridos são não citotóxicos além de serem menos ácidos que os de poliésteres, o que pode
melhorar a estabilidade do antígeno encapsulado (MALLAPRAGADA; NARASIMHAN,
2008). Os copolímeros de éter metilvinílico e anidrido maleico (PVM/MA) são um bom
exemplo. Devido à presença de grupos de anidrido reativos que não necessitam de ativação
química, este copolímero permite a produção prática de nanopartículas através do método de
deslocamento de solvente. Além disso, estudos recentes concluíram que nanopartículas de
polianidrido preparadas com uma quantidade reduzida de solvente orgânico (acetona) facilita a
encapsulação de antígenos (VANDAMME et al., 2011). Uma das propriedades mais
importantes das nanopartículas de polianidrido é a capacidade de desenvolver fortes interações
bioadesivas com componentes da mucosa intestinal (SALMAN et al., 2008). Além disso, a sua
superfície pode ser facilmente modificada por incubação simples com excipientes ou ligantes
diferentes, a fim de melhorar a sua distribuição in vivo e até mesmo aumentar a sua afinidade
pela mucosa intestinal (YONCHEVA et al., 2005). Isso faz das nanopartículas de polianidrido
boas candidatas para tratamentos de imunoterapia oral, que dispõem de muitas vantagens
evidentes (conformidade do paciente, via mais segura, rota menos dispendiosa etc.).
50
Os polianidridos e seus copolímeros também vêm sendo amplamente estudados para o

desenvolvimento de vacinas para alergias. Dentre eles, o polianidrido maleico (PVM/MA),
comercializado como Gantrez® AN 119 (ISP, Barcelona, Espanha), é um copolímero que tem
sido amplamente utilizado para a encapsulação de fármacos, antígenos bacterianos e alérgenos.
O PVM/MA é um polímero biocompatível e de baixo custo, que permite a preparação de
nanopartículas através do método do deslocamento do dissolvente (precipitação), com
resultados reproduzíveis e homogêneos. Além disso, apresenta uma baixa toxicidade oral
(DL50 > 2g/Kg (OJER et al., 2012). Devido à extrema reatividade do PMV/MA, devido a seus
grupos anidridos, permite que fármacos antitumorais (AGÜEROS et al., 2010), antígenos
bacterianos (OCHOA et al., 2007; CAMACHO; COSTA MARTINS, DA; et al., 2011) e
alérgenos protéicos (GÓMEZ et al., 2006, 2009) sejam satisfatoriamente encapsulados. Além
disso, as características estruturais do PVM/MA favorecem interações bioadesivas ao longo do
trato gastrointestinal, que podem ser incrementadas através do revestimento das nanopartículas
com diferentes ligandos de superfície (ARBÓS et al., 2002). De fato, estudos prévios
demonstraram que, quando administradas por via oral, as nanopartículas de polianidrido se
aderem às placas de Peyer presentes no intestino, confirmando o seu potencial como veículo
para administração de moléculas através de mucosas (oral, nasal e conjuntival) (ARBÓS et al.,
2003; SALMAN et al., 2005, 2008).
Por outro lado, as nanopartículas de PMV/MA apresentam propriedades

imunomoduladoras, que são diretamente influenciadas pelo método de preparação (liofilização
ou spray-dryer) (REBOUÇAS et al., 2012). Além de induzir a resposta humoral, estas
nanopartículas demonstraram ser capazes de ativar a imunidade inata através da ativação do
sistema complemento (CAMACHO; SOUZA, DE; et al., 2011) e de receptores toll-like (TLR)
(TAMAYO et al., 2010), etapas essenciais para a indução de respostas imunitárias eficazes.
Estudos prévios descreveram a encapsulação de alérgenos alimentares em nanopartículas

de polianidrido. Gómez e colaboradores demonstraram um aumento na produção de anticorpos
IgG1 e IgG2a (marcadores Th2 e Th1, respectivamente) depois da administração oral de
nanopartículas de Gantrez® contendo ovalbumina (OVA, principal alérgeno do ovo) e
recobertas com lipopolissacarídeo de B. ovis (GÓMEZ et al., 2006). Além disso, os autores
provaram que a incorporação da OVA nas nanopartículas é capaz de proteger do choque
anafilático animais (BALB/c) previamente sensibilizados. Recentemente, os alérgenos do
amendoim (A. hypogaea) foram encapsulados em nanopartículas de polianidrido e, quando
51
administrados em camundongos (C57Bl/6J) por via intradérmica, foram capazes de exercer

efeitos imunomoduladores e adjuvantes (REBOUÇAS et al., 2012; S. REBOUÇAS, DE et al.,
2014). Adicionalmente, os autores também conseguiram reduzir os sinais e sintomas de
anafilaxia em um modelo animal de alergia a amendoim (SUN et al., 2007; BROTONS-
CANTO et al., 2017).
5.2.4.2.1.4. Zeína
A zeína é o produto proteico mais abundante extraído das sementes de milho. Ela foi
investigada pelo seu potencial uso como excipiente farmacêutico, bem como um biomaterial
em engenharia de tecidos. Além disso, sendo de origem natural, é classificado como um dos
excipientes mais seguros pelo órgão que regulamenta o uso de alimentos e fármacos nos Estados
Unidos (FDA) (GEORGET et al., 2008).
As propriedades da zeína, determinadas pela sua estrutura, variam amplamente dependendo

da fração protéica, processamento, condições ambientais, modificações químicas e grau de
degradação (IRACHE; GONZÁLEZ-NAVARRO, 2017). Atualmente, a zeína é usada em
comprimidos e revestimentos farmacêuticos e é considerada a mais promissora para aplicações
em embalagens e revestimentos comestíveis e biodegradáveis, além de aplicações biomédicas.
Ela mostrou um grande potencial no campo da nanotecnologia farmacêutica, pois possui
potencial para uma ampla gama de possíveis modificações, excelente biocompatibilidade e
biodegradabilidade (BARTKOWIAK et al., 2017).
Vários estudos descreveram que a zeína apresenta uma característica promissora de

liberação controlada de fármacos (PENALVA et al., 2015, 2017; MORENO et al., 2017), pois
foi visto que, quando administrada oralmente, ela exibe um longo tempo de permanência no
intestino, devido à sua resistência às enzimas digestivas (PATEL; VELIKOV, 2014; LEE et al.,
2016), além da ausência de efeitos tóxicos (MORENO et al., 2017). A zeína já começou a
despertar interesse por seu potencial adjuvante, uma vez que microesferas de zeína exibiram
um potencial imunogênico, sendo uma ferramenta útil para a terapia com vacinas (HURTADO-
LÓPEZ; MURDAN, 2006; HOFBAUER et al., 2016).
Hurtado-Lopez e Murdan realizaram uma série de estudos que investigaram o potencial da

zeína como portador de drogas e vacinas. Eles primeiro caracterizaram amplamente os efeitos
da proporção de zeína em albumina, a proporção de estabilizadores e a concentração de
hidróxido de sódio, pois esses fatores tiveram o maior impacto no tamanho das partículas e no
52
grau de formação das partículas. A evidência do potencial da modulação da propriedade da

partícula, a liberação por erosão lenta e a manutenção da integridade da albumina encapsulada
levaram a estudos subseqüentes que investigaram a degradação, adjuvanticidade e
imunogenicidade dessas partículas. Estudos de degradação na ausência de enzimas explicaram
a liberação lenta de ovalbumina anteriormente observada em PBS, pois a zeína era muito
resistente à degradação; no entanto, na presença de pepsina e pancreatina, sua degradação foi
mais acelerada. As nanopartículas brancas e contendo ovalbumina encapsuladas foram
administradas por via intramuscular e oral. Os anticorpos de séricos dos camundongos
imunizados com partículas vazias indicaram que a zeína provocou a produção de anticorpos
anti-zeína (HURTADO-LÓPEZ; MURDAN, 2006).
Desta forma, as nanopartículas de zeína são opções seguras e sistemas de liberação

controlada por via oral para uma variedade de compostos, de ingredientes alimentares e
nutracêuticos. Suas propriedades mucoadesivas, seu caráter hidrofóbico, bem como a sua
resistência relativa às enzimas digestivas, pode ser exploradas com sucesso para estratégias de
liberação controlada.
Diante do exposto, este trabalho teve como objetivo desenvolver dois tipos de formulações
de nanopartículas poliméricas para a encapsulação de alérgenos da castanha de caju, e avaliar
o potencial imunogênico destas formulações. Como polímeros escolhidos, utilizamos o
polianidrido, polímero sintético biodegradável, bioadesivo e amplamente utilizado em vacinas
para imunoterapia antialérgênica; e a zeína, polímero de origem natural, extraído do milho, que
possui características imunogênicas previamente relatadas.
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78
CAPÍTULO 1
Artigo ACEITO para publicação na revista European Journal of Pharmaceutics and

Biopharmaceutis.
Fator de impacto: 4,159
Qualis: A2
79
Poly(anhydride) nanoparticles containing cashew nut proteins can induce a strong Th1
and Treg immune response after oral administration.
Marcela Araújo Pereira1, Juliana de Souza Rebouças2, Rafaela de Siqueira Ferraz
Carvalho1, Inés Luis de Redín3, Priscila Valera Guerra4, Carlos Gamazo3, Claudia Ida
Brodskyn4, Juan M. Irache3,*, Nereide Stela Santos-Magalhães1
1
Immunopathology Keizo-Asami Laboratory, LIKA, Federal University of Pernambuco,
Recife, Brazil.
2
Institute of Biological Sciences, University of Pernambuco, Recife, Brazil.
3
Nanomedicines and Vaccines (NANO-VAC) Research Group, University of Navarra,
Pamplona, Spain.
4
Laboratory of Parasite-host Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute, Oswaldo
Cruz Foundation (FIOCRUZ), Salvador, Brazil.
*Corresponding author:
Juan M. Irache
Nanomedicines and Vaccines (NANO-VAC) Research Group
Department of Pharmacy and Pharmaceutical Technology
University of Navarra
C/Irunlarrea 1
31008-Pamplona
Spain
Tel: +34 948 425600; Fax: +34 948 425649
e-mail: [email protected]
80
Abstract
Cashew nut allergy is the second most commonly reported tree nut allergy. Traditional allergen
immunotherapy presents several clinical drawbacks that can be reduced by using nanoparticles-
based allergen-delivery systems, modulating the immune response towards a protective one. In
this context, the goal of this work was to assess the potential of poly(anhydride) nanoparticles
(NP) for cashew nut oral immunization. Cashew nut allergens-loaded nanoparticles (CNE-NP)
were prepared by solvent displacement method. After nanoparticles characterization, oral
immunomodulation ability was evaluated in BALB/c mice. Our results demonstrated that CNE-
NP induced a higher Th1/Th2 ratio in comparison with animals immunized with free cashew
nut proteins. Indeed, a decrease in splenic Th2 cytokines (IL-4, IL-5, and IL-13), and an
enhancement of pro-Th1 (IL-12 and IFN-γ) and regulatory (IL-10) cytokines was observed.
Furthermore, mice orally immunized with CNE-NP presented an increased expansion of CD4+
T regulatory cells, such as CD4+Foxp3+ and CD4+LAP+, in the mesenteric lymph nodes. In
conclusion, oral immunization with a single dose of poly(anhydride) nanoparticles loaded with
cashew nut proteins leaded to a pro-Th1 and Treg immune response. Furthermore, their
immunomodulatory properties could be introduced as a new approach for management of
cashew nut allergy.
Keywords: nanoparticles; food allergy; cashew nut; oral; immunization.

81
CAPÍTULO 2
Th1 and Treg immune response induced by oral immunization with a single dose of
cashew nut allergens-loaded zein nanoparticles
Artigo a ser submetido à revista European Journal of Pharmaceutics
Fator de impacto: 3,649
Qualis: A2
82
Th1 and Treg immune response induced by oral immunization with a single dose of
cashew nut allergens-loaded zein nanoparticles
Marcela Araújo Pereira1, Juliana de Souza Rebouças1,2, Rafaela de Siqueira Ferraz
Carvalho1, Inés Luis de Redín2, Priscila Valera Guerra2, Carlos Gamazo3, Claudia Ida
Brodskyn2, Nereide Stela Santos-Magalhães1, Juan Manuel Irache4,*
1
Immunopathology Keizo-Asami Laboratory, LIKA, Federal University of Pernambuco,
50740-465, Recife, Brazil.
2
Laboratory of Parasite-host Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute,
Oswaldo Cruz Foundation, Fiocruz, 40296-710, Bahia, Brazil.
3
Department of Microbiology, 31008, University of Navarra, Pamplona, Spain.
4
Department of Pharmacy and Pharmaceutical Technology, University of Navarra, 31008,
Pamplona, Spain.
*Corresponding author:
Juan M. Irache
Departament of Pharmacy and Pharmaceutical Technology
University of Navarra
31008, Pamplona
Spain
Tel: +34 948 425600; Fax: +34 948 425649
e-mail: [email protected]
83
ABSTRACT
IgE-mediated food allergy represents the major form of food allergy, causing immediate
reactions and affects up to 2.5% of the adult population and 6% to 8% of children less than 3
years of age, being associated with significant morbidity and mortality. The prevalence for
Cashew nut (Anacardium occidentale) is between 7% and 55%, of tree nuts, in Europe, and
cashew nut allergy is the second most commonly reported tree nut allergy in the US. Despite
of the high potential to induce allergic reactions, there is no effective treatment available to
cashew nut allergy. Traditional allergen immunotherapy presents several clinical drawbacks
and could even lead to life-threatening allergic reactions. These limitations can be reduced by
using nanoparticles-based allergen-delivery systems as adjuvants, modulating the immune
response toward a protective one. In this context, the aim of this work was to develop zein
nanoparticles (NPz) for cashew nut oral immunization. NPz loaded with cashew nut proteins
(CNE-NPz) were prepared by desolvation method and oral immunization studies were
conducted with BALB/c. Our results showed that CNE-NPz induced a pro-Th1 response, in
comparison with the animals orally immunized with a single dose of free cashew nut proteins
(CNE), accompanied by a decrease in splenic Th2 cytokines. Furthermore, mice orally
immunized with CNE-NPz showed a Treg cells stimulation, with higher levels of IL-10 and
TGF-β1, two important regulatory molecules. In conclusion, oral immunization with a single
dose of zein nanoparticles loaded with cashew nut proteins leaded to a pro-Th1 and Treg
immune response. Furthermore, their immunomodulatory properties could be introduced as a
new approach for management of cashew nut allergy.
Keywords: Protein polymer, Nanoparticles, Food allergy, Cashew nut, Oral immunization.
84
RESUMO
A alergia alimentar mediada por IgE representa a principal forma de alergia alimentar, causando
reações imediatas. Afeta até 2,5% da população adulta e 6% a 8% das crianças com menos de
3 anos de idade, estando associada a morbidade e mortalidade significativas. A prevalência da
alergia à castanha de caju (Anacardium occidentale) está entre 7% e 55%, entre as nozes, na
Europa, e é a segunda alergia a nozes mais comumente relatados nos EUA. Apesar do potencial
elevado de induzir reações alérgicas, não há nenhum tratamento eficaz disponível à alergia à
castanha de caju. A imunoterapia tradicional do alérgeno apresenta diversos obstáculos clínicos,
que podem evoluir para reações alérgicas potencialmente graves, como a anafilaxia. Estas
limitações podem ser minimizadas a partir do uso de sistemas de liberação controlada,
utilizando nanopartículas como adjuvantes, modulando a resposta imune para uma ação
protetora. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver nanopartículas de polímero
proteico (NPz) para imunização oral de castanha de caju. NPz contendo com as proteínas da
castanha de caju encapsuladas (CNE-NPZ) foram preparados pelo método de deslocamento do
solvente e os estudos orais da imunização foram conduzidos com BALB/c. Nossos resultados
mostraram que CNE-NPz induziu uma resposta pró-Th1, em comparação com os animais
imunizados oralmente com uma dose única de proteínas de castanha de caju livres (CNE),
acompanhada de uma diminuição nas citocinas Th2 esplénicas. Além disso, camundongos
imunizados por via oral com CNE-NPz apresentaram estimulação de células Treg, com níveis
mais altos de IL-10 e TGF-β1, duas importantes moléculas regulatórias. Em conclusão, a
imunização oral com uma única dose de nanopartículas proteicas carregadas com as proteínas
da castanha de caju levaram a uma resposta imune pró-Th1 e de Treg. Além disso, suas
propriedades imunomoduladoras poderiam ser introduzidas como uma nova alternativa para a
terapia antialérgica frente à castanha de caju.
Palavras-chave: Polímero proteico, nanopartículas, alergia alimentar, castanha de caju,

imunização oral.
85
CONCLUSÕES
As nanopartículas de polianidrido e proteicas, contendo os alérgenos da castanha de caju

encapsulados, foram desenvolvidas com sucesso e caracterizadas. As mesmas, apresentaram
características físico-químicas adequadas à aplicação na imunoterpia oral. Além disso, elas
apresentaram maior estabilidade in vitro, em fluidos gastrointestinais simulados, e um perfil de
libertação controlada dos alérgenos. Avaliação da integridade estrutural e imunogenicidade das
proteínas alergênicas liberadas das NP;
O método de produção das nanopartículas, tanto as proteicas, quanto as de polianidrido, não

afetou a integridade estrutural e a antigenicidade das proteínas de castanha de caju
encapsuladas, mantendo suas características originais.
A encapsulação dos alérgenos de castanha de caju em nanopartículas promoveu um

aumento na viabilidade celular, reduzindo o efeito dessas proteínas na célula, quando
comparados ao extrato da castanha de caju livre. Além disso, o tratamento com estes sistemas
foi capaz de induzir a ativação de macrófagos, reduzindo os níveis de citocinas pró-
inflamatórias.
Ademais, o presente trabalho demonstrou que a administração, oral e intradérmica, do

extrato de castanha de caju encapsulados em nanopartículas de polianidrido e proteicas, foi
capaz de modular a resposta imune humoral e celular, induzindo um aumento na resposta Th1,
redução dos níveis de anticorpos e citocinas Th2 e ativação de células Treg.
Desta forma, nossos resultados sugerem que a encapsulação de alérgenos de castanha de

caju em nanopartículas de polianidrido ou proteicas, pode ser uma alternativa promissora para
a imunoterapia à de castanha de caju, devido às suas propriedades reguladoras pró-Th1 e Treg.
86
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

LABORATÓRIO DE IMUNOPATOLOGIA KEIZOASAMI

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA APLICADA À SAÚDE

MARCELA ARAÚJO PEREIRA

NANOVACINAS ALERGÊNICAS PARA IMUNOTERAPIA EM

ALERGIA A CASTANHA DE CAJU

NANOVACINAS ALERGÊNICAS PARA IMUNOTERAPIA EM ALERGIA A

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-

Orientadora: Profa. Dra. Nereide Stela Santos Magalhães

Coorientador: Profa. Dra. Juliana de Souza Rebouças

Pereira, Marcela Araújo

Orientadora: Nereide Stela Santos Magalhães

1. Castanha de caju 2. Nanopartículas 3. Polianidrido

615.37 CDD (22.ed.) UFPE/CB-2019-098

NANOVACINAS ALERGÊNICAS PARA IMUNOTERAPIA EM ALERGIA A

Tese de doutorado apresentada ao Programa de

Aprovada em: 26/02/2018

A Fernando, palavras nunca poderiam descrever o meu sentimento de gratidão. Um

À minha coorientadora, Prof.ª. Dra. Juliana Rebouças. Os sonhos começam antes

Um agradecimento especial à Rafa. Amiga, irmã e, às vezes, mãe. Nunca hesitou em

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Aos meus colegas do Laboratório de Imunopatologia Keiso-Asami (LIKA), por todo

Ao CNPq e FACEPE pelo apoio financeiro.

A todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.

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Keywords: Nanoparticles. Poly(anhydride). Zein. Cashew nuts. Immunization.

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2.1 OBJETIVOS GERAIS...................................................................................... 20

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................ 20

4 CAPÍTULO 1. POLY(ANHYDRIDE) NANOPARTICLES

CONTAINING CASHEW NUT PROTEINS CAN INDUCE A STRONG

TH1 AND TREG IMMUNE RESPONSE AFTER ORAL

5 CAPÍTULO 2. TH1 AND TREG IMMUNE RESPONSE INDUCED BY

ORAL IMMUNIZATION WITH A SINGLE DOSE OF CASHEW NUT

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2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

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1.3. MECANISMOS IMUNOLÓGICOS ENVOLVIDOS NAS REAÇÕES ALÉRGICAS

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Figura 1. Mecanismos imunológicos envolvidos na sensibilização alergênica. Durante a sensibilização alérgica,

Fonte: Modificada de (PALOMARES et al., 2017).