EXERCÍCO BIOLÓGIA MOLÉCULAR

EXERCÍCO BIOLÓGIA MOLÉCULAR
ALUNA: FRANKIANA TORRES LIMA

PROF.: GEIZA
DATA:09/10/24
1. Quais são os princípios físicos que permitem que a eletroforese em

gel seja aplicada no isolamento de fragmentos de DNA?
 Resposta correta: c) Cargas negativas dos fragmentos de DNA,
corrente elétrica e porosidade da matriz do gel.
2. Com relação à clonagem, explique como é formado o DNA
recombinante e descreva as principais etapas do processo de formação
dos clones.
 O DNA recombinante é formado pela combinação de material genético
de duas fontes diferentes. O processo envolve o uso de enzimas de
restrição para cortar o DNA em locais específicos, permitindo que
fragmentos de DNA de interesse sejam inseridos em um vetor (como um
plasmídeo). A seguir, o vetor contendo o DNA de interesse é inserido em
uma célula hospedeira (como uma bactéria), que vai replicar o DNA
recombinante durante a divisão celular, produzindo clones. As principais
etapas incluem:
1. Isolamento do DNA de interesse.
2. Corte do DNA e do vetor com enzimas de restrição.
3. Ligação do DNA ao vetor.
4. Inserção do vetor recombinante na célula hospedeira.
5. Seleção de clones que contêm o DNA recombinante.
3. Descreva, brevemente, as principais diferenças das técnicas de
hibridização in situ, southern e northern-blotting.
 Hibridização in situ: Detecta sequências de DNA ou RNA diretamente
em células ou tecidos usando sondas marcadas.
 Southern blotting: Técnica usada para detectar sequências específicas
de DNA em uma amostra, envolvendo a separação do DNA por
eletroforese em gel, sua transferência para uma membrana e hibridização
com uma sonda específica.
 Northern blotting: Semelhante ao southern blotting, mas usada para
detectar sequências de RNA. Envolve a separação do RNA em gel, sua
transferência para uma membrana e hibridização com uma sonda de RNA
ou DNA.
4. Quais as principais características que um vetor e uma célula
hospedeira devem conter para que possam ser utilizados no processo
de clonagem?
 Vetor: Deve ter uma origem de replicação para ser replicado dentro da
célula hospedeira, marcadores de seleção (como genes de resistência a
antibióticos) para identificar células que contêm o vetor, e locais de
restrição para permitir a inserção de DNA estrangeiro.
 Célula hospedeira: Deve ser capaz de receber e manter o vetor, replicar
o DNA recombinante e expressar o gene de interesse, e possuir
mecanismos que permitam a seleção dos clones que contêm o vetor
recombinante.]
MARQUE VERDADEIRO OU FALSO :

(F) a) Em uma técnica de PCR, a temperatura do ambiente onde são
inseridos os tubos de ensaio não importa.
(F) b) São necessários nucleotídeos, uma molécula molde de DNA,
enzimas relacionadas ao ácido desoxirribonucleico e ATP para uma
técnica de PCR.
(V) c) O sentido de leitura da molécula molde de DNA e a
consequente síntese da molécula produto ocorre em sentido 5’-3’.
(V) d) A enzima DNA-polimerase é responsável por inserir bases
nitrogenadas em cadeia, enquanto a DNA-helicase promove a separação
das fitas de DNA in vivo.
(V) e) O processo de desnaturação na técnica de PCR é caracterizado
pela separação das fitas de uma molécula de DNA, ocorrendo de
forma espontânea quando a temperatura
( F) f) Na etapa de extensão, a enzima Taq polimerase dá origem a uma
nova fita de DNA utilizando os nucleotídeos livres na solução a uma
temperatura próxima a 72°C.
( F) g) A Taq polimerase é uma enzima sintética termorresistente capaz
de resistir à desnaturação proteína que a temperatura elevada induziria.
(F) h) A etapa de anelamento consiste na síntese dos primers, que são as
regiões que demarcam por onde a Taq polimerase deve dar início à
síntese da fita complementar.
(F) i) A realização da técnica de PCR é útil somente caso as moléculas
geradas forem ser utilizadas em uma técnica subsequente de
eletroforese.
(V) j) Dentre as funções de uma técnica de PCR, é possível citar a
detecção de mutações em genes específicos, o diagnóstico pré-natal em
casos de risco e o estudo do padrão de expressão gênica.
(F) k) A técnica de PCR utilizada no passado utilizava o banho-maria para
alterar a temperatura durante o processo, mas deixou de ser realizada
dessa forma por ser muito rápida e otimizar o processo.
(F) l) A RT-PCR é a técnica de realização da PCR com base na utilização
de uma fita de DNA molde, e não de RNA. A molécula produto,
complementar à fita molde, será uma molécula de RNA.
(F) m) Diferente da técnica de PCR comum, a RT-PCR não necessita
sofrer alterações na temperatura para que as enzimas tenham atividade
estimulada e o processo seja realizado.
A eletroforese é uma técnica moderna que
(F) n) A eletroforese é uma técnica moderna quesegue os princípios
da eletrostática.
1. Justifique as afirmações:
(a) Para aplicar a técnica da PCR é necessário ter conhecimento
prévio da sequência nucleotídica do "alvo" que se deseja
amplificar.
 Para realizar a PCR, é necessário conhecer parte da sequência do DNA
alvo para projetar primers específicos que hibridizem com as regiões
complementares do DNA. Esses primers definem o início e o fim da região
que será amplificada. Sem esse conhecimento, seria impossível projetar
os iniciadores de forma correta.
(b) Para executar a PCR é necessário utilizar dois iniciadores
(primers).
 Dois primers são necessários porque a PCR envolve a amplificação de
ambas as fitas de DNA: um primer se liga à fita molde no sentido 3’ para
5’ e o outro se liga à fita complementar. Assim, os dois primers marcam o
início da síntese de novas fitas de DNA, o que permite a replicação da
sequência desejada.
(c) Nas reações de PCR utiliza-se a enzima Taq DNA polimerase.
 A Taq DNA polimerase é utilizada na PCR porque é uma enzima
termorresistente, obtida da bactéria Thermus aquaticus, que vive em
ambientes de alta temperatura. Essa enzima resiste à temperatura
elevada da fase de desnaturação, mantendo sua atividade nas diferentes
fases do ciclo de PCR, particularmente durante a síntese do DNA na fase
de extensão (~72°C).
2. Um ciclo de PCR envolve três faixas de temperaturas de
reação. Explique o que ocorre nas temperaturas:
93 ºC - 95 ºC (Desnaturação):
 Nesta temperatura, ocorre a desnaturação do DNA, ou seja, a separação
das duas fitas da molécula de DNA, rompendo as ligações de hidrogênio
entre as bases nitrogenadas. Isso permite que as fitas simples estejam
disponíveis para que os primers se liguem durante a próxima fase.
50 ºC - 65 ºC (Anelamento):
 Nesta faixa de temperatura, ocorre o anelamento (ou hibridização) dos
primers com as fitas simples de DNA. A temperatura exata depende da
sequência dos primers e de suas características (como o conteúdo de
G/C), sendo necessária uma temperatura que favoreça a ligação
específica dos primers às regiões complementares do DNA molde.
72 ºC (Extensão):
 Nesta temperatura, ocorre a fase de extensão ou elongação, na qual a
enzima Taq DNA polimerase adiciona nucleotídeos à extremidade 3' dos
primers, sintetizando novas fitas de DNA. A Taq polimerase trabalha de
forma ótima a essa temperatura.
3.
(a) Quais componentes devem estar presentes na amostra
denominada Controle Negativo da PCR?
 O Controle Negativo da PCR deve conter todos os componentes da
reação, exceto o DNA molde. Ou seja, deve incluir água, primers, Taq
polimerase, nucleotídeos e o tampão de reação, mas não deve conter o
DNA alvo.
(b) Qual a função do Controle Negativo na reação de PCR?
 A função do Controle Negativo é verificar se houve contaminação dos
reagentes ou do equipamento utilizado no experimento. Se ocorrer
amplificação no controle negativo, isso indica que houve contaminação,
uma vez que não deveria haver DNA para amplificar.
4.
(a) Escreva a reação catalisada pela Transcriptase Reversa viral.
 A Transcriptase Reversa catalisa a síntese de uma fita de DNA
complementar (cDNA) a partir de uma fita de RNA molde. A reação
pode ser representada da seguinte forma:
RNA(molde)+NTPs→Transcriptase ReversacDNA(DNAcomplementar)RNA
(molde) + NTPs \xrightarrow{\text{Transcriptase Reversa}} cDNA (DNA
complementar)RNA(molde)+NTPsTranscriptase Reversa
cDNA(DNAcomplementar)
(b) Por que a descoberta do mecanismo de ação desta enzima
modificou o Dogma da Biologia Molecular?
 O Dogma Central da Biologia Molecular, estabelecido inicialmente por
Francis Crick, afirmava que o fluxo de informação genética ocorria de DNA
para RNA e de RNA para proteína. A descoberta da Transcriptase
Reversa mostrou que a informação genética também pode fluir no
sentido oposto, de RNA para DNA, como acontece nos retrovírus (por
exemplo, o HIV). Essa descoberta demonstrou que o dogma precisava ser
revisado para incluir essa nova possibilidade de fluxo de informação
genética.

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