PROTEMICA

Departamento de Qumica e Bioqumica - Biologia Molecular 2012/2013 Carlos Marques(40842) e Cristiana Santos (38700) TP3

Tpicos
O princpio da protemica vs. genmica Diferentes tipos de tcnicas de protemica e respectivo equipamento
Anlise e interpretao de resultados

Exemplos de aplicaes

Fig. 1 Exemplo de um gel obtido por electroforese 2D.

Protemica
Protemica estuda o proteoma!
O proteoma todo o conjunto de protenas expressas por um genoma, clula, tecido ou organismo num determinado momento. Mais especificamente, o conjunto de protenas expressas num determinado tipo de clulas ou organismo num determinado momento, em condies definidas. (WILKINS et al., 1996)

Protemica: metodologia da biologia molecular que tem como principais objectivos

reconhecer e quantificar as protenas na clula, bem com identificar a sua funo e localizao na clula. Fundamenta-se em princpios bioqumicos, biofsicos e de bioinformtica.

Proteoma

Proteoma foi o termo criado por por Marc Wilkins em 1994. Geneticista Interactoma Interaces protena-protena Que complexos proteicos existem? Podem ser separados?

Qual

papel

das

modificas

ps-

traducionais no interactoma?

Qual a dependencia das doenas com a perda ou ganho de interaces entre proteina-proteina?

Fig. 2 Marc Wilkins, criador do conceito de proteoma.

Protemica vs. Genmica

Genmica: estuda o conjunto de todos

os genes de um organismo - genoma. Identifica os genes presentes no DNA, a partir dos cromossomas . Estuda a interaco dos genes com o meio ambiente.

Protemica:

estuda as protenas transcritas a partir do genoma e engloba as modificaes ps-traducionais. Caracteriza as protenas Complexos proteicos na distribuio celular

Protemica
Diversos mecanismos de expresso a partir de um gene locus, podem formar diversas

proteinas:

Seleco alternativa no pr-mRNA;

Clivagem proteoltica;

Modificao ps-traducional dos aminocidos.

Fig. 3 Processos de transcrio e traduo.

Protemica

Pr-requisito da protemica

O genoma sequenciado do organismo investigado ou, pelo menos, uma coleco de cDNAs.

Dificuldade protemica

Deteco (o maior desafio) Manuteno das proteinas sem alteraes Extraco de amostras

Fig. 4 Laser mapture microdissection (LCM).

Base experimental

Electroforese 2D

Mtodo para separao e deteco das protenas Separao por carga e massa Anlise e identificao de protenas Fragmentao de protenas Anlise de pptidos

Espectrometria de massa

Fig. 5 Espectrmetro de massa.

Electroforese 2D

Preparao da amostra:

Ruptura das clulas por mtodos qumicos e/ou fsicos;

Solubilizao e desnaturao das protenas numa soluo contendo detergentes zwiterinicos, ureia e agentes redutores (DTT).

Fig. 6 Esquema de um procedimento de electroforese bidimensional.

Electroforese 2D
1 dimenso IEF
(separao por ponto isoelctrico)

2 dimenso SDS-PAGE
(separao por peso molecular) de pH

Gel com um imobilizado;

gradiente

Tira obtida por IEF colocada num gel de acrilamida; Mobilidade electrofortica d-se de acordo com o tamanho da protena, sendo restringida pelo tamanho do poro da matriz de poliacrilamida; SDS desnatura a protena e elimina as cargas movimento somente devido massa!

Corrente elctrica leva as protenas carregadas a moverem-se at alcanarem o ponto isoelctrico, pI (carga total zero).

Elevado grau de resoluo!

Limitaes da Electroforese 2D

Reprodutibilidade Sensibilidade

Incompatibilidade de algumas protenas com a focagem isoelectrica (protenas altamente hidrofbicas) smearing. Dificuldade de deteco de protenas pouco abundantes Modificaes ps-traducionais afectam o pI

Fig. 7 Seco de um gel de electroforese 2D que descreve o smearing de uma protena na direco (horizontal) do IEF.

Fig. 8 Seco de um gel de electroforese 2D que mostra spot trains devido s diferentes formas modificadas de uma mesma protena.

Deteco das protenas

Colorao de protenas

Azul de Coomassie (> 100 ng) Nitrato de prata (< 1 ng)

Marcao radioactiva: 3H, 14C, 35S, 32P, 33P ou 125I

Autoradiografia
Fluorografia directa

Fig. 9 Azul de Coomassie.

Fig. 10 Nitrato de prata.

Electroforese 2D

Fig. 12 Gel obtido por electroforese bidimensional para protenas de E. coli. Fig. 11 Perfil da protena total (150 g) de Xylella fastidiosa a electroforese bidimensional em gel gradiente (9-18%) de poliacrilamida; gel corado com nitrato de prata.

Base experimental

Fig. 13 Esquema de um procedimento experimental tpico de uma anlise protemica.

Spot picking

Espectrometria de Massa (MS)

Porqu a digesto das protenas?

Protenas intactas:

Erros nas medies

Modificaes ps-traducionais
Difcil medio da massa

Protenas grandes e altamente hidrfobas

Maior sensibilidade para medies para pptidos

ESPECTROMETRIA DE MASSA EM PPTIDOS

Fig. 14 Identificao de protenas por espectrometria de massa.

Digesto proteoltica

O spot de protenas retirado do gel digerido com proteases, para clivar a protena em locais especficos, originando pequenos fragmentos pptidos (6-20 aminocidos). Caractersticas dos proteases

Estveis Especificidades bem definidas Disponveis elevadas em quantidade e pureza

Suficientemente robustos para aplicao numa grande variedade de circunstncias

Tabela 1 Proteases mais usados para anlises protemicas e respectiva especificidade.

Proteases

Tripsina

Mais usado e fcil de purificar! Cliva as protenas em resduos de Lys e Arg, excepto se existir um resduo de Pro na

direco do terminal C.

Endoproteinase Glu-C (digestes em gel)

Cliva no lado carboxilo de resduos de Glu em tampo acetato de amnia ou bicarbonato de amnia ou em resduos de Glu e Asp, quando em tampo fosfato de

sdio.

Proteases no especficos (Pepsina, Proteinase K, Pronase, Subtilisina)

Clivam as protenas mais ou menos aleatoriamente para produzir vrios pptidos sobrepostos

Proteases qumicos (brometo de cianognio)

Clivam as protenas em resduos de Met

Digesto em Gel

Spot de protena recortado a partir do gel, descorado e tratado com um protease. O enzima penetra a matriz do gel e digere a protena em pptidos, que so depois eludos do gel por lavagem.

Fig. 15 Representao esquemtica da digesto em gel

Um factor determinante do sucesso deste tipo de digesto a tcnica de colorao do gel utilizada:

Fixadores de aldedos ou exposio prolongada a cidos (ex.: cido actico).

Espectrometria de Massa (MS)

Espectrometria de Massa (MS) utilizada para determinar massas precisas de molculas numa amostra.

Fig. 16 Representao esquemtica de um espectrmetro de massa.

Actualmente, em protemica, so principalmente usadas duas tcnicas de ionizao:

MALDI-TOF MS ESI-MS

MALDI-TOF MS

MALDI-TOF = Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight Tcnica aplicvel a molculas de grandes dimenses e termicamente instveis. Amostras dispersas numa matriz (normalmente, cido orgnico) colocadas numa placa que, aps evaporao do solvente, introduzida na fonte MALDI onde os cristais amostra-matriz so irradiados para um feixe laser.

Fig. 17 Representao esquemtica da anlise por MALDI -TOF MS.

ESI-MS

ESI = Electrospray Ionization

Fig. 18 Spray electrosttico produzido em ESI-MS.

Processo de ionizao ocorre presso e temperatura atmosfricas. Amostra introduzida num capilar sob alta voltagem (L/s).

Fig. 19 Representao esquemtica da anlise por ESI -MS.

Espectrometria de Massa (MS)

Resoluo

Permite distinguir ies com valores de razo m/z muito prximos.

Preciso

Valores medidos devem ser o mais prximo possvel da realidade.

Exactido

Comparao com o padro.

Sensibilidade

Instrumentos que sejam capazes de obter informaes a partir de pequenas

quantidades de pptidos.

Bioinformtica
Software de analise gel electroforese 2D Melanie Redefin

Fig. 20 - Sequest software.

Software para MS Sequest Spectrolyzer Quantinetix

Fig. 21 REDEFIN.

Abordagens em Protemica

Mining

Identificao de todas as protenas (ou tantas quanto possvel) numa amostra. O objectivo deste tipo de abordagem catalogar o proteoma directamente, em vez de se inferir a sua composio a partir da expresso dos genes (por exemplo: microarrays). Identificao de protenas numa amostra em particular, em funo de um estado particular do organismo, da clula (estado de desenvolvimento, de doena, exposio a um droga, etc.). Determinao do modo como as protenas interagem umas com as outras em sistemas vivos.

Protein-expression profiling

Protein-network mapping

Mapping of protein modifications

Identificao de como e quando as protenas so modificadas.

Protemica animal
Proteoma do veneno Bothrops
Electroforese bidimensional

Aplicado corantes especificos para determinadas caracteristicas proteicas

Espectrometria de massa

Utilizada para cruzamento informao de pptidos presentes na electroforese

Digesto com tripsina

Para facilitar o manuseamento dos pptidos entre tecnicas

Fig. 22 Proteoma do veneno Bothrops.

Protemica animal
Bioinformtica identificao dos pptidos a partir do gel informao das proteinas numa base de dados

Fig. 23 Pptidos identificados. Fig. 24 Software MELANIETM.

Bibliografia

Cooper, Geoffrey M. & Hausman, Robert E., The Cell A Molecular Approach 5th edition, ASM Press, Sunderland, Massachusetts, 2009 (Pgs. 64-69) Lewin, Benjamin, Genes IX, Sudbury, Massachusetts: Jones and Bartlett Publishers, 2008 Liebler, Daniel C., Introduction to Proteomics Tools for the New Biology, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2002 Palzkill, Timothy, Proteomics, Kluwer Academic Publishers, USA, 2002. Proteomics 2005, 5 (Animal Proteomics), 501 510, A multifaceted analysis of viperid snake venoms by two-dimensional gel electrophoresis: An approach to understanding venom proteomics, Solange M. T. Serrano, John D. Shannon, Deyu Wang, Antonio C. M. Camargo and Jay W. Fox

Rosenborg, Ian M., Protein Analysis and Purification Benchtop Techniques 2nd edition, Birkauser, Boston 2005
http://bioinformatica.uab.cat/base/documents%5CmasterGP%5CMCaceres_Transcriptomics.pdf (5/12/2012) http://bondingorbital.com/espectros/EM.pdf (6/12/2012) http://www.ama-assn.org/ama/pub/physician-resources/medical-science/ genetics-molecular-medicine/currenttopics/proteomics.page (20/11/2012) http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio29/proteoma.pdf (20/11/2012)

http://www.dq.fct.unl.pt/servicos-externos/espectrometria-de-massa-maldi-tof (8/12/2012)
http://www.oardc.ohio-state.edu/tomato/Proteomics%20Presentation.pdf (3/12/2012) http://www.slideshare.net/labimuno/proteomica-presentation#btnNext http://www.unicamp.br/unicamp/unicamp_hoje/jornalPDF/ju309pg03.pdf (20/11/2012) Imagem da capa - http://www.mdc-berlin.de/en/news/archive/2008/2008091 0erwin_schr_dinger_prize_2008_goes_to_resea/index.html (3/12/2012)