UNIUNEA EUROPEAN

GUVERNUL ROMNIEI MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I PROTECIEI SOCIALE AMPOSDRU

Fondul Social European POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale 2007-2013

OIPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

Investete n oameni! Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 2013 Axa prioritar 1 Educaia i formarea profesional n sprijinul creterii economice i dezvoltrii societii bazate pe cunoatere Domeniul major de intervenie 1.5 Programe doctorale i post-doctorale n sprijinul cercetrii Titlul proiectului Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar Contract POSDRU/21/1.5/G/36154

Raport tiinific Expert tiinific: LUPAN Iulia

Clonarea i exprimarea genelor o metod excepional pentru obinerea de proteine

1. Prezentarea principiilor metodei de clonare i exprimare a genelor n sistem procariot ADN n sine are doar 2 funcii importante i anume pstrarea informaiei genetice i furnizarea acesteia pentru sinteza de proteine. Pstrarea include transmiterea materialului genetic nemodificat de la o generaie la alta. Acest fapt este realizat prin replicarea ADN i mprirea egal din timpul diviziunii celulare. A doua funcie este legat de descifrarea informaiei pentru sinteza de proteine. Mesagerul informaiei ntre ADN i proteine este ARN care este sintetizat n procesul de transcriere a ADN de ctre o enzim numit ARN polimeraz. ARNm rezultat servete ca matri n procesul de traducere a ADN (sinteza proteinelor) care are loc n ribosomi. Practic ARN este cruul informaiei din nucleu n citoplasm unde are loc sinteza proteinelor. Dogma central a biologiei presupune transmiterea unidirecional a informaiei de la ADN la proteine prin intermediul ARN (Figura 1). Informaia genetic nu poate fi transmis invers de la proteine la ADN. Informaia genetic poate fi transmis de la ARN la ADN n cazul retrovirusurilor la care materialul genetic este ARN. Nu exist cazuri de transmitere a informaiei de la ADN direct la proteine.

Replicare ADN Nucleu

Transcriere

ARNm

Traducere Citoplasm Protein

Figura 1. Dogma central a biologiei.

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investete n

OAMENI

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdiciplinar POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea

ROMNIA UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Str. Mihail Koglniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482 Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Resurselor Umane 2007-2013

Pag. 1/17

UNIUNEA EUROPEAN

GUVERNUL ROMNIEI MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I PROTECIEI SOCIALE AMPOSDRU

Fondul Social European POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale 2007-2013

OIPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

Clonarea genelor const n izolarea unei gene dintr-un genom i introducerea ei n alte celule gazd pentru multiplicare i n unele cazuri pentru exprimare. Prin multiplicarea celulelor cu genele clonate se pot obine milioane de copii ale unei singure gene. Sumar procesul clonrii const din urmtoarele etape: - amplificarea genei de interes - introducerea genei de interes ntr-un vector de clonare - introducerea moleculelor recombinate n celule gazd - selecia celulelor transformate (purttoare ale moleculei recombinate) - verificarea moleculelor recombinate Amplificarea genei de interes. O gen este considerat orice fragment de ADN care se transcrie ntro molecul de ARN. Moleculele de ARN rezultate n urma transcrierii pot fi mprite n 2 categorii: - ARN funcional - ARN informaional ARN funcional este ARN care nu se traduce, ndeplinete anumite funcii n celul (n cea mai mare parte particip la procesul de traducere) i ocup cea mai mare parte din ARN total din celul ARN ribosomal (ARNr) i ARN de transport (ARNt). ARN informaional este ARN mesager (ARNm) care codific un polipeptid i servete ca matri n procesul de traducere (sintez a proteinelor). De cele mai multe ori genele de interes care sunt scopul clonrii codific un polipeptid. n alte cazuri scopul clonrii nu este obligatoriu o gen, ci un fragment de ADN care nu poate fi separat dintr-un amestec heterogen de molecule apropiate ca mrime. Din aceast cauz n continuare se va utiliza doar termenul fragment ADN de interes pentru a evita confuziile. Deoarece fragmentul ADN de interes sau int se afl ntr-un genom este necesar extragerea acestuia. Exist 2 modaliti de a obine fragmentul dorit, fie prin tierea acestuia din genom, fie prin copierea acestuia. Tierea fragmentului din genom este mai dificil deoarece necesit prezena unor situsuri (secvene specifice) la capetele fragmentului, care necesit apoi o izolare din amestecul de fragmente generate, iar numrul moleculelor deci i cantitatea de ADN este mic. A doua opiune de copiere a fragmentului din genom este cea mai des utilizat. n acest scop se utilizeaz tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction). Aceast tehnic poate fi considerat un adevrat copiator de gene. Tehnica este pe larg utilizat, este rapid i sensibil deoarece necesit cantiti foarte mici de ADN matri. O condiie obligatorie pentru o amplificare reuit este cunoaterea secvenei int, n special la capetele acesteia. Dac secvena este necunoscut, atunci se vor analiza cel puin secvene ADN omoloage de la alte specii sau secvena de aminoacizi a proteinei dac este vorba despre o gen. Principiul tehnicii PCR este o imitaie a procesului de replicare a ADN care are loc n celule. Dac n celule pentru replicare se folosete o ntreag serie de proteine, aici rolul unora dintre ele este preluat de unii factori fizici, cum ar fi spre exemplu denaturarea ADN. Denaturarea ADN presupune separarea celor dou catene. Procesul este reversibil, catenele complementare formnd molecula dublu catenar dup nlturarea agentului de denaturare. Reacia de amplificare este una ciclic, fiecare ciclu fiind alctuit din 3 etape: - denaturarea ADN - alinierea amorselor - sinteza catenei complementare de ctre ADN polimeraz Dup fiecare ciclu practic cantitatea de ADN se dubleaz, iar dup 35-40 de cicluri se obin milioane de copii ale fragmentului int pornind de la o singur copie. Denaturarea ADN este necesar pentru separarea celor 2 catene. Ca agent denaturant se utilizeaz temperaturi nalte de 94-98C. Denaturarea din primul ciclu dureaz cteva minute (2-6) deoarece pentru denaturarea moleculelor de ADN genomic, care sunt foarte mari, e nevoie de mai mult timp. Etapele de denaturare dup primul ciclu sunt mai scurte, doar de 30-45 sec.

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investete n

OAMENI

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdiciplinar POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea

ROMNIA UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Str. Mihail Koglniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482 Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Resurselor Umane 2007-2013

Pag. 2/17

UNIUNEA EUROPEAN

GUVERNUL ROMNIEI MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I PROTECIEI SOCIALE AMPOSDRU

Fondul Social European POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale 2007-2013

OIPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

Amorsele (termenul englezesc este primer), denumite i oligonucleotide, sunt secvene scurte de ADN monocatenar. Aceste amorse sunt complementare cu extremitile secvenei int i formeaz poriuni scurte dublu catenare. Pentru alinierea amorselor la secvenele complementare, temperatura este cobort la 40-60C timp de cteva zeci de sec. Aceast etap este numit de aliniere sau hibridizare. Temperatura de aliniere se stabilete la cteva grade (2-5) mai puin dect temperatura de topire (Tm) a amorsei. Temperatura de topire se calculeaz n dependen de lungimea amorsei i de compoziia ei. Exist mai multe formule de calcul, cea mai simpl formul de calcul pentru o amors de pn n 25 de nucleotide este: Tm = 4 (G + C) + 2(A + T) Unde G, C, A i T sunt numrul de nucleotide ce conin aceste baze azotate. Numrul de G i C se nmulete dublu fa de A i T deoarece ntre acestea exist 3 legturi de hidrogen, n consecin moleculele bogate n G i C au o temperatur mai mare topire. Exist cteva reguli pentru construirea amorselor i anume: - numrul de nucleotide este de 15-35 - temperatura de topire a amorselor trebuie s fie ntre 40 i 70C - coninutul de G i C nu trebuie s depeasc 50-55% - la captul 3' al amorsei este de dorit s fie o G sau C, deoarece ofer o stabilitate mai mare - amorsele nu trebuie s prezinte complementaritate intern, n caz contrar amorsa poate forma secvene interne dublu catenare care au aspect de bucl - cele dou amorse sens (forward) i antisens (reverse) nu trebuie sa fie complementare ntre ele, altfel se vor forma poriuni dublu catenare sau dimeri de amorse, iar ca rezultat se vor amplifica poriunile scurte rmase monocatenare. De la aceste poriuni dublu catenare formate ntre catena matri i amorsa ADN, polimeraza poate iniia sinteza catenei complementare. ADN polimeraza catalizeaz sinteza catenei complementare n direcia 5'3' (Figura 2). Amorsele servesc n primul rnd la delimitarea fragmentului amplificat, dar i ca punct start pentru ADN polimeraz care nu poate porni sinteza de la zero i are nevoie de un capt liber 3'. Iniial la originea tehnicii PCR se folosea ADN polimeraza izolat de la bacteria Escherichia coli care are activitatea optim de sintez la 37C. Cel mai mare dezavantaj al utilizrii acestei enzime era inactivarea termic n timpul denaturrii ADN. n acest fel tuburile de reacie trebuiau schimbate de la o temperatur la alta i dup fiecare ciclu era nevoie de un surplus de ADN polimeraz. Astfel amplificarea fragmentelor de ADN era una foarte costisitoare. Salvarea acestei metode a venit dup descoperirea i descrierea ADN polimerazelor de la bacteriile termofile. Enzima revoluionar n acest sens, pe larg utilizat i astzi este Taq polimeraza. Aceast enzim este o ADN polimeraz, izolat de la o bacterie termofil Thermococcus aquaticus (de unde i denumirea ei), care sintetizeaz polimerizarea nucleotidelor trifosfat ntr-un lan polinucleotidic n direcia 53. Taq polimeraza are activitatea optim la 72C i nu se denatureaz la temperaturi ridicate de peste 90C foarte repede, astfel dup cteva ore la 95C pierderea de activitate este nesemnificativ. Viteza de polimerizare a Taq polimerazei este de aproximativ 1000 de nucleotide per minut. Durata elongrii necesare sintezei va fi n dependen de mrimea fragmentului int. Pentru un fragment de 500 de nucleotide vor fi suficiente 30 sec, iar pentru un fragment de 2000 de nucleotide 2minute.

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investete n

OAMENI

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdiciplinar POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea

ROMNIA UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Str. Mihail Koglniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482 Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Resurselor Umane 2007-2013

Pag. 3/17

UNIUNEA EUROPEAN

GUVERNUL ROMNIEI MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I PROTECIEI SOCIALE AMPOSDRU

Fondul Social European POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale 2007-2013

OIPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

ADN genomic cu fragmentul int

5' 3'

Etapa iniial de denaturare

3' 5'

5'

3' 3' 5'

Alinierea amorselor la capetele fragmentului int

3'

5'

3' 5'

Ciclu I

5'

3'

Etapa de elongare sau sintez a catenei complementare de ctre ADN polimeraz

3'

5'

5'

3'

Sfritul primului ciclu

3' 5'

5' 3'

3' 5'

5' 3'

3' 5'

5'

3'

5'

3'

3'

3'

5'

Ciclu II
3'

5'

3'

5'

3'

3'

5'

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investete n

OAMENI

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdiciplinar POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea

ROMNIA UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Str. Mihail Koglniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482 Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Resurselor Umane 2007-2013

Pag. 4/17

UNIUNEA EUROPEAN

GUVERNUL ROMNIEI MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I PROTECIEI SOCIALE AMPOSDRU

Fondul Social European POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale 2007-2013

OIPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

5' 3'

3' 5' 3'

5'

3' 5'

5' 3'

3'

5' 3'

3'

5' 3'

3' 5'

5' 3'

3' 5'

Ciclu III

5' 3'

3' 5'

5' 3'

3'

Taq polimeraza amors amors ce indic direcia de sintez

Figura 2. Reprezentarea schematic a primelor cicluri de PCR. Un tip special de PCR este RT-PCR sau PCR de transcriere invers. Acest tip este asemntor PCR obinuit, doar c folosete o matri de ARN pentru a sintetiza ADN. Enzima responsabil de aceast sintez este transcriptaza invers, care este de fapt o ADN polimeraz ARN-dependent. Taq polimeraza este o ADN polimeraz deoarece sintetizeaz ADN i este ADN dependent deoarece utilizeaz o matri ADN pentru sintez. Transcriptaza invers a fost izolat de la virusurile care au material genetic ARN i n momementul intrrii n celul necesit sinteza unei copii a materialului su genetic. RT-PCR se utilizeaz pentru obinerea copiilor de gene eucariote care nu conin introni i analiza exprimrii de gene. n ambele cazuri se pornete de la ARNm (informaional care codific proteine). Exprimarea genelor sau transcrierea este etapa intermediar ntre ADN i proteine. ADN codific informaie genetic despre sinteza proteinelor, calea de la ADN la proteine constituie dogma central a biologiei. Enzime de restricie. Enzimele de restricie sau restrictazele sunt enzime care taie molecule monocatenare sau dublu catenare de ADN la anumite situsuri specifice. Ele pot fi numite cu alte cuvinte adevrate foarfece de ADN. Restrictazele recunosc doar anumite secvene scurte numite situsuri specifice de recunoatere, se fixeaz de acestea i taie legturile fosfoesterice ntre nucleotide. Aceste enzime au fost descoperite la bacterii i se presupune c funcia lor este de aprare contra bacteriofagilor (virusuri ale bacteriilor). n momentul intrrii ADN fagic n bacterii, enzimele de restricie diger aceste molecule. ADN bacterian propriu este protejat contra enzimelor de restricie prin metilarea unor baze azotate, enzimele de restricie, n general, nu taie ADN metilat. Pn acum au fost descrie 4000 de enzime de restricie de la cteva sute de specii bacteriene. Toate aceste enzime se mpart n 3 clase: I, II i III. Aceast clasificare este n dependen de cofactorul utilizat i de secvena de recunoatere. Enzimele cele mai utilizate n tehnicile moleculare sunt cele de tip II, care au secvena de recunoatere un palindrom i utilizeaz ioni de Mg2+ ca i cofactor. Secvena palindrom este alctuit din 4-6 nucleotide i citit pe ambele catene n direcia 53 este identic.

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investete n

OAMENI

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdiciplinar POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea

ROMNIA UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Str. Mihail Koglniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482 Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Resurselor Umane 2007-2013

Pag. 5/17

UNIUNEA EUROPEAN

GUVERNUL ROMNIEI MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I PROTECIEI SOCIALE AMPOSDRU

Fondul Social European POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale 2007-2013

OIPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

Nomenclatura enzimelor de restricie pornete de la denumirea bacteriei de la care a fost izolat. Astfel, HindIII este izolat de Heamophilus influenzae tulpina Rd, iar EcoRI de la Escherichia coli tulpina RY13. A EcoRI B SmaI

5 GAATTC 3 CTTAAG

3 5

5 GGGCCC 3 CCCGGG

3 5

5 G 3 CTTAA

AATTC G

3 5

5 3

GGG CCC

CCC GGG

3 5

Figura 3. Secvenele de recunoatere pentru enzimele EcoRI (A) i SmaI (B) i capetele libere dup tiere. Locurile de tiere sunt indicate cu sgei. Capetele libere dup tierea de ctre enzimele de restricie pot fi de 2 feluri: coezive sau drepte. Enzima BamHI i EcoRI genereaz capete coezive dup tiere, iar enzimele SmaI i EcoRV genereaz capete drepte sau netede (Figura 3). Cu ajutorul unor programe speciale se pot alctui hri de restricie care reprezint situsurile de recunoatere pentru diferite restrictaze ntr-o secven (Figura 4).
B a m I (533) H H inf (7 5) I E co RV (5 8) H inf (32) I H inf (461) I E co (605) RI H inf (616) I E co (633) RI B a m I (7 7 3) H NcoI (7 7 7 ) H inf (942) I

Y L R3 7 7 C
1047 bp

Figura 4. Harta de restricie a unei gene de la drojdia Saccharomyces cerevisiae. Cu cifre n paranteze sunt indicate situsurile enzimelor de restricie.

Ligarea fragmentelor de ADN Dei moleculele de ADN pot fi asemnate cu nite fire, acestea nu pot fi legate prin creare de noduri sau nu exist nici un lipici special. Pentru legarea fragmentelor de ADN se utilizeaz o enzim numit ADN ligaz. Aceast enzim reface legturile fosfoesterice ntre gruparea hidroxil a unui nucleotid (captul 3) i gruparea fosfat de la nucleotidul altui fragment (captul 5) (Figura 5). Funcia ligazei n celule vii este legarea fragmentelor n timpul replicrii, recombinrii i dup repararea ADN. Cea mai des utilizat este ADN ligaza T4 izolat de la bacteriofagul T4. ADN ligaza T4 utilizeaz ATP ca i cofactor.

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investete n

OAMENI

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdiciplinar POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea

ROMNIA UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Str. Mihail Koglniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482 Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Resurselor Umane 2007-2013

Pag. 6/17

UNIUNEA EUROPEAN

GUVERNUL ROMNIEI MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I PROTECIEI SOCIALE AMPOSDRU

Fondul Social European POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale 2007-2013

OIPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

OH OH OH P 5 3 GGAT CCTA O P OH OH HO O CGCAA GCCTT 3 5

Figura 5. Reprezentarea schematic de legare de ctre ADN ligaz a dou fragmente ADN care au capete netede.

Vectori de clonare Prin vectori de clonare subnelegem molecule de ADN transportatoare ale fragmentului de ADN strin n celulele gazd. Vectorii sunt de mai multe tipuri: cosmide, bacteriofagi, plasmide i vectori artificiali. Aceti vectori sunt utilizai n dependen de scopul clonrii. Cele mai pe larg utilizate sunt plasmidele. Un plasmid este o molecul dublu catenar de ADN, care este circular, nchis i capabil de replicare autonom n celule gazd. Plasmidele comerciale utilizate pe larg sunt plasmide naturale izolate de la bacterii care au fost modificate. Plasmidele au nite secvene specifice necesare replicrii, clonrii, seleciei i uneori exprimrii genelor. Pentru replicarea autonom n celule gazd plasmidele conin secvena ori, care este originea de replicare. Nicio molecul de ADN nu poate fi replicat fr o origine de replicare. Originea de replicare este o regiune a moleculei de ADN de unde poate ncepe replicare i care este recunoscut de anumite proteinele care iniiaz replicarea. O regiune foarte important ntr-un vector de clonare este Situsul Multiplu de Clonare (termenul englezesc este Multiple Cloning Site). n aceast regiune se introduce fragmentul int de ADN cu ajutorul enzimelor de restricie i a ligazei. Att vectorul ct i fragmentul ADN este tiat cu aceleai enzime de restricie i legate mpreun cu ajutorul ligazei. SMC conine secvenele de recunoatere pentru mai multe enzime de restricie i care nu se conin n alt regiune a vectorului. O alt component foarte important a plasmidelor sunt markerii de selecie care sunt de obicei nite gene a cror produs (enzim) fac posibil selectarea celulelor cu plasmid de cele fr plasmid care sunt mai numeroase. Cei mai des utilizai markeri sunt genele ce confer rezisten la antibiotice, mai corect spus produsul genei confer rezisten. Spre exemplu, -lactamaza confer rezisten la ampicilin. Plasmidele care conin gena pentru aceast enzim vor proteja celulele bacteriene de efectul antibioticului. Astfel dac un amestec de celule transformate cu plasmide care vor conine att celule cu ct i fr plasmid, se nsmneaz pe un mediu cu ampicilin, vor supraveui doar celulele care conin plasmidul. Un alt fel de selecie este selecia celulelor transformate cu plasmid recombinat adic cu insert de cele cu plasmid fr insert. Insert se refer la fragmentul de ADN int clonat. n acest scop situsul multiplu de clonare se afl ntr-o gen ce codific o enzim. Dac n SMC nu a fost introdus niciun fragment ADN atunci gena este intact, produsul ei este o protein activ. Dac n SMC a fost introdus un fragment ADN atunci gena este modificat i produsul ei este inactiv. Spre exemplu dac SMC se afl n gena lacZ care codific subunitatea a enzimei -galactozidaz, atunci produsul acestei gene mpreun cu subunitile codificate din genomul celulei gazd bacteriene vor forma o enzim activ capabil s metabolizeze un derivat al galactozei numit X-Gal (bromo-cloro-indolil galactopiranozid) care este adugat n mediu i este incolor. Dac -galactozidaza este activ atunci va metaboliza acest substrat iar produsul format n urma reaciei va avea o culoare albastr. n acest fel coloniile rezultate dup transformare care conin vectorul fr insert vor fi albastre, iar cele ce conin vector recombinat vor fi albe, deoarece ele nu produc enzim activ

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investete n

OAMENI

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdiciplinar POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea

ROMNIA UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Str. Mihail Koglniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482 Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Resurselor Umane 2007-2013

Pag. 7/17

UNIUNEA EUROPEAN

GUVERNUL ROMNIEI MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I PROTECIEI SOCIALE AMPOSDRU

Fondul Social European POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale 2007-2013

OIPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

capabil de metabolizarea substratului X-Gal. Un alt tip de selecie utilizeaz o enzim toxic pentru celulele bacteriene. Astfel, celulele cu plasmid fr insert au gena funcional care va provoca moartea celulelor. Celulele bacteriene care au plasmidul cu insert vor avea gena nefuncional i vor supraveui. Vectorii de clonare au de obicei mrime mic, doar de cteva mii de pb i n care pot fi inserate fragmente de ADN de la 100 pb pn la 2000-3000 pb (Figura 6: A, B). O caracteristic important pentru plasmide este numrul de copii per celul. Vectorii de clonare mai mici au de obicei un numr mai mare de copii per celul. Acest fapt permite obinerea unei cantiti mari de ADN plasmidic dintr-o cultur mic de bacterii (din 3-5ml de cultur se pot obine cteva g de ADN plasmidic). Pentru vectorii mai mari numrul copiilor per celul este mai mic, n consecin i pentru a obine o cantitate mai mare de ADN este necesar o cantitate mai mare de cultur. A
Sca I (3847) Pvu I (3737) Cla I (25) Eco RI (4360) HindIII (30) Eco RV (188) BamHI (376) Sph I (567) SalI (652)

LacZ
EcoRI (616) Sac I (626)

AP r
Pst I (3612)

bla(AmR)

Kpn I (632)

TC

pTZ57R
2886 bp

Xba I (645) Bam HI (655)

pBR322
4361 bp

M CS
Apa I (666) Sal I (668) Pst I (677) Hin dIII (691)

ORI
Bst Z17I (2247)

T 7 promoter Ori
T7 terminator

His tag

C
f1 origin

XhoI (159) Not I (167) HindIII (174) SalI (180) Sac I (191)

M CS
Eco RI (193)

bla (Ap)

Bam HI (199) NdeI (239)

pET-21a
5443 bp

T7 promoter
BglII (343)

la cI

ColE1 pBR32 2 origin

Figura 6. Hrile unor vectori plasmidici. A harta plasmidului pBR322 include 2 gene de rezisten la
antibiotice: Apr confer rezisten la ampicilin, iar TCr rezisten la tetraciclin, situsul multiplu de clonare l poate constitui oricare dintre cele dou gene de rezisten, n dependen de gena selectat pentru inserare, rezistena la antibioticul respectiv se va pierde . B harta plasmidului de clonare pTZ57R comercializat de firma Fermentas. Plasmidul are rezisten la ampicilin iar situsul multiplu de clonare se afl n gena lacZ' care ofer selecia alb-albastr a clonelor pozitive. C harta vector de exprimare pET21a de la Novagen care include gena bla care confer rezisten la ampicilin, situsul multiplu de clonare care conine un codon START i un codon STOP dup eticheta de 6 histidine, promotorul de la fagul T7 care este inductibil cu IPTG.

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investete n

OAMENI

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdiciplinar POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea

ROMNIA UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Str. Mihail Koglniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482 Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Resurselor Umane 2007-2013

Pag. 8/17

UNIUNEA EUROPEAN

GUVERNUL ROMNIEI MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I PROTECIEI SOCIALE AMPOSDRU

Fondul Social European POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale 2007-2013

OIPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

Vectorii de exprimare sunt de asemenea vectori de clonare dar care mai ofer n plus posibilitatea exprimrii genei clonate(Figura 6 C). Plasmidele de exprimare trebuie s mai conin cteva elemente n plus fa de vectorii de clonare. Aceste elemente sunt cele care se gsesc i n genom i fac parte dintr-o gen: promotorul, situsul de legare al ribosomilor, codonii START i STOP care delimiteaz cadrul deschis de citire (termenul englezesc este Open Reading Frame). Promotorul este o secven care se afl n amonte de gen i este recunoscut de factorii de transcriere, care se fixeaz la nivelul promotorului i iniiaz transcrierea. Numai n prezena promotorului exprimarea va fi foarte sczut, de aceea situsul de legare al ribozomilor (termenul englezesc este Ribosome Binding Site) este o secven care se transcrie dar care nu se traduce i care este recunoscut de ribosomi. Ribosomii se leag la acest situs i se deplaseaz de-a lungul ARNm pn ntlnesc primul codon START de unde ncepe traducerea. Codonul START la procariote este n cele mai dese cazuri ATG. Acest codon este de obicei inclus n situsul multiplu de clonare, n caz contrar acesta se poate introduce n fragmentul int cu ajutorul amorselor. Codonul STOP este inclus i el de obicei n situsul de clonare. n unele cazuri acesta este prezent dup regiuni care codific anumite aa-zise etichete. Etichetele faciliteaz purificarea proteinelor recombinate prin cromatografie de afinitate. Cele mai des utilizate sunt eticheta de 6 histidine (His-tag), Glutation S-transferaza (GST) i proteina de legare a maltozei (Maltose Binding Protein, MBP este termenul n englez). Aceste etichete vor fi parte integrant a proteinelor la captul ei C-terminal sau N-terminal dac secvena ce codific eticheta este prezent dup sau nainte de situsul de clonare respectiv. Etichetele vor conferi proteinelor recombinate afinitate fa de anumite rini cromatografice. Introducerea moleculelor recombinate n celule gazd Introducerea plasmidelor recombinate n celule gazd se numete transformare dac sunt utilizate celule bacteriene sau transfecie dac sunt celule eucariote. n continuare se va detalia doar transformarea celulelor procariote, acestea avnd cea mai mare aplicabilitate i simplitate n scopul obinerii clonelor i proteinelor recombinate. Exist dou tipuri de transformare a celulelor bacteriene pe larg utilizate n laboratoarele de biologie molecular: - transformarea chimic - transformare sub influena cmpului electric. Ambele tipuri de transformare necesit inducerea unei competene de transformare, deoarece E. coli nu are proprieti de transformare natural. Aceast competen n cazul transformrii chimice este indus cu CaCl2. n acest scop se realizeaz o cultur de E. coli i prin tratarea celulelor cu clorur de calciu la rece se poate induce transformarea celulelor bacteriene (Figura 7 A). Celulele sunt ocate termic foarte scurt, timp de maxim 2 minute, la 42C. Acest timp este suficient pentru intrarea moleculelor recombinate n celulele bacteriene. Transformarea n cmp electric este mai eficient dect transformarea chimic. Prepararea celulelor competente presupune doar creterea lor pn n faza logaritmic (D=600nm = 0,6-0,8) i nlturarea prin splri repetate a mediului de cultur. Aceste splri repetate vor asigura eliminarea ionilor care pot afecta transformarea. Pentru acest tip de transformare este necesar un aparat numit electroporator, care va crea cmpul electric ntre doi electrozi. Amestecul de celule competente i plasmide recombinate vor fi depuse ntr-o cuv special de electroporare, ai crei pereii laterali sunt electrozii. Transformarea are loc la o tensiune de 1800 sau 2500 V timp de cteva msec (Figura 7 B). Dup transformare celulele ocate sunt preluate n mediu de cultur i apoi nsmnate pe mediu selectiv cu antibiotice. Doar unele celule bacteriene sunt transformate, cea mai mare parte dintre ele fiind netransformate adic fr plasmid. Eficiena de transformare a celulelor se poate msura efectund o transformare cu o cantitate de 1ng de ADN plasmidic i apoi numrnd coloniile rezultate. Numrul de colonii va corespunde numrului de celulele transformate deoarece fiecare colonie ia natere dintr-o singur celul. Numrul obinut de la transformarea a 1 ng de ADN plasmidic se raporteaz la 1 g de ADN (nmulind valoarea la 1000). O eficien bun de transformare este 106, ceea ce nseamn ca la transformarea unui g de plasmid s-

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investete n

OAMENI

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdiciplinar POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea

ROMNIA UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Str. Mihail Koglniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482 Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Resurselor Umane 2007-2013

Pag. 9/17

UNIUNEA EUROPEAN

GUVERNUL ROMNIEI MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I PROTECIEI SOCIALE AMPOSDRU

Fondul Social European POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale 2007-2013

OIPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

ar obine 1 milion de colonii, o valoare foarte mare innd cont de faptul c avem nevoie de o singur colonie sau de cteva cnd avem un amestec eterogen de molecule int. Desigur n amestecul de ligare numrul de molecule recombinate este mic i din aceast cauz este de dorit o eficien ct mai mare a celulelor competente. Fiecare dintre cele dou metode de transformare prezint avantaje i dezavantaje legate de eficiena de transformare i de costuri. Transformarea chimic este mai puin eficient dect electroporarea, dar mai ieftin deoarece nu necesit aparatur i cuve costisitoare. A
CaCl2

2 min 42C

Celule de E.coli

Celule transformate de E.coli

nsmnarea celulelor transformate pe mediu selectiv

Splarea celulelor bacteriene

1800 V 5 msec

Figura 7. Transformarea celulelor bacteriene cu ADN plasmidic. A transformarea chimic cu

CaCl2; B electroporarea celulelor bacteriene.

Electroforeza acizilor nucleici Electroforeza este procesul de migrare a moleculelor cu sarcin ntr-un cmp electric. Migrarea moleculelor se realizeaz printr-o matrice specific. Metoda este aplicat pentru analiza proteinelor i a acizilor nucleici. Pentru proteine se aplic cel mai des electroforeza proteinelor n condiii denaturante n gel de poliacrilamid (termenul englezesc SDS-PAGE). Poliacrilamida se poate utiliza ca matrice i pentru electroforeza acizilor nucleici care ofer o rezoluie foarte bun a separrii fragmentelor de ADN, mai ales n cazul fragmentelor mici. Aceast matrice este folosit mai rar n laboratoarele de analize genetice, deoarece este mai laborioas. Primul loc n utilizarea vizualizrii acizilor nucleici aparine electroforezei n gel de agaroz. Dei metoda ofer o rezoluie inferioar celei din poliacrilamid, ea este utilizat cu succes deoarece este mai simpl. Moleculele de acizi nucleici sunt ncrcate negativ datorit gruprilor fosfat. Aceast sarcin face posibil migrarea moleculelor de ADN i ARN ntr-un cmp electric de la catod la anod. Amestecul de molecule nu se va deplasa n cmp electric cu aceeai vitez. Moleculele mici se vor deplasa mai repede prin porii matricei, iar cele mai mari vor avansa mai lent. Astfel separarea moleculelor va fi n dependen de masa lor molecular. Pentru estimarea aproximativ a mrimii fragmentelor n acelai gel dar n godeu separat se va migra un amestec de molecule cu mase moleculare diferite dar cunoscute. Acest amestec de molecule se numete marker molecular. Agaroza este un poliglucid extras din alge marine roii. Gelurile de agaroz se realizeaz prin nclzirea agarozei ntr-un tampon specific. Concentraia agarozei n gel poate fi ntre 1 i 3% n dependen de scopul urmrit. Cu ct concentraia agarozei este mai mare, cu att mrimea porilor va fi mai mic. La concentraii mai mici de agaroz, porii vor fi mai mari i migrarea moleculelor mai rapid. n concluzie concentraii mai mici se folosesc pentru fragmente mari (cteva mii de pb), iar concentraii mari pentru

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investete n

OAMENI

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdiciplinar POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea

ROMNIA UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Str. Mihail Koglniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482 Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Resurselor Umane 2007-2013

Pag. 10/17

UNIUNEA EUROPEAN

GUVERNUL ROMNIEI MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I PROTECIEI SOCIALE AMPOSDRU

Fondul Social European POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale 2007-2013

OIPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

fragmente mici. Gelurile de agaroz de 1% sunt cel mai des utilizate oferind separarea moleculelor ntre 0,1 i 10 kpb. Gelurile de agaroz sunt plasate ntre cei doi electrozi n cuve speciale care conin tampon de migrare. Acest tampon este acelai folosit i pentru realizarea gelului. Cele mai folosite tampoane sunt TAE (Tris/Acetat/EDTA) i TBE (Tris/Borat/EDTA). Deoarece ADN nu poate fi vizualizat cu ochiul liber este necesar utilizarea unui colorant. Cel mai des folosit n acest scop este bromura de etidiu, care fixat de ADN n lumin ultraviolet devine fluorescent i are o culoare portocalie (Figura 8). Bromura de etidiu se intercaleaz ntre bazele azotate din molecula dublu catenar de ADN. Lungimea de und a luminii ultraviolete la care este expus gelul trebuie s fie cuprins ntre 260 i 300 nm. A B

Figura 8. Separarea unor fragmente de ADN cu ajutorul electroforezei n gel de agaroz.

A imaginea gelului la expunerea n UV; B fotografia aceluiai gel.

Electroforeza n gel de agaroz este utilizat pentru vizualizarea i purificarea ADN. Vizualizarea ne ofer informaii despre integritatea ADN (ADN genomic, ADN plasmidic etc), rezultatul digestiilor enzimatice, estimarea cantitii de ADN obinut n reaciile PCR sau de extracie. ADN poate fi purificat din gel de agaroz dup migrare prin excizarea fragmentului int i purificarea din gel cu kituri special predestinate acestui tip de purificri.

Verificarea moleculelor recombinate Rezultatul ligrii i transformrii se poate vedea doar dup 12-18 ore de la transformare cnd apar coloniile de E. coli pe mediu selectiv. Apariia coloniilor nu indic neaprat i o reuit deplin a clonrii, deoarece acestea pot conine un amestec de colonii pozitive i colonii cu plasmid fr insert. Chiar dac se folosete un sistem alb-albastru de selecie a coloniilor pozitive, acestea necesit totui o dovad n plus a prezenei plasmidului recombinat. n acest scop se va efectua o cultur lichid de 3-5 ml de mediu cu antibiotic care se va nsmna cu o singur colonie. Cultura se va incuba peste noapte cu agitare la 37C. Ziua urmtoare din bacteriile rezultate se va purifica ADN plasmidic cu ajutorul unor metode clasice sau cu ajutorul unor kituri speciale. ADN plasmidic urmeaz a fi analizat iniial prin digestie enzimatic i apoi prin secvenializare. Digestia ADN plasmidic se va realiza cu enzimele de restricie cu care acesta a fost introdus n vector sau care se afl la extremele situsului multiplu de clonare. Aceast digestie va confirma prezena insertului n plasmid i aproximativ mrimea acestuia, dar nu va furniza nicio informaie despre secvena fragmentului clonat. Secvenializarea fragmentului int este verificarea definitiv a clonrii. Aceast verificare este necesar deoarece ADN polimeraza utilizat pentru amplificarea insertului prin PCR poate introduce erori de sintez. Pentru a evita erorile n produii PCR se poate utiliza o ADN polimeraz care are proprietatea de a corecta erorile introduse. Astfel de ADN polimeraze sunt Vent polimeraza, Pfu polimeraza, Tli polimeraza . a. Taq polimeraza nu are activitate de corectare a erorilor, dar asigur de obicei randamente de sintez mai mari. n unele cazuri se utilizeaz un amestec de 2 polimeraze (3 pri de Taq polimeraz i o parte Pfu polimeraz) pentru a combina un randament mai mare cu o fidelitate crescut.

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investete n

OAMENI

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdiciplinar POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea

ROMNIA UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Str. Mihail Koglniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482 Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Resurselor Umane 2007-2013

Pag. 11/17

UNIUNEA EUROPEAN

GUVERNUL ROMNIEI MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I PROTECIEI SOCIALE AMPOSDRU

Fondul Social European POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale 2007-2013

OIPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

n cadrul Centrului de Biologie Molecular exist 2 secveniatoare: Analizorul Genetic ABI Prism 310, Applied Biosystems, SUA (laser cu detecie pentru 5 fluorocromi), Analizor Genetic CEQ 8800 Genetic Analysis System (laser cu detecie pentru 4 fluorocromi). Ambele aparate utilizeaz principiul Sanger de secveniere. Acest principiu presupune utilizarea unei variante de PCR pentru secve niere. Matria ADN ce urmeaz a fi secveniat este denaturat, apoi la unul din capetele sale are loc ataarea unei amorse de la care ADN polimeraza va porni sinteza catenei complementare. Amestecul PCR conine dezoxiribonucleotide trifosfat (dNTP) dar i didezoxiribonucleotide trifosfat (ddNTP) care nu conin gruparea OH n poziia 3' a dezoxi ribozei. Lipsa acestei grupri va face imposibil continuarea sintezei ADN, deoarece ADN polimeraza nu poate aduga urmtorul nucleotide. Rezultatul acestui PCR vor fi fragmente monocatenare (deoarece se foosete o singur amors) de diferite mrimi. Numrul de cicluri este de 40 ceea ce permite sinteza tuturor fragmentelor care se opresc n toate punctele matriei de ADN. Pentru detecia fragmentelor, fiecare ddNTP este marcat cu un fluorcrom. Amestecul de fragmente rezultate sunt separate cu ajutorul electroforezei capilare, care presupune utilizarea unui capilar cu un diametru de ordinal micrometrilor. O cantitate de civa microlitri vor fi separai n gelul din capilar. Migrarea fragmentelor n gel este n dependen de mrimea lor, cele mai mici vor fi primele, iar la final cele mai mari. n ultima parte a capilarului exist o fereastr transparent prin care un fascicol laser va excita frluorocromii, iar fluores cena emis va fi captat i prezentat sub forma unei cromatograme (Figura 9). Cromatogramele sunt apoi analizate i comparate cu secvena existent n bazele de date. Mrimea fragmentelor de ADN care pot fi secvenializate variaz ntre 600 i 800 pb. Pentru fragmente mai mari sau pentru matrie dificile (cu secvene repetitive) este necesar utilzarea unor kituri speciale.

Figura 9. Cromatograma unei secvene obinut cu ajutorul analizorului ABI Prism 310. Exprimarea genelor n sistem procariot Clonarea genelor vizeaz n principal dou obiective posibile: multiplicarea unui fragment ADN sau exprimarea genei clonate. Clonarea n scopul multiplicrii fragmentului este utilizat atunci cnd ADN supus analizei este de fapt un amestec de fragmente care nu pot fi separate cu ajutorul electroforezei i la care se urmrete cunoaterea secvenei. n acest scop amestecul de fragmente se cloneaz ntr-un vector de clonare, iar clonele pozitive sunt apoi secvenializate. Celulele de E. coli sunt utilizate pe larg n obinerea de proteine recombinate. Ele pot fi numite adevrate fabrici de proteine la comand, care ns cteodat refuz s sintetizeze proteinele comandate i de ce cele mai dese ori strine celulei bacteriene. Clonarea n scopul exprimrii genei i obinerii de protein recombinat include cteva aspecte care sunt importante pentru exprimare. Gena codificatoare poate fi clonat direct n vectorul de exprimare. Plasmidele de exprimare conin neaprat un promotor recunoscut de

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investete n

OAMENI

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdiciplinar POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea

ROMNIA UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Str. Mihail Koglniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482 Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Resurselor Umane 2007-2013

Pag. 12/17

UNIUNEA EUROPEAN

GUVERNUL ROMNIEI MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I PROTECIEI SOCIALE AMPOSDRU

Fondul Social European POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale 2007-2013

OIPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

ARN polimeraza celulei gazd, un situs de legare a ribosomilor (rbs), un codon START i unul STOP la capetele situsului multiplu de clonare. Foarte important n acest caz este pstrarea cadrului deschis de citire, adic mprirea exact pe codoni a genei de la primul codon tradus pn la ultimul. Promotorii din aceste tipuri de plasmide sunt de tip inductibil. Cel mai des utilizat inductor este IPTG (isopropil-tio-galactozid), care este un analog al galactozei. Spre exemplu vectorii de tip pET de la Novagen asigur de obicei o supraexprimare a genelor clonate. Plasmidul pET21 conine promotorul de la fagul T7, situsul de recunoatere a ribosomilor, codonul START n situsul multiplu de clonare i codonul STOP dup o etichet de 6 histidine. Dac se opteaz pentru prezena unei etichete 6His la captul C-terminal a proteinei pentru facilitarea purificrii atunci din gen se va nltura codonul STOP. Dac aceast etichet nu este necesar, atunci n gen se pstra codonul STOP i traducerea se va opri nainte de etichet. Promotorul T7 nu este recunoscut de ctre ARN polimeraza de la E. coli i simpla prezen a plasmidului n celulele bacteriene nu va sigura o exprimare a genei. Vectorii pET necesit tulpini de E. coli care conin gena pentru ARN polimeraza de la fagul T7. Aceast gen se afl sub controlul promotorului lacUV5 i a operatorului lac (Figura 10).

P lac lac

Lac O P T7 Lac O

lacI lac pET21 lacI ADN genomic

represorul lac gena lacI promotorul lac operatorul lac

gena pentru T7 ARN polimeraz promotorul T7 gena int

Figura 10. Inhibiia exprimrii genei pentru ARN polimeraza de la fagul T7 i a genei int n celulele gazd de E. coli n lipsa inductorului. Operatorul lac este o secven recunoscut de ctre o protein numit represorul lac. Atunci cnd n mediu nu exist lactoz (sau analogi ai lactozei) represorul lac se fixeaz la operatorul lac i mpiedic transcrierea genei pe care o regleaz, care n acest caz este gena pentru T7 ARN polimeraza. n absena T7 ARN polimerazei nu va exista nici transcrierea genei int din plasmid. Represorul lac este codificat de gena lacI care se afl att n genomul bacteriei gazd ct i n plasmidul de exprimare. Agentul care induce exprimarea este un analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixeaz de represorul lac i cauzeaz disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel promotorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E. coli care va transcrie gena pentru T7 ARN polimeraz. Aceasta din urm va recunoate promotorul T7 din plamsid i va transcrie gena int. Acest sistem de exprimare este unul foarte puternic i care poate asigura o producie de protein care va alctui pn la 50% din proteinele totale bacteriene.

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investete n

OAMENI

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdiciplinar POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea

ROMNIA UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Str. Mihail Koglniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482 Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Resurselor Umane 2007-2013

Pag. 13/17

UNIUNEA EUROPEAN

GUVERNUL ROMNIEI MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I PROTECIEI SOCIALE AMPOSDRU

Fondul Social European POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale 2007-2013

OIPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

Purificarea proteinelor recombinate Proteinele recombinate pot fi purificate prin metode cromatografice. Pentru o purificare ct mai bun din amestecul total de proteine este necesar purificarea n cel puin 2 etape prin metode cromatografice diferite. Ataarea unor etichete la proteinele recombinate asigur purificarea proteinelor ntr-o singur etap, ceea ce reduce timpul necesar i asigur randamente de purificare mai mari (Figura 11). Dac eticheta deranjeaz n analiza ulterioar a proteinei, atunci se poate recurge la nlturarea acesteia prin digestie cu peptidaze. n acest scop pentru clonare i exprimare se va alege un plasmid care conin situsul pentru peptidaz, cum este spre exemplu situsul pentru trombin n cazul plasmidului pET28. A B C

Figura 11. Reprezentarea schematic a purificrii de proteine recombinate prin cromatografie de afinitate. A ncrcarea amestecului total de proteine pe coloana cu rin; B splarea coloanei cu
tampon i fixarea proteinei int de rin; C eluarea proteinei int de pe coloan.

2. Utilizarea clonrii de gene i exprimrii de proteine recombinate n studii interdisciplinare

Clonarea genelor n ultimii ani a devenit o tehnic indispensabil n laboratoarele de biologie molecular. Una dintre aplicaiile acestei tehnici, importante nu numai pentru biologie, dar i pentru studii interdisciplinare este utilizarea ei n scopul obinerii de proteine recombinate. Clonarea genelor i exprimarea lor n celule gazd reprezint o surs foarte preioas de proteine. n cele mai multe cazuri purificare unei proteine din celulele n care aceasta se exprim n mod firesc natural prezint mai multe dificulti: - cantitatea de proteine n esuturi este foarte mic, spre exemplu pentru purificarea unei proteine din bacterii este necesar o cantitate de zeci de litri de cultur bacterian, iar rezultatul purificrilor n cteva etape pot fi sub 1g de protein; - obinerea unei cantiti mari de esut pentru purificare este aproape imposibil, spre exemplu cum este cazul unor bacterii pe care nu putem s le cultivm n condiii de laborator; - obinerea materialului pentru purificare implic probleme etice, cum ar fi spre exemplu cazul unor proteine umane, obinerea de proteine din celule umane ar fi imposibil;

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investete n

OAMENI

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdiciplinar POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea

ROMNIA UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Str. Mihail Koglniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482 Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Resurselor Umane 2007-2013

Pag. 14/17

UNIUNEA EUROPEAN

GUVERNUL ROMNIEI MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I PROTECIEI SOCIALE AMPOSDRU

Fondul Social European POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale 2007-2013

OIPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

purificarea se face n mai multe etape care necesit timp, consumabile i are randamente mai mici.

Aceste dezavantaje ale purificrii direct din material biologic sunt eliminate n cazul exprimrii genelor n celule gazd. Un mare avantaj al acestei metode este posibilitatea introducerii de mutaii care pot dezvlui rolul unor domenii sau aminoacizi particulari n activitatea proteinei. Prin intermediul tehnicilor de mutagenez pot fi introduse mai multe tipuri de mutaii: - mutaii missens care schimb un aminoacid cu altul; - deleii n care poriuni ntregi din lanul polipeptidic pot fi nlturate; - inserii care constau n introducerea de fragmente noi n gena codificatoare i respectiv n proteina recombinat; - fuzionrii, se pot fuziona proteine ntre ele sau regiuni ale unei proteine cu regiuni ale altei proteine, spre exemplu regiunea N-terminal a unei proteine de la o specie se poate fuziona cu captul C-terminal al aceleiai proteine de la o specie nrudit; - proteinele recombinate pot fi marcate. Proteinele pot fi marcate cu anumite molecule care sunt introduse n proteine n procesul lor de sintez sau pot fi fuziuni. Un exemplu n acest sens este marcarea proteinelor cu izotopi stabili sau radioactivi, n mod specific sau randomic. Un alt exemplu este marcarea proteinelor prin fuziunea lor cu proteine fluorescente, care apoi faciliteaz detecia lor. Clonarea genelor i exprimarea lor n sistem procariot este tehnica la care se apeleaz cel mai des, deoarece este mai rapid i mai puin costisitoare. Proteinele sunt structuri cu mai multe nivele de organizare, astfel o protein are structur: primar, secundar, teriar i cuaternar. Exprimarea genelor i sinteza proteinelor n celulele procariote asigur doar structura primar exact a polipeptidului sintetizat. n unele cazuri proteinele adopt structura secundar independent dup sintez, n alte cazuri este nevoie de condiii speciale i alte proteine care contribuie la adoptarea conformaiei proteinei active. Unele proteine att de la eucariote ct i de la procariote sintetizate n celule gazd de E. coli nu reuesc s adopte o structur secundar corect, iar ca rezultat polipeptidele acumulate n citoplasma formeaz corpi de incluziune. Exist cazuri cnd acumularea proteinei sub forma corpilor de incluziune este un avantaj. Corpii de incluziune ofer posibilitatea unei purificri printr-o singur etap n condiii denaturante. Proteinele denaturate purificate n acest mod pot fi utilizate pentru imunizarea de animale n scopul producerii de anticorpi. Cel mai important aspect pentru imunizare este secvena de aminoacizi a proteinei i nu structura ei secundar sau teriar. Exprimarea proteinelor sub forma corpilor de incluziune nu poate fi prezis pe baza apartenenei genei sau pe baza analizei structurii primare. O alt problem care poate aprea este neexprimarea genei. Cauzele neexprimrii pot fi toxicitatea proteinei asupra celulelor gazd. Un alt dezavantaj (dei n unele cazuri este un avantaj) este lipsa modificrilor post-traducere a polipeptidelor sintetizate n celule bacteriene. Majoritatea proteinelor de la eucariote necesit nu numai adaptri conformaionale dar i modificri post-traducere cum ar fi fosforilri, glicozilri . a. Dac prezena acestor modificri este absolut necesar, atunci se va recurge la clonarea genei n sistem procariot i exprimarea ei n celule gazd eucariote. Lipsa modificrilor posttraducere este un avantaj atunci cnd este cunoscut funcia proteinei active i se dorete s se cunoasc rolul gruprilor care sunt adugate dup sintez. n acest fel proteina recombinat nu va fi modificat i se va putea deduce rolul acestor grupri n activitatea proteinei.

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investete n

OAMENI

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdiciplinar POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea

ROMNIA UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Str. Mihail Koglniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482 Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Resurselor Umane 2007-2013

Pag. 15/17

UNIUNEA EUROPEAN

GUVERNUL ROMNIEI MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I PROTECIEI SOCIALE AMPOSDRU

Fondul Social European POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale 2007-2013

OIPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

3. Infrastructura existent n cadrul Centrului de Biologie Molecular

Denumire echipament Instalaie de preluare i prelucrare a imaginilor Ced Limited, Marea Britanie Instalaie de ap ultrapur, Elga-Lab Water, Marea Britanie Centrifug cu rcire Sigma 3K18 (4 rotoare), Sigma, Germania Caracteristici Achizitia i interpretarea imaginilor de pe geluri de poliacrilamid sau geluri de agaroz Purificarea apei pn la o rezistivitate de 18,2 M/cm (apa MilliQ)

Centrifugarea probelor, de la 0,2ml la 1 litru, maximum 28000xg, rcire de la temperatura camerei la 0C, rotor Eppendorf (24 tuburi), rotor 6x30ml, rotor 8x50ml si rotor 4x250ml Centrifug de mas Sigma 1-13, Sigma, Germania Fr rcire cu rotor Eppendorf (12 tuburi, 13000xg) Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR n tuburi de 0,2ml, 0,5ml si Thermocycler, Eppendorf, Germania placi ELISA cu 96 de godeuri; gradient de temperatur n tub Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR n tuburi de 0,2ml i plci Thermocycler, Corbett Research, Australia ELISA cu 96 de godeuri; gradient de temperatur Electroporator Eppendorf, Germania Transformarea celulelor electrocompetente bacterii i drojdii Spectrofotometru UV-Vis monofascicul M301, Interval de fotometrare, 198-1000 nm, rezoluie 1 nm CamSpec, Marea Britanie Spectrofotometru Jasco V-530 dublu-fascicul cu Interval de fotometrare, 198-1000 nm, rezoluie 1 nm, cu termostatare, termostatare, Jasco, Japonia pentru cinetic enzimatic Patru instalaii electroforez proteine, Consort, Electroforez vertical n gel de poliacrilamid, max. 32 probe Belgia ase instalaii electroforeza acizi nucleici, Electroforeza orizontal n gel de agaroz, max. 48 probe Consort, Belgia pH-metru P901 (dou buci), Consort, Belgia Masurarea pH-ului, electrod combinat prevzut cu senzor de temperatur Congelator temperaturi foarte sczute, 70 litri, Congelare probe biologice la -82C Sanyo, Japonia Congelator temperaturi foarte sczute, 100 litri, Congelare probe biologice la -82C Snijders Scientific, Olanda Domeniul de msurare de la 0,1mg la 160g, autocalibrare, interfa pentru Dou balane analitice, Scaltec, Germania calculator i imprimant Dou incubatoare bacteriologice, Memmert, Incubarea culturilor bacteriene i a probelor moleculare de la Germania temperatura camerei la 70C Doua bai de apa cu agitare, Memmert, Germania Incubarea probelor biologice pana la 100C, (3%) Analizor Genetic ABI Prism 310, Applied Biosystems, SUA laser cu detecie pentru 5 Secvenierea fragmentelor de ADN, identificare uman i fluorocromi determinarea polimorfismelor genetice; electroforeza capilar la 15kV; soft-uri speciale pentru secveniere i genotipare; Analizor Genetic CEQ 8800 Genetic Analysis System laser cu detecie pentru 4 fluorocromi Instalaie Real Time PCR, Corbett Research, Amplificarea ADN-ului n timp real; detecia simultan a 4 Australia fluorocromi Separarea probelor prin cromatografie de nalt performan; gradient Instalaie HPLC, Jasco, Japonia binar de nalt presiune i gradient cuaternar de joas presiune Microscop inversat NIKON Eclipse TE2000S, Studiul preparatelor celulare i tisulare n lumina normal, contrast de Nikon, Japonia faz i fluorescen Autoclav 80l, Selecta, Spania Sterilizarea umed sau uscat a mediilor de cultur, materialelor i instrumentelor Autoclav AE-75-DRY Raypa, Spania Dezintegrarea celulelor bacteriene, esuturilor animale i vegetale n Ultrasonicator cu patru sonde, Sonics & Materials volume de la 1ml pn la 1 litru Flux laminar vertical, filtru bacteriologic HEPA, iluminare, preparare Hota PCR cu flux laminar steril, Telstar, Spania probe PCR (4% Filtru exahustare HEPA (0,3 um 99,97%), filtru HEPA (0,3 m 99,97%), Hota flux laminar biohazard 100, Coreea de Sud prefiltru reciclabil (3-30 m); flux de aer reglabil n 9 trepte (0,35-0,5 m/s);

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investete n

OAMENI

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdiciplinar POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea

ROMNIA UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Str. Mihail Koglniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482 Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Resurselor Umane 2007-2013

Pag. 16/17

UNIUNEA EUROPEAN

GUVERNUL ROMNIEI MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I PROTECIEI SOCIALE AMPOSDRU

Fondul Social European POSDRU 2007-2013

Instrumente Structurale 2007-2013

OIPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

4. BIBLIOGRAFIE
Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., and Walter P., (2002). Molecular Biology of the Cell, 4th edition, New York: Garland Science. Berg J.M., Tymoczko J.L., and Stryer L., (2002). Biochemistry, 5th edition New York: W. H. Freeman Company. Brown T.A., (2006). Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 5th edition, Wiley-Blackwell Publishing. Carson S., and Robertson D., (2005). Manipulation and Expression of Recombinant DNA, 2nd Edition, Academic Press. Glick B.R., Pasternak J.J., Patten C.L., (2009). Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, 4th edition, ASM Press. Glover D.M., Hames B.D., (1995). DNA Cloning: A Practical Approach: Expression Systems (The Practical Approach Series), 2d edition, Oxford University Press. Griffiths A., Gelbart W.M., Miller J., and Lewontin R.C., (1999). Modern Genetic Analysis, New York: W. H. Freeman Company. Griffiths A., Miller J., Suzuki D.T., Lewontin R.C., and Gelbart W.M., (2000). An Introduction to Genetic Analysis, 7th edition, New York: W. H. Freeman Company. Lodish H., Berk A., Zipursky L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J., (2000). Molecular Cell Biology, 4th edition, New York: W. H. Freeman Company. McPherson M.J., and. Mller S.G., (2000). PCR, Basics: from Background to Bench, 1st edition, SpringerVerlag Telos. Metzenberg S., (2007). Working with DNA (THE BASICS (Garland Science)), 1 edition, Taylor & Francis. Popescu O., 1990. Electroforeza proteinelor in geluri de poliacrilamid, Editura Tehnic, Bucureti. Watson J.D., Myers R.M., Caudy A.A., Witkowski J.A., (2006). Recombinant DNA: Genes and Genomes A Short Course, 3rd Edition, W. H. Freeman Company.

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investete n

OAMENI

Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdiciplinar POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea

ROMNIA UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Str. Mihail Koglniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482 Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/

Resurselor Umane 2007-2013

Pag. 17/17