Protectia muncii in lucrarile de laborator Prin specificul activitatii sale, medicul veterinar este permanent in situafia de a lucra intr-un mediu ‘care presupune pericole. In munca de laborator aceste pericole constau in special in aceea ci o serie dintre agentii bacterieni, virali si chiar parazitari intilnii la animale, au ca- ractere de patogenitate si pentru om. Asa-numitele antropozoonoze pot si fie transmise acestuia fie prin contactul direct cu animalele bolnave sau Purtdtoare si eliminatoare de germeni, fie prin manipularea produselor atologice de la acestea sau a materialelor contaminate. Antraxul, morva, leptospiroza, febra Q, turbarea, salmoneloza, psitacoza, tuberculoza, te- tanosul, botulismul, tularemia, trichineloza, tricofitia, toxoplasmoza, ‘sint numai citeva exemple din cele peste 100 de entitifi morbide care, pe tot globul, sint comune omului si animalelor. Pericolul pe care il reprezint ‘trebuie considerat cu atit mai important, cu cit multe din aceste infec pot genera accidente mortale, prin gravitatea cu care evolueazi. Este semnificativ in acest sens s& se sublinieze cd boli ca turbarea, botulis- mul etc., sint necrutatoare. Laboratoarele si incdperile anexe vor fi {inute in permanent intr-o ordine perfect. Dup& terminarea lucrarilor, de fiecare dati, materialele (instrumentar, ustensile etc.) cu care s-a lucrat se adund si se trimit la Sterilizare in cazul cd s-a Iucrat cu produse contaminate, sau se spalé In celelalte cazuri. Ele se pun apoi in dulapuri speciale pe categorii, pen- tru ca la nevoie si se stie de unde pot fi luate. Este bine ca in asemenea Jaboratoare s& existe dulapuri separate pentru diferitele categorii de us- tensile: sticlirie sterilizata, colorant, instrumente, reactivi $i magazii co- respunzitoare pentru medii de cultura neinoculate, pentru culturi care se pastreazd la temperatura camerei, camere frigorifice pentru cele care se conserva la temperaturi joase, sau refrigeratoare pentru produse bio- logice, care se congeleaza. Toate acestea trebuie s& poarte etichete deta- liate cu privire la confinutul recipientelor. ‘Mesele de lucru se lasi dupa fiecare lucrare in stare de curditenie Perfect i se dezinfecteazd, pentru ca, la inceperea unor lucrdri noi, s& existe condifii corespunzitoare de lucru. Ca urmare, respectarea unor principii de protectie a muncii este 0 necesitate cit se poate de stringent’, mai ales in conditiile activitatilor de aborator, care presupun un contact permanent ca surse generatoare de asemenea accidente. Iata citeva dintre acestea: — In laboratoare, una dintre conditiile sine qua non o reprezinta 15imbracimintea si materialele de protectie. Utilizarea halatelor de pro- tectie este menité si evite contaminarea sau deteriorarea prin diferi reactivi chimici a imbrécimintei proprit si, in acelasi timp, permite apli- carea corespunzaitoare a operatiunilor de sterilizare. — Folosirea.mastilor de tifon individuale se impune ori de cite ori se lucreazi cu materiale continind germeni transmisibili pe cale aero- wend, : — Utilizarea ménusilor de cauciue, mai ales cind se lucreazé cu materiale patologice suspecte de a contine germeni patogeni (in caz de turbare, antrax, leptospiroz etc.), permite 0 manipulare fara riscuri a acestora si evitd deci accidentele. — Manipularea instrumentelor, a aparatelor si materialelor_conta- minate sau suspecte de contaminare se va face cu deosebita atentie, evi tindu-se atingerea parfilor care au venit in contact cu. materialele sus pecte. Ele se vor reutiliza numai dupa prealabila sterilizare prin fier- bere, autoclavare sat prin actiunea agentilor chimici. —In cazul in care se intimpla sa se ating’ totusi asemenea ma- teriale contaminate sau suspecte, se va recurge imediat la spalarea mi- nutioasé cu apa calda si sipun a regiunilor atinse dupa care se vor dezinfecta cu solutii dezinfectante (cloramind 2%, formol 1%, sodd caus ticd 0,5%/). Aceeasi conduitd se adopta si cind’ se vine In contact cu medi de culturé in care s-au cultivat germeni sau cu. suspensii bacte- riene necesare diferitelor operatituini de diagnostic bacteriologic etc. — Daca masa de lucru a fost contaminaté cu produse care contin germeni (culturi microbiene, suspensii virale, organe suspecte) se va aco- peri zona respectiva cu vata sau tifon imbibate cu substante antiseptice si numai dupa ce a trecut un timp necesar distrugerii acestora, se trece la curairea propriu-zisi a locului respectiv. Cind asemenea materiale ajung pe halatul de protectie acesta va fi dat imediat la sterilizare (fier- bere sau autoclavare) si numai dupa aceea va fi reutilizat, — Dac pe masi au ajuns substante chimice periculoase, ele vor fi in prealabil neutralizate si numai apoi se indeparteazd (daci sint sub- stanfe alcaline se vor neutraliza cu acizi si invers). — Nu vor fi lasate niciodatd materiale sau vase continind eventuali agenti patogeni, descoperite sau in pozifii care si expund la contami- nari. “— Este interzis4 utilizarea de pipete in operatiuni cu materiale con- finind germeni sau solujii chimice periculoase, fard ca ele sd alba la partea superioara un dop de vata de protectie. Este preferabil in aceste cazuri Si se pipeteze cu pere de cauciuc, evitindu-se aspirarea cu gura. Se pot folosi in asemenea cazuri, ca gi atunci cind se lucreaza cu solufii caustice sau toxice, pipetele cu buld de siguranta. — Cind se lucreazd cu substante toxice care degajé vapori noctvi, este necesar s& se recurga la nige speciale cu hote de evacuare sau in baxe care si evite orice accidente. — Este interzis fumatul, mincatul si béutul tn incdperile in care se lucreaz cu germeni sau cu substante toxice. — Manipularea animalelor de experienta necesare inoculiilor ex~ perimentale se va face cu deosébita atentie, dupa 0 prealabila contentie corespunzatoare, care si le facd inofensive pe tot cursul operafiel. 16 z EMME Stee yee delll de in sacul ¢ © solutie +Dac, cu toate masurile de protectie luate se intimpld totusi anumite aceidente se vor avea in vedere urmatoarele: — Orice lichide (suspensii bacteriene sau virale, stropi din mate- vialul patologic suspect) care ajung la nivelul cavitifii bucale nu vor fi deglutite, ci imediat scuipate. Imediat se procedeaza la spalari si garga- risme repetate cu solutii de permanganat de potasiu 1% sau apa oxi- genatd 4%. Apoi se clateste gura cu apa, fara a se degluti; operatiunea se repetii de mai multe ori, timp de 0 ord. — In situatia cind, in mod reflex, materialul infectios a fost de- glutit, se vor face spaldturi repetate si gargare cu aceleasi solutii pe lingd care Se vor degluti solufii slabe (n/10) de acid clorhidric si se va in cerca provocarea reflexd a vomizarii, Operatiunea se repeté de mai multe ori — Dacd lichide septice sau suspecte ajung pe conjunctiva, in primul rind se va evita pe cit. posibil sé se clipeascd, pentru a evita difuzarea in sacul conjunctival. Se recurge imediat la spalarea cu apa si apoi cu © solutie slaba de oxicianat 0,001%/s. Deoarece lichidele acestea pot ajunge prin canalul lacrimo-nazal in cavitatea nazala si bucala se vor face con- comitent si operatiunile enunfate la dezinfectia gurii, Nasul se va sufla energic evitindu-se inspiratia pe nas. Se va instila apoi solufie de oxi- cianat 0,001", — fn cazul c& in cursul operatiunilor de inoculare la animalele de experienté se produc musoituri sau zgirieturi, se va recurge la spalarea imediata a ranii, lasarea s4 singereze din abundenfa si apoi badijonarea cu tinctura de iod si pansarea. — Dac este vorba de material continind germeni foarte periculosi (antrax, turbare, tetanos), pe lingé masurile acestea de urgenté se va solicit’ imediat intervenfia medicului, pentru instituirea masurilor de prevenire a infectiei. Fiecare laborator sau grup de laboratoare, avind un anumit specific de lucru, trebuie sa dispuna de un dulépior sanitar in care si existe un minimum de ustensile si produse farmaceutice de prim ajutor (vaté, tifon, alcool, tincturé de iod, solutie de 1% permanganat de potasit, solufie 1% api oxigenatd, solutie 0,001" oxicianat, unguente cu antibio- tice cum sint penicilina, cloramfenicolul, aureomicina). Ele trebuie s& fie amplasate in locuri usor accesibile.Sterilizarea si dezinfec{ia In laboratoarele in care se lucreazd cu agenti patogeni, sterilizarea si dezinfectia reprezinté operatiuni deosebit de importante, in primul Hind pentru preintimpinarea contaminarii personalului, dar si pentru a impiedica difuziunea in mediu a acestor agenti. Sterilizarea este un termen larg care presupune distrugerea micro- organismelor, indiferent de mijlocul folosit, in timp ce prin dezinfectie se nfelege in special distrugerea germenilor eu ajutoral unor substante imice. Sterilizarea se poate realiza prin agent fizici gi chimici. Sterilizarea prin agentifizici a) Sterilizarea prin cflduré poate fi uscatd (flambare, incdlzire la rosu, ‘aer cald) si umeda (fierbere, autoclavare, tindalizare, pasteurizare); b) Sterilizarea prin radiatii: ultraviolete, gamma; ©) Sterilizarea prin filtrare. a) Sterilizarea prin cildura Sterilizarea prin cAlduri uscati poate fi de mai multe feluri, — Sterilizarea prin flambare este cea mai simpli si constd in tre- cerea obiectului sau a suprafejei de sterilizat prin flacdra timp de ci- teva secunde, de mai multe ori la interval de 3—4 secunde. Metoda se foloseste in cazul pipetelor Pasteur (extremitatea efilata), pentru steri- lizarea gurii eprubetelor si flacoanelor sau altor recipiente cind se lu- creazi steril. Nu se pot steriliza prin flambare obiectele din materiale inflamabile. Sterilizarea prin tnodlzire la rosu este folosité in cazul anselor de Snsdiminfare si a spatulelor. Sterilizarea prin aer cald se realizeazd in diferite cuptoare in care aerul este incilzit intre anumite limite convenabile scopului urmarit (etuve, sterilizatoare Poupinel, cuptoare Pasteur). Majoritatea lor func- fioneazi pe bazii de rezistenfe electrice si sint prevazute cu termoregula- ‘toare. biectele care urmeazi a fi sterilizate trebule si fie uscate si se invelese in hirtie albi, care joacd si rolul de indicator al sterilizarii, in 18 a i i i ll i il iL pipetted tce sey! eee a ily leh BetisFig. 1 — Steriizarea prin flambare sensul ci aceasta este corecté cind hirtia, sub actiunea céldurii, devine cafenie. Ea trebuie insd si ramind intacti. Timpul de sterilizare difera cu temy — la 160°C — sint necesare 2 ore; — la 170°C — este necesard 0 ord; = la 180°C — este necesara 1/2 01 Se infelege cA se sterilizeazd in acest mod materialele si obiectele care nu se deterioreazé la aceste temperaturi (sticlaria si in nici un caz materialul plastic, obiectele de cauciuc, sticlaria cu armaturi metalice). Sticliria de laborator cum ar fi pipetele gradate, placile Petri, mojarele, feava fuzibilé, baloanele etc, se pot steriliza in condifii foarte bune cu aer cald, dar si prin autoclavare, tor, Sterlzaren rin cllduri umedi poate 11 si ca de mai multe fe- uri. Sterilizarea prin fierbere se foloseste mai ales pentru instrumentele metalice, pentru siringi, dopuri, garnituri, racorduri sau alte obiecte de caueiue. ‘Pentru a le proteja de actiunea nocivé a unor sfruri con{inute de apa de robinet, este indicatd fierberea in ap distilatd, la care se adaugi borax sau carbonat de sodiu, pentru a impiedica ruginirea, Du- rata fierberii este de cel putin 30 de minute din momentul clocotirii apei. Temperatura de 100°C, timp de o jumatate de ord, distruge toate formele vegetative si chiar uncle forme microbiene sporulate. Trebuie specificat c& exist spori bacterieni care rezisti la 100°C, fapt care face ca me- toda s4 nu fie suficienté, mai ales dacd se impun conditii riguroase de sterilizare. In plus, obiectele sterilizate in acest fel nu pot fi intrebuintate a sterile decit imediat dupa fierbere. ‘\Sterilizarea prin vapori de apa sub presiune (autoclavarea) se rea- lizeazd in aparate speciale denumite autoclave. Ele sint nigte cazane care se pot inchide ermetic si in care, printr-o sursd caloricd (gaz sau cu- 19rent electric), se poate realiza 0 atmosfera de vapori incdlziti la 100—135°C si sub presiunea de 1—2 atmosfere. Fiecare atu- toclav trebuie sf fie prevazut cu un _ma- nometru care indici presiunea interioara si indirect temperatura (cunoscind cé unei atmosfere fi corespunde temperatura de 120°C), Este important de subliniat c& prin intermediul unui robinet special, fnainte de sterilizarea propriu-zisa trebuie elimi- nat aerul din interior, presiunea realizin- du-se pe seama vaporilor de api existenti {in cazan. Pentru evitarea eventualelor ac- cidente cauzate de suprapresiuni datorite nesupravegherii, autoclavele sint prevzu- te si cu supape de siguranta. Durata ne- cesar sterilizarii este variabilé cu presiu- nea realizati: — la 0,5 atmosfere (112°C) — 90 de minute; — la 1,0 atmosfera (120°C) — 30 minute = 1a 20 atmosfere (134°C) — 10 minute. Prin autoclavare se sterilizeazi majoritatea mediilor de cultura, sti- claria, aparatele de sticlé cu garnituri de cauciuc, materiale de protectie, solutiile si toate materialele infecte. Acestea se ‘asazi in cutii de tabla cu Pereti géuriti, in cosuri din plasa de sirma (flacoanele cu medi sau solutii, eprubetele) sau in casolete (vata, materiale de protectie). Reci- pientele confinind lichid, pe lingé dopul de vata, trebuie sa fie legate 1a gurd si cu hirtie. Recipientele al cdror dop a fost aruncat in cursul ste- rilizarii, nu se considera sterilizate. Presiunea si implicit temperatura din interiorul autoclavului_sint controlabile cu ajutorul manometrului, dar se poate recurge la nevoie si la determindri cu ajutorul unor substante care la temperatura came- Tei sint solide dar peste anumite limite, cunoscute, se lichefiazd. In acest scop, ele se introduc in tuburi capilare, inchise la flacdra, care se pun {in autoclav odata cu materialele de sterilizat si se verificd dacd, la des- chiderea capaculut, ele sint sau nu in stare lichida, aceasta indicind atin- gerea temperaturii dorite. Dintre substantele cele mai folosite pot fi amintite urmatoarele, impreund cu punctul corespunzitor de topire: aci- dul oxalic 101°C, benzonaftolul 110°C, chinina 116°C, sulful (floarea de sulf) 120°C, acidul benzoic 121°C, urea 132°C. In vederea sterilizarii materialele trebuie pregitite corespunzaitor: — pipetele gradate se astupa la extremitatea prin care se aspira, ‘cu un dop de vat, dupa care se invelesc in hirtie sau staniol; — Placile Petri si mojarele se impacheteazd in hirtie de ambalaj; — bucitile de feava din care se confectioneaza pipetele Pasteur se stupa la ambele capete cu dopuri de vatd gi se ambaleazé in hirtie, ‘cite 20—30 intr-un pachet; — baloanele se astupd cu dopuri de vata, se inveleste gitul cu hhiptie 51 apoi se leaga cu sfoara; — la aparatele de filtrare se impacheteazi in hirtie filtrul si tu- bulura laterala a balonului; 20— eprubetele se astupa cu dopuri de vaté i tifon, se invelese in hirtie gi se pun in cosuri de sirma; — instrumentele metalice invelite in tifon, se pun in plici de sticlé care, la rindul lor, se invelesc in hirtie; se poate face, si este preferabil, sterilizarea in cutii speciale nichelate, prevazute cu orificii care, la scoa- terea din autoclay, se vor inchide; — maierialele moi (vata, tifon, pinza) se sterilizeazA in casolete, ale cdror orificii se inchid la scoaterea din autoclav. Sterilizarea prin tindalizare (incalzire fractionat) se foloseste cind substantele de sterilizat au un grad de termolabilitate, care le face ca la 120°C si se denatureze (medii de cultura continind zaharuri sau sub- stanje proteice macromoleculare cum ar fi oul, serul coagulat etc.). Ste- rilizarea se face la temperatura suportata de ‘materialele respective, de mai multe ori (2—3 ori) consecutiv, timp de o ord, la interval de 24 de ore. Aga de exemplu, tindalizarea'mediilor continind zaharuri se face a 100°C, a serului coagulat sau a mediilor cu ou, la 70—80°C. Ea se realizeazi in autoclavul cu capacul nestrins sau deschis, sau in dispozi- tive speciale care realizeazd conditiile dorite si permit’ in acelasi timp controlul lor. Prin acest procedeu, la prima incalzire se distrug formele vegetative ale bacteriilor. Formele sporulate se transforma in vegetative prin ter- mostatare la 37°C care, prin cea de a doua incalzire se vor distruge. Cea de a treia incilzire va asigura sterilizarea completa, prin distrugerea uultimelor forme vegetative rezultate din germinarea sporilor rimasi dupa a doua incalzire, ‘Sterilizarea prin pasteurizare se foloseste pentru lichide, ea reali zind numai distrugerea formelor vegetative, nu si a sporilor. Ea se Poate face la 60—65°C timp de 30 minute (pasteurizarea joasé), Ia 70—75°C timp de 10—20 minute (pasteurizare medie) sau la 85—90°C timp de citeva secunde, urmati de o rdcire bruscé (pasteurizare inalta). In mod curent, aceasta’ metoda se foloseste in industria laptelui si are a scop distrugerea germenilor patogeni, fara a altera valoarea alimen- tard si vitaminele continute. b) Sterilizarea prin radiafii Poate folosi razele ultraviolete si radiafiile gamma. Sterilizarea prin raze ultraviolete se foloseste pentru suprafete plane si incdperi (mai ales boxe sterile). In acest scop servese lampile speciale de diferite intensitati, ce dau radiafii cu o lungime de unda intre 2400 si 2800 A. Numarul acestor limpi depinde de marimea suprafefei sau volumul incaperii de sterilizat. Durata iradierii este variabild, in general de citeva ore pind la 24 de ore. Actiunea lor bactericidd se limiteazd la formele vegetative. Sterilizarea prin radiafii gamma se foloseste in special pentru vasele de material plastic (placi Petri). > 9 Ste area prin filtrare Sterilizarea prin filtrare se foloseste in special pentru gaze sau chide care trebuie aduse in postura de a fi libere de germeni (bacterieni si micotici). In cazul lichidelor, metoda se foloseste mai ales cind e vorba de solutii care contin substante alterabile prin cildurd (toxine, lichide diologice, medii de cultura). Virusurile trec prin porii acestor filtre, ‘asa incit metoda nu poate fi folositd pentru a debarasa aceste lichide de anasemenea agenti (exist totusi filtre care refin unele virusuri, fapt de- pendent de porozitatea filtrului si de diametrul virusurilor). | Filtrele ce se folosesc in aceste scopuri pot fi de mai multe tipuri: f — Chamberland sint confectionate din porfelan ars, au forma unor $ | luminari (bujii) si sint notate cu Ly, Ly...Lq, Porii cei mai mici find in cazul filtrului notat cu L;; i — Berkefeld fabricate din F pimint de infuzorii sau kiselgur — fille Seitz sint prepa rate din amestec de celuloza si azbest, sub forma de plici fil- traversarea placilor filtrante se face nu prin aspiratie, ci prin presiune; aceste filtre sint no- i tate in functie de porozitate cu i EKS, EKS,, EKS, si EKS, (fil-Fig. § — Piltrn de sticlt adaptat prin dop Pig. 6 — Pack filtranth oa de caucine ‘carcasdmetalicd trele EKS, retin bacteriile fiind permeabile pentru virusuri, iar EKS, re- fin si virusurile de dimensiuni mari); se folosesc la separarea unor toxine bacteriene, sterilizarea unor seruri sau lichide contaminate cu bacte membranele odatd folosite nu mai pot fi refolosite; — filtrele de sticla se prezinti sub forma de plici filtrante montate fn pilnii, de diferite forme gi care se adapteazd 1a baloane cu tubulurd laterala ‘sau dispun de dispozitive proprii de etangeizare; cele mai frec~ vent folosite sint filtrele tip Schott, notate cu G, pind la Gs, acestea din urma avind porozitatea cea mai find; aceste filtre au avantajul ci nu influenjeazd pH-ul lichidelor filtrate si se pot folosi vreme indelungata, daca sint ingrijite corespunzétor dupé fiecare folosire; sterilizarea lor se face numai la autoclav; — membranele filtrante se pot confectiona din diferite materiale (colodiu, celuloz4 sau material plastic) si se folosese in special in viru- sologie, cind sint necesari pori de dimensiuni foarte mici (5—3000 mili- microni). Deosebit de rispindite au devenit in ultimul timp membranele fil- trante celulozice de tip ,.Millipore* (Millipore Intertech Corp. U.S.A.). Ele au pori de diferite dimensiuni, sint foarte usor de manevrat si servese in scopuri foarte variate: debarasarea unor lichide de germeni, deter- mindri cantitative de germeni din lapte, produse lactate, ape potabile sau reziduale. Dupi scopul in care se folosesc ele se pot adapta la siringi, la vase racordate la pompe de vid sau la pompe de presiune ‘si au capacitati variabile. 23,anon 1H yp amis ap uss — ¢ hrTabetul 7 Prineipatele substanfe ehimiee eu aetiune dezinfectantd we eet Denumica atten ‘Seopa fs cre ete ft 1 | cia acetic 1% Dezinfecfia pipetelor sl lamelor in laboratoarele care fy second co sud ermenor "ain penal Lepto- 2 | Alcoot etille 70° Dezinfeefia caren saliitor ‘3 | Alcoot medicinal ‘ 4 | Apa oxigenati 1% Dezinfectia mucoaselor 5 | Bicromat de potasiu 8% | Dezinfectia pipetelor tntrebuingate 6 | Cloramina 8) Desinfectia mliilor (ol. 1%) D) Desinfectia "meselor “de laborator, exgtilor de animale (cone. 5%) b) Desinfectil mal riguroase ale mlinilor 8 | Creotina 510% Dezinfectia adiposturior — in cazul bolilor pro- } vocate de agentt nesporulaji (dezinfectant slab) 9 | Clorara de var (2—5% clor | Desinfectia curenté a raj activ) 10 | Detergenti aiergt ‘a) Dexinfectia miinilor (ol. 0, 1) Spilarea stcliriel 11 | Forme! — sol. 409 a) Desinfectia objectelor din sticll, falantd, ttvi de metal dia Iaborator (in cone. de 5%) ) Dezinfectia grajdurllor, eurfilor, obiectelor, ta Aiferiteinfecft bacteriene 3h viaie (sl. 5%) «) Inactivarea cultarilor mleroblene in vederea,pre- patie unce vaceinar! (cone. 0,1 —2°,) 12 | Hilroxid de odin Goda | a) Desai mobilieratal, Gopumclclor coplor de counted) ‘imal (ome, 053%) si 1) Desncfin siapotarion de animale ga cart j ” for im cae do epootl one. 2-380)" 13 | Fenol (acid fenle) 9) Desinfecfia diferitelor oblecte din sticlt, porfelan, metal ete. (bol. 5%) +) Conservarea seratilar mane (cone. 05%) Dezinfeetia mucoaselor Dezinfectia mucoaselor ‘Dezinfectia locurilor de punctie 7 | Clorara mercorics 4) Desinfectia mesclor gl altor eategoril de mobilier (Gubtimat eoroste) din sticld, falanga, Lavi de ‘material plastic ete. (cone. 0,1%)Sterilizarea prin agenti chimici Foloseste diferite substante, care, prin insusirile lor fizico-chimice, au un efect nociv asupra microorganismelor, ducind la distrugerea lor ‘dupa perioade variabile de contact. Unele substanfe antimicrobiene sint utilizate pentru a impiedica dezvoltarea bacteriilor intr-un mediu de cultur sau lichid biologic, sau pentru distrugerea completé a lor (in primul caz e vorba de acfiune bacteriostaticd gi se obtine prin doze reduse, iar in cel de al doilea — actiune bactericida si se obfine prin doze mari). ‘Substanjele chimice antimicrobiene au capacitatea de a fi selective in sensul c& pot exercita 0 actiune bactericidd pentru unii germeni, bac- teriostaticd sau indiferenta pentru alfii. In compozitia unor medii de cultura selective sint inglobate sub- stante ca verde de malahit, verde briliant, cristal violet, rosu de Congo, care inhiba cresterea unor speci bacteriene, favorizind dezvoltarea al- tora. ‘Pentru distrugerea germenilor in mediul inconjurator, substantele ‘chimice cele mai frecvent folosite sint cele prezentate in tabelul 1.Tehnica recolfarii, ambalarii si transportului materialelor patologice pentru examene de laborator Materialele patologice care servese pentru diagnosticul de laborator al diferitelor stari de boal la animale sint foarte diferite in functie de natura bolii, de faza evolutivé in care se afl, in functie de starea ani- malului de ‘la care provin i de posibilitdfile materiale de examinare. Medicul veterinar, atit cel de laborator, cit si. practicianul, trebuie si ‘cunoasca temeinic’ce fel de materiale patologice se preteazi pentru diag- nosticul fiecarei entitati morbide, alegind intotdeauna pe acelea care oferd in cea mai mare masurd sansa de a stabili un diagnostic real, precis si cit mai precoce. Pentru. medicul de laborator sint imperios necesare aceste cunostinte, pentru a fi capabil si se adreseze in cursul examenelor ce le efectueaz’, materialelor care sint cele mai indicate si care-i permit si ajunga la o concluzie intr-un timp cit mai scurt. Pentru medicul practician este necesar s& cunoasci aceste probleme trimite spre examinare materialele cele mai adecvate gi in condifii vate, care sé permit efectuarea probelor de laborator fn vederea pre- cizdrii diagnosticului In functie de examenele care se efectueaz se trimit 1a laborator materialele ardtate in continuare. 1. Pentru examenul bacterioscopie si bacteriologic. Singele se preteazd pentru aceste examene sub form de frotiuri sau ca atare. Frotiurile se vor efectua intocmai ca in cazul examenului hematologic, pe lame obisnuite de microscop. Dupé uscare, daca e nevoie 8 fie transportate, se va avea grija ca suprafetele lamelor s& nu vind in contact intre ele (se pun in cutii separate, sau se izoleazA una de alta cu ajutorul unor bete de chibrit sau cu hirtie). Pentru hemoculturd, se recolteazA prin puncte venoasa, dupé prea- labila asepsie, 5—10 ml singe, in funclie de specie si talia animalului, in eprubete sau sticlufe sterile. Daca sint mai multe probe, ele se vor individualiza prin numerotare. Transportul pentru lucrérile de insimin- fare se va face cit mai urgent. Lichidul cefalorahidian se va recolta cu ace de sering& sterile in eprubete de asemenea sterile, pe un anticoagulant (de exemplu hepa- rind). Urina se recolteazA in recipiente sterile. De la femel este prefera- bila recoltarea prin cateterism, in acest fel evitindu-se ca germenii de pe cfile urinare si falsifice rezultatele examenului. Urocultura este de 27dorit sa se practice si ea cit mai precoce dupa recoltare. Secrefiile (oculare, nazale, vaginale etc.) se vor recolta ci tampoane sterile regatite in prealabil, special in acest scop. Ele sint fixate pe baghete de sticla sau me- tal, care, la rindul lor, sint introduse in i ) eprubete de marime corespunzaitoare si ste- rilizate prin autoclavare. Lichidele patologice de punctie se vor recolta intocmai ca singele, in epru- bete sau recipiente sterilizate. Organele se vor trimite de preferinta intregi sau fara a fi scoase din cadavrul respectiv, pentru ca operafiunile de insi- minfare $4 se poata face in condifii cit mai une. Se infelege ca si in acest caz trans- portul trebuie s& se faci in conditii cit mai bune $i rapid, pentru ca insimintarile 84 fie facute inainte de invadarea cada vrului de germenii saprofiti intestinall. Cel mai bun lucru este si se trimita (in cazul animalelor mici §i mijlocii) animalele in stare preagonicd, fapt care permite recol- tarea tuturor probelor necesare, in condi- {ii optime. Daca nu este posibil acest lu- cru, Se vor recolta, cu instrumente sterilizate prin flambare, porfiuni de organe care se vor trimite in recipiente sterilizate, pentru’ insimintari. Laptele se va recolta in eprubete sterile, avindu-se grija si se in- lature primele picituri de pe canalul galactofor, acestea continind ger- meni ajungi aici din mediul extern, prin orificiul papilar. 2. Pentru examenele virusologice se pot recolta materiale patologice diferite, in functie de entitatea morbid in cauzd: singe (numai in faza de viremie), secretii (mai ales in bolile respiratorii, cum sint rinotraheita bovinelor, parainfluenta bovinelor, adenoviroze eic.), fecale (infectii cu enterdvirusuri, adenovirusuri, virusul diareei virotice a bovinelor, virusul gastroenteritei infectioase a ‘porcinelor etc.), organe (turbare, boala Tui Aujeszky, hepatita virotica a ciinilor, leucoza aviara etc.) lichidele ve- iculare (febra aftoasé, exantemul veziculos al porcului), epitelii_mu- coase sai cutanate (febra aftoasd, exantemul veziculos), cruste cuta- nate (variole). Esentialul este insi ca ele si fie prelucrate cit mai precoce dupa recoltare. Daca este necesar transportul, acesta se va face numai in termose cu gheati si in recipiente sterile, pentru a evita contaminarea cu germeni bacterieni. Congelarea constituie un mijloc si mai eficient. Se poate recurge si la trimiterea acestor produise patologice in ser fizio- logic glcerinat 50% neutru si steril, care conservi; majoritatea virusu- rilor. 3. Pentru examenul histopatologic se va recurge la recoltarea ma- terialelor cit mai repede dupa moartea sau sacrificarea animalelor. Aceas- ta din catiza rapiditatii cu care se instaleazi fenomenele aterative post Fig. 10 — Tampoane sterile peatra ecoltarea de_secrefii patologice 28mortale. In unele cazuri se procedeaz la recoltarea prin biopunctie sau prin biopsie. Recoltarea se face direct in solutia fixatoare (de obicet formol 10°74; fn cazul turbar in boredinage care au pe fund 0 rondela de hhirtie de filtru sau vata, menita s4 impiedice aderenta pieselor la fundul borcanului* si si asigure procesul de fixare, din toate partile. Bucatile de organe recoltate nu vor trebui sa fie mai groase de 5 mm pentru ca fixatorul si pitrunda in profunzime. Este deosebit de important a se recolta cele mai adecvate fesuturi pentru diagnosticul urmérit. Cunoseind localizarea leziunilor cu cea mai mare valoare diagnosticd, vor fi re- coltate acele organe in care acestea se giisese cel mai frecvent. Asa de exemplu, pentru diagnosticul turbirii se vor recolta porfiuni din. sis- temul nervos central si anume cornul Iui Amon, scoarja cerebral si cerebel, pentru diagnosticul laringotraheitei infectioase a pasérilor se vor recolta portiuni de mucoas traheala, pentru. diagnosticul_histopa- tologic al variolei portiuni cutanate sau de mucoasé cu leziuni, pentru diagnosticul anemiei infectioase a calului portiuni de ficat ete. Este de asemenea necesar si se recolteze segmente de organe cuprinzind atit Portiuni modificate cit si fesut sindtos pentru ca, in preparatele ce re- zulté, SA se poatd face comparatia intre fesuturile' afectate si cele nor- male. 4. Pentru examenul hematologic recoltarea singelui se face dupa tehnici si locuri de electie variabile, in functie de specie. Ca principiu general, dupa asigurarea contentiei, se procedeazi 1a efectuarea toaletel Tocului de electie, care consta in tunderea sau raderea parului urmatd de dezinfectia locului cu un tampon imbibat in alcool-eter. Se asteapta Pind cind locul este perfect uscat si numai dupa aceea se face punctio- narea sau sectionarea. Pentru punctionare si sectionare se vor folosi instrumente sterilizate gi perfect uscate (ace de seringd, lantete Franke, foarfeci, bisturie etc.) Nu se va folosi acelasi instrumentar pentru recoltarea singelui de la mai multe animale, succesiv, atit pentru a evita erorile de determinare, cit si pentru a evita transmiterea in serie a unor boli De la speciile mari (bovine, cabaline, ovine) singele poate fi prelevat prin punctionarea venei jugulare, cind e vorba de cantitéti mai mari, sdu a venei angulare a ochiului, venei auriculare medii, a suprafetei interne a buzelor precum si prin sectionarea marginii pavilionului urechii a pielii de la baza cori, cind e vorba de cantitati mi De la pore, singele poate fi recoltat prin punctia confluentei jugu- larelor, a venelor mari auriculare, prin sectionarea marginilor conchiei auriculare si prin amputarea virfului cozii. De la cline se poate recolta singe din jugulare, venele ulnare sau safene, prin sectionarea marginilor conchiej auriculare, De la pisici, iepuri, cobai se recolteazd singe prin sectionarea mar- ginilor urechii, punctia venelor auriculare sau punctia cardiaca. La sobolani $i soareci, se practicd in mod obignuit sectionarea vir- fului cozil sau a arterei femurale. Recoltarea singelui de 1a iepure, cobai, soareci si sobolani, se mai Poate face si din sinusul orbital, dupa metoda inifiaté de Halpern 29(1954). Se contentioneaza in aga fel animalul incit s4 se realizeze si staza vaselor submaxilare dup care, cu ajutorul unui tub capilar de sticla, avind diametrul exterior de 1—1,2 mm, iar cel interior de 0,6—0,8 mm sau a unei pipete de sticld bine efilata, care se introduc sub pleoapa 3-a, orientate ugor oblic, spre planul ‘sagital al capului, se patrunde fn sinusul orbital, pe o adincime de cca 1 cm. Singele care se scurge in jet continua sau in picdtura prin lumenul capilarului de sticld, se va ‘colecta intr-un recipient cu anticoagulant. Metoda este practic’, ‘re~ lativ comoda si nu presupune riscuri (hemoragii ulterioare). De la pisiri, singele se poate recolta prin sectionarea crestei, bar- bitelor sau a membranei interdigitale (la palmipede), prin punctionarea venei ulnare sau a arterei brahiale, pe marginea anterioaré a aripii, sau prin punctie cardiacd. Indiferent de locul si modalitatea de prelevare a singelui, trebuie avut grijé si nu se traumatizeze zona de electie, si se evite pe cit posibil stressarea animalelor prin contentii brutale, punctiondri repetate etc. Pentru a reduce la minimum modificarea unor parametri hematologici. Cantitatea de singe ce se va recolta depinde de numarul si felul exame- nelor hematologice care urmeazi si se efectueze. Daca singele trebuie transportat la laborator in vederea efectudrii diferitelor examene sau daci natura acestora impune folosirea singelui necoagulat, recoltarea acestuia se va face pe un anticoagulant. Dintre substanfele anticoagulante cu cea mai mare utilizare fac parte: EDTA (acidul etilendiaminotetraacetic) cunoscut in comert sub ferite denumiri — Versen, Titriplex, Sequestren, Komplexon III etc. — este unul dintre cei mai buni anticoagulanti pentru faptul c& nu pro- duce modificéri ale singelui nici dupa un contact prelungit (citeva zile), cu conditia mentinerii probelor 1a o temperatura sc&zuté (5°C). Dintre numeroasele siruri pe care le formeazd, se pare cé cele mai multe ca- litati le intruneste sarea dipotasicé (K,EDTA) care conserva perfect mor- fologia celulelor sanguine. Se fac solufii in ser fiziologic sau apa dis- filatd, in concentrafit diferite (1%, 5%, 10%/). Recipientele cu anticoagu- lant Pot fi pregitite din timp gi pistrate vreme indelungaté féré ca an- ticoagulantul sé se altereze, dupa cum urmeaz: K,EDTA 1,0 g Ser fiziologic 0,85% 100,0 mi Din aceasta solutie se repartizeaz in fiecare recipient (eprubete, sticlute de penicilind etc.), cite 0,2 ml lasindu-se apoi la temperatura camerei ca apa si se evapore. Cantitatea de reziduu anticoagulant uscat rimas in eprubetd, dupa evaporarea apei, este suficienta pentru a face necoagu- labili 2 ml de singe. In general proportia de EDTA utilizat in acest scop este de 0,5—1,0 mg/ml singe. Este indicat s& se foloseasci EDTA pentru oricare test hematologic, inclusiv pentru examenul morfologic al sin- gelui. Amestecul de oralati (Wintrobe). Intrucit folosirea individualé, a unuia sau altuia din oxalati, determina modificdri ale unor componente sanguine, fie sub aspect cantitativ, fie calitativ, afectind fn consecinta 30rezultatele examenului hematologic, s-a convenit asupra utilizirii unui amestec de oxalafi, care se poate obtine din: — Oxalat de potasiu 08 g — Oxalat de amoniu 2 g — Api distilata 100,0 mi Din acest amestec se utilizeazi 0,1 ml pentru fiecare 1 ml singe. Ames- tecul se repartizeaz in recipiente in cantitate de 0,2 ml sau 0,9 ml (res~ pectiv pentru 2 si 5 ml singe), ldsindu-se la temperatura camerei, ever tual la termostat a 37°C (nu sint indicate temperaturi mai mari céci substantele din amestec se descompun), pind cind apa se evapora com- plet, raminind numai o pulbere alba.’ Recipientele astfel pregatite, se astupa cu dopuri de cauciuc $i pot fi pastrate timp indelungat. Desi amestecul de oxalafi (Wintrobe) intruneste calitafi superioare fata de fiecare oxalat in parte, el are totusi dezavantajul cd nu poate fi Utilizat cu bune rezultate pentru studiile de morfologie a singelui, in- trucit produce modificari ale celulelor sanguine (vacuolizari, picnoze, aglu- tinarea trombocitelor etc.), find, din acest punct de vedere, inferior EDTA-ului. Se poate folosi ins’ cu rezultate eficiente in. determinarea ‘VEM, VSH, hemoglobinei, numaratoarea globulelor rosii si albe. Heparina este un anticoagulant natural. Se poate folosi in concen- tratie de 0,1—0,2 mg/ml singe pentru anumite determindri hematologice, dar nu $i Pentru examenul morfologic al singelui, pentru aceleasi con siderente pe care le-am mentionat la oxalafi. La ora actualé, atit oxalatii cit si heparina tind a fi inlocuiti cu EDTA. Rezulté, din cele prezentate, cd alegerea tipului si proportiei de anticoagulant trebuie facutd cu grijé, in raport cu testul care urmeaz& a fi executat si nu la intimplare, pentru a putea conta pe rezultate cit mai corecte. 5, Pentru examenele serologice se va recolta singe in eprubete sau sticlufe sterile, in cantitati variabile in functie de specie (10 ml la ai male mari, 1—2 ml la pastri), avindu-se grija de a se numerota cu aten— tie tuburile si de a se identifica animalele de la care provin probele. Dupa recoltare, singele se va ldsa la temperatura camerei timp de 30—60 mi- nute, pentru a se coagula, dupa care se va face decolarea cheagului de Pe Peretii tuburilor, cu ajutorul unor baghete de sticld sterile sau a lunor-anse de sirma’flambate dupa fiecare proba. Apoi probele se pun la frigider pentru retractarea cheagului si pentru o mai bund exprimare a serului; serul astfel exprimat se poate folosi in reactiile serologice. 6. Pentru examenele micologice recoltarea se face conform indica- fillor de la capitolul ,,Metode si tehnici de laborator pentru diagnosticut micozelor“. 7, Pentru examene biochimice ale singelui se vor respecta aceleasi principii de recoltare ca cele de la examenul serologic. Pentru glicemie recoltarea se va face pe fluoruré de sodiu (citeva cristale), pentru a reveni glicoliza.Examenul microscopic Urmareste punerea in evidenta a agentilor anjmati (bacterieni, pa- razitari) prin examinarea la microscop a frotiurilor sau a preparatelor, ca atare, sau colorate prin diferite metode. Pentru aceasta se folosese diferite produse: ‘Singele se preteazi pentru punerea in eviden{d a germenilor pato- geni in bolile care evolueazi cu septicemie. In cursul multiplicarii, ef sint vehiculafi de torentul circulator in toate fesuturile. De obicei este vorba de infectii cu evolutie acuté sau supraacutd si mult mai rar de cele subacute si cronice, caz in care germenii se gisesc in singe pentru perioade scurte, numai in anumite faze. In stari de bacteriemie, traduse prin prezenfa temporard a germenilor eliberati din focare latente de infectie si care nu se insofesc de manifestari clinice, proportia lor in singe este scdmuta. Cele mai frecvente boli in care germenii pot fi gisiti si decelati in singe sint: antraxul septicemic, pasteureloza, salmoneloza si colibaciloza septicemica, precum si parazitozele endoglobulare (babesioza, babesieloza si anaplasmoza la taurine si ovine, babesioza si nutalioza la cabaline etc.). ‘Momentul optim pentru decelarea’acestor agenti este p2rioada de pirexie, cind febra este maxim sau, dacd este posibil, chiar inaintea unui fri- ‘son. Frotiurile din singe se fac de la animalele in viata sau, mai rar, dupa moarte. Grija care trebuie avutd in ambele cazuri este aceea de a evita rdspindirea in mediul inconjurétor a singelui si deci, crearea de surse de infectie pentru alte animale. Se vor efectua frotiuri subtiri, uniforme, care se vor colora apoi prin metoda Gram sau Giemsa si se ‘Vor examina cu obiectivul de imersie. Lichidul cefalorahidian ofera date orientative pretioase in infectiile acute si cronice septice ale meningelor (stafilococice, streptococice, lep- tospirice, colibacilare, tuberculoase etc). In acest scop se vor efectua 3 frotiuri din sedimentul lichidului (sedimentul spontan sau de centri- fugare) care se coloreazi prin metoda Gram, Giemsa, Ziehl-Neelsen. Streptococii hemolitict vor apirea sub forma de coci, Gram pozitivi, izo- afi, perechi sau in lanfuri scurte, si se pot foarte greu diferentia de stafilococi, flind necesard diferentierea culturald. Stafilococii apar de obicei in grémezi. In meningitele tuberculoase vor apirea acidorezistenti eu morfologie caracteristicd, in frotiurile colorate prin metoda Ziehl. 32Laptele da indicii asupra eventualelor procese inflamatorii ale glan- dei mamare, atit prin modificarile insugirilor sale fizico-chimice, cit i prin flora bacteriand ce poate fi pus in evidenta in sediment. In acest Scop, se va centrifuga din laptele suspect o cantitate suficienta (10—20 ml), iar din sediment se vor face frotiuri care vor fi colorate dupa prealabila degresare in eter, cu metodele obisnuite (Gram, Giemsa, Zieh) in functie de suspiciune. Prin acest mijloc se poate preciza diagnosticul mamitelor stafilococice, streptococice, tuberculoase (la vaci), gangrenoase (la oaie). Secrefiile genitale constituie substratul pentru diagnosticul bacterio- scopic in procesele inflamatorii de la nivelul cAilor genitale gi in special de la nivelul endometrului. In avortul produs de chlamydif la oi de exem- plu, se vor face frotiuri prin amprent din mai multi carunculi placentari, din mucusul de la suprafata avortonului si din pulmonul sau continutul acestuia (din acestea din urmé sansele sint mai reduse), iar dupa fixare se vor colora prin metoda Stamp $i se vor examina cu obiectivul de imersie pentru evidentierea corpusculilor elementari. Acestia prin metoda amintita ‘par colorati in rogu-aprins in timp ce restul bacteriilor se coloreaz in verde, albastru sau violet. Se poate face si colorarea prin metoda Macchia vello in acelasi scop. In brucelozi, frotiuri facute din carunculii placentari, din confinutul cheagului avortonului, scurgerile losiale ale vacii care a avortat, din sper ‘ma taurilor suspecti, ‘colorate prin metode elective (Kozlovski, Késter) pot pune in evidentd germeni izolati, grupati sau inglobafi in celule fa- gocitare, coloraji in rosu, care contrasteaza cu restul elementelor celu- lare. Pentru alte tipuri de infectii, punerea in evidenté, in frotiuri, a ger- menilor fn cauz presupune utilizarea metodelor curente. Aga de pilda, fn salpingitele si metritele de natura tuberculoasé, in secretiile genitale se vor putea pune in eviden{é germenii acidorezisten{i, liberi sau In- globati, cu o morfologie caracteristica. Secrefiile purulente pot fi examinate la microscop in suspiciuni de actinomicozd, actinobacilozi, gurmé, limfadenita cazeoasd, dermatitd no- dulara etc. in aceste cazuri se va prefera prelevarea de materii puru- lente din formatiuni specifice, nedeschise (chisti, formatiuni pe cale de abcedare) in care nu au intervenit alti germeni de infectie secundard. In acest scop, se va face toaleta si dezinfectia locala, urmata de punctia si extragerea’de lichid purulent, din care se vor face frotiuri si se vor colora adecvat. In cazul actinomicozei si actinobacilozei se va recolta Puroiul intr-o eprubeté si se va agita cu o solutie de carbonat de sodiu, Pentru dizolvarea mucusului, apoi se toarnd continutul intr-o placd Petri pentru separarea granulelor formate de tufele actinomicotice si fuctinohacilare caracteristice. Se iau apoi 1—2 asemenea formatiuni, se Pun intre doud lame si se preseazi ugor, dupé care se examineazi direct Ia microscop sau se coloreaz prin metoda Gram. Actinomyces bovis va apiirea sub forma de filamente Gram pozitive, fine, ramificate In actinobacilozé se vor pune in evidenga tufe caracteristice in ro- zeta, de dimensiuni mici In dermatita nodulard, pe frotiuri practicate din continutul puru- ent al nodulilor dermici se pot pune in evidentd, dupa colorarea prin metoda Ziehl—Neelsen, germeni acidorezistenti, in’ numér redus, izolati, mai rar fagocitati. 33,In limfadenita cazeoasi a oii prezenta, in frotiurile practicate din ganglionii afectati i colorate prin metoda Gram, a unor bacili fini, poli- morfi, Gram pozitivi izolafi sau in grémezi confirma diagnosticul. Urina constituie un material, care supus examenului bacterioscopic furnizeazdi in putine cazuri date importante, daté fiind posibilitatea con- taminari ei pe traiectul cailor urinare, In vederea examinarii pe linga recoltarea in conditii de asepsie pe cit posibil mai riguroase, se impune a se face o centrifugare si din se ment, practicarea unor frotiuri, gi colorarea lor dupa metodele uzuale. Trebuie specificat ci prezenta germenilor acidorezistenti, mai ales cind acestia sint in numar redus, trebuie interpretaté cu prudena, deoarece Ja nivelul cailor urinare se gasesc uneori si micobacterii nepatogene (mai ales M. smegmatis) care sint saprofite ale mucoaselor genitale. In cazul leptospirozei, se poate decela prezenfa leptospirelor in urin& in cea de a doua fazi a bolii — leptospiruria, In acest scop se foloseste numai urina foarte proaspata, leptospirele lizindu-se destul de repede in pH-ul acid al urinei, Dupa centrifugarea urinei se examineazd sedi mentul intre lama i lamelé direct, necolorat, in cimp intunecat si mai rar dupa o colorare corespunzatoare. Fecalele se preteazi mai putin pentru acest examen, dat fiind poli- morfismul floret bacteriene care le populeazi. Totusi, in unele boli se foloseste cu rezultate bune. Astfel, in enterita paratuberculoasd a bovine- lor, frotiuri efectuate din materii fecale diareice sau, mai bine, din feca- ele cu mult mucus si epitelii intestinale, permit punerea in evidenta a agentilor etiologici, fapt care, alaturi de semnele clinico-epizootologice concura la precizarea diagnosticului. Trebuie mentionat ins cd, dato- ritd periodicitatii cu care se elimind germenii in acest caz, este necesar ca asemenea examene si se repete la interval de citeva zile. In perioadele ind eliminarea lor este activa, ei pot fi observati cu usuriné, datorita numérului lor mare gi dispozifiel in grimezi. Maj usor de decelat in fecale sint bacilii tuberculozei aviare, ei eli minindu-se in cantitati imense, mai ales cind exista si localizari intesti- nale, dar si in cele hepatice, cind ei sint deversai in lumenul intestinu- lui pe cale biliard. In acest caz, se face un frotiu fie direct din materiile fecale, fie, preferabil, din sedimentul de centrifugare objinut din filtra~ ul (prin vaté sau tifon) suspensiei de materii fecale. Aceasté din urma solujie are avantajul cd permite concentrarea materialului de examinat dintr-o cantitate mai mare de fecale, rezultatele fiind mai sigure. Pen- tru aceasta se recolteazi materiile fecale de la pasarile suspecte, se sus- ensioneaza si omogenizeaza bine in ser fiziologic, dupa care se filtreazé prin vatd sau chiar prin hirtie de filtru, pentru a obtine un lichid de- barasat de materiile alimentare. Filtratul se supune centrifugarii, 10 mi- nute la 3000 t/minut si din sediment se fac frotiuri care apoi se colo- reaza prin metoda Ziehl—Neelsen. In disenteria porcului, produsi de Treponema hyodisenteriae, pre- arate efectuate din fecalele porcilor bonavi sau, in cazul cadavrelor, din raclatele de mucoasé de la nivelul colonului spiralat, examinate di- rect, sat, preferabil dup’ colorarea prin metoda Tribondeau—Fontana, Permit evidentierea agentului etiologiae eo as De asemenea, in cazul disenteriei produsd de Vibrio coli, 1a aceeasi specie, preparate ‘din fecale sau raclatele de mucoasa de la nivelul ileo- nului, examinate dupa o prealabild colorare negativa, permit observarea vibrionilor cu aspect curbat, in forma de virgulé sau in S, Tehnica efectuarii frotiurilor Frotiul este un preparat expeditiv, efectuat din diferite produse pa- tologice (singe, lichide patologice, organe etc.), sau din culturi ale dife- ritilor germeni, preparat care permite punerea in evidenta a formatiunilor celulare si cercetarea insusirilor lor morfologice si tinctoriale. Tehnica efectuarii frotiurilor diferé in functie de materialul din care se practiea si de natura germenilor in cauzd. Din lichide frotiurile se realizeazi prin intinderea materialului res- pectiv in strat subtire, cu ajutorul une anse bacteriologice sau a unei Jame slefuite, pe lame de microscop obignuite. Pelicula de material tologic este recomandabil s& fie cit mai find si sd aibé o intindere mai redusi decit marginile lamei de microscop. Daca se presupune cd lichidul respectiv contine o cantitate redusi de elemente celulare, se poate rea- liza o concentrare a acestora prin centrifugare, frotiul practicindu-se din sediment. ‘Daca este vorba de frotiuri ce se practicé din culturi, in cazul med lor lichide, frotiul se face cu ansa bacteriologica, sau cu pipeta Pasteur, direct din 'mediul de cultura, iar in cazul mediilor solide se face prele- varea cu ansa bacteriologica’a unei cantitati reduse de cultura care se emulsioneazi bine intr-o picdturd de api distilatd, pus in prealabil Be 0 lama de microscop bine degresatd si apoi se intinde suspensia in strat subfire. In cazul culturilor in medi solidificate in pozitie verticala (de exem- plu geloza Veillon) se recurge la o pipet Pasteur la care se adapteaz un tub de cauciuc, in aga fel ca el sd permit manipularea pipetel in profunzimea mediuiui sub control vizual. Materialul microbian se recol- teazi prin aspirarea coloniilor izolate, care se gisesc in diferite puncte ale mediului. — Din organe, frotiul se poate realiza in mod diferit in functie de natura acestora. Cel mai freevent se face prin aplicarea unei lame de microscop pe suprafata de sectiune a organului de cercetat, in acest fel riminind 0 impresiune corespunzdtoare formei suprafetei atinse (metoda prin amprenta). Este bine ca pe aceeasi lama si se practice mai multe asemenea amprente, pentru a se putea examina frotiurile mai subfiri (ultimele amprente sint intotdeauna mai fine). Se poate recurge, de asemenea, 1a glisarea nei portiuni de organ, taiati geometric, pe suprafafa unei lame de microscop, avindu-se grija de a nu se atinge marginile lamei. $i in acest caz se preferd frotiurile cit mai fine. Uneori, frotiurile se executé prin strivirea intre dod lame (in ca- ul leziunilor de tip nodular, cum sint cele din tuberculoza). In acest scop, se depune 0 formatiune nodulard suspect pe o lama si cu o a doua se striveste prin compresiune. 35.Fig. 11 ~ Rfectuarea frotiulul din organe In cazul unor organe bogate in lichide (inge, exsudate) frotiul se poate face prin depunerea cu ajutorul unei anse bacteriologice sau a unei pipete Pasteur pe lama de microscop a unel cantitafi reduse de material patologic gi etalarea lui in strat subtire. Frotiurile astfel obfinute se fixeazi dupa uscare la flacdra si se co- loreazd. Fixarea este necesara pentru a realiza o bund aderenté a mi terialului patologic pe lama si implicit evitarea desprinderii de citre so- lufiile colorante a materialuluj de examinat pe de o parte si inactivarea germenilor etalati pe de alta. Fixarea se poate obtine prin mijloace ter mice sau chimice. Fixarea termicd presupune trecerea frotiului uscat de 3—4 ori prin flacdra unui bec de gaz sau a unei limpi cu alcool, avind grija ca lama si fie orientaté spre flacira cu partea opus celei pe care s-a etalat ma- terialul. Viteza de trecere este moderatd, in aga fel ca in final temperatura lamei si fie in jur de 60°C. Fixarea termicé se poate face si prin flambare, punind pe frotiu citeva picituri de alcool etilic, metilie sau alcool-acetona (din bateria de colorare Gram) si dindu-li-se’ foc imediat dupa scurgerea excesului de alcool. Fixarea chimicii se realizeazé prin folosirea unor substante fixatoare (alcool etitic, amestec de alcool etilic, eter si alcool metilic). Acestea se un fn cantitate suficienta pentru a acoperi pelicula de material de pe Jama si se las pind la evaporarea totalé. ‘Trebuie mentionat ci unii coloranti (de exemplu solutia Giemsa din metoda cu acelasi nume sau solutia Ruge din metoda Tribondeau— Fontana) au si capacitatea de a fixa frotiurile, aga incit in acest caz nu maf este necesara fixarea prealabilé. ‘Dupa fixarea si ricirea frotiului urmeazé colorarea, care este bine sf se facd cit mai curind dupa efectuarea frotiurilor. Metodele cele mai importante de colorare pentru examenul bacteriologic Prin colorare se pot stabili unele particularitati morfologice ale ger- menilor (dimensiuni, forma, afinitati tinctoriale) ca si relatiile cu eae turile in care se afla, facilitindu-se in acest fel precizarea diagnosticului.Fig. 12 — Baterie de colorare ‘Metodele de colorare sint diverse gi se aplicd in mod diferentiat, in functie de scopul urmirit. Exist metode care se aplici in mod curent §i metode speciale, mai pretentioase si aplicate numai in anumite situatii. Coloratia Gram se foloseste pentru diferentierea germenilor Gram pozitivi de cei Gram negativi din frotiurile efectuate din diferite tesu- turi sau din culturi microbiene. Este o metoda de baz in practica bac teriologicd. Ea consta in: — colorare cu solutie de violet de Gentiana 1% timp de 1 minut — varsarea colorantului de pe lama — tratarea frotiului cu solufie Lugol timp de 2 minute — decolarea cu amestec de alcool-acetona (4) pina cind ameste- cul ce se scurge de pe lama nu mai este colorat — spilare cu apa de robinet — recolorare cu fucsina diluata 1/10 timp de 20—30 secunde — spalare cu apa de robinet — uscare — examinarea la microscop. Fig. 13 — Daterie de colorare a frotiurlor 37Germenii Gram pozitivi vor apirea colorati in albastru-violet iar cei Gram negativi in rosu. Aceastd diferent de colorare rezulta din fap- tul_ cd germenii Gram pozitivi fixeazi violetul de Gentiana in asa fel fncit prin tratarea cui solutia de alcool-acetond nu se decoloreaz, in timp ce cel Gram negativi se decoloreaz si apar ca urmare colorafi in rou eu cel de al doilea colorant (fuesina diluata). Sporii bacterieni apar sub forma de vacuole. Coloratia cu albastru de metilen (Laffler). Se foloseste pentru pu- nerea in evidenta a germenilor intr-un material patologic, flrd a-i dife- + _renfia sub raportul afinitatii lor tinctoriale. In acest scop se acoperd frotiul fixat cu o solutie de albastru de metilen 3% si, dup& 2—5 minute, se spald cu api, se usuicd, se exami- neazi. Germenii vor aparea colorafi in albastru, uniform. Metoda per- mite si observarea unor particularitati morfologice cum ar fi prezenta capsulei si sporului. Capsula se coloreaza in roz-pal, iar sporul apare sub forma unei vacuole. Colorafia Ziehl—Neelsen, Se foloseste pentru punerea in evident a germenilor acidorezistenti, care nu se coloreazd prin metodele obis- nuite (mai ales micobacteriile) — acoperirea frotiului, fucsind Ziehl — incdlzirea la flacdra pind la aparitia vaporilor gi mentinerea prin Iincdlziri repetate timp de 5—10 minute (e va avea grija ca solutia colo- ranté sé nu fiarbé si sd se completeze in caz ci s-a evaporat de pe anu- mite portiuni de frotiu) — varsarea colorantului — decolorarea cu 0 solutie de acid sulfuric 1/4 sau acetic 1/3, timp de cca 2 minute in prealabil fixat la flacdra, cu solutie de — spilare cu apa — tratare cu alcool absolut timp de 5 minute — spilare cu api — recolorare cu solutie de albastru de metilen minute — spalare cu apa — uscare §i examinare cu imersie. TF to it Fig. 14 — Bacili the fm frotia din organe cu leslaniLa examenul frotiurilor, germenii se pot prezenta colorafi in rosu {acidorezistenji) sau in albastru (neacidorezistenti). Primii fixeaz fucsina Zieh! si nu se decoloreazé sub actiunea acidului, in timp ce secunzii se decoloreazdi sub influenta tratdrii cu acid. Acidorezistena rezida in struc- tura chimicd particulara a peretelui celular al germenilor, in sensul cd in cazul acidorezistentilor acesta fiind bogat in substante lipoide impie- dicd patrunderea acidului decolorant ca dealtfel si a colorantilor (fucsina pitrunde datorita concentratiei ridicate si a cildurii). Pentru acest mo- tiv, germenii acidorezisten{i nu sint colorabili prin metode obignuite. Colorafia ZiehI—Neelsen modificati, in vederea diferentierii mico- bacteriilor patogene de cele saprofite: ~ — colorare cu fucsina Ziehl, prin incal vaporilor, timp de 5—10 minute — varsarea colorantului de pe lama — decolorarea cu acid sulfuric 1% cca 2 minute — spalare cu api — tratare cu alcool absolut timp de § minute — spalare cu apa — colorare cu solutie de violet de Gentiana 19 — tratare cu solufie Lugol timp de 30 secunde — clatire in alcool etilic 96°, de mai multe ori, pind cind lichidul ce se scurge de pe frotiu nu mai confine colorant — colorare cu solufie de verde de malahit 2/, timp de 10 secunde — dlatire, uscare, examinare. Micobacteriile patogene apar colorate in rosu, in timp ce cele nepa- togene vor fi colorate in violaceu. Coloratia Késter. Se foloseste pentru colorarea brucelelor: — fixarea frotiurilor la flacdra — colorarea timp de 1 minut cu solutie alcalind de safranina pre- paratd ex tempore din 5 picdturi solutie apoasé 31 de safranind gi 1,5 ml solutie de KOH 5,674 — ‘spilare cui apa de robinet — diferentierea cu solutie de acid sulfuric 0,054/, timp de 15 secunde — spalare cu api de robinet —recolorare cu albastru de metilen 3% timp de 15 secunde — spilare, uscare, examinare. Prin aceasté metoda electiva, dar nu specifica, brucelele vor aparea colorate in rogu, in timp ce restul elementelor celilare si bacteriene, cu ‘exceptia acidorezistentilor, in albastru. ‘Metoda Koslovski. Se foloseste pentru colorarea brucelelor; — frotiul fixat se acoperd cu 0 solutie apoasi 2% safranind si se in- ccilzeste pind la aparifia vaporilor; se menfine timp de 1 minut la aceasta temperatura; — spilare cu apa — recolorare cu solutie apoasi 1% de verde de malahit sau verde brillant — spiilare cu ap — uscare, examinarea la obiectivul cu imersic Brucelele vor apdrea colorate in roz in timp ce alfi germeni in verde. repetatd, pind la aparitia timp de 30 secunde 39Metoda selectiva recomandata de O.MLS. pentru colorarea brucelelor. Este folosita in special pentru punerea in evidenta a brucelelor in materia lele patologice: — colorare cu solutie de fucsind diluata 1/10 timp de 1 minut — diferentierea cu solutie de acid acetic 0,5%/ timp de 30 secunde — spalare cu apa distilata prin acoperirea frotiului timp de 1—3 mi- nute — colorare cu solutie de albastru de metilen 1% timp de 90 secunde — spillare cu apa distilata — uscare, examinare la obiectivul cu imersie. Germenii din genul Brucella apar colorai in rosu aprins, iar cei apar- finind altor genuri se coloreaza in albastru. Metoda Tribondeau—Fontana. Se foloseste pentru colorarea lepto- spirelor si const in impregnarea argentica. Sint necesare trei solutii: — Solugia Ruge: = formol 2,0 ml = acid acetic glacial 1,0 mi = api distilati 100,0 mi — Solufia mordanta : — acid tanic 50g = fenol 10 g — api distilata 100,0 mt — Solufia argentici Fontana — azotat de argint 5.0 g = api distilata 100,0 mt La 80 ml din solutia argenticd Fontana se adauga picitura cu picd- turd solutie concentraté de amoniac. Se formeazi un precipitat brun, dens. Se adauga amoniac In continuare pind ce precipitatul se dizolva si amestecul devine limpede. La acest amestec se adaugé, tot picaturd cu Picdturd, solutie de azotat de argint 5%, pind cind devine ugor opa- lescent. Astfel pregatita, solutia poate fi pastrata 1—2 luni. Tehnica de colorare: — frotiul, uscat, se acoperd cu solufia Ruge (fixare) timp de 5 mi- se repeti fixarea de 2—3 ori spilare cu alcool — se acoper lama cu solutia mordanta $i se incdlzeste pind la apa~ ritia vaporilor — spiilare cu apa se acoperdi frotiul cu solutie argentica Fontana $i se inciilzeste la flacdra pind la aparitia vaporilor, timp de 20—30 secunde (frotiul trebuie sd ia un aspect metalic brun); se poate repeta impregnatia de 2—3 ori — spilare cut apa distilata — uscare — examinare la obiectivul cu imersie. Leptospirele apar colorate in brun-negru, iar fondul in_galben. Colorarea capsulei bacteriene. Coloratia Giemsa, Pre- paratul se coloreaza timp de 20—80 minute cu solutie Giemsa (diluaté in proportie de 0,5 ml solutie Giemsa la 10 ml api distilat’ neutrd la pH 7,2), se spali cu api distilat’, se usuct si se examineazi. Capsula se coloreazi in’ diferite nuanje de roz pind la violaceu, iar corpul bacterian in violet-Inchis. Adesea capsula nu se coloreazi dife- nut 40 ae ons B 22 S$QRe ea ee 33 § orirenfiat de corpul bacterian, aga fncit prezenta ei se deduce dupé mari- mea diametrului transversal al germenului capsulat in comparatie cu cei necapsulati. Colorarea ‘simpli cu albastru de toluidind. Frotiul, fixat 1a flacdra sau prin flambare cu alcool, se acopera cu o solutie de albastru de tolui- dina, care se las pe lama timp de 1—2 minute. Se varsi, se spali, se ustcd gi se examineaza la imersie. Capsula apare coloratd in roz, iar corpul bacterian in albastru, Da rezultate mai bune in cazul frotiurilor efectuate din organe, la scurt timp dupa moarte. Metoda de colorare negativi a eapsulei cu tus de China. Pe o lama de microscop se pune 0 picdtura de ser fiziologic in care se suspensio- neazi germenii de examinat, iar aldturi se pune o picdtura de tus de China si se omogenizeazi in suspensia bacteriand. Din amestec se fac poi frotiuri cu ajutorul unei lame slefuite sau cu ansa bacteriologica. Dupa uscare, se fixeazd frotiurile, se coloreazi timp de 1—2 minute cu 0 solutie de aibastru de metilen Léffler. Se vars colorantul, se spala ‘cu apa gi se usucd. La examinare, pe fondul negra colorat cu tus, apar germenii colo- rati in albastru, Intre fond si corpul bacterian se observa o zona clara, necolorati, care corespunde capsule. Metoda se foloseste mai ales pentru punerea in evidenta a capsulei germenilor din specia Clostridium perfringens si a germenilor capsulati din culturi. Colorarea sporilor. Metoda Méller — fixare cu alcool ab- solut 2 minute — tratare cu vapori de acid osmic § minute — spillare cu apa de robinet — colorarea cu fucsind Ziehl, prin incdlzire de 3 ori pind la emi- terea de vapori — decolorarea rapida cu solutie de acid azotic 1/4 — spilare cu apa de robinet — recolorare cu albastru de metilen 1% timp de 2 minute spalare cu apa — uscare, Sporii apar colorati in rosu, iar bacilii in elbastru. ‘Metoda Pooman — colorare cu fucsin& Ziehl, prin incilzire de 2—3 ori pind la aparitia vaporilor — decolorare cu acid sulfuric 1%. — spilare cu apa — recolorare cu albastru de metilen alcalin, timp de 2 minute — spiilare cu apa, uscare. La examinare, sporii apar colorati in rosu, iar formele vegetative in albastru. ‘Metoda cu verde de malahit — frotiurile fixate prin cAldurd se aco- Pera cu o solutie de verde de malahit 5%/ — se incalzeste pind la aparitia vaporilor, se lasé si se raceasca, se indeparteaz colorantul; se repet operatia de 3 ori punind de fiecare data colorant proaspat — se lasii si se raceasca lama — se spala cu apa de robinet 4se recoloreazd cu fucsina diluatd 1/10 timp de 30 secunde — se spald, se usucd si se examineaza la imersie. Formele vegetative vor apirea colorate in roz-rogu iar sporii in verde. Colorarea cililor. Metoda Casares—Gill. Foloseste fucsina Ziehl si o solutie mordanta. Solutia mordanté se prepara prin mojararea a 10 g tanin si 18 g clorurd de aluminiu lichidd in 33 ml alcool de 70°. Intr-un alt mojar se dizolva 10 g clorurd de zinc si 1,5 g fucsind bazicd in 10 ml apa distilata. Cele doua solutii se amestecd varsind picdtura cu picitura cea de a doua solutie in prima. Pastrarea solufiei se poate face la intuneric si rece, vreme indelungata. In vederea coiordrii, pe 0 lama bine degresata se pune o picdturé de ser fiziologic in care urmeazi si se fac suspensia de germeni, cu foarte lente migcari, data find fragilitatea deosebita a cililor, care se desprind cu uurinté. Dupa uscare la aer se obtine frotiul propriu-zis. Pentru objinerea unor imagini mai clare se poate recurge la suspensio- narea prealabild a germenilor in apa distilata i finerea la 37°C timp de 2 ore, din suspensia respectiva efectuindu-se frotiul. Frotiul se acoperd cu solutia mordanta, diluata 1/5 (1 parte mordant la 4 parti apa distilata) si filtraté extemporaneu. Solutia se fine pe lama pind la aparifia unui luciu metalic, dupa care se varsé. Se pune apo} fucsina Ziehl, care se las sé actioneze 1—2 minute, se varsd, se spalé, se usticd gi se examineaza. Corpii bacterieni apar colorafi in rosu, iar cilii in roz-pal. Determinarea dimensiunilor bacteriilor Poate fi flicuta cu oarecare aproximatie prin comparatie cu diferite clemente avind dimensiuni cunoscute sau folosindu-se metode microme- ice. ‘Metoda comparatiei foloseste in special elementele eritrocitare, al . caror diametru este in general de 7,7—8 microni. In acest scop se ames- tec o suspensie bacteriana in ser fiziologic cu o picdturd de singe. Din amestec se face un frotiu care se coloreazd si se examineazd. Metoda are doar o valoare orientativa. ‘Metoda micrometricd permite aprecieri mai exacte si foloseste dispo- zitive speciale din sticlé, pe care sint gravate scdri gradate si care se adapteaza la microscop (micrometrul ocular montat sub lentila superioard a ocularului si micrometrul obiectiv, agezat pe platina microscopului). Micrometrul obiectiv se regleaz astfel incit liniile zero ale celor doud micrometre s se suprapuna. Apoi se noteazd care din diviziunile celelalte se suprapun. Valoarea gisita la micrometrul obiectiv se inmulteste ‘eu 10 (valoarea in microni a unei diviziuni) si se imparte la valoarea de pe micrometrului ocular, obtinindu-se valoarea in microni a tunei diviziuni de pe micrometrul ocular, cu care se fac apoi determind- rile. Micrometrul obiectiv se scoate de pe platina microscopului si se pune preparatul de examinat. Numérul de diviziuni ocupat de formatiunea bacteriand sau celulard ce urmeazd si fie determinaté, se inmulfeste cu cifra corespunzatoare valorii in microni a unei diviziuni a micrometrului ‘ocular, determinindu-se astfel mérimea formatiunii respective. ani Examenul bacteriologic Examenul bacteriologic presupune izolarea, cultivarea si identifica- rea germenilor bacterieni din diferite produse ‘patologice suspecte. Fata e examenul microscopic, care permite decelarea prezentel agentului etiologic, metodele bacteriologice complexe permit, pe ling izolare, si cercetarea diferitelor insugiri biologice care-l caracterizeazi si pe baza cérora se poate afirma cu certitudine natura procesuluipatologic si se ot orienta corect masurile terapeutice de combatere in focar si de pro- filaxie. Faptul are o deosebitd importanfé si din punct de vedere epi- demiologic, prin aceste examene evitindu-se, de exemplu, darea in con- sum a unor produse animaliere care pot provoca la om infecjii sau toxi- infectii, uneori cu evolutie grava. Este suficient sé se aminteasca perico- ul pe care-I prezinté, mai ales carnea animalelor sacrificate de necesi- tate, la care intreruperea procesului patologic, prin sacrificare, face ca modificarile organoleptice si organice sé nu trezeascd suspiciune la exa- minare. Un examen bacteriologic ins poate pune in evidenta agentii unei salmoneloze, ai tularemiei, leptospirozei, antraxului etc. toate transmi- sibile la om. Examenul bacteriologic da adesea si indicii referitoare la sursa de infectie si permite deci, eliminarea ei. Asa de exemplu, identi- ficarea la animalele tuberculino-pozitive sacrificate, a tipului aviar de bacil al tuberculozei, araté cd existi o sursi de infectie cu acest tip, care, daci se elimina, se objine cu usurinfé asanarea efectivului. De ase- menea dacd se izoleazd tipul uman, simpla indepirtare din sectorul 200- tehnic a persoanei eliminatoare de bacili se soldeazA cu. autoasanarea efectivului, transmiterea interbovina a acestui tip de infectie nereali- zindu-se de regula. Depistarea infectiei cu Salmonella typhimurium la bovine da indicii cu privire la posibilitatea contractarii infectiei de la rozatoarele din ada- Posturile respectiv Produsele patologice folosite pentru punerea in evident a germeni- lor bacterieni sint in principiu aceleasi ca gi la examental microscopic. Singele. Cind se foloseste pentru. cultivarea unor germeni eventual prezenti in el, se realizeaza asa-numita hemocultura. In acest scop, se va recolta singe de la animalele suspecte, in mod steril, in eprubete cu anticoagulant sau cu perle de sticld gi se insdiminfeaz4 pe’medii corespun- zitoare. Trebuie avutd in vedere o proportie optima a singelui faté de mediul respectiv, pentru a asigura, pe de o parte, neutralizarea efectului bactericid al singelui, si pe de alta, condifiile nutritive proprii unei dez- 43.voltari optime, Aceasta proportie este de 1/20, 1/30. Pentru a bloca ac- fiunea fagocitara a leucocitelor confinute de singele insémintat se poate recurge si la un adaos de saponind in proportie de 2% (2 ml saponind 1% la 100 ml lichid). Daca individul de la care provine singele de exa- minat a fost supus unui tratament cu penicilind sau sulfamide, este ne- cesar si se adauge 5 mg acid paraaminobenzoic la 100 ml mediu care sf neutralizeze efectul inhibitor al acestora. Se poate Practica si hemocultura din coagul de singe, mai ales in cazul unor microbi mai greu de izolat sau cind metodele precedente nu au dat rezultate (de exemplu brucele). In acest scop, 0 cantitate de 10 ml singe, recoltat in conditii de asepsie perfect’, se las si se coaguleze, apoi se inidtura serul exprimat si, in condifii de sterilitate riguroasd (la fla cdr sau in boxa sterild), se’ toarnd coagulul intr-un flacon cu 100 mi mediu licihd. Incubatia, la 37°C si eventual in atmosferd imbogatita in CO,, se urmireste circa’o lund, practicindu-se periodic subculturi. Lichidul cefalorahidian se insdminjeazd pe medi diferite, in functie de suspiciune, in cantitate de cel putin 0,5 ml. In mod obignuit se fac insdmintari pe bulion glucozat si pe pléci cu singe gelozat. Dacd se sus- Picioneazd meningite tuberculoase, se vor face insdminfari pe medii se- lective (Lowenstein-Jensen este cel mai folosit), dupa prealabila tratare alcalin&, pentru distrugerea eventualei flore secundare. In cazul lepto- spirozei’ se are in vedere ci leptospirele pot fi decelate la acest nivel numai in faza de leptospiremie, deci in prima saptamina de boald. Urina este preferabil si se recolteze prin cateterism pentru a evita contaminarea de pe caile urinare. Faptul este desigur posibil la femele si foarte dificil la masculi. Inainte de recoltare este bine sd se suspende administrarea de antibiotice sau chimioterapice, urmele aces- tora avind 0 actiune inhibitoare in dezvoltarea germenilor. Insimintérile se vor face cit mai repede dupa recoltare, pentru a impiedica multipli- carea eventualilor germeni de contaminare. Pentru aceasta se vor insdminta, direct, 3—4 picdturi de urind luate cu pipeta Pasteur, pe suprafata unei plicl cu gelozi simpla si una cu gelozd cu singe, dupa care se disperseazé cu ansa pe toati suprafata mediului. Se iau apoi 10 ml urina si se centrifugheazé 10 minute la 3000 t/mi- nut, iar din sediment se procedeaz la o noua insdmintare pe o Placé cu geloza-singe si pe bulion glucozat. Cind se suspecteazi un anumit tip de infectie se poate recurge inci din aceastd etapa la medii speciale (Drigalski pentru E. coli si salmonele, Léwenstein—Jensen pentru bacili aj tuberculozei, mediul Korthoff pentru leptospire). In cazul leptospirozet se are in vedere cd leptospirele se elimina prin urind numai dupa 8 zile de la debutul bolii. Uroculturile ce se practicd in acest scop, este bine sd fie precedate de o dieta alcalina, care s& evite lizarea leptospirelor fn mediul acid al urinei. Insimintarea se face din sedimentul de centri fugare pentru a explora o cantitate cit mai mare de urind. Incubarea tuburilor insdmintate se face la 2B—30°C, controlindu-se aparitia lepto- spirelor in cultura la microscop, din 5 in’ zile, timp de dowd luni. In momentul in care se observa apariia leptospirelor in mediu, se fac pasaje pe alte medii, noi. Organele, prin continutul lor bogat in germeni, se preteazd pentru izolarea acestora in condiii foarte bune. Avind in vedere ins rapidita- “4retummpsny — 9p “Bhtea cu care se multiplicd germenii de putrefactie si saprofitii, care in perioada de agonie difuzeazi pe cale circulatorie, este necesar si se efectueze insiminférile cit mai repede dupa moarie gi si se aleagd in ‘acest scop organele care se preteazd in cel mai fnalt grad pentru izolarea germenilor. Unul dintre fesuturile care conferé o garantie c& germenul izolat este incriminat in procesul patologic dat, este maduva osoasi. In ‘acest fesut, complet izolat prin peretele osos, de mediul inconjurator, ger ‘meni ajunsi pe cale circulatorie pot fi izolati de cele mai multe ori in stare purd; prezenta lor denotd o septicemie si, cu mare probabilitate, determina si agentul etiologic. Urmeaz apoi cordul, care de asemenea este locul de unde, in caz de septicemie sau chiar numai de bacteriemie, se pot izola germenii in stare purd. Exist situafii in care agentul cau- zal poate fi izolat numai de la nivelul unor anumite fesuturi, unde se ocalizeazd cu predilectie. Astfel, listeriile, la specia ovina, pot fi izo- late mai ales de la nivelul sistemului nervos central; bacilif rujetului in formele cronice de endocardite, de la nivelul vegetatiilor endocardice; salmonelele abortigene mai ales din avortoni (continutul stomacal, intes- tinal, bila, al acestora); Cl. chauvoei de la nivelul tumorii emfizematoase musculare, Cl. perfringens din continutul intestinal si din ganglionii me- zenterici ete. Ca tehnici de insdminfare pot fi aplicate mai multe procedee: a) Cu pipeta Pasteur. Se cauterizeaz suprafata organului cu 0 spa- tula incalzitd, se extrage cu ajutorul unei pipete Pasteur, flambata si ea si récita, 0 cantitate de lichid organic din profunzime si se Insdminjeazi intfi pe mediul lichid (bulion), iar apoi pe mediul solid (agar inclinat, agar cu singe, agar cu ser etc.). In cazul oaselor lungi, se flambeazd temeinic suprafafa de sectionare gi, cu pipeta Pasteur, se extrage prin migcdri re- petate de du-te-vino spre’ profunzime, lichid’din maduva osoasi, care se introduce apoi in mediile de cultura. Se intelege ci la inchiderea si des- chiderea tuburilor se iat toate masurile de asigurare a sterilitatii, flam- bind gura lor imediat dupa deschidere si inainte de inchidere. b) Cu ajutorul acului de insiiminfare drept. Se cauterizeazi supra- fata organului si se sterilizeazd acul prin incilzire la rogu (tija se trece si ea de 3 ori prin flacara), iar dupa racire se infeapa organul prin supra fafa cauterizata, facind citeva miscdri spre interior. Se scoate acul din organ si se face insiminfarea prin clatirea acestuia In mediul lichid. Fird a se flamba, acul se introduce apoi in tubul cu mediul solid, facin- du-se pe suprafaja acestuia migcdri in zig-zag, incepind de la baza me- diului spre partea superioard, sau se clateste acul in lichidul de conden- sare, dupa care se umecteazd intreaga suprafaté a mediului cu acest li- chid, prin inclinari repetate. Dupai fiecare proba, acul se sterilizeaza prin inrogire la flacdrd. ©) Cu porfiuni de organ. Cind organul a fost recoltat in conditii de sterilitate (mai ales in cazul animalelor mici) se poate recurge la sectio- narea unor bucifi cu ajutorul unor instrumente sterile, iar cu una din suprafefele sectiunii se disperseazé materialul patologic pe suprafata unei plici cu mediu. In unele laboratoare aceasta tehnicd este folositd aproape fn exclusivitate. 4) Prin introducerea directa in mediu a portiunilor de organ. Metoda se foloseste mai rar, in special cind se banuieste sdrdcia in germeni a 46Fig. 17 — Tehnica tnsliningisit materialului patologic. Recoltarea si manipularea acestuia treb faci in condiii de sterilitate perfecta. Ca principiu general, se va evita deschiderea organelor sau sectio- narea fesuturilor Inainte de recoltarea materialului pentru examenul bacteriologic. — Seerefiile (nazala, oculard, mai rar salivara) se insiminteazd di- rect cu tamponul steril, cu care au fost recoltate, atit pe mediile lichide, cit §i pe cele solide. Se poate recurge si la spilarea tampoanelor respec tive in ser fiziologic steril, din care apoi se fac insdminfarile pe aceleasi medi, — Transsudatele si exsudatele se supun de preferin{é unei centri- fugari obisnuite (3000 T/minut timp de 10 minute in tuburi de centri- fuga sterile), iar din sediment se vor practica insiminfarile de rigoare. ‘Tehnica transplantirilor. Are ca scop fie izolarea din culturile mixte a diferitilor germeni in stare pura, fie menfinerea lor in timp, in con- difii de laborator (tulpi Din culturile pe medii lichide, transplantarea se face cu pipeta Pas- teur sau cu ansa de insiimintare. In primul caz, se recolteazi o cantitate sA se 47Fig. 18 — Tnshininjarea in placa Petri eu agar arbitraré (citeva picdturi) din cultura veche, care apoi se insdminteazd in mediul proaspat. In cel de al doilea, se introduce ansa flambata si ri- ita in cultura veche, dup care se face Insiminjarea pe mediile proas- pete (intii in mediul lichid si apoi in mediul solid, daca e cazul). Din culturile pe medit solide, transplantarea se face cu ansa, raclind © cantitate foarte redusa de cultura, care apoi se depune pe mediile proas- pete. In timpul insminférilor, de orice natura, este necesar si se aibé in ve- dere citeva reguli general valabile: — insdmintarile se executé in boxe sterile sau in hote speciale, care permit sterilizarea periodicd si nu per~ mit formarea de curenfi de eer in tim- ul lucrului; — in timpul operatiunilor de in sdminare se evité pe cit posibil con- versatia si orice migcare de prisos in jurul operatorului; — instrumentul cu care se exe- cut insiminfarea nu trebuie sd fie atins de nici un fel de obiect nesteril (mina, halat, masé de lucru etc.); — insdminfarile se vor executa cit mai repede, cu scopul de a reduce la minim contactul materialului de insé- minfat cu atmosfera ambianta; — in timpul cit recipientele sau tuburile de culturd, sterile sau insd- pig. 49 — rea tn agar minjate, Sint deschise, vor fi finute in" "7 ~ Metisse i= ane pela 48poritie inclinatd, cit mai aproape de flacira, pentru a evita contaminarea a germeni sau spori din atmostera; — imediat dup insdmintare se face notarea tuburilor cu creioane dermatografe, creioane speciale sau cerneald de scris pe sticla, fara a se omite data insdmintarii. Mediile de cultura folosite pentru izolarea diferitelor tpuri de bacterii Pentru a pune un diagnostic bacteriologie corect, sigur si prompt, fo- losirea unor medii de cultivare corespunzatoare este de 0 importanta hotéritoare. Cunoscindu-se insusirile germenilor cdutati, condifiile lor optime de dezvoltare, bacteriologul trebuie si foloseascd mediile cele mai eficiente si indicate de izolare, in functie de specia microorganismu- ui in cauzi. Un mediu de cultura trebuie sd asigure substratul nutritiv pentru eresterea si multiplicarea microbilor, s& aibé un pH care s& permit des- fasurarea normal a proceselor metabolice microbiene (in general 7,2—7,4), si asigure conditiile de serobiozi sau anaerobloz’, sa fle pastrate In re- ipiente care si impiedice contaminarea cu alfi microbi si si fie usor de manevrat. In general, microbii patogeni se dezvolti optim la tem- Peratura corpului speciei de 1a care sint izolati. Sint insd si specti micro- iene care preferé temperaturi mai joase (leptospirele se multiplicd la 28—30°C). Mediile de culturd se pot imparfi in dowd categorii: — medit uzuale (obisnuite), pe care se dezvolta majoritatea germenilor pa- togeni. Ele pot fi: pentru bacterii aerobe; pentru bacterii anaero! medii speciale, destinate izolarii, cultivarii si cercetarii insusirilor biolo- gice ale anumitor specii de germeni. Ele pot fi: de izolare, de tmbogatire, selective, diferentiale. Mediile speciale de izolare favorizeaza dezvoltarea anumitor ger- meni, care nu se pot cultiva de la inceput pe mediile obignuite, ei nece- sitind anumite condifii speciale sau anumifi ,factori de plecare*. Astfel Sint mediile cu ser, cu singe (pentru Pasteurelle, Corynebacterium), cu glicerina, cu cartof, cu ou (pentru micobacterii). Mediile de imbogatire sint folosite pentru cazurile in care in pro- dusul patologic de examinat se binuieste o cantitate mici de germeni Patogeni si un numar mare de germeni din flora de asociatie. Astfel de medii sint mediul Kaufmann—Miller (pentru enterobacteriaceae), me- diul Chapman (pentru stafilococi patogeni), mediul Korthoff (pentru lep- tospire). Mediile selective favorizeazd, prin compozitia lor chimicd, dezvolta- rea anumitor germeni. Astfel sint mediul Wilson—Blair si Drigalski (pen- tru salmonele), mediui Istrati—Meitert (pentru Escherichia, Shigella, Sal- ‘monella), mediile Lowenstein—Jensen, Sauton, Youmans (pentru mico- bacteri) mediile Czapek, Sabouraud (pentru ciuperci). Mediile diferentiale permit cresterea diferentiat4 a unor speci: m- erobiene sau pun in evident4 anumite particularitati metabolice cu sem- nificatie diagnostica. Ele evidentiaza anumite procese biochimice caracte- 49Tistice metabolismului anumitor specii de bacterii, permitind in acest fel identificarea lor (fenomene proteolitice, zaharolitice, oxidoreductoare etc.) Includerea in componenta acestor medii a unor substante indicatoare sau revelatoare este meniti si facd vizibil procesul respectiv. Astfel pot fi citate mediul Fergussen (pentru evidenfierea ureazei) mediul cu acetat de plumb (pentru detectarea formarii de hidrogen sulfurat), mediul Dri- galski (pentru diferentierea speciilor lactozo-poritive) etc. Pentru speciile de germeni anaerobi se folosesc de asemenea medit speciale, cum ar fi bulionul de ficat, geloza Veillon, geloza cu singe Zei ter, iar ‘pentru determinarea mobilitatii unor germeni mediul semisolid ‘Tittsler—Sandholzer. ‘Dupa starea lor fizici mediile se pot imparfi in: solide, semisolide, lichide. Dupa compozitie pot fi: medii simple si complexe. Exist si_medii ,sintetice* bazate pe componente cunoscute din punctul de vedere al ‘structurii lor chimice. In comparatie cu. bulionul, agarul sau alte medii ale cror componente nu sint identificate chimfc in totalitate, mediile sintetice au avantajul c& permit anumite determinri capabile s& ofere rela{ii asupra metabolismului bacterian (prin dozarea fnainte si dupa cultivare a diferitelor componente se poate cunoaste ce anume a fost consumat in cursul multiplicarii si in ce cantitate). Dintre cele mai frecvent folosite medii de cultura sint date, in cele ce urmeaza, citeva refete si moduri de preparare. Apa peptonati este unul din cele mai simple medi de cultura, dar care are largi utilizari, in special cind i se adaugd zaharuri, in vederea etermindrilspectrulul zaharolitic al diferitelor specit de bacteri. Se pre- ard di — apa distilata 100,0 mi — peptoni 10g — NaCl 05 g Se ajusteaz pH-ul la 7,2—7,4, se incdlzegte 15 minute la 115°C pen- tru precipitare, se filtreazé prin hirtie de filtru si se sterilizeazi din nou la autoclav. Cind se adauga zaharurile, acestea se pun in proportie de 1% in balonage separate, se adauga albastra de bromtimol (12 ml la 11 de mediu) ca indicator si se sterilizeazd prin tindalizare 30 de minute, 3 zile consecutiv. Solutia de albastru de bromtimol folosita in acest scop se prepara din: 1 g albastru de bromtimol + 25 ml NaOH n/10 + 475 ml apa distilata. Bulionul de carne se prepara mai ales din carne de bovine si caba- Tine, mai rar din cea de pasire. Mugchii se curéjé de aponevroze, ten- doane, fascii si grasime, se taie bucafi mici, sau se toaca la magina de tocat carne. La 500 g tocaturd, se adauga 1000 ml apa de robinet, se tine 24 de ore la rece, pentru macerare, apoi se fierbe 30 minute, se decan- teazai si se stoarce, iar lichidul obfinut se filtreazd prin mai multe straturi de tifon si se completeazé cu apa la volumul initial. Se incilzeste la 80—90°C $i se adauga peptond 10 g si NaCl 5 g la 1000 ml lichid. Se ajusteaza pH-ul cu 0 solutie de NaOH n/1 (la 7,2—7,6) prin metoda colorimetrica. Se incdlzeste la autoclav la 115°C timp de 18 minute. Incal- zirea in prezenta NaOH produce o precipitare abundenta, cea ce impune © filtrare prin hirtie de filtru. Apoi se face repertizarea in tuburi, in 50cantitate de cca 5 ml, in sticle sau baloane, care se astupi cu dopuri de vatd si se sterilizeaz 30 minute la autoclav la 115°C. Pentru repartizare se pot folosi Pipete de 25—50 ml, dar cel_mai practic este si se folosesed dispozi- tive speciale constind din vase cu tubulurd inferioard sau pilnii sus- ndate, prevzute cu un tub de cau- iue si clema. In unele laboratoare exist dispozitive automatizate care asigura un debit constant, reglabil. Bulionul astfel preparat are un aspect asemdnator cu untdelemnul si trebuie si fie perfect limpede. Pastrarea lui se poate face vreme indelungata in vase bine in- chise, in incdperi reci si la adapost de himina. In functie de speciile bacteriene care urmenzi a fi cultivate, pot fi reparate $i alte variante de bulion, cum ar fi bulionul triptic sau bulio- nul Martin, Ele diferé de bulionul obisnuit prin aceea c peptona este in- locuitd cu alte preparate, aseminatoare ca structura chimicd. Astf cazul bulionului triptic s¢ foloseste un extract de carne obtinut prin’ di- gestia acesteia sub actiunea tripsinei iar in cazul bulionului Martin, se foloseste un extract de stomac de pore, obtinut prin actiunea acidului clothidric. La ora actualé, este din ce in ce mai réspindita folosirea extractelor de carne care sint livrate in stare deshidrataté, purificatd i standardi- zata, ceea ce asigurd obfinerea unor medii de 0 calitate superioara (ex- tractele Difco, Merck, Oxoid etc.). Agarul nutritiv (geloza) este un mediu solid obtinut prin adaugarea Ja bulionul de carne a agarului (fibre sau pulvis). Acesta nu are nici un rol nutritiv, dar determina solidificarea mediului. La 1 litru de bulion, se calculeaza 30 g agar fibre sau 25 g agar pulvis, care se topeste apoi prin incdlzire la 115°C, timp de 15 minute la autoclav. Se filtreazd prin vata, in autoclavul cu capacul deschis (pentru a evita solidificarea pe parcursul filtrarii). Se repartizeazi in eprubete sau alte recipiente unde urmeazi a fi Pastrat. Se astupi cu dopuri de vaté, se sterilizeazi 20 de minute la 120°C dupa care eprubetele se pun in pozitie inclinata pentru solidificare. Pastrarea se poate face in flacoane inchise etans pentru a evita pier- derea apei, dar in general este bine si nu se prepare sarje prea mari pentru a dispune de mediu cit mai proaspat. Agarul moale este un mediu semisolid, folosit pentru cultivarea si ‘mai ales pentru conservarea tulpinilor bacteriene. Se prepara la fel ca agarul inclinat, cantitatea de agar fiind ins mai redusé (2-5 g agar la 1000 ml bulion). Fig. 20 — Disteibaizea medilor de culturi 51Bulionul cu fiat se foloseste pentru cultivarea bacteriilor anaerobe gi se bazeazd pe faptul ca fesuturile animale cum sint ficatul, rinichiul, Muschiul, prin confinutul lor in cistind, au capacitatea de a fixa oxigenul din mediu, creind astfel condifii favorabile dezvoltarii bacteriilor anae- robe. Pentru preparare, ficatul proaspat (preferabil de bovine) se fierbe gi se taie in fragmente de forma paralelipipedicd, cu inaltimea de 3—4 cm i litimea de 1—2 cm, Aceste portiuni de ficat se introduc in tuburi cu bulion simplu, se adauga glucozd in proportie de 1% (la fiecare tub se pun 5—6 picituri dintr-o solujie de glicozd 200/) si se sterilizeazd la 115°C timp de 20 minute. Dacé mediul se foloseste dupa un oarecare timp de la preparare, se face regenerarea lui prin fierbere timp de 10 minute in baie de apa (pentru eliminarea oxigenului dizolvat in mediu). Bulionul cu ficat si carne (VF) se foloseste in acelasi scop ca si pre- cedentul. Pentru preparare, 1a 1000 ml apd distilaté se adauga 250 g carne de vitel $1 250 g ficat de vifel, tocate marunt. Fierberea timp de 20 minute este urmati de filtrarea prin tifon. Amestecul de ficat si carne rimas pe tifon se spalé de 4—5 ori cu apa distilata si se usucd. Sub aceasta forma se adauga la tuburile cu bulion de carne obignuit, in can- titate de 1-3 g/tub. Lichidul rezultat din filtrare se completeaz cu apa 1a volumul initial de 1000 ml, se adauga 5 g peptond si 5 g NaCl. Se incilzeste pind la Gizolvarea acestora si se ajusteazé pH-ul la 8. Se autoclaveazé 20 minute la 120°C, dupa care se adaugé glucozi 2%. Se filtreaza prin hirtie de filtra gi Se repartizeaza cite 6 ml in tuburile in care s-au pus in prealabil 3g din amestecul de carne gi ficat. La suprafata se poate adduga un strat de oleu de parafind, de aproximativ 1 mm grosime. Mediul se sterilizeaza timp de 15 minute la 115°C sau prin tindalizare la 100°C timp de 30 minute, 3 zile consecutiv (cu capacul autoclavului nefixat). Geloza Veillon serveste mai ales pentru cultivarea germenilor anae- robi. Se prepara din: — bulion de carne 1000 mi = agar fibre 8-10 g = glucozi 5-10 g — azotat de potasiu 12g Se dizolva mai intti glucoza si azotatul de potasiut in bulion, se adaugé agarul tdiat mérunt, se incalzeste la autoclav, se filtreazi prin vata si se repartizeazé in tuburi inguste Weinberg (8—10 mm diametru si 20— 25 cm fndltime) astfel ca mediul sé ocupe mai mult de jumatate din {naltimea tubului. Se sterilizeazd la 100°C timp de 15 minute si se sol fica in pozitie verticala. Adiugarea azotatului de potasiu se face cu scopul de a preintimpina fragmentarea mediului prin, gazele produse In cursul metabolismului bac- terian, Bioxidul de carbon si hidrogenul care rezulta in cursul dezvoltarii germenilor sint transformate in prezenfa azotatului de potasit: in carbonat de potasiu si apa. Bulionul si agarul cu ser se folosesc pentru izolarea primara a unor bacterii (pasteurele, corynebacterii, unii streptococi etc.). Se prepara din medij uzuale (bulion, agar) la care se adauga ser normal nefenicat in proportie de 1/10 (de obicei ser de cal). Recoltarea 52singelui pentru obtinerea serului se face in recipiente sterile prevazute eu baghete de sticlé ajezate incrucisat. Dupa exprimarea serului, se de- canteaza in flacoane sterile. Se face controlul sterilitatii lui prin insamin- {ari pe_medii de cultura si dacd nu este steril se filtreaza imediat prin filtrul Seitz EKS. Pentru prepararea agarului cu ser, mediul se topeste in prealabil, se las s& se réceasci la 45°C, se adauga serul, se omogenizeazd si se iasd sd se solidifice in pozitia dorité. Dupa adaugarea serului, mediile se con- troleazi din punct de vedere al sterilitafii, finindu-se'la termostat 24 de ore. Mediile glicerinate se folosesc pentru cultivarea bacililor tubercu- lozei, morvei, brucelelor, cele mai uzuale find bulionul glicerinat, agarul Blicerinat si cartoful glicerinat. Bulionul si agarul glicerinat se pregdtesc prin addugarea de glicerind 10% la mediile obisnuite. Sterilizarea se face la 110°C timp de 20 minute. Pentru pregiitirea cartofului glicerinat se taie din cartofi de bund calitate curdfafi, bucati cilindrice (cu ajutorul unor preducele speciale avind diametrul ceva mai mic decit al tubului de cultura). Cilindrii res- Pectivi se taie oblic pe diagonal, rezultind doua bucati identice care se spala in apa si se fin 3 ore intr-tn vas cu 1% carbonat de sodiu, pentru neutralizare (au o reactie usor acida). Fiecare felie se introduce apoi in cite un tub Roux, prevazut cu o gituiturd la nivelul cdreia felia respec tiv se opreste. Apoi se toarnd in tuburi bulionul glicerinat 5%/, pind la nivelul gituiturii in aga fel ca partea inferioard a cartofului si fie umec- tata in permanent cu bulionul glicerinat. Sterilizarea se face la 110°C timp de 20 minute. Mediut Lowenstein-Jensen este un mediu pe bazd de ou, cel mai larg folosit pentru cultivarea micobacteriilor. Se prepara inifial'o solutie salina compusé din: — fosfat monopotasic 24g fat de magneziu 0.24" citrat de magneziu 06 g = asparagini 36 g = slicering, neutra 12,0 ml = apa distilata 600,0 mi Dupa dizolvarea ingredientelor se sterilizeaza la autoclav. Oudle care urmeazé si fie folosite pentru prepararea medjului tre- buie si fie proaspete, curate si relativ uniforme. Un numir de 22—26 ua se spald intii cu apa si spun, cu ajutorul unei peri, se clitese abun- dent cu api si apoi se sterg cu un prosop curat si se pun timp de 30 minute in alcool 70° (nu sanitar) dupa care se pun intr-un recipient curat. La flacira, de preferin}a in boxa sterild, ouile se sparg pe rind cu aju- torul unef pense flambate si continutul’ se scurge intr-tn balon rotund de 11, cu fund plat, sterilizat prin autoclavare si care confine perle de sticlé (pentru ugurarea scurgerii confinutului dup spargerea oului la ‘un capat, se face un orificiu gi la celalalt). Dupa spargerea tuturor oudlor, confinutul acestora se omogenizeazi temeinic prin agitare si apoi se filtreaz4 prin mai multe straturi de tifon sterilizat in prealabil, intr-o pilnie de dimensiuni corespunzatoare. Pentru facilitarea filtrarii este bine a pllnia si fie montatd la un balon Kitasato, adaptat la 0 trompa de vid. Se adaugé apoi 20 ml solutie 2 de verde de malahit si solufia salina 33.(rece) omogenizindu-se. Amestecul are o culoare verde-deschis. Se repar- tizeazd amestecul in eprubete sterile, la flacdrd, cite 5—6 ml, se inclina gi se coaguleazi la etuvd, la 85°C, 3 zile consecutiv, cite 45 de minute. Este preferabila coagularea in mediu umed (in dispozitive speciale care permit inclinarea tuburilor la nivelul dorit si formarea de cdlduré umeda de vapori la nivel constant). Tot in cultivarea micobacteriilor se mai pot folosi mediile descrise mai departe. Mediul solid cu plasma umand (original) a fost folosit cu rezultate foarte bune in obtinerea unor culturi abundente, chiar si in cazul lui M, bovis, care se cunoaste c& se dezvolté disgonic. Mediul se prepard dintr-un amestec salin compus din: Glicerind neutra SaS0, sol, 0.001% 1,0 mi 0,001% 10 ml Apa distilata 960,0 ml Dizolvarea realizati prin fierbere la baia de api este urmaté de adaugarea a 25 g agar pulvis (Difco, BDH). Dupa topire, se face 0 fil- trare prin vata si sterilizarea la autoclav (121°C timp de 15 minute). Li- chidului racit apoi la temperatura de 55°C i se adaugé 100 ml plasma umana, incdlzita si ea 1a 45—50°C si 100000 U.L. penicilina. Omogeniza- rea temeinicd este urmati de repartizarea in tuburi sterile, in cantitate de 5—6 ml si inclinarea pentru solidificare. Se objine un'mediu solid, transparent, de culoare galbuie, foarte asemanator cu agarul obisnuit. Mediul Sauton este un mediu glicerinat, sintetic, lichid, compus din: — asparagin’ 40 g = acid citric = fosfat. bipotasic = sulfat de magneziu — citrat de fier amoniacal = glicerina — apa distilata 1.000,0 ml Asparagina si sirurile se dizolva intr-o parte din apa incalzit& 1a 70°C, dupa care se adauga glicerina gi restul de apa. Se ajusteazd pH-ul la 7,2, se repartizeaza in recipiente si se sterilizeaza, ‘Mediul Youmans se foloseste pentru cultivarea micobacteriilor gi are urmétoarea compozitie: = asparagini = fosfat monopotasie — sulfat de potasin = citrat de magneziu = slicerin — apa distilata ad 1000.0 mi Asparagina si sdrurile se dizolva intr-o parte din apa incdlzité la 70°C, dupé care se adauga glicerina gi se ajusteazd pH-ul la 7,0—7,2. 4Agarul 7H-10 Middlebrook se foloseste pentru cultivarea micobac- teriilor si in special pentru obtinerea maselor bacteriene destinate reacti- ilor serologice de identificare a acestora. — Mediul de baza: — K,PO, 15g — Na,HPO, (anh.) 15 g — citrat trisodic. 24,0 0/4 g (10% : 4 ml) = MgSO, - 7H,0 005 58 Ome = CaCl, * 22,0 0,005 g (0.5% = ZnSO, *7H,0 O01 § (008%: 0'm) = CuSO, - 5,0 0,001 g (0,05% :2,0 ml) — api distilati ad 1000,0 mi Se autoclaveaz la 120° timp de 10 minute. La 11 mediu de baza se adauga: — Leglutamat de sodiu 20% 25 ml (05 g) — sulfat de amoniu 20% 25 ml (0,5. g) — slicerina 5,0 ml (6,25 g) — Citrat feroamoniacal 1% 40 ml (0,04 g) — piridoxind HCI 100 meg/m! 10,0 ml (0,001_2) = biotina 100 meg/imt 5,0 ml (0,0005 ) — verde de malahit 1 meg/m! 1,0 ml (0,001 g) Se ajusteaz pH-ul la 6,8. Se repartizeaz cite 200 ml in 5 flacoane Erlenmayer de 500 ml si fieciruia i se adaugé 1,5%/ (3,0 g) agar pulvis. Se autoclaveaz la 120°C timp de 10 minute (nu mai mult) se raceste 1a 50—60°C si se adauga fiecdrui flacon cu 200 ml mediu: — glucozi solutie 50% 08 ml (0,2%) — catalaza tehnica 1% 0.4 ml (0,2 mg%) — complex acid oleic-albumini 20,0 ml Daca se dispune, se poate inlocui cu DIFCO Enrichment OADC in aceeasi cantitate. Se amestec prin rotatie moderatd, pentru a se evita formarea bulelor de gaz si se repartizeazd in eprubete sau placi Petri. Mediul Korthoff este folosit pentru cultivarea leptospirelor. El con- fine: — peptoni Witte O4 g = Ca 0,700 g — NaHCO, 0,010 g — Kd 0,020 g — KH,PO, 0,090 g = Na,HIPO, 0,480 g — api distilata 500,0 ml Dupai dizolvarea ingredientelor, solufia se sterilizeaz la 100°C timp de 30 minute. Se las sd se raceascd si se filtreazd prin hirtie de filtru. Se repartizeazd in baloane si se sterilizeazd din nou la 115°C timp de 30 minute, dupa care se adauga ser de iepure steril in proportie de 5—10%/ Acesta trebuie sf fie in prealabil inactivat timp de 30 minute la 56°C. In final pH-ul trebuie si fie de 7,2—7,4. Se controleaza sterilitatea prin incubatie timp de 48 de ore la 37°C. Se vor folosi numai mediile perfect limpezi. Mediul Uhlenhuth se foloseste pentru cultivarea leptospirelor. In acest scop se fierbe apa de fintina pind ce volumul ei se reduce la juma- 58tate, se ajusteazd pH-ul la 7,2—7,4. Se repartizeaza apoi in eprubete mici (10/120 mm) sau alte recipiente, se sterilizeazé 20 minute la 120°C si se adauga ser de fepure in proportie de 5—10%/ inactivat in prealabil la ‘56°C timp de 30 minute. ‘Mediut Terskih se foloseste tot pentru cultivarea leptospirelor. Constdi din: — apa distilata 90 ml — solutie tampon Sérensen pH — 7,2 10 mi Se sterilizeaz& la autoclav timp de 30 minute la 120°C, dupa care se adaugi 7—10 ml ser de iepure inactivat si se distribuie in ‘tuburi sterile. Solutia tampon Sérensen este formata din: solutia A (11,876 g fosfat Gisodie anhidru in 1000 ml apa) si solutia B (9,078 g fosfat monopotasic anhidru in 1000 ml apa). Amestecarea acestora se face in proportie de 8 ml solutie A si 2 ml solutie B. Mediile hiperclorurate au o actiune selectiva, permitind dezvoltarea Stafilococilor si unor streptococi (enterococi), inhibind in acelasi timp dezvoltarea celorlalte specii bacteriene. Concentratia NaCl in aceste medi este de 6,5%/. Agarul cu sulfatiazol. Addugarea de sulfatiazol la agarul obignuit in proportie de 0,002% are capacitatea de a inhiba mobilitatea speciei Proteus vulgaris, permitind in acest fel izolarea germenilor patogeni din culturi sau materiale patologice contaminate cu Proteus. Mediile cu antibiotice. Se folosesc in scopul izoldrii unor germeni din grupa micoplasmelor, a ciupercilor din materialele contaminate cu alte bacterii si a mutantelor antibiorezistente ale bacteriilor. Addugarea anti- bioticelor se face in proportii variabile in functie de natura acestora. ‘Mediile cu substanfe colorante. Cristalul violet addugat in. proportie de 1/500 000 permite dezvoltarea streptococilor, dar are o acfiune inhi- banté asupra altor specii bacteriene. Agarul cu singe defibrinat 1/10 si verde briliant “1/40 000 se foloseste pentru izolarea germenilor din genul Campylobacter (Vibrio). El consta in urmatoarele: = bution de carne —1000,0 ml — agar fibre 25,0 g — pepton’ Bacto 100 g — NaCl 50g — verde briliant 1/100 2,5 ml Se ajusteazd pH-ul la 7,4—7,6 gi in momentul turndrii in pldci se adauga singele. ‘Mediul Kaufmann-Milller este un mediu de imbogitire, folosit mai ales pentru izolarea germenilor din genul Salmonella in cazul cind in materialul patologic (fecale) ei se gisese in numar redus. El se compune din: = bulion 90,0 mi = carbonat de calein 50 g = biliide bou sterilizat’ 5,0 ml Se sterilizeaz’ amestecul timp de 30 minute la 120°C, se las s& se rraceascé gi se adauga in conditii de sterilitate: — solufie apoasi de verde briliant 1%» 10 = solufie Lugol 20 — solufie de tiosulfat de sodiu 50% 20Se repartizeazi in tuburi sterile cite 10—15 ml si se incubeazd la 37°C timp de 48 de ore pentru controlul sterilitati. Mediul cu selenit de sodiu (Leifson) are aceleasi indicajii ca $1 pre- cedentul si se prepara din: — biselenit de sodiu anbidru 06 g — fosfat disodic (12 - H,0) 05g = lector 4g = peptona 4 g — api distilata 100,0 mi Se ajusteaz pH-ul la 7, se sterilizeazd prin fierbere 5 minute si se repartizeazai in tuburi sterile. ‘Mediul Chapman lichid este un mediu de imbogatire hiperclorurat care permite dezvoltarea stafilococilor patogeni din diferite produse pato- logice. Consta din: — extract de carne 40 g — peptona Witte 10.0 g — Nacl 1500 g — lactozi 15,0 g — api distilata 1.000,0 mi Solutia de lactozd se prepard separat, in 100—150 ml apa distilata. Celelalte substante se dizolv la cald in restul de apa distilati, se corec- teazd pH-ul la 7,6. Se autoclaveazd 30 minute la 120°C. Se filtreazd prin hirtie de filtru, se adauga solutia de glucozi si se sterilizeaz din nou prin autoclavare la 110°C timp de 20 minute. Mediu Chapman solid serveste la diferentierea stafilococilor patogeni de cei saprofiti si in acelasi timp, prin confinutul de clorura de sodiu are roprietafi selective pentru stafllococt fafa de alte specti bacteriene confine — extract de carne 80 g — peptoni 90g — clorur’ de sodiu 75-100 g — manitol 10—100 g — agar fibre 15—30 g — rogu fenol 0,025—0,25 g — api distilata 1000,0 mi Se dizolva extractul de carne, peptona, clorura de sodiu, ajustindu-se pH-ul la 7,6 si se autoclaveazé 20 minute 1a 110°C. Se topeste si se adaugi solufia de manita gi rosu de fenol. Solutia de rosu fenol se prepara din 0,1 g rosu fenol + 5,7 ml NaOH n/20 + 35 ml apa distilaté. Manita se prepara prin dizolvarea 1/10 in apa distilata. Mediul are o culoare rosie. Stafilococii, care fermenteazi manitolul, determina virarea culorii, mediului spre galben, in timp ce cei saprofiti ‘nu modificd culoarea mediului. Mediul Istrate-Meitert este un_mediu selectiv, folosit pentru dife- renfierea coloniilor de Salmonella, E.coli si Proteus. Este format din: — agar nutritiv 2% 100,0 ml — bili de bou uscaté 1a 105°C 03 g = lactozi 15 g — citrat de sodiu crist. 08 & 37— tiosulfat de sodiu crist. 95 g — citrat de fier \2 g — solufie de albastru de bromtimol 1/500 40. ml Se ajusteazd pH-ul la 7,3—7,4 cu NaOH 10%, Mediul se fierbe 15 minute in baia de apa, se lasi si Se rdceasca la 55°C si se toarnd in placi Petri. El are 0 culoare verde si trebuie folosit: in decurs de maximum 48 de ore de la preparare. Pe acest mediu care, neinsiminfat, are culoarea verde, coloniile de Salmonella apar albastre-verzui, cele de E. coli apar galbene si cele de Proteus albestre-verzui, cu centrul mal opac, nein~ vadante. ‘Mediul Gassner se foloseste in acelasi scop ca si precedentul. Se pre~ ard din: — agar nutritiv 2.0000 mi — solufie de Metachromgelb 2% — 125,0 ml — solufie Wasserblau 1% 175,0 ml — lactoza 100 g Se topeste agarul, se prepara solutia de Metachromgelb care se fil- treazd gi se fierbe 2 minute, iar separat se prepara solutia Wasserblau, care se filtreaz, apoi se adaugé lactoza si se fierbe 10 minute. La agarul topit se adaug mai intii solutia de Metachromgelb si apoi cea de Was- serblau. Culoarea mediului este verde-albistruie. In urma —dezvoltarii germenilor pe suprafata acestui mediu, culoarea vireaza spre galben in dreptul coloniilor de Salmonella si in’ albastru intens in dreptul celor de E. coli. ‘Mediut Drigalski se foloseste pentru diferentierea speciilor lactozo- Pozitive de cele care nu fermenteazd lactoza (Salmonella). La 0 cantitate de gelozd 31/ topiti se adauga 1% lactozd si turnesol fn solufie de 10% pind ce mediul capitd 0 culoare’ violet-ametist. Se repartizeazd in cutii Petri, se controleazé sterilitatea prin termostatare. Daca se adaugd mediuilui si o solufie de cristal violet, el dobindeste © valoare selectiva. Agarul Mac Conkey este un agar selectiv ce se foloseste cu bune re- zultate pentru izolarea si cultivarea enterobacteriaceelor din diferite ma- teriale patologice, alimente, ape etc. Prin sarurile biliare gi cristalul vio- let ce le contine, inhiba germenii Gram pozitivi si pe cei apartinind altor genuri decit enterobacteriaceele. Prin continutul de lactoza permite de asemenea diferentierea coloniilor lactozo-pozitive si negative. Se compune din: Oo: 0. — peptoni (din casein’) = peptoni (din carne) — lactoza pH-ul final este 7,1. Salmonelele si shigelele crese sub forma de colo- nii incolore transparente, E. coli, sub forma de colonii mari rosii cu halou opac, Klebsiella si Enterobacter, sub forma de colonii mari, de 58culoare roz, mucoase, enterococii gi stafilococii sub forma de colonii mici, izolate, opace. Geloza cu singe Zeisler se foloseste pentru izolarea unor germeni care nu crese de la inceput pe medii obignuite (streptococi, corynebac- terii), pentru a testa capacitatea hemoliticd a unor tulpini (stafilococi, streptococi etc.) si pentru cultivarea germenilor anaerobi, cu condifia | a incubatia sd se realizeze in anaerobioz. Se prepara astfel: — gelozi peptonata cu pH 7,2—7,4 100,0 mi = glucozi solutie 20% sterilé 10,0 ml — singe de oaie sau cal, defibrinat 20,0 mi Se topeste geloza gi se riceste la 56°C, se adauga steril cu o pipeta solufia de glucozd, apoi singele defibrinat, amestecindu-se incet. Apoi se repartizeazd in plici Petri cite 8—10 ml si se agazi in pozitie perfect orizontald pentru a asigura o uniformitate a grosimii stratului de mediu. Daca fundul plicilor este neregulat, se poate folosi turnarea prealabili unui strat de agar de egalizare, format din: = NaCl 85 ¢ — fosfat disodie 05g — agar fibre 16.0 g — api distilata ad 1.0000 mi Turnarea gelozei cu singe se face peste agarul de egalizare, dupa solidificarea acestuia. Este recomandabil ca dupa ce agarul cu singe s-a solidificat s& se tind clteva ore (2—4 ore) la termostat pentru a se elimina apa de condensatie. In cazul cultivarii anaerobilor, plactle insiminfate se incubeaz la anaerostat, sau mai simplu, se foloseste urmatoarea metoda: — dupa turnarea $i solidificarea in plici a agarului cu singe se face insdiminfarea, iar pe capacul placii se lipeste cu ajutorul unor benzi de leucoplast o punga de hirtie confinind urmatorul amestec: = 0.2 g pirogalol — 0,2 g carbonat de potasiu ) = 03-0,4 g carbonat de calciu — 03 g pirogalol = 03 g carbonat de potasiu — 14 g pamint de infuzorii Etangeizarea cu parafini, plastilind sau alt mijloc permite realizarea unui spafiu inchis in care, prin reactia chimicd ce are loc, oxigenul este consumat, anaerobii dezvoitindu-se foarte bine. Mai practic este ca lipirea pungii sf se facd pe partea externé a capacului dupé care acesta se in- toarce, se pune cu punga spre interiorul plicii insiminfate si se etansei- zeaza cu parafind. ‘Mediul Tittsier-Sandholzer se foloseste pentru studiul mobilitatii bacteriilor. Se prepara astfel = balion de carne —1000,0 mi \ = pepton 50 g SS — gelozi pulvis 5.0 g Se ajusteazi pH-ul la 7,2, se sterilizeaza si se repartizeazA in tuburi fn pozitie verticala. Insdminjarea se face prin injepare in centrul mediu- Jui, La becilii mobili se observa difuzarea lor in mediu in toate directiile, 59de la linia de insimintare spre peretii tubului, dind mediului un aspect opalescent. Bacilii imobili se dezvoltd exclusiv de-a Iungul liniei de in- sdminfare. Serveste de asemenea si pentru stabilirea afinitatilor fata de oxigen, in sensul ci germenii aerobi vor dovedi o dezvoltare mai intens& spre suprafata mediului, abundenta scizind spre profunzime (aspectul de brad rasturnat), in timp ce la cei anaerobi situatia este inversi. ‘Mediul pentru punerea in evidentit a ureazei (Christensen) se foloseste pentru punerea in evidenté a capacitafii unor germeni de a descom- Pune ureea, punind in libertate apa, CO, si NH, Se compune din: — peptoni Bacto 05g — NaCl 25 g — KH,PO, 10 g = glucoza O5g ~ = ap’ distilata 500,0 mi Dupé dizolvarea Wientelor, se fierbe si se adaugd 3 ml dintr-o solufie de rosu fenol 1/500, ca indicator. Dupa autoclavare si racire, se adauga 10 g uree (dizolvaté in prealabil in apa distilata gi sterilizata prin filtrare prin filtru Seitz). Mediul are o culoare gilbuie. Indicatorul din mediu, in prezenfa unor germeni care hidrolizeazi uureea, datorité amoniacului ce rezultd, vireazi spre rou-violet intens (salmonelele — negativ, Proteus = pozitiv). Mediul Fergusson se foloseste pentru testarea capacititii ureazice a bacteriilor. Se compune din: uree 20 g = fosfat monopotasic 0,1 g — fosfat bipotasic O1g — NaCl 05g = alcool 95° 1,0 ml — api distilata 100,0 ml Ca indicator se adauga rosu de fenol in proportie de 0,28. Mediul are 0 culoare galbend. Daci ‘tulpina microbiand insiminjata produce ureaza, ureea se descompune gi culoarea mediului vireazi in violet. Bulionul cu uree se foloseste pentru punerea in evident a ureazel. Se compune din: — extract de drojdie O1g KH,PO, O1g NaHPO, 95g — uree 20,0 g = ros fenol 0,01 g = api distilata 1.000,0 mi Medjul"se sterilizeazd prin filtrare, pH-ul find in final de 6,8. Se repartizeazd cite 3 ml in tuburi de reactie Baste recurge si ln dizolvarea ingredientelor, cu exceptia ree, in $00-mi apa distilata urmata de sterilizare. Dupa racire se adauga 100 ml solufie 20% uree sterilizat prin filtrare. Dup& omogenizare se repartizeazé steril cite 3 ml in tuburi de reactie. Insdminjarea se face abundent, din culturi pe mediu solid, pentru ‘a obfine o suspensie densi. Se incubeazd la baia de apa la 37°C gi se inter preteazd rezultatul dupé 10 minute, 60 minute, 2 ore, 8 ore, 12 ore $i 24 ore. 60Reactia pozitiva const in colorarea mediului in rosu. Reactia nega- tiv este exprimati de pastrarea culorii initiale (galbena) a mediul Mediul multitest SIM (Costin 1969) se foloseste pentru identifi- carea enterobacteriaceelor, permitind punerea in evidenta a indolului, hi- drogenului sulfurat si mobilitatii. Culturile folosite trebuie s4 fie pure. ‘Compozitie: = pepton’ (din casein’) 20,0 g = peptona (din carne) 60 g — Citrat feric amoniacal (III) 02g = tiosulfat de sodin 2 — agar-agar 30g = api distilata ad 1.000, mi Se dizolva ingredientele in apa distilaté prin incdlzire pind la fier- bere, se repartizeazi in tuburi in aga fel incit indltimea mediului si fie de cca 4 cm. Se sterilizeaz prin autoclavare timp de 15 minute la 121°C si se solidified in pozifie verticald. In final pH-ul trebuie sd fie de 7,3£0,1 Ia 37°C. Insiminfarea prin punctie este urmatd de incubatie timp de 18—24 ore la 37°C, Mobilitatea este indicaté de o turbiditate difuzi in jurul tinfet de insmintare in timp ce lipsa mobilitatii, de cresterea strict de-a lungul liniei, fara difuziune in jur. Productia de H,S este exprimata de inne- grirea de-a lungul linfei de insdminfare sau in jurul acesteia. Addugind peste mediu reactiv Kovacs, colorarea purpurie a acestuia releva prezenta indolului. Mediul Kligler este un mediu solid multitest, ce se foloseste in dife- renfierea germenilor Gram negativ pe baza capacitatii lor de a produce HS gi de a fermenta lactoza si glucoza. Se prepara din: — extract de carne 30 g — extract de drojdie 30g — peptona din cazeind 15,0 g = Peptoud din carne 30g — lactozi 10,0 g = glucozi D 10 ¢ = Gitrat feroamoniacal O35 ¢ = Neci 30 6 = Hosolfat ee sodiu cae a fen ; =e 20g” = api distilata 1000,0 tat Se ajusteazd pH-ul la 7,4 si se repartizeazA cite 4 ml in tuburi de 120/12 ml. Se sterilizeazd 15 minute la 115°C, se solidified inclinat, in aga fel incit s& se obfind o coloana compacta de 1—1,5 cm $i 0 panta Insiminjarea se face din cultura pe mediu solid — coloana prin infepare, iar panta in suprafafa. Incubarea se face la 37°C timp de 24 de ore, La interpretare se vor avea in vedere aspectele furnizate de coloand si de panta: — coloana: — nemodificata: (rosie) glucoza nu a fost fermentata — galbend: glucoza a fost fermentata 6— eu productie de gaz — fara gaze — panta: nemodificata (rosie): lactoza nu este fermentata — galbena: lactoza este fermentata Productia de H,S este sugerat de aparitia unui inel negru la partea superioara a coloane} sau innegrirea intregii coloane de mediu. Mediul pentru punerea in evidenja a scinddrii gelatinei si producerea de HS. Se compune din: — bulion de carne 1000,0 ml — extract de drojdie 10,0 ml — peptona purificata 100 g — gelatina 30,0 g Dupa filtrare, se sterilizeazi si apoi se ‘adaugi la fiecare 100 ml cite 1 ml Na,8,0, solutie 2%, 0,05 g sulfat feroamoniacal. Se fierbe 20 de minute si se repartizeazi ‘tuburi sterile, cite 10 ml. Insdmintarea se face cu un ac de insiminare féré ans (prin intepare). Incubatia timp de citeva zile presupune urméarirea eventualei liche- fieri a mediului. Citirea se face intotdeauna faté de tub martor neinsd- mintat si dupa o prealabil mentinere la frigider. In caz pozitiv, in tubu- rile Insdminfate agarul este lichefiat. Mediul cu subacetat de plumb se foloseste pentru punerea in evident a bacteriilor care produc H,S. In acest scop, se topesc, prin fierbere, un numar de tuburi cu gelozd simpld 2% si se adauga steril fiecdrui tub cite 0,1 ml dintr-o solutie apoasd sterilé 10% de subacetat de plumb. Se amestecd prin agitare si se lasd s& se solidifice in pozitie verticala. Insi- mintarea se face prin intepare. Tulpinile care produc H,S innegresc me- diul in zona de crestere a culturii. Mediul pentru punerea in evident a reducerii nitratilor tn nitrii, se foloseste pentru identificarea acelor bacterii care au enzime capabile s& reducd nitratii in nitriti si ypune fie din bulion la care se adaug’: azotat de potasiu (NO,K) in proportie de 0,2%/ fie din urmatoarea com- pozitie: — peptond 100 g — NOK 100 ¢ — apa distilata 1000,0 ml Dupa incilzirea mediului in scopul dizolvarii substantelor, acesta se sterilizeaza prin tindalizare gi se repartizeaza in tuburi. ‘Mediul insiminfat se controleazé dupa 3—5 zile de incubare, pri “~~saddugarea a cite 5 picaturi din reactivul Griess-llosvay. In cazul reactiei pozitive, dup addugarea reactivilor, mediul se coloreazi in rosu, iar dac& ‘nu a avut loc reducerea, culoarea nu se modifica. ‘Se poate folosi si un mediu solid avind urmatoarea compozitie: — extract de carne 30g = peptona 50g — azotat de potasiu 10g = agar-agar 120g Dizolvarea ingredientelor este urmata de sterilizarea la autoclav, re- partizarea in tuburi gi solidificarea in pozitie inclinata. Insaminjarea in suprafaté permite observarea productiei de gaze prin aparifia de cripi- 62turi in mediu. La addugarea citorva picdturi de reactiv Griess-Iosvay, colorarea in rosu indicd o reactie pozitiva. Mediul cu citrat de sodiu Simmons se foloseste pentru testarea capa- citatii unor bacterii de a utiliza citratul ca substrat nutritiv. Se com- pune din: — clorura de sodiu = sulfat de magnezin — fosfat de amoniu biacid — citrat de sodiu crist — agar = api distilata Se dizolva intii ingredientele, se incalzeste amestecul pind la topirea gelozei, se stabfleste pH-ul la 7,2, se adaugi 10 ml dintr-o solutie de albastru de bromtimol 1,5%/. Se filtreazd, se repartizeazi, se sterilizeazd la 120°C timp de 15 minute, se repartizeaza si se solidifica in placi Petri sau in tuburi (in pozitie inelinata). Pe acest mediu unele bacterii nu se dezvolt, in timp ce altele se dezvolta bine si prin alcalinizarea lui deter mina modificarea culorii acestuia in albastru intens. Reactia pozitiva este dati de colorarea de la verde la albastra. a mediului in timp ce o reactie negativa este indicata de raminerea neschimbaté a culorii si nedezvolta- rea culturii. ‘Mediul cu citrat Koser se foloseste in acelasi scop ca si precedentul st consta in: — NaCl 50g = sulfat de magneziu 028 — fosfat de amoniu 10 g — fosfat bipotasic 10 g — apa distilata 1000.0 mi Dupa dizolvarea ingredientelor se ajusteazd pH-ul la 6,8 si se adaugi 2,0 g de acid citric. Se reajusteazi pH-v1 la 6,8 $i se repartizeaza in tuburi ite 5 ml. Se sterilizeazi 10 minute la 115°C. Insdmintarea se face cu ansa dintr-o suspensie in solutie salina fizio- Jogicd sterilé a unei culturi tinere pe agar sau direct din cultura pe agar. Incubarea la 37°C timp de 4 zile este urmata de interpretare. Reactia pozitiva este data de dezvoltarea culturii si tulburarea mediu- lui, far reactia negativai de aspectul limpede al acestuia. In interpretarea rezultatelor inséminfarilor pe mediile enuntate se au in vedere o serie de insusiri morfologice, culturale, biochimice ale Se a ed de PYogenitate si antigenitate. Examenul caracterelor culturale Dezvoltarea germenilor bacterieni pe mediile de cultura ia aspecte Giferite in functie de specia in cauzd, mediul folosit si uneori conditiile de cultivare. Pentru unele specii, o serie de caractere culturale reprezinta Particularitati deosebit de prefioase pentru identificarea lor. In mediile lichide, in aprecierea dezvoltarii bacteriilor se au in vedere turbiditatea, depozitul si formatiunile de suprafata. 63.‘Turbiditatea poate fi pronunfati, discreta sau poate sé lipseascd. Depozitul ia nastere prin depunerea la fundul tubului a germeni lor care s-au dezvoltat in mediu. Bl poate fi discret sau abundent, granu- lar, viseos sau pulverulent, omogenizabil sau neomogenizabil prin agitare, aderent sau nu la fundul tubului Suprafaja mediului poate oferi aspectul unei_ membrane de grosimi variabile, rugoasa, granularé, increfita sau neteda, sau al unui inel de grosimi variabile la suprafata lichidulul, Pe mediile solide, germenii constituie, prin multiplicare, aglomerari cunoscute sub numele de colonii, vizibile cu ochiul liber sau cu lupa. tn aprecierea lor, se at in vedere: dimensiunile, forma in ansamblu, profi- Jul, suprafafa, marginile, culoarea, opacitatea, consisten{a, emulsionabili- tatea, Sub aspectul dimensiunii, coloniile pot fi de talie variabila, pind la citiva milimetri diametru. Fig. 21 — Vormarea de mem- Fig. 22 — Culturh de brand la suprafata. sedialui MM. avium pe media de cultura g cderea Ia fundul Teil feprubetel « fragmentelor de cculturs (2. avin)Forma poate fi circulard, ovalard, radiata sau neregulata. Profilul (in sectiune prezumtiva) poate avea un aspect plat, convex, concav, ombilicat, mamelonat sau papiliform. Suprafata poate fi netedé, aspré, granulard, lucioasa sau mata. Marginile pot fi uniforme, neregulate sau cu prelungi Culoarea coloniilor este ‘diferitd in functie de prezenta si natura Pigmentului pe care eventual fl contin (alb, galben, verde, rosu, porto- caliu etc.) Sub raportul opacitatii, coloniile pot fi translucide sau opace, intre ele existind grade intermediare. Consistenta este si ea variabild: untoasd, viscoasd, uleioasd, grun- joasé, friabild, filantd, ea determinind cel mai adesea gi gradul de ade- Ten{a la suprafata mediului, In timp ce coloniile de consistent untoasa si granulard se desprind cu. usurinté, cele viscoase aderd, determinind 6 dificultate in desprinderea lor. Emulsionabilitatea poate fi usoard sau dificila si face ca suspensiile care se practicd si fie omogene sau neuniforme. Citeva exemple in acest sens, pot fi edificatoare. In medi lichide: — mediul poate fi tulbure omogen (salmonele, stafilococi); — mediul poate fi tulbure cu un inel pe perete la limita superioara a mediului (B. colt); — mediul poate fi clar, insé la fund prezinta un depozit grunjos sau nisipos (streptococi); — meditil poate fi clar, cu un depozit floconos si aderent la fundul tubului (bacilul antraxului); — mediul prezinté un val subfire la suprafaté (vibrionul holeric); — mediul prezinté o membrana uscata la supratata (Bacillus subtilis): — mediul prezinté o membrana groasd, rugoasé, plisatd la suprafata, restul lichidului réminind limpede (M. tuberculosis); — mediul este colorat in verde-albstrui (b.piocianic). Pe medi solide: — E. coli da colonii rotunde cu margini si suprafete netede de 35 mm diametru, de culoare albi-liptoasé, Iucioase; — Pasteurella’ da, de reguld, colonii mici, abia vizibile, transparente, tuneori usor albastrui, aderente la mediu; — b. antraxului di colonii cu suprafata aspra si cu margini avind prelungiri laterale, efilate, care privite cu lupa, au aspectul unor ondu- —Jatii ale firelor de par; ~~ — stafilococii dau colonii rotunde, bombate, cu margini si suprafete netede, unele din ele pigmentate in alb, auriu sau citrin; — streptococii dau colonii mici bombate; — b. tuberculozei umane produce colonii rugoase, uscate, cu mar- gini neregulate, Bacteriile anaerobe oferd si ele aspecte variabile in functie de me- diul folosit in cultivarea lor. In cazul mediilor lichide, in general, se produce 0 tulburare uniforma eu sau fara productie de gaze, vizibile sub forma unor bule fie in intimi- tatea lui, fie la suprafata. In cazul mediilor semisolide (geloza Veillon) se pot forma dowd tipuri de colonii, in functie de difuzibilitatea germenilor in mediu, insugirelegata de prezenta mobilitatii. Bacteriile mobile (Cl. tetani, Cl. chauvoet) produc colonii pufoase de aspect sferoid, in timp ce cele imobile (Cl. erfringens) produc colonii de aspect lenticular, de talie variabila. Unele din ele au mameloane centrale caracteristice, altele pot determina liche- fierea partiala sau totala a mediului. Examinarea caracterelor metabolice (biochimice) ale germenilor bacterieni Caracterele morfo-culturale au_o valoare importanta, dar nu tot- deauna concludenta si pentru a confirma datele pe care ele le furnizeaz este nevoie sa se recurga si la alte mijloace suplimentare. Ele se bazeazi pe anumite particularitaji metabolice, cum ar fi de exemplu capacitatea de a fermenta anumite zaharuri, de a produce H,S, indol, ureazd, de a reduce nitrafii, de a produce hemoliza, de a coagula plasma, de a elabora toxine etc. Aceste caractere sint variabile cu specia microbiand si chiar cu tul- pina si au la bazd existenta unui echipament enzimatic diferit, care le confer capacitatea de a actiona asupra unor substanfe confinute in mediu sau de a elabora, in cursul multiplicdrii lor, anumite substante noi, identificabile prin diverse reactii chimice. In functie de natura enzimelor bacteriene si a substantelor asupra cdruia acestea activeazd, reactiile biochimice pot fi diferite. de punere in evident a capacitatii Reacti aaharolitice (fermentarea zoharurilor) Fermentarea zaharurilor se datoreste elabordrii de citre germeni a unor enzime capabile s& scindeze glucidele, cu formarea de aldehide, acizi si gaze (CO,, Hp, CH). Ea se determina prin folosirea unor medii lichide (cel mai frecvent) sau solide, la care se adauga diferite zaharuri si un indicator care s& releve transformarile biochimice care survin (de obicei modificarea de pH a mediului). Substantele hidrocarbonate care se folosesc cel mai frecvent in acest ~———~scop sint: glucide: dizaharide (maltoza, lactoza, zaharoza sau sucroza); ‘rizaharide (rafinoza); pentoze (arabinoza, xiloza, ramnoza); hexoze (glu- coza sau dextroza, levuloza sau fructoza, manoza, galactoza); polizaharide Gnulina, amidonui, glicogenul); glicozide (salicina, esculina); polialcooli: alcooli trivalenti (glicerina); alcooli tetravalenti (aritrina); alcooli_penta- valenti (adonita); alcooli hexavalenti (manita, dulcita, sorbita, inozita). Dintre mediile lichide, cel mai frecvent folositd pentru evidentierea Insusirilor zaharolitice este apa peptonaté, in care se dizolv’, in proportie de 1%, substanta hidrocarbonatd urmarita si 0 solufie indicatoare (albas- tru de bromtimol, tincturd de turnesol, rosul neutru). Mediul se repar- tizeazi de preferinjé in tuburi de reactie tip Wassermann, In mediul zaharat, insimintarea tulpinii bacteriene de cercetat (de pe un mediu solid, cu ajutorul ansei bacteriologice) se soldeazd cu virarea 68, in caz ch s-a produs fermentarea, sau cu pastrarea inifiale dacd aceasta nu s-a produs. Modificarea culorii. mediu- Tuj are loc in timpul incubatiei la 37°C, dupa o perioada variabila, in functie de rapiditatea cu care fenomenele fermentative au loc. La unele specii, aceasta se produce dupa citeva ore, in timp ce la altele este nevoie de 0 incubafie mai indelungata, de citeva zile sau chiar séptimini. In acest din urma caz, pentru a se evita evaporarea mediului, dopurile tuburilor se parafineazé sau se recurge la un procedeu de incu- bare in tuburi inchise la flacard. Pentru aceasta, din sticla pentru pipete Pasteur, se pregitesc prin efilare la flacdra pipete cu bul, avind ambele capete inchise (marimea bulei este de cca 1 cm iar capetele de 6—7 cm fiecare). Ele nu mai trebuie sterilizate deoarece incalzirea la flacdré rea- lizeazi acest deziderat. In momentul folosirii, se rup ambele capete si se flambeaza, in fla- cara, dupa care se extrage din mediul zaharat 0 cantitate de lichid pina Ja umplerea bulei. Se inchid apoi capetele prin efilare (tubul fiind foarte subjire operatiunea se realizeazd cu ugurin{a). Din fiecare mediu zaharat se umplu atitea pipete cite tulpini’ se cerceteazi. Apoi, se rupe unul din capetele efilate si cu ajutorul unui ac de insaminfare fara an: flambat in prealabil si racit, se ia o cantitate mica de cultura de pe medi solid si se introduce prin capatul rupt al pipetei efilate, pind in mediul confinut in bula pipetel. Apoi pipeta se inchide din nou prin efilare la flacdra. In mod similar, se procedeazi si cu celelalte pipete continind zaharuri diferite. Pipetele insdminfate i inchise se pun apoi in stative speciale prevazute cu orificii corespunzatoare partii efilate, in aga fel Incit bulele ramin la nivelul platformei stativului. Pentru recunoasterea tulpinilor si a zaharurilor puse in lueru, pe marginea stativului sint no- tate indicativele necesare (de exemplu, pe una din laturi se indic& zaha- rurile, iar pe latura perpendicularé pe prima, numérul tulpinii). Inter- pretarea este identicd cu aceea din tuburi, luindu-se ca criteriu modifica- ea culorii medjului. La unele bacterii, fermentarea substantelor hidrocarbonate este inso- fitd de producerea de gaze. Pentru a evidentia acest caracter, in tuurile ————— Fig. 25 — Stativ pentru pipete tachise, folosite tn determinarea fnoupiclor zahatolitice In actedconfinind mediul zaharat se introduc, inainte de sterilizare, cu gura in jos, tubulefe Durham. In caz pozitiv, in acestea se acumuleazi gaze, are pot fi usor observate, iar dacd sint abundente determing chiar ridi- carea spre suprafafa a tubulul Durham. Mediile solide, folosite pentru a evidenfia capacitatea fermentativa a bacteriilor, au inglobate in ele zahérul respectiv si un indicator, care relevi prin virarea culorii prezenta procesului de fermentare (in practicd se folosesc numai citeva medii de larga circulatie, pentru diferentierea ‘unor germeni ca E. coli, Salmonella, Klebsiella). Pentru a evidentia capacitatea de a hidroliza amidonul, prezenta ta acestea se Insiiminjeaz in plici cu gelozi continind 0,2% amidon solubil. Dupé dezvoltarea culturii, suprafaja mediului se acopera cu solutie Lugol sau solutie saturata de iod (20 g iod si 100 ml alcool eti- lic de 50°). In cazul existentei unor colonii care au determinat hidroliza amidonului, in jurul acestora mediul rimine necolorat, contrastind cu restul mediului care apare de culoare albastra-violacee. Re it in evider isten| ilor activi tofd de subsonele protce p aminceca gentenia unor produsi rezultati din dezintegrarea sul Nor proteice Testut de gelatinolizt foloseste un mediu cu gelatind, preparat astfel: 1a 100 ml bulion obignuit si incdlzit la 55°C se adaugd, foité cu foité, 10—15 g gelatin si 7,5 ml dintr-un amestec rezultat din omoge- nizarea unui albus de ou cu 50 ml apa distilaté. Se incilzeste 15 minute la 115°C, Albusul de ou, prin coagulare, antreneaza toate substantele ne- dizolvate din mediu, clarificindu-t. Se fitreaza prin vata, se distribule in tuburi gi se sterilizeazd la 110°C timp de 20 minute, dupa care se las sa se solidifice in pozitie verticald. Insdmintarea se face prin injepare, prin introducerea acului in cen- trul mediului, astfel ca si ajunga pind la fundul tubului. Incubatia se face la 20—22°C urmarindu-se caracterul cresterii si producerea lichefierii la diferite intervale de timp. Aspectele sint diferite, in functie de speci dezvoltarea fara lichefiere, dezvoltarea in forma de perie de spalat epru- bete, in forma de brad rasturnat, aspect filiform, dezvoltarea cu lichefiere, aspect de pilnie, infundibuliform, napiform, de cupa ete. Daci germenul nu se dezvolté la 20°C se poate recurge la incubatia la 37°C, in acest caz fiind necesara tinerea culturilor la frigider inainte de interpretarea rezultatelor. Testul permite diferentierea unor specii bacteriene (streptococi —, salmonella +, E. coli —, Shigella —, Pasteurella —) sau a prezentei altor Pea (ia islstl sepals yates ceemunn Ong noliti Testul de lichefiere a serului coagulat se foloseste pentru punerea in evident a insusirilor proteolitice ale bacteriilor. Pentru prepararea seru- lui coagulat, se recolteaz singele in conditii aseptice si se distribuie in tuburi sterile, Coagularea se realizeazd prin incalzirea la 75°C in pozitie inclinatd. Rezulté un mediu de culoare albé-cenusie. Instminfarea in suprafatd se soldeazd, in cazul bacteriilor proteolitice, cu formarea unor depresiuni in dreptul coloniilor.Testul cultivérié bacteriilor in lapte se foloseste pentru a observa mo- dificirile pe care dezvoltarea germenilor le antreneazi prin multiplicare. In acest scop, laptele se degreseazd la separator sau prin separarea spon- tana a grasimii. Se controleaz4 pHi-ul care trebuie si fie in jurul neu- tralitatil. Se repartizeazd in eprubete, se sterilizeazd prin tindalizare la 100°C cite 30 minute sau la 110°C o singura data timp de 20 minute (nu se sterilizeazd la 115°C pentru cd la aceasta temperatura cazeina se pep- tonizeazd, lactoza se caramelizeazé si mediul dobindeste 0 culoare galbe- na). Pentru a putea observa modificirile de pH se adauga la mediu o solutie apoasa de tinctura de turnesol 10% sterila, pind cind se obfine 0 culoare violeta. Insiminjarea tuburilor cu lapte poate avea ca urmare lipsa oricdrei modificéri, coagularea fari acidifiere, coagularea insotité de acidifiere sau alcalinizarea laptelui, sau acidifiere, urmatd de coagulare si ulterior de peptonizare. Testul de hidroliza a cazeinei. La geloza repartizaté in tuburi, ste- rilizata si lichefiaté, se adauga lapte steril, degresat, in cantitate de 1—2 ml la 10 ml mediu. Amestecul se repartizeaz in placi Petri. In- samintarea se face in suprafaté. In cazul germenilor proteolitici, cazeina din lapte se hidrolizeaza si, in jurul coloniilor, mediul se clariticd. Testul de hemoliza se foloseste pentru a determina capacitatea de ‘a hemoliza globulele rosii apartinind unor specii variate (cal, oaie, bovine, cobai, iepure, om). Insusirea este prezenté numai la uncle specii sau tulpini bacteriene si este adesea legatd de patogenitatea acestora. Astfel, in cazul E. coli, tulpinile izolate din procese inflamatorii au aceasté ca- Pacitate, in timp ce cele putin sau deloc patogene nu o au. Capacitatea hemolizanta este prezenta in diferite grade si la unele tulpini de strepto- coci, corynebacterii, stafilococi, listerii, pasteurele (hemolytica), Cl. per- fringens, specii din genul Bacilius. Efectul hemolitic poate imbrica diferite aspecte in functie de specia si tulpina in cauzd. De exemplu, in cazul streptococilor, hemoliza poate fi: — de tip alfa, care se caracterizeazi prin producerea in dreptul in jurul coloniei a unei decolorari mai mult sau mai putin intinse, in- Fig. 24 — Hemolisi 69soit de o inverzire a mediului, datoritd modificarilor chimice de oxidare ale hemoglobinei (efectul viridans); zona respectiva aratd o hidroliza ade- varat dupa o conservare de 24 ore la frigider; — de tip beta, care se caracterizeazé numai prin decolorarea me- diului din dreptul si din jurul coloniei si denotd liza totala a globulelor rosii din zona respectiva. Tulpinile care, pe medi cu singe, nu au nici un fel de actiune asupra globulelor ‘rosii_se numesc anhemolitice sau de tip gamma si caracterizeaz8, de reguld, germenii lipsiti de patogenitate, atit in condifii experimentale cit si naturale. In cazul stafilococilor, hemolizinele au o activitate diferita faté de globulele rosii ale diferitelor specii animale, ceea ce a determinat cla- sificarea lor din acest punct de vedere in 3 categorii: a) stafilococi secretori de hemolizine alfa, activé fata de globulele rosii de iepure; }) stafilococi secretori de hemolizine beta, active fata de globulele rosii de oaie; ©) stafilococi secretori de hemolizine gamma, active faté de globulele rosii de iepure si foarte putin fata de cele de oaie. Hemolizinele alfa se inactiveaza la 60°C si se pare c& se reactiveazé printr-o reinedlzire la 100°C, in timp ce celelalte pierd numai partial activitatea lor la 56—60°C si se inactiveaza total la 100°C. Efectul he- molitic al toxinei de tip beta se accentueaza la ghetar. Pentru stabilirea capacitétii hemolitice, insAmintarea se face in su- prafaé, pe placi Petri, pe mediul continind singe defibrinat de diferite specii (bovine, ovine, ‘iepure, cal, om) in proportie de 5%. Citirea se face dupa o incubatie de 24 de ore la 37°C. Proba activitatii hemolizante se poate face si in mediu lichid, metoda prin care se poate realiza si titrarea capacitatii hemolitice. In acest scop, se amestecd in parti egale 0,5 ml cultura de 15 ore in bulion (sau bulion cu ser in cazul germenilor serofili) cu 0,5 ml suspensie 5% de globule rogii. Amestecul se tine 90 de minute la 37°C. Tulpinile care secreté hemolizine filtrabile, deci apartinind tipului beta, hemolizeazA in acest interval globulele rosii, lichidul clarificindu-se. Pentru titrare se rea- lizeaz amestecuri cu. concentratii descrescinde de cultura (0,5; 0,1; 0,01 tc.) cu un volum constant de suspensie de globule rosii. Testul indolului. Indolul rezulta din dezintegrarea triptofanului. Pen- tru punerea lui in evidenta se preferd culturile bacteriene in apa pep- tonaté fara zaharuri, care oferd rezultate mai fidele. Se folosese in acest _scop diferiti reactivi (reactivul Ehrilch-Bohme, reactivul Ehrlich modificat de Kovacs, reactivul Kovacs-Hoffmann) sau hirtii indicatoare, impregnate cu indicatori (Pingsheim, Kovacs). Cel mai frecvent se foloseste reactivul Ehrlich-Kovacs, care se adau- 4 cu ajutorul unei pipete, lao cantitate de 1—2 ml culturé proaspitd de 24 ore in apd peptonata, atit cit si formeze un strat de 1—2 mm Ja suprafafa mediului. Colorarea stratului de reactiv in rogu-inchis (din galben-deschis) este indiciul unei probe pozitive. Jn cazul folosirii hirtiei impregnate, aceasta se pregateste astfel: — se taie benzi de hirtie de filtru lungi de cca 5 cm gi late de 5-7 mm; 70— se imbibi cu reactiv Kovacs proaspat preparat sau reactiv Gil- — se usucd $i se pistreaz in sticle brune la loc uscat si intuneric. Benzile se fixeazi cu ajutorul dopului la tuburile insamintate cu ina de cercetat in mediu de api peptonatd. In cazul unei reactii , banda se coloreazi rosu sau roz. Dac reactia este negativé Se executd gi reactia dupé tehnica anterioaré. Acest test permite diferentierea salmonelelor si klebsielelor (indol- negative) de colibacili si pasteurele (indol-pozitive). Reactii pozitive dau si germenii din genurile Proteus (retigeri), Providencia, iar negative — Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Hafnia. In cazul hirtiei indicatoare, fisii de hirtie de filtra impregnate cu reactivul respectiv si uscate se imbibé cu cultura microbiand urmérin- du-se modificarea culorii acesteia, Se poate recurge §i la folosirea unor medii complexe (multitest) care Permit punerea in eviden{a a indolului si eventual a altor produse de dezasimilatie. Testul de evidentiere a H,S permite stabilirea capacitaii unor bac- terii de a dezintegra aminoacizii care contin sulf (cistina, cisteina etc.) sub actiuinea unor enzime specitice. In acest scop se pot folosi medii cu acetat de plumb sau benzi im- Pregnate cu aceeasi substanfa. In primul caz, pe medii solide cu acetat de plumb (tuburi sau pléci Petri) se face insdmintarea bacteriilor de cercetat si se incubeazd la 37°C. Daca ele produc H,S, me- (¢ diul se innegreste in jurul coloniilor H,S-pozitive, din cau- za sulfurii de plumb care rezultd, IY In cel de al doilea caz, benzi de hirtie de filtru de 6—8 em lungime si 8—10 mm létime, se imbibd cu 0 so- lufie 101% de acetat de plumb, dupa care se ustcd, se in- troduc in tuburi sau flacoane i se sterilizeaza la autoclav. Benzile astfel pregatite se introduc in tuburile cu mediul de culturé, pind la Indlfimea de aproximativ 1 cm deasupra suprafefei’ mediului. In cursul incubatiei, dacd._germenul produce H,S, banda se innegreste in porfiunea inferioard, eo lungime mai mare sau mai mica, in functie de can- titatea de gaz degajaté. Timpul de innegrire este variabil de la citeva ore la citeva zile. Germenii aparfinind genurilor Salmonella, Pasteurella, Citrobacter, produc HS in timp ce alfii (Escherichia, Shi- gella, Enterobacter, Klebsiella, Stafilococeus, bacilul mor- vei etc.) nu produc H,S. Testul de hidrolizd a ureei se face prin cultivarea ger- menilor pe anumite medii speciale (Christensen, Fergus- son, bulion cu uree). In urma inséminférii, bacteriile care hidrolizeaza ureea determina colorarea mediului respectiv fn rosu (initial este galben) datorit prezenfei amoniacului rezultat din metabolizarea ureel. Germeni ai genului Pro- teus hidrolizeazi ureea in timp ce Shigella, Escherichia, %a,cintorul ben Salmonella, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, “2° acclat" de Providencia sint negative sau slab pozitive. plumb n~ Reactii prin care se pun in evidenta fermentii aon identa fermentii Testul de reducere a unor substanfe colorante se bazeazd pe pro- prietatea unor bacterii de a reduce coloranfii organici transformindu-i in Jeucobaze incolore. Acestea, in prezenta oxigenului, redobindesc culoarea iniiala. Se folosesc in acest. scop, albastru de metilen, verdele de ma- lahit, indigo-carminul, molibdatul de amoniu, La 5 ml de cultura de 24 ore in bulion, se adauga o picitura din solufia apoas 1% de colorant, sterilé. Dupi omogenizare se adaugi citeva picdturi de oleu de parafind steril (daca reactia se desfasoard in tub) sau se recurge la inchiderea la flacdra.(dacd se folosesc fiole). Dupa © incubatie de 1—24 ore la termostat, se observa decolorarea mediului, care indica 0 reactie pozitiva. Testul de reducere a nitrafilor in nitrifi (denitrificare). Bacteriile de cercetat se cultiva in medii confinind nitrat de potasiu. Dupi 3—5 zile de incubatie, se adauga cite 5 picdturi din cei doi reactivi Griess-llosvay. In caz pozitiv, mediul se coloreazi in rogu. Daca reducerea nitratilor nu a avut loc, culoarea mediului nu se modifica. Testul Voges-Proskauer urmareste punerea in evidentd a acetil- metil-carbinolului, un metabolit rezultat prin oxidarea butilenglicolului. Foloseste pentru cultivarea germenilor mediul avind urmatoarea compozitie: — pepton’ Witte 50g — K,HPO, 50 g — glucoza 508 — api distilata 1.000,0 mi Se ajusteazi pH-ul la 7,1, se filtreazd, se autoclaveazd gi se repar- tizeazd in tuburi. 2-2 de cultura de 3—4 zile pe mediul Voges-Proskauer se adau- g4 1 ml dintr-o solutie alcoolicd 60/4 de alfanaftol si 0,4 ml KOH. Reactia Pozitiva se manifest prin schimbarea culorii in roz-rosu’ in decurs de Giteva minute pind la citeva ore. Testul cu rosu de metil se practica in acelasi scop ca si reactia pre- cedenta. Se foloseste in acest scop cultivarea germenilor pe un mediu avind ‘urmatoarea compozitie: — pepton’ special 7.0 g = glucozi 50g — fosfat bipotasic 50 g — api distilata 1.000,0 mt Se ajusteazd pH-ul la 6,9—7,0, se repartizeazd cite 5 ml in tuburi, se sterilizeazi 10 minute la'121°C. Inséminjarea se face cu o picatura din cultura tinara in apa peptonaté sau cu ansa dintr-o cultura tindrd e agar inclinat. Se incubeazA 48 ore — 4 zile la 37°C dupa care se adaugé 5—6 picdturi din reactivul rogu metil, constituit din 0,1 g rosu metil, 300 mi alcool etilic 96° si 500 ml apa’ distilata. Reactia pozitiva 2const in colorarea in rogu a amestecului, reactia slab pozitiva in rogu- portocaliu si negativé in culoarea galbend sau slab portocalie. In mod similar se pot folosi si alfi reactivi. — Reactivul O'Meara consta din 40,0 g hidroxid de potasiu dizolvat in 100 mi apa distilata, la care dupa racire se adauga 0,3 g creatind monohidricd si se dizolva. Solutia poate fi pistrata la frigider (+4°C) cca 1 luna. Din acest reactiv se adauga culturii de cercetat 5 ml, reactia pozitiva find data de colorarea in rosu trandafiriu a amestecului, dupa agitare viguroasé si apoi lsare in repaus. Colorarea incepe de la Supra- fafa si in decurs de eca 4 ore cuprinde tot amestecul. — Reactivul Leifson se prepara din 1,0 g sulfat de cupru dizolvat in 40 ml amoniac concentrat (min. 25¢/) la care se adaugd 690 ml so- lutie de hidroxid de potasiu 10%. Din acest reactiv se adaugd 5 ml fiecdrui tub cu cultura de cercetat. Reactia pozitiva consta in colorarea fn rogu a amestecului. — Reactivul Barrit se prepara dizolvind 5 g alfa naftol in 100 ml ethanol. Reacjia se executd adiugind culturii proaspete de 1—2 zile 3 mi de reactiv si 1 ml KOH 40%. Reactia pozitiva este daté de colorarea in rosu. Testul catalazei se foloseste pentru punerea in evidenta a existentel catalazei in culturile pe medii solide sau lichide. Se foloseste apa oxi- genata 3%. In cazul culturilor pe medii solide se pune o picitura de apa oxigenatd pe lama de microscop si se adaugi cu o ansi bacteriolo- gicd o cantitate de cultura. Reactia pozitiva este data de aparitia unor ule de gaz (oxigen) care se degajé cu o intensitate variabila, in functie de cantitatea de catalazi existent in cultura, In cazul culturilor pe medi lichide, se amesteci 5 ml din cultura in bulion triptts-de.24 de ore cu 3 ml solutie de apa oxigenaté. Reactia pozitivd este dati de producerea unei efervescenje cu degajare de bule de oxigen, care dureazi 1—2 minute. Reactia devine mai evidenta daca, inaintea solutiei de apa oxigenata, se adaugd la cultura o cantitate ‘egal dintr-o solutie 100, de spun. Testul oxidazei se efectueazi depunind citeva picituri dintr-un reactiv constituit din solutie apoasd 1% de clorhidrat de tetrametil parafenilen diamina sau oxalat de dimetil parafenilen diamind, preparat, ex tempore pe un fragment de hirtie de filtru Whatman nr. 1, avind dimensiunile de 6 x 6 cm. Cu o ansa se ia din cultura de cercetat si se depune pe hirtie ca la executarea unui frotiu. Reactia pozitiva este data de aparitia unei colorafii rosii-brune spre negru in dreptul culturii depuse intr-un interval de 5—10 secunde, iar reactia negativa, de lipsa oricdrei modificéri a hirtiei imbibate. Reactia se poate scuta si in placi Petri cu culturi, depunind reac- tivul direct pe colonii. In cazul unor colonii oxidazo-pozitive, acestea devin suecesiv rosii, brune, apoi negre. Testul decarboxilazei — Falkov foloseste un mediu de baza avind ‘urmatoarea compozitie: — pepton’ Bacto 5.0 — extract de drojdie de bere 30 g 3= glucozi 10g — bromerezol purpur (sol. alcoolica 1,6%) 1,0 ml — api distilata 1.000,0 ml pE-ul = 6,7—68 ‘Mediul se imparte in 4 parti egale, dintre care la 3 se adauga ami- noacizit: L-lizina dihidrocloricé, L-arginina monohidroclorica, L-ornitina dihidrocloricd, toate in concentratie de 1%, iar ultima servegte drept martor. Se reajusteazi pH-ul mediilor cérora li s-au addugat amino- acizi, se repartizeazd cite 3—4 ml in tuburi de 100/10 sau 120/12 mm i se sterilizeazd 10 minute la 121°C. Dacd aminoacizii sint in forma DL se folosesc in concentratie dublé — 2%, Insdminjarea se face cu ansa, dintr-o cultura tindra pe agar inclinat i apoi se adaugé un strat de oleu de parafina steril, gros de 4—5 mm, inclusiv in tuburile martor. Incubarea la 37°C timp de 4 zile este ur-~ mata de interpretare. Reactia pozitiva este dat de alcalinizarea mediului (datorita de- carboxilarii) cu schimbarea culorii sistemului de indicatori, de la galben la violet sau rosu-violet. Majoritatea reactiilor pozitive apar in primele hss Hest neghlirh extn, inden ec cloare pelbend (= acid al mediului). Reactii care urmarese punerea in evidenta a folosirii €q sursd de hrand a unor substraturi confinute in mediu Testudscultivarii pe medi cu citrat de sodiu. Mediul confinind citrat de sodiu est@-favorabil dezvoltarii numai anumitor bacterii (de exemplu Enterobacter, Citrobacter, S. gallinarum), in timp ce altele (de exemplu Shigella, Escherichia coli, S. pullorum) nu pot folosi citratul ca sursd energeticd. Cele care se dezvoltd, prin alcalinizare determina si virarea culorii verzui a mediului, catre albastru intens. Teste speciale foloste pentru identficarea micobacterilor In practica laboratoarelor de specialitate au intrat in ultimii_ani © serie de reactii pentru testarea capacitafii metabolice a micobacteriilor, reactii care au devenit indispensabile pentru incadrarea de specie. Cele mai importante dintre acestea sint testul niacinei, catalazei, nitrat-re- ductazei, hidroliza Tween 80, determinarea spectrului amidazic. Pentru cercetari de profunzime privind stabilirea caracterelor diferitelor tul- ini se poate face si stabilirea capacitafii zaharolitice. Testul niacinei. Tuburilor de cultura proaspat pe mediul Lowenstein- Jensen li se adauga cite 1 ml apa distilata, Se pun apoi la autoclavul eu capactl deschis timp de 20 minute, dupa care se scot si se lasa si se riceascd. Din lichidul de extractie se pune cite o picaturd pe o placa de plastic sau preferabil porfelan, prevézuté cu godeuri, Se adaugd 1 picdturd dintr-o solutie 4%/ de anilind in alcool etilic 90°, preparaté ex tempore si o picdturé de bromura de cianogen. Este indicat ca placa sé se Pund intr-o nisi cu evacuare, pentru a evita inhalarea vaporilor toxici, Reactia pozitiva const in aparitia unei coloratii galben-canar 4(sugele umane), iar cea negativa in pastrarea culorii initiale (susele bo- vine gi aviare), Dupa o alta tehnicd, se adaugd tubului cu cultura studiaté 1 ml ser fiziologic steril, se las 20 minute in pozitie inclinaté, in aga fel incit cultura s& fie total acoperita. Se scot apoi 0,5 ml cu o’ pipet si se pun intr-un tub de reactie. Se adauga 0,5 ml din solutia de anilind 4% si 05 ml dintr-o solutie de 10%/ de bromura de cianogen (BrCN). Reactia ozitiva este indicata de coloratia galbena. Acest test se poate efectua si dupa o a treia metoda. In acest scop, se iau doud anse din cultura de cercetat, se pun in eprubete continind 1 ml de apa distilata, se fierb timp de 1/2—1 ord, se adauga 1 ml dintr-o solufie 1%/ de KCN 'si 1 ml dintr-o solutie 5% ‘de cloramina T, prepa- ratd ex tempore. Reactia pozitiva este data de aceeasi colorare in galben a amestecului. Intotdeauna, este necesar si se efectueze gio probé martor folosin- du-se cultura de M. tuberculosis tulpina H,,Rv pentru comparatie (martor pozitiv). Proba catalazei se efectueaza prin punerea in contact pe lama, a tunel anse cu cultura de micobacterii, cu o picdtura de apd oxigenata solutie 30% (din solutia de apa oxigenata de 30 de volume, existenta in comer} se ia 0 parte, la care se adauga 3 parti de apa). Interpretarea reactiei se face prin aprecierea cantitatii de gaze de- Bajatd, in sensul cd, cu cit existé o cantitate mai mare de catalazd in culturd, cu atit cantitatea de oxigen degajaté este mai mare. Pozitivi- tatea acestei reactii este legata de specie si tulpind, fiind slabé la tipul uman, inconstanté la tipul bovin si intensd la tipul aviar i alte mico- bacterii atipice. Proba nitrat-reductazei. In tuburi de reactie corespunzitoare nu- meric tulpinilor cercetate, se pun intii 0,5 ml dintr-o solutie de NaNO, (85 mg NaNO, crist. in 100 ml apa distilata avind pH-ul 7). Se adauga apoi 0,5 ml dintr-o suspensie micobacteriand omogend, confinind 10 mg germeni pe ml, in solufie tampon fosfat la pH 7,2. Tuburile se pun la incubatie la 37°C timp de 24 de ore. Se adauga apoi 0,5 ml dintr-o solutie de sulfanilamida (1 g de sulfanilamida in 75 ml apa distilata ++ 25 ml HCI) si 0,5 ml dintr-o solutie 0,02% de naftiletilendiamind in apa distilaté. Se ‘lasi 10 minute, dupa care se face citirea. Reactia pozitiva este data de colorarea in’ verde-albastrui a amestecului. Nuanta este variabilé in functie de cantitatea de nitriti care rezulti din reducerea nitratilor. Reactia este pozitiva in cazul M. tuberculosis, negativa la M. bovis gi variabila la celelalte micobac- teri Hidroliza Tween-80. Se foloseste o solutie substrat formata din: — solujie tampon-fosfat M/15 (pH 7) 100,0 mi = Tween—80 0,5 mi = solufie apoasi de rosu neutru 0,1% 2,0 ml Se repartizeaza in eprubete sterile, in cantitate de 2 ml, se auto- claveazd, obtinindu-se 0 solutie de culoare galbend-carmin. Solutia se poate paistra la -+4°C cca 2 séptdmini In tuburile continind acest substrat se insiminteazi tulpinile de cercetat (cite o ansd de cultura pentru fiecare tub) fara a se omogeniza in mediu. Se incubeazd timp de 5 zile la 37°C, cind se face o citire in- 3termediar’, iar dupa alte 5 zile cea definitiva. In caz pozitiv, culoarea mediului vireazd de la galben-carmin la roz sau chiar rosu.” Tuburile nu trebuie agitate. O reactie pozitiva este concludenta daca coloratia Toza sau rosie intereseaz numai solufia-substrat, nu si cultura, Ca martori, se folosese un tub cu solutie-substrat neinsdmintata (control negativ) si un tub insimintat cu M. kansasti (control pozitiv). ‘Tipul bovin si aviar dau o reactie negativa la ambele citiri, in timp ce alte micobacterii (kansasii, flavescens, gastri, terrae, smegmatis, phlei, ‘marinum) dati reactii pozitive. Tipul uman dao reactie discreta. Determinarea spectrului amidazie at micobacteriilor. Se dizolva intii amidele de cercetat in api distilaté sterild, incdlzindu-se la 60°C (la baia de apa). In mod obisnuit se foloseste o serie de 10 amide (mica serie a lui Bénicke) in urmatoarele concentrafii exprimate in mg/100 ml: acetamida 9,68 benza: 19,48 ree 984 izonicotinamida 20,0 pyrazinamida 20,16 nicotinamida «20,0 salicinamida 22,46 allantoina 26,0 succinamida 19,0 10 — malonamida 16,72 eevee 1 Din solutiile astfel preparate, se repartizeaza cite 0,5 ml din fiecare, in atitea tuburi de reactie cite tulpini se cerceteaza. In solutie tampon la pH 7,2 se realizeazi suspensti bacteriene omo- gene din tulpinile de cercetat, in concentratie de 10 mg bacterii la 1 ml solufie, Pentru o niai bund omogenizare este preferabil si se recurgé la tuburi de centrifugi sterile, a cdror tara sa facut pentru fiecare in Parte, la balanta analitied (cu 2 zecimale), in care se repartizeazd cite 3—4 anse de mas bacteriand raclata de pe suprafata mediului Léwen- stein-Jensen (culturi proaspete). Apoi eprubetele se recintaresc, stabil du-se exact greutatea germenilor. Cu baghete de sticli de cca 5 mm diametru, sterile, se omogenizeazi apoi cultura pe pereii tubului, pind se obtine 0 pasta cit mai omogend. Se adauga 0 cantitate redusi de so- lufie fiziologicd gi se continua omogenizarea, realizindu-se 0 suspensie uniforma. Aceasta se dilueazé pind la un volum de 4—5 ml $i se su- Pune centrifugarii timp de 10 minute, la 3000 t/minut. Se varsa lichidul supernatant Intr-un vas (care apoi se va steriliza), se omogenizeaza din nou cu o bagheta si se adauga solutie fiziologica pind Ja volumul initial. Se recentrifugheaz, se varsi lichidul, se omogenizeaz si se adauga (eventual fractionat) 0 cantitate de solutie tampon, variabila in functie de cantitatea de mas& bacteriand cintérita initial, in aga fel incit concentratia realizatd si fie de 10 mg/ml (de exemplu dacd cultura Boece Od- me vo sorpentooats fn:6) al sabe tampon foe fat). Peste solutiile de amide, repartizate in prealabil in eprubete, se adauga cite 0,5 ml suspensie ‘bacteriand pentru fiecare tub cu amida si ‘se omogenizeaza amestecul, se pune la incubatie la 37°C timp de 22 de ore, dupa care se efectueazi reactia de testare proprit-zisd 6Fig. 26 — Omogenizarea culturii cu ajutoral baghetel de aticld In eprubete de sic In acest scop, se adauga in fiecare tub cite 1 ml reactiv fenol, 0 picdtura dintr-o solutie de sulfat de mangan gi 0,5 ml apa de Javeile, Pregatite dupa indicafiile care urmeaz. Amestecul are 0 culoare galbend- pai, Totul se pune la etuva la 80°C timp de 15 minute, dupa care se las si se raceasca si se face citirea. Reactia pozitiva consta in aparitia unei coloratii de nugnte diferite, de la galben-verzui la albastru-inchis, {in functie de cantitatea de enzime confinute in cultura. M. tuberculosis ave spectrul amidazic 3,5,6 (uree, nicotinamida, razinamida), tipul aviar spectrul 5,6 (nicotinamida, ‘pyrazinamida), ia tipul bovin fermenteazé numai rareori urea (3). La celelalte micobacterii ‘este variabil cu specia. Reactivul fenol se preparé punind 250 g fenol cristalin (anhidru) intr-un pahar Berzelius de 500 ml care, la rindul lui, se pune intr-o baie marina la maximum 40°C. Separat se dizolva 108 g NaOH cristalin fn cca 500 mi apa distilati rece. Prin dizolvare incdlzindu-se, trebuie ricit apoi la api de robinet. Cind ambele substanfe s-au dizolvat, se toarnd hidroxid peste fenolul solubilizat si se completeazd la 1000 ml cu apa distilata. Solufia trebuie sa aibao culoare galbend-pai si se Poate pastra In sticle brune, etange, la frigider, cca 1 lund. ‘Solutia de sulfat de mangan se prepara dizolvind 66,92 MnSO,-4H,0 in 100 ml apa distilata; se pastreazd la frigider, in sticle brune. Apa de Javelle (hipoclorit de soditi 25%) se prepara conform refetet obignuite, dar se dilueazd pentru Iucru in proporfie de 1/10 (1 parte apa de Javelle bruté + 9 parti de apa).Determinarea sensibilitatii germenilor fata de substanfe antibiotice si chimioterapice Determinarea sensibilitati fata de antibiotice {antibiograma) Aceasti operatiune are o deosebita important practic’, ea furnizind date foarte utile pentru aplicarea corecté a misurilor terapeutico-profi- lactice. Intr-o serie de boli bacteriene (holera aviara, colibaciloza viteilor, mamitele stafilococice, infectiile salmonelice, listeriene etc.), administra- rea antibioticelor, mai ales in tratamentele de masi, este indicat si se faci numai dupa ce s-a stabilit spectrul de sensibilitate a agentilor cau- zali fat de acestea. In special in etapa actuald, cind tulpinile rezistente fata de antibiotice, chiar cu spectru larg, sint din ce in ce mai frecvent semnalate, este imperios necesar, atit din punct de vedere economic cit si din considerente epizootologice, si se actioneze cu substante eficiente. ‘Mecanismul antibiogramei se bazeaz& pe inhibarea dezvoltirii unei culturi microbiene puse in contact cu doze variate de antibiotice pe me- dif de cultura adecvat Testarea sensibilitafii fafa de antibiotice se poate face prin dowd metode mai importante: metode difuzimetrice; metode folosind dilutii seriate. Metodele difucimetrice se bazeazd pe insusirea solutiilor de antibio- tice de a difuza in mediul de culturd pe diferite distante de la punctul in care sint puse. Ca medii_ nutritive se folosesc geloza simpla, geloza cu ser (pentru speciile serofile) sau medii speciale (pentru germenii care se cultiva nu- mai pe asemenea medii). Ca metode de lucru, existd descrise o serie de tehnici: tehnica ron- delelor de hirtie de filtru imbibate cu diferite antibiotice, tehnica ben- zilor de hirtie de filtru, tehnica cilindrilor sau tuburilor de sticla cu agar, tehnica agarului cu godeuri, tehnica jgheaburilor in agar, tehnica difuztunii verticale, tehnica microcomprimatelor. Deoarece la noi in fara, la ora actuala cel mai larg folosita este teh- nica microcomprimatelor standardizate, va fi descrisd In amanunt numai aceasta. Pe mediile de cultura amintite, turnate in plici Petri si zvintate prin finerea la termostat cu. capacul semideschis timp de 20—30 minute, se face inséiminfarea culturii microbiene de cercetat. In acest scop, din 8Fig. 27 — Set de microcomprimate cu antibiotice ‘penta antibiograma culturi ‘de 18-24 de ore in bulion, se realizeazi mai intii o dilutie de 40-? in ser fiziologie steril (in caztl streptococilor), de 1/200 (in cazul stafilococilor). Diluarea se realizeazd pentru a obtine colonii foarte dese, dar nu confi te. Din suspensia microbiand rezultata se ia cu o pipetaé Pasteur 0 cantitate de 1—1,2 ml care se depune pe suprafata mediului, fn apropierea flacirei. Prin inclinéri repetate se disperseaz apoi sus” pensia pe toaté suprafaja, dupa care excesul de cultura se scoate cu Ajutorul aceleiasi pipete i se arunca in vasul cu dezinfectant. Insimin~ farea se mai poate face si cu ajutorul unui tampon sterilizat, imbibat cu suspensia bacteriand, cu care se umectea2A apoi, in mod uniform, in- freaga suprafata a mediulul, Mediul astfel insaminfat se pune din’ now Ja termostat cu capacul plicii semideschis, pentru zvintare, timp de 20—30 minute. Apoi, cu ajutorul unei pensete flambate in’ prealabil, se repartizeaza’ microcomprimatele, avindtiese grija ca acestea si fie la Fig. 28 — Set de rondele cu antibiotce pentru antibiogramt 79cca 15 mm de periferia mediului si la cca 30 mm unul de altul $1 ca simbolul imprimat pe microcomprimate, care indicd antibioticul cores~ Punzdtor sd fie deasupra (de exemplu A — ampicilind, C — cloramfe- nicol, E — eritromicina, K = kanamiciné, O — oxacilina, P — penicilina G, S'— streptomicina, 'T — tetraciclind, 'L — lincomicing, No — novo- biocina, R — rifampicin, Ne — neomiciné, Po — polimixina, B = ba- citracina etc,). Pentru 0 amplasare corecté’ se pot folosi sabloane care se agazd sub placa cu mediu inainte de a incepe operatiunea, Placile se pun apoi la termostat, rezultatele interpretindu-se dupi 18-24 de ore de incubatie. Citirea const in aprecierea marimii zonelor de inhibitie indusd de antibiotic, zone in care coloniile microbiene lipsesc. Diametrul acestora este direct proportional cu sensibilitatea germenului respectiv, Jn sensul c& cu cit substanfa antibioticd este mai activi, zona de in- hibare a dezvoltarii microbiene este mai extinsa. Metodele cu dilufit seriate folosesc solutii de antibiotic in apa bi- distilata neutra sau in solufii tamponate la pH 7. Majoritatea antibioti- celor se dizolv cu usurinta. Aureomicina si terramicina nu sint insé Fig. 29 — Antibiograma (A, B — grade diferite de sensibilitate fajd de antibiotics)Fig. 30 — Dispositiv original de distribuire automat a ‘microcomprimatelor de antibiotice in plille de agar solubile decit in apa acidulaté (aureomicina se dizolva intr-un amestec de 20 picdturi dintr-o solutie 1% acid sulfuric pa. la 10 ml apa, avind un pH final de 4,2—45 iar terramicina in solutie de acid clorhidric la PH 6). Eritromicina se dizolva in alcool metilic (10 ml metanol pentru 0,025 g eritromicind, se completeazi pind la 100 ml cu apa distilata tamponata la pH 8). Conservabilitatea acestor solufii nu este de lungé duraté (penicilina 7 ile la +4°C, streptomicina 10—14 zile, aureomicina 12 zile). lle de antibiotic, se fac dilufii succesive in bulion steril, fn asa fel incit s4 se obfind in fiecare tub 0 concentratie precis cunoscuta pe mi. Inifial acestea se fac din 10 in 10, urmind ca, in cazul cd este Recesaré o determinare mai precisd, si se faci si diluii intermediare De exemplu, in cazul penicilinei se folosesc dilutii de 100; 10; 1; 0,1; 0,01 SPs sropcrsicins 1005 20515 1 OT Oe mlezoese: me/mi. In fiecare dilutie, inclusiv in tubul martor, fara antibiotic, se insd~ minjeaz4 o cantitate constant din cultura in bulion de 24 de ore din tulpina de cercetat (in mod obisnuit se pun in fiecare tub 1—2 picd- turi din dilutia 1/1000; se pot folosi si culturi tinere de 3—4 ore, nedi uate). Se incubeaz tuburile insiminfate timp de 18—24 de ore la 37°C, dupa care se face interpretarea. Tubul martor trebuie s4 contind 0 cul- tur corespunzatoare tipului cultural al speciei. In cazul germenilor sensibili, in primele tuburi ale seriei, in care cantitatea de antibiotice este mare, mediul amine nemodificat, pentru ca in ultimele aspectul si fie apropiat sau identic cu cel din tubul martor. Titrul bacteriostatic este indicat de cantitatea minima de antibiotic fare a fost capabild si produca o inhibare totala a deavoltari. Indiferent de metoda intrebuinfatd, 0 determinare de’ precizie ne- cesitd compararea cu sensibilitatea unor tulpini cu sensibilitate cunoscuta si de asemenea, cu antibiotice etalon, avindu-se in vedere diferentele €are pot exista’intre produsele apartinind unor firme diferite. Dintre tulpinile microbiene mai frecvent folosite in acest scop, Pot fi amintite 81tulpina de stafilococ auriu Oxford 12, tulpina de Bacillus subtilis Mar- burg, tulpina de E. coli Bruxelles. Dozarea antibioticelor din singe si umori se poate realiza fie prin metoda difuzimetricd, fie prin dilufii seriate. Metoda dilutillor este pre- feraté deoarece rezultatele cantitative oferite sint mai precise. In acest scop, se recolteaz aseptic singe si, dupa exprimarea serului, se pastreazdi la frigider pind in momentul dozarii (nu mai mult de 24 de ore). Pentru neutralizarea activitatii antimicrobiene native a seralui se recurge la © prealabild inactivare la 56°C ({Incdlzirea este insd contraindicaté in cazul penicilinei, care este termosensibila, procedindu-se la inactivarea prin metode chimice). In 16 tuburi de reactie sterile se repartizeazi cite 1 ml bulion (de preferinja operatiunea se face cu 24 de ore inainte pentru a permite In primele 8 tuburi se fac dilu fiecare dilutie flind cuprinsa intr-un volum de 1 ml (in cazul penicilinel de exemplu, se realizenzi 1; 05; 0,28; 012: 006; 009; 0.015 si 0,007 Ud. pe ml). In celelalte 8 tuburi se fac dilutii succesive’ din serul de exa- minat: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 1/64, 1/128, 1/256 — ambele serii de tuburi se ‘insétninjeazd cu cite o picdturd din cultura de cercetat de 18—24 de ore, diluaté 1/1000 si se pun la termostat timp de 24 de ore. In interpretarea rezultatelor se noteazA cantitatea minima de anti- biotic si dilufia maxima de ser, care au inhibat total dezvoltarea tulpinii sensibile. Dilujia maxima inhibatd de ser va contine o cantitate de an- tibiotic egalé cu cantitatea minima inhibanta. Cantitatea de antibiotic din ser, pe unitatea de volum, se objine inmulfind cantitatea minima de antibiotic intrebuintata cu dilutia maxima inhibanta de ser. De exem- plu, dacd in seria cu dilutiile de penicilind, ultimul tub in care s-a pro- dus inhibitia corespunde unei cantitati de 0,06 ULI. iar in seria dilutiilor de ser ultimul tub in care cultura este inhibata de 1/32, cantitatea de pe- nicilind din ser va fi egal cu 0,06 32—=1,92 U.L/mi. Testarea rapida a sensibilittji fata de antibiotice prin metoda mi- crocoloniilor a fost elaboraté de MAHONY si CHADWICK si permite obtinerea rezultatelor in decurs de 4 ore. Se practicd pe placi cu agar si foloseste direct materialul patologic suspect. Suspensiile de antibiotice se fac la o concentratie de 1 mg/ml in apa distilata sterild. Ele se adaugi agarului proaspat topit la 50°C si repartizat in strat subtire in placi. Concentrafia antibioticului in agar este: — penicilina 0,1 gi 1,0 unit./ml critromicina ——_0,4 $i 0,8 micrograme/ml novobiocina «si 36-_micrograme/ml tetraciclina 5 micrograme/m! streptomicina 5 micrograme/ml cloromicetina 8 icrograme/ml 6 micrograme/ml 6 micrograme/ml 3° si 10. micrograme/ml 20 unit. /ml 20 _ micrograme/m! 1,6 micrograme/ml 1,0 microgram /mlis Mar- — methicitina 5 micrograme/m! = ampicilina 6 si 20 micrograme/ml ‘Metoda se poate practica in cazul fecalelor, urinei, singelui sau altor materiale patologice. Fecalele se suspend mai intii in solutie fiziologica sterild, in proportie de 1/4. Urina gi singele se dilueaz in proportie de 1/10 pind la 1/100. Din aceste dilufii, se fac insdminfarile pe placile cu mediti confinind antibiotice si pe placile martor cu mediu fara antibiotice §i se incubeazA 4 ore la 37°C. Suprafafa agarului este apoi examinata ia microscopul obisnuit. Mai intii se examineaza placile martor. Interpre- tarea se face astfel — cresterea pe plicile martor si pe cele confinind antibiotice este egald, cea ce denota rezistenta totala; — cregterea pe placile martor, cuplaté cu lipsa oricirei dezvoltiri pe plicile insdminfate cu material patologic, denota sensibilitate totala; — cresterea unor colonii mai putin numeroase pe plicile continind antibiotice fat de placile martor, denota sensibilitate moderata, inter- pretabila variabil, dupa intensitatea dezvoltarii. Determinarea sensibilitatii fafa de antibiotice si chimioterapice a micobacteriilor. In operatiunile de testare a acestei sensibilitati, Uniunea Internationalé contra tuberculozei a stabilit atit jaloanele principale cit ‘si metodologia de lucru, in vederea uniformizdrii acestora. In acest sens axarea pe mediul Léwenstein—Jensen a devenit necesard pentru a asi- gura rezultate comparabile pe plan international. Au fost de asemenea stabilite concentrafii standardizate de tuberculostatice, care se inglo- beazi in mediile de cultura. In acest scop, din culturi proaspete de micobacterii pe mediul Li- wenstein—Jensen se ia 0 ansi bacteriologica avind diametrul de 3 mm (@iametru interior) incdreaté si se pune intr-un balon rotund sterilizat de 150 ml si care confine 4 perle de sticla. Se las materialul de pe ansa fn balon si se flambeazd ansa sub protectia unui clopot de sticld montat la becul de gaz (pentru a evita eventuala imprigtiere a germenilor in cursul flambarii). Flacoanele se numeroteazd cu indicativele tulpinilor de cercetat. Se omogenizeaz temeinic cultura din baloane cu ajutorul per- lelor de sticla, prin migcdri de rotatie, pind se obtine o pasta uniforma Pe peretii vaselor (5—10 minute). Se adauga apoi 1—2 ml de apa disti- lata sterilé si se omogenizeaza din nou, pin se realizeazd 0 suspensie ‘omogend. Se pregatese apoi seri de cite 3 balonage Erlenmayer sterile Pentru fiecare tulpina, corespunzitoare celor 3 dilutii de germeni cu care se lucreazA si se pun cite 2 ml apa distilata sterila in primul balon, 1,8 ml fn al doilea si 1,8 ml in al treilea. Se iau din balonul cu perle continind suspensia unicd bacteriand primard, cu ajutorul unei pipete sterile, 0,2 ml gi se pun in primul balonag cu apa distilatd. Suspensia obtinutd se ajusteazd apoi la o turbiditate corespunzatoare unui confinut de 10 000 000 ‘germeni pe ml prin comparatie cu 0 scaré Brown. Din aceasté dilutie se trec apoi in balonagul urmator 0,2 ml obti- nindu-se 0 suspensie de 1000000 germeni pe ml. Dup& omogenizare se fau alti 0,2 ml si se trec in ultimul balon, obfinindu-se astfel dilutia de 100 000 germeni pe ml. Dilufia finala se las fn repaus pind a doua 2i cind se fac insimin- firile. Acestea se efectueaz luindu-se 0 ans bacteriologica din suspen- sia respectiva, cea ce corespunde aproximativ cu 10 000 de germeni. 83Insdminfarea se face pe tuburi cu mediu Léwenstein—Jensen avind Inglobate diferitele tuberculostatice, faté de care se face testarea. Concentratiile principalelor tuberculostatice cu care se lucreazd in mod curent sint urmatoarele: streptomicini 4 si respectiv 10 gamma/ml PAS 1 gi respectiv 10 gamma/ml Nizotin 20 $i respectiv 30 gamma/ml HIN 0,2 1 respectiv 1 gamma/m! Etambutol 3 si respectiv 5 gamma/ml Rifampicins 20 i respectiv 40 gamma/m! Viomicina 20 $i respectiv 30. gamma/ml Tuburile cu. mediu se noteaz inainte de Insdminjare cu indicativt ‘ulpinii, tuberculostaticul si concentratia acestuia din mediu. Suspensia bacteriand de insiminfat se disperseaz cit mai_omogen pe suprafata mediului, inoculindu-se din fiecare proba cite dowd tuburi. Din aceeasi dilutie se insiminteazé de asemenea, ca martor, cite doud tuburi pe mediu lipsit de tuberculostatice. Tuburile se astupa cu dopuri de vata si tifon, care se parafineazd, sau cu dopuri de cauciue prevazute ccu orificii de aerisire speciale (un fir de ata trecut prin dop). Se pun apoi la incubatie timp de 21 de zile, dupa care se face interpretarea re~ zultatelor in functie de modul de dezvoltare a coloniilor pe mediile cu diferite concentrafii de tuberculostatic si prin comparatie cu tubul mar- tor. Rezultatele se noteaza astfel: +++ crestere confluenta, denotind rezistenta totala faté de tuberculosta- ticul respectiv; +* colonii izolate, numeroase, ce nu pot fi numdrate, denotind o rezis- tent moderata; * colonii ce pot fi numérate, find in numar de 20—100 pe intreaga su- prafaid a mediului, denotind o rezistenté redusd (existenta unui nu- mar de sub 20 colonii se specifica de asemenea, indicind 0 rezistenta i mai redusa 0 lipsa dezvoltarii, denotind sensibilitatea totald a tulpinii. Determinarea actiunii antibacteriene a substantelor antiseptice si dezinfectante Valoarea antibacteriand a unei substanfe se apreciaza prin compara fie cu o altd substantd, cel mai frecvent folosindu-se fenolul. In acest Seop se determina indicele sau coeficientul fenolic, exprimind de cite ori o substanfd este mal activa sau mai slabai decit fenolul. Pentru a determina indicele fenolic se fac inti dilutii seriate din solutia antisepticd de cercetat, Se amestecd apoi cite 1 ml din fiecare di- lufie cu cite 1 ml din cultura bacteriand in bulion de 24 de ore. Dupé 5 minute de la inceperea efectuarii dilutiilor, deci 5 minute de contact intre germeni si substanta de cercetat se fac transplantiri cu ansa bacteriologicd, din fiecare tub din prima serie de tuburi cu bulion. Dupé alte 5 minute, deci la 10 minute de contact cu substanfa de cercetat, se face 0 noua insiminfare din fiecare dilutie in alté serie de tuburi cu bulion. 84Paralel cu substanta de cercetat se procedeaza la aceleasi operafiunt eee eer eres (6 si 10 mi- ute). ‘Tuburile insdminfate se pun la incubat gi, dupi 24 de ore, se face Citirea. Se noteazd dilutia maxima de fenol si respectiv de substanté de cercetat care inactiveazd suspensia bacteriand in 10 minute dar nu in 5 minute. Pentru calcularea indicelui fenolic se impart cele doua cifre {aceea a dilutiei active a substanfei cercetate a cifra dilutiei active de fenol). De exemplu, daca ultima dilutie activa la 10 minute dintr-o substanta examinata este 1/10, iar ultima dilutie activa de fenol este 1/80, indicele fenolic este dat de formula: 00