CAPITOLUL 2.

ELEMENTE DE TAXONOMIE MOLECULARĂ A DROJDIILOR

2. 1. PRINCIPALELE ANALIZE FOLOSITE ÎN CARACTERIZAREA,

IDENTIFICAREA ŞI CLASIFICAREA DROJDIILOR

Un pas esenţial în studiul tulpinilor de microorganisme, este clasificarea lor taxonomică şi

stabilirea relaţiilor filogenetice dintre acestea. Deşi studiile asupra drojdiilor datează de peste un
secol, în ciuda unui vizibil progres, încă nu s-a reuşit punerea la punct a unui sistem acurat de
clasificare. Acesta ar permite, printre altele, găsirea unui tratament adecvat împotriva diferitelor
infecţii microbiene, înţelegerea interacţiilor între specii în natură, selecţia unor organisme cu
proprietăţi optime în industrie şi în alimentaţie (Kurtzman, 1988; Anghel, 1991).

La drojdii, unitatea taxonomică de bază este tulpina. Unele specii cuprind o singură
tulpină (Brettanomyces abstinens), în timp ce altele prezintă un număr mare de tulpini (de
exemplu, pentru specia Saccharomyces cerevisiae au fost descrise peste 200 de tulpini).
Tulpinile sunt grupate în specii, speciile care prezintă caractere comune formează genuri, iar
grupurile de genuri formează familii asamblate în ordine, ordinele în clase. Taxonii superiori
sunt desemnaţi prin sufixe standard: -aceae pentru familii şi -ales pentru ordine.
Drojdiile sunt clasificate în funcţie de prezenţa / absenţa şi mecanismele procesului de
sexualitate, în : ascomicete, basidiomicete şi deuteromicete (fungi imperfecţi). Cu toate acestea,
analizele moleculare indică faptul că ascomicetele de tipul Saccharomyces şi Pichia reprezintă
formele teleomorfe (forme ce prezintă meioză şi sporulare şi, implicit, sexualitate) ale fungilor
imperfecţi de tipul Candida, consideraţi ca forme anamorfe (forme care se divid vegetativ prin
mitoză şi nu prezintă sexualitate).
În ultima vreme, au fost identificate numeroase specii aparţinând genurilor de drojdii
Rhodotorula, Candida şi Yarrowia (Durham, 1984; Mauersberger, 1996; Barth, 1996) ca fiind
implicate în procese biodegradative ale unor compuşi poluanţi. Utilizarea acestor specii în
bioremedierea ecosistemelor poluate, implică, în primul rînd, o cunoaştere cât mai profundă şi
acurată a aspectelor morfo-fiziologice si biochimice a acestora şi, nu în ultimul rând, a
mecanismelor genetice implicate în căile metabolice specifice acestei categorii de drojdii.
 În vederea unei caracterizări complete şi a unei identificării taxonomice cât mai acurate,
tulpinile de drojdii sunt supuse unui număr mare de analize. O parte dintre acestea sunt
cunoscute generic sub denumirea de „analize convenţionale”, fiind reprezentate de tehnici care
conferă date cu privire la caracterele morfo-fiziologice ale tulpinilor luate în studiu şi anume:
Aspectul microscopic al celulelor - se iau în studiu mărimea şi forma celulelor, modul
de reproducere vegetativă (prin înmugurire multilaterală, bipolară sau unipolară, prin fisiune,
prin formare de filamente) şi, acolo unde este cazul, forma, structura şi modul de formare a
ascosporilor şi teliosporilor.
Tipul de reproducere sexuată. Unele specii de drojdii se reproduc sexuat prin ascospori,
unele prin teliospori, iar altele prin bazidiospori. O importanţă deosebită o au informaţiile cu
privire la: dacă tulpina este homotalică sau heterotalică; tipul de împerechere; forma, topografia
şi numărul ascosporilor.
Caracterele fiziologice luate în studiu sunt: capacitatea (1) de a fermenta semi-anaerob
unele zaharuri; (2) de a creşte aerob pe diferiţi compuşi prezenţi în mediu ca unică sursă de
carbon sau azot; (3) de a creşte pe medii lipsite de unele vitamine; (4) de a creşte în prezenţa în
mediu a D-glucozei în concentraţie de 50% sau 60% (w/v) sau a NaCl 10% (w/v) + D-glucoza
5% (w/v); (5) de a se dezvolta la 37oC; (6) de a creşte în prezenţa cicloheximidei; (7) de a scinda
acizii graşi; (8) de a produce polizaharide de tip amidon; (9) de a hidroliza ureea; (10) de a forma
acid.
Testele fiziologice reprezintă o etapă importantă în identificarea şi clasificarea drojdiilor.
Majoritatea taxonomiştilor utilizează aceste teste în combinaţie cu observaţiile de microscopie,
dar există unele scheme care permit identificarea completă a taxonilor aproape exclusiv pe baza
reacţiilor de asimilaţie şi fermentaţie. Dezavantajul major rezultat din utilizarea exclusivă a
testelor de fiziologie este acela că, orice variabilitate apărută în timpul realizării testelor, fie
datorită procedurii, fie datorită răspunsului tulpinii analizate, poate duce la o identificare total
eronată.
Testele morfo-fiziologice permit identificarea unor noi specii sau tulpini prin realizarea
unor referiri la cele existente şi caracterizate în diferite colecţii şi laboratoare din întreaga lume.
Determinatoarele de drojdii prezintă chei de identificare a căror utilizare permite, de regulă,
identificarea până la nivel de specie a drojdiei luate în studiu.
Caracterele biochimice. Studiul unor caractere biochimice, cum ar fi, structura peretelui
celular şi, în mod special, studiul mananilor, poate avea un rol important în taxonomie. Un alt
exemplu îl constituie observaţiile privind tipul de ubiquinonă (coenzima Q) specifică diferitelor
drojdii.
 Barnett şi colab. (1983) au pus la punct un sistem de identificare asistat de computer,
bazat pe un anumit număr şi combinaţie de chei de identificare pentru diferite specii, luând în
consideraţie, în principal, caracterele fiziologice, eliminând astfel observaţiile de morfologie care
necesită o practică mai îndelungată şi o anumită experienţă.
Date fiind însă neajunsurile sistemului bazat pe chei de identificare, Kirsop şi colab.
(1986) au realizat un sistem probabilistic, care ia în consideraţie răspunsul a 400 de specii la 46
de teste morfologice şi fiziologice, teste alese pe bază de reproductibilitate a rezultatelor,
uşurinţa execuţiei, independenţă reciprocă şi grad de aplicabilitate la un număr mare de specii.
Drojdiile necunoscute sunt examinate pe baza acestui test, iar rezultatele sunt introduse în
computer şi este determinată probabilitatea ca o tulpina neidentificată să aparţină fiecărei specii
în parte. Identificarea se bazează astfel pe răspunsul la toate testele a tulpinii necunoscute, iar în
calculul de probabilitate sunt incluse răspunsurile atipice.
În cazul în care se urmăreşte numai indicarea unei posibile identităţi a drojdiei, pot fi
utilizate anumite teste pentru elaborarea unor chei de identificare. Pentru aplicarea unui astfel de
sistem însă este necesară o indicare aproximativă a genului sau speciei din care se presupune că
drojdia studiată face parte.
Actualmente există kit-uri de identificare a drojdiilor, care prezintă un număr de teste
care au, de cele mai multe ori, aplicabilitate numai pentru anumite specii. Deoarece condiţiile de
cultură de pe kit-uri sunt diferite de cele din testele de laborator, este recomandat ca rezultatele
obţinute prin utilizarea acestor kit-uri să fie completate cu experimente efectuate prin metode
clasice şi apoi supuse comparaţiei cu datele din determinatoare în scopul obţinerii unei
identificări acurate (Kurtzman, 1988).
Identificarea unei anumite tulpini sau specii de drojdie, nu poat fi realizată însă numai pe
baza acestor studii morfo-fiziologice, acestea permiţând, de cele mai multe ori, identificarea
microorganismelor până la nivel de specie. Dezvoltarea rapidă şi extensivă a biologiei
moleculare, precum şi cantitatea şi calitatea net superioară a informaţiilor furnizate de aceasta, au
dus la dezvoltarea şi perfecţionarea unui număr din ce în ce mai mare de tehnici şi metode înalt
performante care permit abordarea unor aspecte intime de structură şi funcţie a genomului
eucariot. Acestea au avut ca rezultat obţinerea unei clasificări taxonomice acurate, precum şi
realizarea sau chiar rearanjarea unor arbori filogenetici. În acest sens, tehnicile / analizele de
taxonomie moleculară, cum sunt denumite generic, au grade diferite de selectivitate lanivelul
rangurilor taxonomice, pornind de la familie până la tulpină (Tab. 6).

Rang taxonomic
 Analiza Familie Gen Specie Tulpină
Secvenţierea ADN
Secvenţierea ARNr (18S, 25S)
Determinarea compoziţiei în baze azotate (mol % GC)
ARDRA
Determinarea gradului de omologie a moleculelor de ADN
- reasociere (hibridizare) ADN / ADN
Electrocariotiparea (PFGE)
RFLP
RAPD

Tab.6. Câteva analize folosite în taxonomia moleculară a drojdiilor şi rangul lor taxonomic

2. 2. ANALIZE DE TAXONOMIE MOLECULARĂ FOLOSITE LA DROJDII

În ultimele decenii au fost optimizate o serie de tehnici de nivel molecular care permit
studiul complex al genomului drojdiilor, atât a celui nuclear cât şi a celui extranuclear.

Studiul genomului nuclear Studiul genomului extranuclear

Tehnica denaturării termice, pentru determinarea Analiza profilului plasmidial (2m / 2m – like)
compoziţiei în baze azotate a ADN (mol%GC)
Electrocariotiparea Identificarea sistemului killer
R.F.L.P. pe ADN cromozomal sau pe molecule de R.F.L.P. pe ADN mitocondrial
ADN cromozomal intacte
A.F.L.P. A.R.D.R.A.
Reasocierea (hibridizarea) ADN/ADN R.A.P.D.

Trebuie subliniat faptul că analizele de taxonomie moleculară furnizează, în primul rând,

date referitoare la structura genomului şi la eventualele modificări suferite de acesta în cursul
evoluţiei sau sub influenţa anumitor factori din mediu, fapt care poate duce la apariţia de noi
tulpini sau chiar specii. Iată de ce o parte dintre aceste tehnici şi analize au fost deja prezentate în
capitolul anterior (Cap. 1).

2. 2. 1. Determinarea procentului molar de guanină şi citozină (mol % GC)

Determinarea conţinutului în baze azotate a ADN, respectiv a procentului molar de

guanină şi citozină, reprezintă un punct important pentru caracterizarea genomului tuturor
organsimelor vii, inclusiv al drojdiilor. Pe lângă acest aspect, valorile mol%GC oferă
posibilitatea de a diferenţia clasele şi genurile de drojdii.
S-a stabilit astfel că în cadrul unui gen, spectrul de valori mol % GC corespunzător
speciilor incluse prezintă, în general, o variaţie de 10% sau mai puţin: genul Hansenula are un
mol % GC cuprins între 32.2 - 44.2%, genul Kluyveromyces are un procent de aprox 33.1 -
46.2%; speciile de Pichia diferă cu până la 22%, iar la cele de Rhodotorula prin 14%. Prin
interpretarea valorilor mol % GC, ca şi a altor teste, se deduce că genul Candida şi sinonimul sau
Torulopsis sunt compuse din reprezentanţi aparţinând atât ascomicetelor cât şi din
bazidiomicetelor.
Utilizarea valorilor mol % GC implică însă anumite rezerve întrucât aproximativ 600
specii de drojdii au un conţinut în G+C de circa 20 - 70 %, astfel încât este inevitabilă
suprapunerea unor specii înrudite. De altfel, diferenţa între procentele GC în cazul a două tulpini
diferite de drojdii este acceptată ca primă evidenţă care exclude împărţirea aceleiaşi secvenţe de
baze azotate între două tulpini şi arată că ele nu s-au desprins dintr-un ancestor comun, fapt
pentru care determinarea conţinutului GC este considerată un criteriu negativ de clasificare.
Pentru a stabili categoric că două tulpini aparţin la două specii diferite, trebuie avută în
vedere tehnica folosită pentru determinarea valorilor mol % GC : în cazul tehnicii densităţii de
plutire (buoyant density) această diferenţă este de 1.0 - 1.5%, iar prin denaturare termică are
valori mult mai mari, cuprinse între 2.0 - 2.5%. (Kurtzman, 1987).
În cazul unei tulpini provenite din izolate naturale, a cărei identitate este necunoscută,
într-o primă etapă se realizează analize de taxonomie clasică, care oferă o posibilă încadrare a
tulpinii respective în cadrul unei specii. După efectuarea experimentelor de denaturare termică,
valoarea Tm este folosită pentru calcularea mol%GC care este comparat cu valorile din
determinatoare de specialitate pentru specia în care tulpina necunoscută a fost clasificată
preliminar. Un exemplu este prezentat în Tab. 7, pentru două tulpini izolate din medii poluate cu
petrol şi identificate ulterior, prin analize complexe, ca aparţinând speciilor Rhodotorula glutinis
(tulpina D1) şi Candida parapsilosis (tulpina D3).

Tulpina Tm mol % GC mol % GC mol % GC

(formula lui Owen) (formula lui Frank) (Barnett, 1983)
D1 78.4 56.67 59.78 Rh. glutinis: 60.2 – 67.8
D3 71.2 41.47 42.21 C. parapsilosis: 39.3 - 41.2

Tab. 7. Valorile mol % GC obţinute pentru tulpinile Rh. glutinis şi C. parapsilosis

2. 2. 2. Electrocariotiparea
Apariţia şi dezvoltarea tehnicilor de electrocariotipare - OFAGE, FIGE, CHEF, etc – au
constituit un pas major în caracterizarea genomului nuclear al drojdiilor. În acelaşi timp,
analizele efectuate pe molecule de ADN cromozomal intacte, au permis o mai bună delimitare a
speciilor una de cealaltă, prin caracterizarea seturilor de cromozomi, precum şi stabilirea acurată
a apartenenţei unei tulpini la o anumită specie prin evidenţierea fenomenului de polimorfism de
lungime al cromozomilor. Aceste avantaje deosebite sunt motivul pentru care electrocariotiparea
costituie în prezent un element esenţial în studiile de taxonomie moleculară a drojdiilor.
În Fig. 18 sunt prezentate grafic gelurile de electrocariotipare pentru separarea
cromozomilor de C. tropicalis (A – godeu 1), C. maltosa (A – godeu 2) şi Y. lipolytica (B –
godeurile 1 şi 2 ), prin folosirea aceleiaşi tehnici – CHEF – şi aceluiaşi marker de migrare –
cromozomi standard de S. cerevisiae. Analiza comparativă a gelurilor evidenţiază profilurile
cromozomale specifice fiecărei specii: s-au separat majoritatea cromozomilor de la C. maltosa şi,
în aceleaşi condiţii de migrare, s-au izolat numai 2 dintre cromozomii de C. tropicalis, aceştia
fiind de dimensiuni mai mari (între 1 şi 2,2 Mb).
Al doilea gel a fost obţinut în condiţii electrice care au permis separarea cromozomilor de
dimensiuni mari ai drojdiei Y. lipolytica. Mai mult, se observă chiar variaţia intra-specifică a
electrocariotipului, datorată polimorfismului de lungime şi număr al cromozomilor.

(A) (B)
Fig. 18. Reprezentarea grafică a gelurilor de electrocariotipare obţinute prin CHEF
(A - godeuri: 1 - C. tropicalis, 2 - C. maltosa; B - godeuri 1, 2 - Y. lipolytica ; M –
pentru A şi B – marker - cromozomi de S. cerevisiae)

2. 2. 3. Determinarea gradului de omologie a moleculelor de ADN prin

reasociere de tip ADN / ADN
Termenul de omologie a moleculelor de ADN presupune o referire la secvenţa în baze
azotate a moleculelor studiate. Secvenţele ADN pot fi caracterizate în termenii similarităţii şi
complementarităţii lor:
  Similaritatea între două secvenţe este dată, în fapt, de existenţa unei identităţi în ceea
ce priveşte proporţia lor în baze (în cazul ADN mono catenar) sau în perechi de baze (pentru
ADN dublu catenar);
 Complementaritatea este determinată de regulile de împerechere dintre adenină şi
timină, respectiv, citozină şi guanină, astfel încât să se respecte principiul complementarităţii
catenelor în molecula de ADN dublu catenar. Complementaritatea poate fi masurată direct prin
capacitatea a două monocatene de ADN de a hibridiza. Dacă două molecule de ADN sunt
denaturate la monocatene, complementaritatea dintre cele două monocatene poate fi utilizată
pentru a indica gradul de similitudine dintre duplexurile parentale.
Capacitatea a două monocatene de a reface dublul helix pe bază de complementaritate se
numeşte renaturare pentru ADN provenit de la aceeasi sursă, dar procesul este descris ca
hibrizare pentru ADN provenit din surse diferite. Există numeroase metode de determinare a
gradului de omologie a moleculelor de ADN, dintre care cea mai utilizată se bazează tocmai pe
stabilirea gradului de hibridizare a ADN monocatenar provenit din diferite surse şi a stabilităţii
hibrizilor formaţi.
Procesul de renaturare, respectiv, hibridizare, decurge în două trepte:
1. Cele două monocatene ADN se întâlnesc aleator în soluţie; dacă secvenţele lor sunt
complementare, ele vor genera o regiune dublucatenară;
2. Regiunea dublucatenară se extinde la nivelul întregii molecule, procesul putând fi
asimilat închiderii unui fermoar ("zipper-like effect"). Renaturarea dublului helix restabileşte
proprietăţile care s-au pierdut în timpul procesului de denaturare.
Există două metode de realizare a hibridizarii:
 Hibridizare în mediu lichid. În acest caz moleculele de ADN monocatenar sunt
amestecate în soluţie. În cazul în care există cantităţi mari de material genetic reacţia poate fi
urmată de modificări ale densităţii optice (Fig. 19). Dacă materialul genetic este prezent în
cantităţi mai mici, una dintre monocatene este marcată radioactiv sau neradioactiv, iar gradul de
încorporare a acesteia în dublul helix este monitorizat prin cantitatea de ADNdc marcat care
poate fi separat de cel monocatenar fie cromatografic, fie prin metode ce asigură degradarea
monocatenelor din amestec.
 A
260
denaturare
renaturare

Tm

T [ oC] Timp [min]

60 70 80 90 100
0 10 20 30 40 50
Calcularea Reasociere
% mol GC ADN/ADN

Fig.19. Curba variaţiei absorbanţei în procesele de denaturare

şi renaturare a ADN

 Hibridizarea pe suport solid. Hibridizarea în soluţie nu este cea mai eficientă metodă
pentru determinarea gradului de înrudire între doua probe de ADN datorită faptului ca în timpul
amestecării celor două monocatene apar doua tipuri de reacţii: (1) catenele complementare
provenite din aceeaşi molecula de ADN pot renatura cu refacerea moleculei originale; (2) fiecare
monocatenă a unei molecule de ADN dintr-o sursă poate hibridiza cu alta provenită din ADN-ul
celeilalte surse. Competiţia dintre cele două tipuri de reacţii îngreunează estimarea gradului de
hibridizare. Acest neajuns poate fi eliminat prin imobilizarea monocatenelor provenite de la una
dintre surse, astfel încât aceasta să nu mai poata renatura. Principalul suport solid folosit este
filtrul de nitroceluloză. Odata ce un filtru a fost folosit pentru a absorbi ADN monocatenar poate
fi tratat pentru a împiedica absorbţia ulterioară a altor monocatene.
În Fig. 20 este reprezentată tehnica prin care una dintre moleculele de ADN este
denaturată si absorbită pe filtru, ulterior, fiind adaugată o a doua probă de ADN denaturată în
soluţie. Aceasta se absoarbe pe filtru numai dacă este complementară cu ADN monocatenar
existent deja pe suprafaţa solidă. De obicei, a doua probă de ADN monocatenar este marcată
(radioactiv sau neradioactiv cu fluoresceină sau biotină), ceea ce permite determinarea gradului
de hibridizare prin măsurarea cantităţii de marcaj radioactiv reţinut pe filtru şi, respectiv, prin .
Din datele actuale obţinute prin experimentele de reasociere speciile de bacterii si drojdii
pot fi definite ca diferind prin diverse valori ale omologiei ADN/ADN. Bacteriologii tind să
considere ca fiind conspecifice tulpinile bacteriene care prezintă un grad de omolgie relativ
scăzut de 65 - 70%, în timp ce la drojdii aceste valori sunt mai ridicate situându-se între 80 -
100% (Kurtzman si colab.,1980). Utilizând metoda de determinare spectrofotometrică a lui de
Ley (1970), Jahnke si Bahnweg (1986) au stabilit că tulpinile de drojdii care prezintă 90 - 95%
omologie de secvenţă ADN sunt conspecifice.
 Fig. 20. Schema realizarii reasocierii ADN /ADN pe filtru cu sonde ADN
marcate cu biotin - dUTP

Interpretarea datelor obtinuţe din experimentele de reasociere ADN / ADN ramâne însă
problematică, rezultatele depinzând de tipul de ADN folosit: ADN total, ADN nuclear purificat,
ADN mitocondrial sau ADN ribozomal. În acest sens, un rol important îl are prezenţa ADN
repetitiv. Cum renaturarea ADN este dependentă de numărul secvenţelor de ADN
complementare, este clar ca ADN repetitiv va renatura mai repede decât cel non-repetitiv
reprezentat de secvenţe unice. De aceea, procesul de renaturare este rezultanta a două reacţii:
renaturarea rapidă a secventelor de ADN repetitiv sau ADN mitocondrial, dacă este cazul, şi
renaturarea mai lentă a fragmentelor unice de ADN. La eucariotele superioare aproximativ 80%
din genele transcrise în proteine sunt localizate în porţiuni unice ale ADN şi numai 20% în ADN
moderat repetitiv. ADN înalt repetitiv de la animale şi la plantele verzi nu conţine, în general,
informaţie genetică codificatoare. Ca urmare, ADN non-repetitiv reprezintă materialul cel mai
indicat pentru experimentele de reasociere ADN / ADN. La drojdii, la care ADN repetitiv
reprezintă 20% din cel total, aceasta regulă nu este respectată deoarece, pe de o parte, informaţia
genetică din ADN moderat repetitiv este transcrisă în mare masură, putând fi folosită în
experimente de reasociere ADN / ADN iar, pe de altă parte, majoritatea ADN repetitiv nu este
luat în calcul la interpretarea finală a cineticii reacţiei fiind exclus încă din primele momente
datorită vitezei mari de reasociere.
Tehnicile de realizare a reasocierii ADN / ADN sunt influenţate deasemenea, în proporţie
diferită, de prezenţa ADN repetitiv. Astfel, metoda imobilizării pe filtru este cea mai afectată.
Datorită prezenţei ADN în concentraţie scazută în mediul de reacţie, va reasocia numai o mică
parte a genomului şi anume cea reprezentată de secvenţele repetitive care au o viteză si o rată
mare de reasociere. Dacă cele două molecule de ADN participante la reacţie nu conţin aceeaşi
cantitate de ADN repetitiv, se vor obţine două valori ale procentului de reasociere ADN / ADN
depinzând de care dintre moleculele de ADN este cea imobilizată pe filtru: în cazul în care ADN
fixat este cel mai bogat în secvenţe repetitive, cantitatea de ADN din soluţie care va hibridiza cu
acesta va fi mai mare. În cazul tehnicii de reasociere în soluţie monitorizată spectrofotometric,
procentul de renaturare poate reprezenta 10 - 17% până la 50% din genom.
Se poate concluziona că procesul de reasociere a ADN este afectat de mărimea şi
structura genomului care constituie factori importanţi în evaluarea gradului de omologie ADN /
ADN.
Un rol important îl au însă şi condiţiile de reacţie :
Creşterea tăriei ionice a mediului de reacţie duce la mărirea vitezei de reacţie. Folosirea
unui tampon salin citrat 2 X (0.15 mM clorura de sodiu/ 0.015 mM citrat de sodiu, pH = 7.0)
permite parcurgerea procesului într-un timp relativ scurt.
Temperatura optimă de reasociere a ADN este cu 25 - 30oC mai mică decât valoarea Tm.
Concentraţia initială a probei de ADN afectează viteza de reacţie. Aceasta însemnă că o
soluţie ce contine 100 g ADN/ml reasociază în jumatate din timpul necesar pentru o soluţie ce
contine numai 50 g/ml ADN.

2. 2. 4. Tehnica R.F.L.P. (Restriction Fragments Length Polymorphism)

 Datorită reativei simplităţi de execuţie şi a numărului mare de rezultate ce pot fi obţinute,
R.F.L.P. reprezintă una dintre cele mmai folosite tehnici de analiză taxonomică. Materialul
biologic care poate fi folosit poate fi reprezentat de ADN nuclear sau total, dar şi de ADN
mitocondrial, de ampliconi ai genelor (ADNr) pentru diferite specii de ARN ribozomal, sau chiar
de cromozomi întregi obţinuţi pentru electrocariotipare (PFGE).
Tehinca R.F.L.P. se bazează pe restricţia (digestia) unei probe de ADN, cu endonucleaze
de restricţie (ER). Acestea sunt enzime de provenienţă bacteriană care au capacitatea de a tăia
ADN dublucatenar la nivelul legăturilor fosfodiesterice de pe ambele catene de ADN, la acelaşi
situs sau la situsuri diferite, specifice. Frecvenţa de tăiere a moleculei de ADN de către o
anumită enzimă de restricţie depinde, în primul rând, de compoziţia în baze a ADN.
Enzimele de restricţie aparţin la trei clase:
- ER I - sunt enzime de restricţie care taie ADN la circa 1000 - 5000 perechi de baze (pb) faţă
de situsul pe care îl recunosc;
- ER II - au proprietatea de a tăia ADN la nivelul situsurilor de recunoaştere;
- ERIII - sunt ER care taie ADN la circa 20 nucleotide de situsul recunoscut.
In tehnicile care utilizează ER (RFLP, AFLP) sunt preferate enzimele de restricţie
aprţinând celei de a II - a clase. Acestea recunosc fragmente de ADN de 4 - 8 pb, iar alegerea lor
se face astfel încât lungimea fragmentelor de restricţie rezultate să fie de aproximativ 14 pb. In
această categorie intră un număr mare de ER în urma acţiunii cărora apar fragmente de ADN de
două tipuri:
* cu capete coezive - “cohesive ends” - datorate acţiunii ER la situsuri diferite pe cele două
catene ale ADN (Eco R I, Hind III, Mae I, Msp I, Bam H I)

* cu capete netede - “blunt ends” - ER taie cele două catene ale ADN la acelaşi situs (Hae III,
Eco R V, Sma I)

Dat fiind faptul că diferitele enzime de restricţie recunosc o gamă largă de secvenţe, este
relativ uşor a alege o enzimă care să producă un fragment de ADN ce conţine o anumită genă.
Într-o reacţie de restricţie poate fi folosită o singura enzimă sau mai multe.
 Probele rezultate sunt supuse electroforezei în gel de agaroză, iar profilurile benzilor
obţinute sunt studiate comparativ (Fig. 21). Viteza de migrare a fragmentelor în gel este invers
proporţională cu mărimea lor, fragmentele mici migrând mai repede decât cele mari, în timp ce
fragmentele de aceeaşi dimensiune migrează cu aceeaşi viteză, ocupând poziţii echivalente în
gelul de elctroforeză. Colorarea gelurilor cu bromura de etidiu, care interferă cu bazele azotate din
structura ADN, permite vizualizarea benzilor rezultate în urma electroforezei şi, totodată,
interpretarea rezultatelor. În cazul în care se utilizează molecule de ADN extrase din diferite surse
care au fost supuse digestiei cu aceeaşi / aceleaşi enzime de restricţie, tehnica R.F.L.P. poate
furniza informaţii privind evoluţia genomului şi gradul de înrudire a organismelor sursă.

Fig. 21. Evidenţierea prin electroforeză în gel de agaroză a fragmentelor rezultate prin restricţia a
trei probe de ADN cu aceeaşi enzimă de restricţie

Compararea dimensiunilor fragmentelor provenite dintr-o anumită regiune genetică prin

acţiunea unui complex de enzime de restricţie, permite realizarea hărţii de restricţie cu
localizarea situsurilor de restricţie. Această hartă permite identificarea şi localizarea genelor ce
 codifică diferite caractere, precum şi a eventualelor modificări (mutaţii) din structura lor,
modificări care pot fi tulpină sau specie – specifice.
Mutaţiile care pot apărea la nivelul materialului genetic - deleţii, inserţii, duplicaţii - în
apropierea sau chiar în interiorul situsurilor de restricţie recunoscute de diferite enzime, au ca
rezultat modificări ale dimensiunii fragmentelor de ADN (Fig. 22).

Fig. 22. Exemplificări de mutaţii la nivelul ADN, care determină apariţia unor profiluri de
restricţie diferite

(A) o moleculă de ADN este tăiată cu aceeaşi ER la trei situsuri, rezultând două fragmente de
ADN cu mărimi diferite, izolate ulterior prin elecroforeză în gel de agaroză;
(B) modificarea unei perechi de baze din interiorul unuia dintre situsurile de restricţie împiedică
recunoaşterea acestuia de către ER, rezultatul fiind un singur fragment de restricţie de
dimensiune mai mare;
(C) duplicarea unei secvenţe de ADN duce la creşterea dimensiunii primei secvenţe de ADN
recunoscute de ER.

Analize R.F.L.P. pe ADN mitocondrial

Analiza ADN mitocondrial (ADNmt) este importantă nu numai pentru stabilirea structurii
genomului unei anumite specii de drojdie, ci şi pentru evaluarea încadrării sale taxonomice, astfel
de studii oferind informaţii de nivel filogenetic chiar până la nivel de tulpină.
Interesul deosebit pentru acest tip de ADN rezidă din faptul că:
→ ADNmt are o dimensiune mică comparativ cu cel nuclear şi constituie un material ideal
pentru experimentele de restricţie;
 → diferenţele intra- si interspecifice din pattern-urile de restricţie ale ADNmt se datorează
diferenţelor din secvenţa de nucleotide;
→ conformaţiile, masele moleculare, densităţile de plutire şi temperaturile de topire ale
moleculelor de ADNmt sunt caractere specie şi tulpina specifice.
În literatura de specialitate sunt descrise două variante ale metodei RFLP pe ADNmt:
 Într-o primă variantă se realizează extracţia ADNmt care este ulterior supus restricţiei şi
se studiază profilului benzilor obţinute (Querol, 1992; Guillamon, 1994; Versavaud, 1995);
 tratarea ADN total cu enzime de restricţie care recunosc situsuri de 4pb (AluI, HaeIII,
HpaI, RsaI, Sau 3A, MboI) sau 5 pb (DdeI, HinfI, MaeIII). Numărul de secvenţe recunoscute de
aceste enzime în ADN nuclear este foarte mare, spre deosebire de ADNmt în care acţionează
numai la nivelul unui număr redus de situsuri. Datorită dimensiunilor mai mari, fragmentele
rezultate prin restricţia ADNmt pot fi uşor identificate în gelurile de electroforeză(Fig. 23.;
Csutak, 2002, Lucrarea de Doctorat). Astfel este posibilă identificarea polimorfismelor de
lungime a fragmentelor de restricţie ale ADNmt fără a mai fi necesară purificarea anterioară a
mitocondriilor sau a ADNmt. Această metodă dezvoltată de Querol şi colab. (1996) este relativ
simplă, reproductibilă şi permite diferenţierea taxonomică a drojdiilor până la nivel de tulpină.

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4

(A) (B)
Fig. 23. Electroforeza în gel de agaroză a fragmentelor de restricţie a ADN mitocondrial
(A) godeuri: 1, 6 –  / Eco RI, Hind III; 2 - Y. lipolytica / Rsa I; 3 – C. parapsilosis / Rsa I;
4 – C. tropicalis / Rsa I; 5 - C. boidinii / Rsa I;
(B) godeuri: 1 – C. parapsilosis/ Hinf I; 3 – C. tropicalis / Hinf I; 4 –  / Hind III

Analize R.F.L.P. pe molecule de ADN cromozomale intacte

Moleculele de ADN cromozomal intacte care sunt preparate pentru electrocariotipare
sunt supuse digestiei cu enzime de restricţie care recunosc un număr redus de situsuri (AluI, NotI,
SfiI, BssHII), după un protocol de lucru asemănător celui din tehnica R.F.L.P pe probe de ADN
extrase şi purificate, obţinându-se fragmente cromozomale de dimensiuni mari. Acestea sunt
separate prin electroforeza utilizând unul dintre sistemele P.F.G.E. Se obţin profiluri de restricţie
a căror analiză comparativă poate furniza date de interes taxonomic, permiţând clasificarea
drojdiilor până la nivel de tulpină (Fig. 24.)

(b)
(a)
Fig. 24. Profilurile de restricţie obţinute prin CHEF pentru probe de ADN cromozomal
intacte, provenite de la 4 tulpini patogene de C. tropicalis (benzile 13, 14, 15, 16)
izolate de la pacienţi diferiţi, supuse digestiei cu (a) BssHII şi (b) SfiI (M - marker
cromozomi de S. cerevisiae) (de Rho, 2004)

2. 2. 5. Tehnica P.C.R. (Polymerase Chain Reaction)

Reacţia de polimerizare în lanţ (P.C.R.) a fost pusă la punct în 1985 de Kary Mullis şi, la
fel ca tehnica de secvenţiere a ADN, a revoluţionat genetica moleculară, conferind o nouă
dimensiune studiului şi analizei genelor. O problemă majoră în abordarea analizei unor gene
eucariote o constituie numărul mic de copii în care sunt prezente în genom. Tehnica P.C.R.
rezolvă tocmai această problemă, permiţând producerea unui număr mare de copii a unei
anumite secvenţe de ADN fără a recurge la clonare.
Tehnica P.C.R se bazează pe câteva dintre caracteristicile replicării ADN:
 ADN polimeraza foloseşte ADN monocatenar (ADNmc) ca matriţă pentru sinteza unei catene
noi, complementare şi necesită un primer pentru iniţierea sintezei.
 ADN mc poate fi generat relativ uşor prin încălzirea moleculei dublucatenare;
 Primer-ul poate fi un lanţ oligonucleotidic sintetizat chimic, care se leagă de secvenţa ţintă la
capătul 3 al acesteia în condiţiile răcirii uşoare a amestecului de reacţie;
 Reacţia de polimerizare propriu-zisă are loc în condiţiile creşterii temperaturii, în prezenţa
ADN polimerazei termostabile şi a dNTP;
 Amestecul este reîncălzit pentru a separa catenele moleculelor noi sintetizate care astfel sunt
disponibile pentru alte cicluri de hibridizare cu primeri, sinteză de ADN şi separarea catenelor.
Rezultatul parcurgerii a n cicluri de reacţii P.C.R. este un maximum de 2 n molecule de
ADN care sunt copii ale secvenţei ADN dintre primeri. ( Fig. 25 )

Fig. 25. Tehnica P.C.R.

Componentele reacţiei P.C.R.:

- molecula de ADN matriţă care cuprinde secvenţa ţintă de amplificat;
- ADN polimerază termostabilă - Taq polimeraza. Iniţial a fost folosită fragmentul Klenow al
ADN polimerazei I, însă datorită instabilităţii sale la temperatura de desfacere a legăturilor
fosfodiesterice a ADN dublucatenar (95oC), a fost înlocuită cu Taq polimeraza. Ulterior s-a
trecut la utilizarea altor tipuri de polimeraze termostabile (Ampli Taq polimeraza, Vent ADN
polimeraza) care prezintă proprietăţi ce fac posibilă derularea reacţiei numai în două trepte: I.
desfacerea ADN dublucatenar (ADNd.c.) şi legarea primerilor; II. polimerizarea lanţului
oligonucleotidic;
- primeri oligonucleotidici - sunt reprezentaţi de fragmente de ADN monocatenar care nu
prezintă complementaritate unul faţă de altul, având: dimensiuni cuprinse între 10 şi 30 pb, un
mol % GC = 40 – 60%, o secvenţă de baze complementară cu capetele 3 şi, respectiv, 5 ale
secvenţei ţintă de amplificat şi valori ale Tm foarte apropiate;
- dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP);
- MgCl2 - necesar pentru stabilizarea nucleotidelor şi pentru reacţie (sunt necesare concentraţii
stoechiometrice între Mg2+ şi nucleotide);
- EDTA - cu rol de înhibare a acţiunii degradative a DNazelor contaminante asupra ADN;
- Tris - HCl - asigură un pH optim al reacţiei de 8,3 - 8,8;
- KCl - în concentraţie de 50 mM, realizează balansarea între un conţinut ridicat de săruri care
avantajează hibridizarea şi asigură stabilitatea hibrizilor şi tăria ionică relativ scăzută care nu are
efect stopant asupra reacţiei polimerazice.
Echipamentul necesar: Reacţia P.C.R. necesită variaţii rapide de temperatură şi este, de
regulă, efectuată într-un DNA Thermal Cycler.
Principalele probleme care pot apărea în cursul derulării reacţiei sunt:
▷ contaminarea - a cărei sursă majoră o constituie chiar persistenţa în mediul de reacţie a
copiilor ADN amplificat în cadrul reacţiilor precedente. Contaminarea se produce prin simpla
manipulare a tuburilor de reacţie şi poate fi evitată prin asigurarea unor condiţii de lucru de înaltă
sterilitate, prin iradierea primerilor cu raze ultraviolete şi prin utilizarea componentelor reacţiei
în cantităţi mici.
▷ lipsa de specificitate a Taq polimerazei - este datorată lipsei activităţii 3 - 5 exonucleazice
(funcţia de proofreading). Acest impediment este redus prin utilizarea în prezent a unor enzime
cu o mai înaltă specificitate: Ampli Taq polimeraza, Vent ADN polimeraza (din Thermococcus
litoralis), Deep Vent ADN polimeraza, etc.
▷ apariţia unor amplificări parazite - reprezentate de hibridizarea nespecifică a primerilor cu
ADN ţintă. Nivelul acestor amplificări este, de regulă, nesemnificativ şi pot fi eliminate mai ales
prin ridicarea progresivă a temperaturii sau prin adăugarea în concentraţii scăzute a formamidei.
Aplicaţii practice ale tehnicii P.C.R.
Tehnica P.C.R. permite o mai rapidă şi precisă abordare a numeroase aspecte:
 Identificarea deleţiilor. In mod clasic aceasta se realizează prin tehnica Southern care
însă este ineficientă în analiza deleţiilor care afectează o singură bază. Tehnica P.C.R. permite
detectarea acestora prin amplificarea regiunii în care se află deleţia şi analiza produsului prin
electroforeză în comparaţie cu unul obţinut pe aceeaşi cale de la un tip normal.
Inducerea de: inserţii - se realizează prin utilizarea în reacţie a primerilor care posedă un
fragment suplimentar de ADN; mutaţii - primerii conţin o mutaţie; deleţii - primerii hibridizează
cu segmente din ADN ţintă care delimitează un fragment ce urmează a fi deletat.
Obţinerea de sonde dintr-o secvenţă de ADN clonat într-o plasmidă fără a fi necesară
tăierea plasmidei, prin folosirea de primeri (eventual marcaţi) care asigură amplificarea specifică
a secvenţei respective.
Analiza produşilor de transcripţie prin aplicarea tehnicii P.C.R. pe ADNc. obţinut dintr-o
populaţie de molecule de ARNmesager.
In situ P.C.R. permite identificarea directă, cu precizie a unor celule care posedă o
anumită secvenţă de ADN sau care exprimă o anumită genă.
Identificarea unei secvenţe necunoscute în cazul în care aceasta este flancată de două
fragmente ADN cu secvenţe cunoscute, sau invers, prin tăiere cu enzime de restricţie,
circularizare şi ataşarea de primeri pentru cele două catene ADN.

Pe lângă imensa importanţă pe care aplicarea tehnicii PCR o are în genetica

microorganismelor, a plantelor şi cea umană, ea ocupă un loc deosebit în rândul tehnicilor de
biologie moleculară intens folosite în studii ce au ca punct final stabilirea încadrării taxonomice
a unui organism şi construirea arborilor filogenetici. La baza acestor studii stă observaţia că
gradul de divergenţă (sau omologie) a secvenţelor de nucleotide a ADN genomic sau
mitocondrial aparţinând speciilor ce provin dintr-un strămoş comun, poate constitui o măsură a
înrudirii lor.
Studiile de taxonomie moleculară folosesc o gamă largă de metode de analiză a
genomului nuclear sau extranuclear, care au la bază tehnica P.C.R. uneori combinată cu alte
tipuri de tehnici în scoul de a mări acurateţea rezultatelor obţinute şi de a lărgi spectrul de
substraturi biologice utilizate, care pot oferi date importante din punct de vedere filogenetic.
Astfel, s-au dezvoltat o serie de noi tehnici:
R.A.P.D. – Random Amplified Polymorphic DNA – se bazează pe amplificarea unor
secvenţe aleatorii din moleculele de ADN, pentru construcţia primeri-lor nefiind necesară
cunoaşterea secvenţei ce urmează a fi amplificată.
 A.R.D.R.A. - Amplified Ribosomal DNA Restiction Analysis – foloseşte ca substrat mai
ales secvenţe din molecule de ADNr 18S sau 5,8S, amplificate prin P.C.R., supuse digestiei cu
enzime de restricţie şi analizate ca în cazul tehnicii R.F.L.P.
A.F.L.P. - Amplified Fragment Length Polymorphisms – debutează ca o tehnică
R.F.L.P., dar fragmentele de restricţie ale ADN rezultate sunt supuse reacţiei P.C.R. folosind
primeri cu acţiune selectivă, din care unul este marcat radioactiv. În final, sunt evidenţiate şi
analizate numai fragmentele amplificate marcate radioactiv.

2. 2. 6. Tehnica R.A.P.D. (Random Amplified Polymorphic DNA)

Apariţia tehnicii R.A.P.D. a reprezentat un pas imporatnt în biologia moleculară, fiind
una dintre cele mai simple tehnici de tip P.C.R. Astfel, fragmente de ADN de dimensiuni mici,
între 300 şi 2000 pb, sunt amplificate randomic folosind un singur primer, un decamer (10 pb),
cu o secvenţă construită aleator, care se leagă de matriţa ADN pe catene opuse la distanţe mai
mici de 3000 pb. Uneori, se pot folosi şi doi primeri în aceeaşi reacţie. Rezultatul este un număr
de 2 până la 10 fragmente care sunt evidenţiate prin electroforeză în gel de agaroză. În cazul în
care o mutaţie apare la nivelul unuia dintre situsurile care prezenta complementaritate anterioară
cu primerul, procesul de amplificare nu va mai avea loc, iar profilul benzilor electroforetice va fi
diferit de cel deja observat.
Dat fiind caracterul randomic al tehnicii, iniţial cerectătorii foloseau mai mulţi primeri în
experimente care se desfăşurau în paralel, pe aceeaşi probe de ADN. În prezent există însă o
serie de primeri recomandaţi de literatura de specialitate ca având specificitate pentru diferiţi
taxoni. În Tab. 8 sunt listaţi câţiva dintre premerii cei mai folosiţi pentru studiul tulpinilor
drojdiilor genului Candida.

Primer Secvenţă
OPA-18 5′-AGCTGACCGT-3′
OPB-01 GTTTCGCTCC
OPB-04 GGACTGGAGT
OPB-10 CTGCTGGGAC
OPB-12 CCTTGACGCA
OPB-11 GTAGACCCGT
OPB-14 TCCGCTCTGG
OPB-17 AGGGAACGAG
OPE-04 GTGACATGCC
RP1-4 TAGGATCAGA
RP-2 AAGGATCAGA
RP4-2 CACATGCTTC

Tab. 8. Primeri R.A.P.D. folosiţi pentru genul Candida

 Ca pentru orice tehnică, utilizarea R.A.P.D. pezintă avantaje şi dezavantaje.
Principalele avantaje sunt:
- nu necesită cunoaşterea anterioară a secvenţei fragmentului de ADN ce urmează a fi
amplificat;
- se folosesc cantităţi mici de ADN, aproximativ 25 ng/reacţie;
- parametrii tehnicii sunt cei ai unei reacţii P.C.R;
- evidenţierea fragmentelor rezultate se face relativ uşor, prin simplă electroforeză, nefiind
necesare tehnici suplimentare de marcare.
Dintre dezavantaje amintim:
- fiind o reacţie bazată pe acţiunea unor enzime, o importanţă deosebită trebuie acordată
purităţii, integrităţii şi concentraţiei probelor de ADN folosite, concentraţiei celorlalte
componente ale reacţiei (tampon, polimerază, primer) şi codiţiilor de timp şi temeratuă
necesare pentru desfăşurarea amplificării;
- alegerea unui primeri nepotrivit cu ADN-ul sursă, poate duce la lipsa produşilor de
reacţie sau la apariţia unor benzi slabe, greu de interpretat;
- este greu de determinat dacă segmentul de ADN amplificat provine dintr-un locus
heterozigot sau homozigot ;
- tehnica poate fi utilizată cu succes pentru realizarea clasificărilor taxonomice la nivel de
specie, subspecie şi tulpină.

2. 2. 7. Analize pe ADNribozomal (ADNr)

Tehnica A.R.D.R.A. ITS – P.C.R.
În prezent, în taxonomia drojdiilor se foloseşte intens analiza secvenţelor de ADN care
codifică pentru diferitele clase de ARN ribozomal (ADNr) 18S, 5,8S sau 25S.
Interesul pentru studiul ARNr se datorează, în principal, la trei caracteristici:
 ribozomii sunt prezenţi în toate organismele şi, aproape sigur, au aceeaşi origine
evolutivă, ceea ce permite plasarea în aceeaşi hartă genetică a tuturor organismelor vii;
 genele pentru ARNr se găsesc într-un număr mare de copii şi, din aceasta cauză,
constituie un material propice pentru reacţiile de amplificare şi restricţie. De exemplu, la S.
cerevisiae, genele pentru ARNr sunt plasate pe cromozomul XII, într-un cluster format din
aproximativ 150 de copii repetate în tandem ale unităţii ADNr (9,1 kb).
  secvenţele codificatoare ale ARNr sunt înalt conservate şi omoloage pentru toate
organismele. Ele servesc ca puncte de reper care permit utilizarea secvenţelor variabile ca unităţi
de măsură a modificărilor survenite în cursul evoluţiei.
O tehnică rapidă, intens utilizată în toate laboratoarele de profil şi care permite obţinerea
unor date de mare acurateţe, este A.R.D.R.A (Amplified Ribosomal DNA Restiction

Analysis). Tehnica se desfăşoară în două mari etape:

(I) amplificarea selectivă prin reacţii P.C.R;
(II) digestia ampliconilor cu endonucleaze de restricţie şi analiza comparativă a profilurilor
rezultate (R.F.L.P.).
Rezultatul îl constituie, în final, o analiză comparativă a secvenţei moleculelor de ARNr
care permite reordonarea în arborii filogenetici deja cunoscuţi a numeroase genuri, specii şi chiar
tulpini de drojdii, precum şi recalcularea distanţei dintre acestea.
A.R.D.R.A. permite identificarea taxonomică a drojdiilor la nivel de specie şi foloseşte ca
material biologic regiunile necodificatoare “internal transcribed spacer” (ITS) 1 şi 2: ITS1 se află
plasată între regiunile codificatoare pentru ARNr 18S şi 5,8S, iar ITS2 între cele codificatoare
pentru ARNr 5,8S şi 28S (Fig. 26). Aceste regiuni prezintă secvenţe cu un grad mai mare de
variabilitate în cursul evoluţiei şi care pot fi astfel utilizate pentru a evidenţia diferenţele dintre
specii sau chiar tulpini (Chen, 2000).

Fig. 26. Poziţia regiunilor necodificatoare ITS1 şi ITS2

Pentru reacţia de amplificare se folosesc perechi de primeri capabili special construiţi

pentru a amplifica regiuni care cuprind secvenţe plasate la nivelul ITS1 şi ITS2 (Fig. 27). Cei
mai utilizaţi primeri sunt însă ITS1 şi ITS4 care permit obţinerea unor ampliconi ce cuprind
ambele regiunui ITS (Tab. 9).
 Fig. 27. Primeri ITS şi sensul lor de acţiune în amplificarea ADNr

Primer Secvenţă
ITS1 5′ - TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′
ITS2 GCTGCGTTCTTCATCGATGC 
ITS3 GCATCGATGAAGAACGCAGC 
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 
ITS1-F CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA
ITS4-R CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG

Tab. 9. Principalii primeri folosiţi în amplificarea ITS1 şi ITS2

Ampliconii obţinuţi sunt analizaţi utilizând tehnica R.F.L.P., prin digestie cu diferite
endonucleaze de restricţie, printre cel mai des utilizate la drojdii fiind: HinfI (5'-G/ANTC-3'),
HaeIII (5'-GG/CC-3'), DdeI (5'-C/TNAG-3'), CfoI (5'-GCG/C-3'). Pentru obţinerea unor
informaţii cât mai complete şi acurate se recomandă utilizarea în experimente paralele a mai
multor endonucleaze pentru analiza aceluiaşi amplicon. Este posibil ca două sau mai multe
tulpini diferite supuse aceluiaşi experiment, să formeze ampliconi cu dimensiuni apropiate sau
identice. Cu toate acestea, în urma reacţiei de resticţie cu o anumită enzimă, vor rezulta profiluri
electroforetice diferite, specie - specifice. În Tab. 10 sunt prezentate trei tulpini de C. maltosa, C.
tropicalis şi Y. lipolytica, supuse amplificării cu primeri ITS1 şi ITS4. Pentru cele două specii de
Candida s-au obţinut ampliconi cu aceeaşi dimensiune (550pb), care însă prin resticţie cu HaeIII,
CfoI şi HinfI au format un număr diferit de fragmente de dimensiuni variate (Esteve-Zarozo,
1999).
Specia Dimensiune Dimensiune fragmente restricţie amplicon (pb)
amplicon (pb) CfoI HaeIII HinfI
C. maltosa 550 300 + 250 550 280 + 270
C. tropicalis 550 280 + 250 450 + 90 270 + 270
Y. lipolytica 380 210 + 170 380 190 + 190

Tab. 10. Analiza comparativă a dimensiunii ampliconilor ITS1/ITS4 şi a fragmentelor de

resticţie obţinute folosind CfoI, HaeIII şi HinfI pentru C. maltosa, C. tropicalis şi Y. lipolytica
Secvenţirea ADNr 18S şi 25S. Arbori evolutivi şi filogenetici.
 În cazul în care ca material genetic se folosesc genele pentru ARNr18S şi 25S, ampliconii
rezultaţi pot fi clonaţi în vectori sau fagi de tipul M13 şi supuşi secvenţierii, sau, cel mai adesea,
sunt direct secvenţiaţi. În ambele cazuri, secvenţele obţinute sunt comparate cu cele din bănci de
date internaţionale (GenBank, EMBL), iar informaţiile obţinute sunt prelucrate pentru realizarea
arborilor filogenetici.
Pe baza unor astfel de analize, Barns şi colab. (1991) au calculat distanţele evolutive
dintre diferite specii ale genului Candida (inclusiv C. tropicalis) şi a acestora faţă de specii ale
altor genuri (Fig. 28). S-a observat o divergenţă semnificativă între secvenţele ADNr obţinute
pentru Yarrowia lipolytica şi majoritatea speciilor de Candida luate în studiu. Se pare că, deşi au
evoluat dintr-un ancestor comun, Y. lipolytica a apărut mult înaintea C. tropicalis, ele fiind
îndepărtate din punct de vedere filogenetic.

Fig. 28. Arbore evolutiv pentru specii ale genului Candida şi ale altor genuri înrudite
(Barns, 1991) (distanţa evolutivă între diferite perechi de specii se obţine prin însumarea valorilor
tercute pe bara otizontală inferioară)

Aceeaşi concluzie a fost obţinută şi recent de Diezmann şi colab. (2004), care au realizat
un studiu cuprinzând 38 de specii de drojdii aparţinând genului Candida şi altor genuri înrudite.
Ei au construit un arbore filogenetic al clasei Hemiascomycetes (Saccharomycetales) căreia
aparţin C. tropicalis, C. maltosa şi Y. lipolytica, folosind datele obţinute prin secvenţierea
ampliconilor mai multor gene: pentru ARNr 18S şi 25S, actină (ACT1), factorul de elongare
EF2, subunitatea B a ARNpolimerazei (RPB1) (Fig. 29). aparţin Studiul a permis determinarea a
3 grupe (“clades”) formate din specii ce prezintă ancestorilor comuni. C. maltosa şi C.
tropicalis sunt strâns înrudite şi aparţin, ca majoritatea speciilor de Candida, primului grup. De
asemenea, a fost evidenţiat un lucru foarte interesant: specii potenţial patogene aparţinând
genului Candida şi nu numai, de exemplu Y. lipolytica, deşi îndepărtate filogenetic, se regăsesc
distribuite în toate cele trei grupe. Această observaţie are o deosebită importanţă, sugerând
apariţia fenomenului de patogenitate în diferite momente ale evoluţiei sub influenţa unor factori
independenţi.

Fig. 29. Arborele filogenetic al clasei Hemiascomycetales (Diezmann, 2004)

2. 2. 8. Tehnica A.F.L.P. (Amplified Fragment Length Polymorphisms)

In ultimii ani, folosirea tehnicilor moderne de biologie moleculară în scopul determinării

gradului de conservare a unor secvenţe aparţinând diferitelor genomuri eucariote, a avut drept
rezultat dezvoltarea metodelor bazate în principal pe detectarea polimorfismului spontan a ADN.
Acest polimorfism este rezultatul mutaţiilor punctiforme (inserţii, deleţii) a ADN şi poate fi
înregistrat ca funcţie de prezenţa sau absenţa unor benzi generate fie prin digestia cu enzime de
restricţie, fie prin procedurile de amplificare a ADN, fie prin ambele. Ideea de bază în acest caz o
constituie faptul că variaţiile din profilul de benzi sunt o reflectare directă a relaţiei filogenetice
a organismelor studiate, putând fi utilizate ca “amprente genomice” (genomic fingerprints) care
permit analiza numerică în scopul caracterizării şi identificării.
In prezent există numeroase tehnici de “DNA fingerprinting”, majoritatea bazate pe
folosirea tehnicii P.C.R. pentru detectarea fragmentelor unei probe de ADN. Alegerea unei
anumite tehnici de DNA fingerprinting depinde de aplicaţiile sale ulterioare.
Tehnica A.F.L.P. (Polimorfismul de Lungime al Fragmentelor Amplificate) este bazată
pe detectarea fragmentelor genomice de restricţie cu amplificarea acestora prin P.C.R. şi are
avantajul de a putea fi folosită pentru probe de ADN de orice provenienţă şi complexitate.
Amprentele sunt produse fără a fi necesară o cunoaştere anterioară a secvenţei, folosind un set
limitat de primeri. Numărul de fragmente rezultate dintr-o singură reacţie poate fi reglat prin
selectarea unor seturi specifice de primeri. Reacţia A.F.L.P. îmbină siguranţa tehnicii R.F.L.P. cu
puterea de amplificare a tehnicii P.C.R.
Tehnica A.F.L.P. decurge în mai multe etape ( Fig. 30):
(1) Digestia ADN total cu două endonucleaze de restricţie (ER):
→ ER care recunoaşte un număr mare de situsuri în proba de ADN studiată (frequent
cutter) şi care generează un număr mare de fragmente de dimensiuni optime pentru procesul
ulterior de amplificare şi separare prin electroforeză în gel denaturant;
→ ER care recunoaşte numai un număr redus de situsuri (rare cutter) şi a cărei utilizare
are drept scop reducerea numărului de fragmente rezultate în urma restricţiei.
Folosirea a două ER face posibilă marcarea uneia dintre catenele ADN a produşilor
dublucatenari ai reacţiei P.C.R., permite o mare flexibilitate a reglării numărului de fragmente ce
urmează a fi supuse amplificării, iar numărul de amprente diferite care pot fi generate este mărit
prin realizarea de combinaţii multiple folosind relativ puţini primeri.
(2) Ligarea la ambele capete ale fragmentelor de restricţie a unor adaptori constituiţi din
oligonucleotide nefosforilate cu secvenţe caracteristice situsurilor corespunzătoare. Aceşti
adaptori constituie ţinte pentru ligarea primerilor reacţiei P.C.R.
(3) Amplificarea selectivă a fragmentelor de restricţie: secvenţele adaptor servesc ca situsuri de
legare pentru primerii P.C.R. Primerii sunt constituiţi la capătul 5 din secvenţe complementare
cu cele aparţinând adaptorilor, includ secvenţa situsului de restricţie, iar la capătul 3 conţin baze
selective. In condiţii stringente vor fi elongaţi numai primerii care se potrivesc perfect. Doar unul
dintre primeri va fi marcat radioactiv şi, ca urmare, vor fi identificate numai fragmentele
purtătoare a situsului de restricţie corespunzător.
(4) Identificate prin electroforeză în gel denaturant de poliacrilamidă a fragmentelor amplificate
(aproximativ 50 - 100 fragmente cu dimensiuni cuprinse între 80 - 550 pb.

Fig. 30. Tehnica A.F.L.P.

 În Fig. 31 este prezentat un fragment dintr-o dendogramă realizată pe baza profilurilor
benzilor obţinute prin A.F.L.P., pentru diferite tulpini aparţinând unor specii de Candida, printre
care şi C. tropicalis.

Fig. 31. Dendograma unor tulpini de Candida, obţinută prin interpretarea rezultatelor A.F.L.P.
(de Borst, 2003)

În ceea ce priveşte avantajele şi dezavantajele pe care tehnica A.F.L.P. le prezintă

comparativ cu alte tehnici folosite în caracterizarea genetică şi taxonomia drojdiilor, acestea pot
fi clasificate în funcţie de anumite criterii (Savelkoul, 1999):
(A) Acurateţe şi reproductibilitate. Tehnica A.F.L.P. permite detectarea directă a unor
cantităţi mici de probe de ADN, fără digestii ulterioare, ceea ce prezintă un avantaj faţă de
R.F.L.P. deoarece se elimină riscul unor digestii parţiale sau apariţiei unor benzi de restricţie
neclare. Ligarea primerilor se realizează în condiţii stringente de temperatură si reacţie, fapt care
conferă A.F.L.P. un grad de reproductibilitate şi acurateţe mai mare decât al R.A.P.D. Principalul
dezavantaj îl constituie însă faptul că detectarea clară a fragmentelor de dimensiuni foarte mici
este dependentă de concentraţia probei de ADN folosite.
(B) Parametrii tehnici. Fiind o tehnică bazată pe P.C.R., probele sunt reprezentate de
cantităţi mici de ADN (10 – 100 ng), care însă trebuie să rezinte un grad înalt de puritate şi
integritate. Spre deosebire de R.A.P.D., acurateţea tehnicii nu este puternic influenţată de o
valoare strictă a concentraţiei probei. Existenţa unor etape de digestie, ligare, amplificare,
denaturare, măresc timpul de desfăşurare al tehnicii, dar acestea sunt compensate de utilizarea
unor primerii marcaţi fluorescent şi de analiza rezultatelor cu ajutorul secvenţiatoarelor
automate.
(C) Selectivitate. Analizele A.F.L.P. pot fi utilizate practic pentru toate organismele,
inclusiv drojdii, cu o singură condiţie: izolarea probelor de ADN trebuie făcută pornind de la
culturi pure.
(D) Putere discriminatorie la nivel taxonomic. Faţă de alte tehnici de taxonomie
moleculară (secvenţierea ADN şi ADNr, ARDRA, reasociere ADN/ADN), tehnica A.F.L.P. nu
permite identificarea microorganismelor la nivel de familie şi gen, ci la nivel de specie,
subspecie şi tulpină. Un avantaj major în acest sens îl reprezintă numărul mare de benzi
electroforetice rezultate şi care pot fi analizate, conferind numeroase date cu privire la posibile
mutaţii apărute în cursul evoluţiei.
Trebuie subliniat faptul că, pe lângă valoarea sa taxonomică deosebită, tehnica A.F.L.P.
are şi alte aplicaţii. Astfel, majoritatea fragmentelor A.F.L.P. corespund unor poziţii unice în
genom şi pot fi utilizate ca markeri în hărţile genetice şi fizice, fiecare fragment fiind caracterizat
printr-o anumită mărime şi prin primerii necesari amplificării. Markerii A.F.L.P. pot fi folosiţi şi
pentru identificarea clonelor genomice corespunzătoare cuprinse în biblioteci formate din vectori
de tip YAC sau BAC şi pentru fingerprinting-ul segmentelor de ADN clonate.