Elemente de Taxonomie Moleculara Drojdii
Elemente de Taxonomie Moleculara Drojdii
Elemente de Taxonomie Moleculara Drojdii
La drojdii, unitatea taxonomică de bază este tulpina. Unele specii cuprind o singură
tulpină (Brettanomyces abstinens), în timp ce altele prezintă un număr mare de tulpini (de
exemplu, pentru specia Saccharomyces cerevisiae au fost descrise peste 200 de tulpini).
Tulpinile sunt grupate în specii, speciile care prezintă caractere comune formează genuri, iar
grupurile de genuri formează familii asamblate în ordine, ordinele în clase. Taxonii superiori
sunt desemnaţi prin sufixe standard: -aceae pentru familii şi -ales pentru ordine.
Drojdiile sunt clasificate în funcţie de prezenţa / absenţa şi mecanismele procesului de
sexualitate, în : ascomicete, basidiomicete şi deuteromicete (fungi imperfecţi). Cu toate acestea,
analizele moleculare indică faptul că ascomicetele de tipul Saccharomyces şi Pichia reprezintă
formele teleomorfe (forme ce prezintă meioză şi sporulare şi, implicit, sexualitate) ale fungilor
imperfecţi de tipul Candida, consideraţi ca forme anamorfe (forme care se divid vegetativ prin
mitoză şi nu prezintă sexualitate).
În ultima vreme, au fost identificate numeroase specii aparţinând genurilor de drojdii
Rhodotorula, Candida şi Yarrowia (Durham, 1984; Mauersberger, 1996; Barth, 1996) ca fiind
implicate în procese biodegradative ale unor compuşi poluanţi. Utilizarea acestor specii în
bioremedierea ecosistemelor poluate, implică, în primul rînd, o cunoaştere cât mai profundă şi
acurată a aspectelor morfo-fiziologice si biochimice a acestora şi, nu în ultimul rând, a
mecanismelor genetice implicate în căile metabolice specifice acestei categorii de drojdii.
În vederea unei caracterizări complete şi a unei identificării taxonomice cât mai acurate,
tulpinile de drojdii sunt supuse unui număr mare de analize. O parte dintre acestea sunt
cunoscute generic sub denumirea de „analize convenţionale”, fiind reprezentate de tehnici care
conferă date cu privire la caracterele morfo-fiziologice ale tulpinilor luate în studiu şi anume:
Aspectul microscopic al celulelor - se iau în studiu mărimea şi forma celulelor, modul
de reproducere vegetativă (prin înmugurire multilaterală, bipolară sau unipolară, prin fisiune,
prin formare de filamente) şi, acolo unde este cazul, forma, structura şi modul de formare a
ascosporilor şi teliosporilor.
Tipul de reproducere sexuată. Unele specii de drojdii se reproduc sexuat prin ascospori,
unele prin teliospori, iar altele prin bazidiospori. O importanţă deosebită o au informaţiile cu
privire la: dacă tulpina este homotalică sau heterotalică; tipul de împerechere; forma, topografia
şi numărul ascosporilor.
Caracterele fiziologice luate în studiu sunt: capacitatea (1) de a fermenta semi-anaerob
unele zaharuri; (2) de a creşte aerob pe diferiţi compuşi prezenţi în mediu ca unică sursă de
carbon sau azot; (3) de a creşte pe medii lipsite de unele vitamine; (4) de a creşte în prezenţa în
mediu a D-glucozei în concentraţie de 50% sau 60% (w/v) sau a NaCl 10% (w/v) + D-glucoza
5% (w/v); (5) de a se dezvolta la 37oC; (6) de a creşte în prezenţa cicloheximidei; (7) de a scinda
acizii graşi; (8) de a produce polizaharide de tip amidon; (9) de a hidroliza ureea; (10) de a forma
acid.
Testele fiziologice reprezintă o etapă importantă în identificarea şi clasificarea drojdiilor.
Majoritatea taxonomiştilor utilizează aceste teste în combinaţie cu observaţiile de microscopie,
dar există unele scheme care permit identificarea completă a taxonilor aproape exclusiv pe baza
reacţiilor de asimilaţie şi fermentaţie. Dezavantajul major rezultat din utilizarea exclusivă a
testelor de fiziologie este acela că, orice variabilitate apărută în timpul realizării testelor, fie
datorită procedurii, fie datorită răspunsului tulpinii analizate, poate duce la o identificare total
eronată.
Testele morfo-fiziologice permit identificarea unor noi specii sau tulpini prin realizarea
unor referiri la cele existente şi caracterizate în diferite colecţii şi laboratoare din întreaga lume.
Determinatoarele de drojdii prezintă chei de identificare a căror utilizare permite, de regulă,
identificarea până la nivel de specie a drojdiei luate în studiu.
Caracterele biochimice. Studiul unor caractere biochimice, cum ar fi, structura peretelui
celular şi, în mod special, studiul mananilor, poate avea un rol important în taxonomie. Un alt
exemplu îl constituie observaţiile privind tipul de ubiquinonă (coenzima Q) specifică diferitelor
drojdii.
Barnett şi colab. (1983) au pus la punct un sistem de identificare asistat de computer,
bazat pe un anumit număr şi combinaţie de chei de identificare pentru diferite specii, luând în
consideraţie, în principal, caracterele fiziologice, eliminând astfel observaţiile de morfologie care
necesită o practică mai îndelungată şi o anumită experienţă.
Date fiind însă neajunsurile sistemului bazat pe chei de identificare, Kirsop şi colab.
(1986) au realizat un sistem probabilistic, care ia în consideraţie răspunsul a 400 de specii la 46
de teste morfologice şi fiziologice, teste alese pe bază de reproductibilitate a rezultatelor,
uşurinţa execuţiei, independenţă reciprocă şi grad de aplicabilitate la un număr mare de specii.
Drojdiile necunoscute sunt examinate pe baza acestui test, iar rezultatele sunt introduse în
computer şi este determinată probabilitatea ca o tulpina neidentificată să aparţină fiecărei specii
în parte. Identificarea se bazează astfel pe răspunsul la toate testele a tulpinii necunoscute, iar în
calculul de probabilitate sunt incluse răspunsurile atipice.
În cazul în care se urmăreşte numai indicarea unei posibile identităţi a drojdiei, pot fi
utilizate anumite teste pentru elaborarea unor chei de identificare. Pentru aplicarea unui astfel de
sistem însă este necesară o indicare aproximativă a genului sau speciei din care se presupune că
drojdia studiată face parte.
Actualmente există kit-uri de identificare a drojdiilor, care prezintă un număr de teste
care au, de cele mai multe ori, aplicabilitate numai pentru anumite specii. Deoarece condiţiile de
cultură de pe kit-uri sunt diferite de cele din testele de laborator, este recomandat ca rezultatele
obţinute prin utilizarea acestor kit-uri să fie completate cu experimente efectuate prin metode
clasice şi apoi supuse comparaţiei cu datele din determinatoare în scopul obţinerii unei
identificări acurate (Kurtzman, 1988).
Identificarea unei anumite tulpini sau specii de drojdie, nu poat fi realizată însă numai pe
baza acestor studii morfo-fiziologice, acestea permiţând, de cele mai multe ori, identificarea
microorganismelor până la nivel de specie. Dezvoltarea rapidă şi extensivă a biologiei
moleculare, precum şi cantitatea şi calitatea net superioară a informaţiilor furnizate de aceasta, au
dus la dezvoltarea şi perfecţionarea unui număr din ce în ce mai mare de tehnici şi metode înalt
performante care permit abordarea unor aspecte intime de structură şi funcţie a genomului
eucariot. Acestea au avut ca rezultat obţinerea unei clasificări taxonomice acurate, precum şi
realizarea sau chiar rearanjarea unor arbori filogenetici. În acest sens, tehnicile / analizele de
taxonomie moleculară, cum sunt denumite generic, au grade diferite de selectivitate lanivelul
rangurilor taxonomice, pornind de la familie până la tulpină (Tab. 6).
Rang taxonomic
Analiza Familie Gen Specie Tulpină
Secvenţierea ADN
Secvenţierea ARNr (18S, 25S)
Determinarea compoziţiei în baze azotate (mol % GC)
ARDRA
Determinarea gradului de omologie a moleculelor de ADN
- reasociere (hibridizare) ADN / ADN
Electrocariotiparea (PFGE)
RFLP
RAPD
Tab.6. Câteva analize folosite în taxonomia moleculară a drojdiilor şi rangul lor taxonomic
2. 2. 2. Electrocariotiparea
Apariţia şi dezvoltarea tehnicilor de electrocariotipare - OFAGE, FIGE, CHEF, etc – au
constituit un pas major în caracterizarea genomului nuclear al drojdiilor. În acelaşi timp,
analizele efectuate pe molecule de ADN cromozomal intacte, au permis o mai bună delimitare a
speciilor una de cealaltă, prin caracterizarea seturilor de cromozomi, precum şi stabilirea acurată
a apartenenţei unei tulpini la o anumită specie prin evidenţierea fenomenului de polimorfism de
lungime al cromozomilor. Aceste avantaje deosebite sunt motivul pentru care electrocariotiparea
costituie în prezent un element esenţial în studiile de taxonomie moleculară a drojdiilor.
În Fig. 18 sunt prezentate grafic gelurile de electrocariotipare pentru separarea
cromozomilor de C. tropicalis (A – godeu 1), C. maltosa (A – godeu 2) şi Y. lipolytica (B –
godeurile 1 şi 2 ), prin folosirea aceleiaşi tehnici – CHEF – şi aceluiaşi marker de migrare –
cromozomi standard de S. cerevisiae. Analiza comparativă a gelurilor evidenţiază profilurile
cromozomale specifice fiecărei specii: s-au separat majoritatea cromozomilor de la C. maltosa şi,
în aceleaşi condiţii de migrare, s-au izolat numai 2 dintre cromozomii de C. tropicalis, aceştia
fiind de dimensiuni mai mari (între 1 şi 2,2 Mb).
Al doilea gel a fost obţinut în condiţii electrice care au permis separarea cromozomilor de
dimensiuni mari ai drojdiei Y. lipolytica. Mai mult, se observă chiar variaţia intra-specifică a
electrocariotipului, datorată polimorfismului de lungime şi număr al cromozomilor.
(A) (B)
Fig. 18. Reprezentarea grafică a gelurilor de electrocariotipare obţinute prin CHEF
(A - godeuri: 1 - C. tropicalis, 2 - C. maltosa; B - godeuri 1, 2 - Y. lipolytica ; M –
pentru A şi B – marker - cromozomi de S. cerevisiae)
Tm
60 70 80 90 100
0 10 20 30 40 50
Calcularea Reasociere
% mol GC ADN/ADN
Hibridizarea pe suport solid. Hibridizarea în soluţie nu este cea mai eficientă metodă
pentru determinarea gradului de înrudire între doua probe de ADN datorită faptului ca în timpul
amestecării celor două monocatene apar doua tipuri de reacţii: (1) catenele complementare
provenite din aceeaşi molecula de ADN pot renatura cu refacerea moleculei originale; (2) fiecare
monocatenă a unei molecule de ADN dintr-o sursă poate hibridiza cu alta provenită din ADN-ul
celeilalte surse. Competiţia dintre cele două tipuri de reacţii îngreunează estimarea gradului de
hibridizare. Acest neajuns poate fi eliminat prin imobilizarea monocatenelor provenite de la una
dintre surse, astfel încât aceasta să nu mai poata renatura. Principalul suport solid folosit este
filtrul de nitroceluloză. Odata ce un filtru a fost folosit pentru a absorbi ADN monocatenar poate
fi tratat pentru a împiedica absorbţia ulterioară a altor monocatene.
În Fig. 20 este reprezentată tehnica prin care una dintre moleculele de ADN este
denaturată si absorbită pe filtru, ulterior, fiind adaugată o a doua probă de ADN denaturată în
soluţie. Aceasta se absoarbe pe filtru numai dacă este complementară cu ADN monocatenar
existent deja pe suprafaţa solidă. De obicei, a doua probă de ADN monocatenar este marcată
(radioactiv sau neradioactiv cu fluoresceină sau biotină), ceea ce permite determinarea gradului
de hibridizare prin măsurarea cantităţii de marcaj radioactiv reţinut pe filtru şi, respectiv, prin .
Din datele actuale obţinute prin experimentele de reasociere speciile de bacterii si drojdii
pot fi definite ca diferind prin diverse valori ale omologiei ADN/ADN. Bacteriologii tind să
considere ca fiind conspecifice tulpinile bacteriene care prezintă un grad de omolgie relativ
scăzut de 65 - 70%, în timp ce la drojdii aceste valori sunt mai ridicate situându-se între 80 -
100% (Kurtzman si colab.,1980). Utilizând metoda de determinare spectrofotometrică a lui de
Ley (1970), Jahnke si Bahnweg (1986) au stabilit că tulpinile de drojdii care prezintă 90 - 95%
omologie de secvenţă ADN sunt conspecifice.
Fig. 20. Schema realizarii reasocierii ADN /ADN pe filtru cu sonde ADN
marcate cu biotin - dUTP
Interpretarea datelor obtinuţe din experimentele de reasociere ADN / ADN ramâne însă
problematică, rezultatele depinzând de tipul de ADN folosit: ADN total, ADN nuclear purificat,
ADN mitocondrial sau ADN ribozomal. În acest sens, un rol important îl are prezenţa ADN
repetitiv. Cum renaturarea ADN este dependentă de numărul secvenţelor de ADN
complementare, este clar ca ADN repetitiv va renatura mai repede decât cel non-repetitiv
reprezentat de secvenţe unice. De aceea, procesul de renaturare este rezultanta a două reacţii:
renaturarea rapidă a secventelor de ADN repetitiv sau ADN mitocondrial, dacă este cazul, şi
renaturarea mai lentă a fragmentelor unice de ADN. La eucariotele superioare aproximativ 80%
din genele transcrise în proteine sunt localizate în porţiuni unice ale ADN şi numai 20% în ADN
moderat repetitiv. ADN înalt repetitiv de la animale şi la plantele verzi nu conţine, în general,
informaţie genetică codificatoare. Ca urmare, ADN non-repetitiv reprezintă materialul cel mai
indicat pentru experimentele de reasociere ADN / ADN. La drojdii, la care ADN repetitiv
reprezintă 20% din cel total, aceasta regulă nu este respectată deoarece, pe de o parte, informaţia
genetică din ADN moderat repetitiv este transcrisă în mare masură, putând fi folosită în
experimente de reasociere ADN / ADN iar, pe de altă parte, majoritatea ADN repetitiv nu este
luat în calcul la interpretarea finală a cineticii reacţiei fiind exclus încă din primele momente
datorită vitezei mari de reasociere.
Tehnicile de realizare a reasocierii ADN / ADN sunt influenţate deasemenea, în proporţie
diferită, de prezenţa ADN repetitiv. Astfel, metoda imobilizării pe filtru este cea mai afectată.
Datorită prezenţei ADN în concentraţie scazută în mediul de reacţie, va reasocia numai o mică
parte a genomului şi anume cea reprezentată de secvenţele repetitive care au o viteză si o rată
mare de reasociere. Dacă cele două molecule de ADN participante la reacţie nu conţin aceeaşi
cantitate de ADN repetitiv, se vor obţine două valori ale procentului de reasociere ADN / ADN
depinzând de care dintre moleculele de ADN este cea imobilizată pe filtru: în cazul în care ADN
fixat este cel mai bogat în secvenţe repetitive, cantitatea de ADN din soluţie care va hibridiza cu
acesta va fi mai mare. În cazul tehnicii de reasociere în soluţie monitorizată spectrofotometric,
procentul de renaturare poate reprezenta 10 - 17% până la 50% din genom.
Se poate concluziona că procesul de reasociere a ADN este afectat de mărimea şi
structura genomului care constituie factori importanţi în evaluarea gradului de omologie ADN /
ADN.
Un rol important îl au însă şi condiţiile de reacţie :
Creşterea tăriei ionice a mediului de reacţie duce la mărirea vitezei de reacţie. Folosirea
unui tampon salin citrat 2 X (0.15 mM clorura de sodiu/ 0.015 mM citrat de sodiu, pH = 7.0)
permite parcurgerea procesului într-un timp relativ scurt.
Temperatura optimă de reasociere a ADN este cu 25 - 30oC mai mică decât valoarea Tm.
Concentraţia initială a probei de ADN afectează viteza de reacţie. Aceasta însemnă că o
soluţie ce contine 100 g ADN/ml reasociază în jumatate din timpul necesar pentru o soluţie ce
contine numai 50 g/ml ADN.
* cu capete netede - “blunt ends” - ER taie cele două catene ale ADN la acelaşi situs (Hae III,
Eco R V, Sma I)
Dat fiind faptul că diferitele enzime de restricţie recunosc o gamă largă de secvenţe, este
relativ uşor a alege o enzimă care să producă un fragment de ADN ce conţine o anumită genă.
Într-o reacţie de restricţie poate fi folosită o singura enzimă sau mai multe.
Probele rezultate sunt supuse electroforezei în gel de agaroză, iar profilurile benzilor
obţinute sunt studiate comparativ (Fig. 21). Viteza de migrare a fragmentelor în gel este invers
proporţională cu mărimea lor, fragmentele mici migrând mai repede decât cele mari, în timp ce
fragmentele de aceeaşi dimensiune migrează cu aceeaşi viteză, ocupând poziţii echivalente în
gelul de elctroforeză. Colorarea gelurilor cu bromura de etidiu, care interferă cu bazele azotate din
structura ADN, permite vizualizarea benzilor rezultate în urma electroforezei şi, totodată,
interpretarea rezultatelor. În cazul în care se utilizează molecule de ADN extrase din diferite surse
care au fost supuse digestiei cu aceeaşi / aceleaşi enzime de restricţie, tehnica R.F.L.P. poate
furniza informaţii privind evoluţia genomului şi gradul de înrudire a organismelor sursă.
Fig. 21. Evidenţierea prin electroforeză în gel de agaroză a fragmentelor rezultate prin restricţia a
trei probe de ADN cu aceeaşi enzimă de restricţie
Fig. 22. Exemplificări de mutaţii la nivelul ADN, care determină apariţia unor profiluri de
restricţie diferite
(A) o moleculă de ADN este tăiată cu aceeaşi ER la trei situsuri, rezultând două fragmente de
ADN cu mărimi diferite, izolate ulterior prin elecroforeză în gel de agaroză;
(B) modificarea unei perechi de baze din interiorul unuia dintre situsurile de restricţie împiedică
recunoaşterea acestuia de către ER, rezultatul fiind un singur fragment de restricţie de
dimensiune mai mare;
(C) duplicarea unei secvenţe de ADN duce la creşterea dimensiunii primei secvenţe de ADN
recunoscute de ER.
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4
(A) (B)
Fig. 23. Electroforeza în gel de agaroză a fragmentelor de restricţie a ADN mitocondrial
(A) godeuri: 1, 6 – / Eco RI, Hind III; 2 - Y. lipolytica / Rsa I; 3 – C. parapsilosis / Rsa I;
4 – C. tropicalis / Rsa I; 5 - C. boidinii / Rsa I;
(B) godeuri: 1 – C. parapsilosis/ Hinf I; 3 – C. tropicalis / Hinf I; 4 – / Hind III
(b)
(a)
Fig. 24. Profilurile de restricţie obţinute prin CHEF pentru probe de ADN cromozomal
intacte, provenite de la 4 tulpini patogene de C. tropicalis (benzile 13, 14, 15, 16)
izolate de la pacienţi diferiţi, supuse digestiei cu (a) BssHII şi (b) SfiI (M - marker
cromozomi de S. cerevisiae) (de Rho, 2004)
Primer Secvenţă
OPA-18 5′-AGCTGACCGT-3′
OPB-01 GTTTCGCTCC
OPB-04 GGACTGGAGT
OPB-10 CTGCTGGGAC
OPB-12 CCTTGACGCA
OPB-11 GTAGACCCGT
OPB-14 TCCGCTCTGG
OPB-17 AGGGAACGAG
OPE-04 GTGACATGCC
RP1-4 TAGGATCAGA
RP-2 AAGGATCAGA
RP4-2 CACATGCTTC
Primer Secvenţă
ITS1 5′ - TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′
ITS2 GCTGCGTTCTTCATCGATGC
ITS3 GCATCGATGAAGAACGCAGC
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
ITS1-F CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA
ITS4-R CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG
Ampliconii obţinuţi sunt analizaţi utilizând tehnica R.F.L.P., prin digestie cu diferite
endonucleaze de restricţie, printre cel mai des utilizate la drojdii fiind: HinfI (5'-G/ANTC-3'),
HaeIII (5'-GG/CC-3'), DdeI (5'-C/TNAG-3'), CfoI (5'-GCG/C-3'). Pentru obţinerea unor
informaţii cât mai complete şi acurate se recomandă utilizarea în experimente paralele a mai
multor endonucleaze pentru analiza aceluiaşi amplicon. Este posibil ca două sau mai multe
tulpini diferite supuse aceluiaşi experiment, să formeze ampliconi cu dimensiuni apropiate sau
identice. Cu toate acestea, în urma reacţiei de resticţie cu o anumită enzimă, vor rezulta profiluri
electroforetice diferite, specie - specifice. În Tab. 10 sunt prezentate trei tulpini de C. maltosa, C.
tropicalis şi Y. lipolytica, supuse amplificării cu primeri ITS1 şi ITS4. Pentru cele două specii de
Candida s-au obţinut ampliconi cu aceeaşi dimensiune (550pb), care însă prin resticţie cu HaeIII,
CfoI şi HinfI au format un număr diferit de fragmente de dimensiuni variate (Esteve-Zarozo,
1999).
Specia Dimensiune Dimensiune fragmente restricţie amplicon (pb)
amplicon (pb) CfoI HaeIII HinfI
C. maltosa 550 300 + 250 550 280 + 270
C. tropicalis 550 280 + 250 450 + 90 270 + 270
Y. lipolytica 380 210 + 170 380 190 + 190
Fig. 28. Arbore evolutiv pentru specii ale genului Candida şi ale altor genuri înrudite
(Barns, 1991) (distanţa evolutivă între diferite perechi de specii se obţine prin însumarea valorilor
tercute pe bara otizontală inferioară)
Aceeaşi concluzie a fost obţinută şi recent de Diezmann şi colab. (2004), care au realizat
un studiu cuprinzând 38 de specii de drojdii aparţinând genului Candida şi altor genuri înrudite.
Ei au construit un arbore filogenetic al clasei Hemiascomycetes (Saccharomycetales) căreia
aparţin C. tropicalis, C. maltosa şi Y. lipolytica, folosind datele obţinute prin secvenţierea
ampliconilor mai multor gene: pentru ARNr 18S şi 25S, actină (ACT1), factorul de elongare
EF2, subunitatea B a ARNpolimerazei (RPB1) (Fig. 29). aparţin Studiul a permis determinarea a
3 grupe (“clades”) formate din specii ce prezintă ancestorilor comuni. C. maltosa şi C.
tropicalis sunt strâns înrudite şi aparţin, ca majoritatea speciilor de Candida, primului grup. De
asemenea, a fost evidenţiat un lucru foarte interesant: specii potenţial patogene aparţinând
genului Candida şi nu numai, de exemplu Y. lipolytica, deşi îndepărtate filogenetic, se regăsesc
distribuite în toate cele trei grupe. Această observaţie are o deosebită importanţă, sugerând
apariţia fenomenului de patogenitate în diferite momente ale evoluţiei sub influenţa unor factori
independenţi.
Fig. 31. Dendograma unor tulpini de Candida, obţinută prin interpretarea rezultatelor A.F.L.P.
(de Borst, 2003)