Spectrofotometrie

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

 Ce este un spectru?

Definitie
➔
Definitie generala = toate valorile pe care le poate lua o marime fizica
valori
Spectru
continuu

 Spectre continue / discrete

➔
Spectru continuu – marimea fizica
poate lua orice valoare, intr-un
interval valori
➔
Spectru discret – marimea fizica
poate lua doar anumite valori valori Spectru
discrete in interiorul unui interval discret

valori

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

 Spectrul EM

Spectrul electromagnetic


c= =⋅
T

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

 Spectrul EM

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

 Spectrofotometrie.
Spectre de absorbtie si de emisie


Spectrofotometria = masuratoare cantitativa a spectrelor
de absorbtie / emisie ale unei substante


Absorbtia radiatiei EM:
➔
Apare la orice substanta
➔
Este maxima la o anume lungime de unda (specifica substantei analizate)

Emisia radiatiei EM:
➔
Emisia anumitor lungimi de unda, in functie de molecula, ca rezultat al excitarii
moleculei (transfer de energie)

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

 Spectrofotometrie.
Spectre de absorbtie si de emisie

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

 Spectre de absorbtie si emisie

Energia radiatiei incidente poate fi absorbita la:
➔
Nivel atomic – electronii “sar” pe niveluri energetice superioare; energia
absorbita corespunde diferentei de energie intre nivelul fundamental si nivelul
excitat, de aceea spectrul de absorbtie va fi discret
➔
Nivel molecular – energia va fi utilizata pentru he energy will be used to:

Cresterea vitezei de agitatie moleculara (energie cinetica) → efect termic, spectru de
absorbtie continuu

Cresterea energiei cinetice de rotatie a moleculelor

Cresterea energiei cinetice de vibratie a moleculelor

Moleculele care au absorbit energie intra intr-o stare
excitata, cu timp de viata scurt; revenirea la starea
fundamentala se face prin eliberare de energie:

Emisie radiativa:
➢
Fotoluminescenta (lungimea de unda emisa va fi intotdeauna mai mare ca
cea absorbita – energia emisa ESTE INTOTDEAUNA sa fie mai mica decat
energia absorbita!)

Emisie neradiativa:
➢
Emisie de caldura
➢
Declansarea unor reactii fotochimice
UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie
 Spectre de absorbtie. Cromofori

Cromoforii sunt anumite grupari din structura unei
molecule, responsabile pentru culoarea ei
Cromofor Varf de
absorbtie

Fiecare cromofor va
prezenta un maxim de
absorbtie specific

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

 Spectre de absorbtie. Cromofori

Cand intr-o molecula exista mai multi cromofori,
aceastia isi influenteaza reciproc maximele de
absorbtie:

Efect batocromic (max ) / efect hipsocromic (max )

Efect hipercromic (absorbtie crescuta) / efect hipocromic
(absorbtie scazuta)

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

 Aplicatiile spectrofotometriei

Analiza calitativa
➔
Din spectrul de absorbtie pot fi deduse informatii
structurale, pe baza varfurilor de absorptie intalnite


Analiza cantitativa
➔
Amplitudinea absorbtiei depinde de concentratia
substantei

Determinari de concentratii ADN/ARN

Determinarea densitatii bateriilor intr-o cultura

Screening toxicologic etc

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

 Legea Beer-Lambert

Exprima legatura intre intensitatea luminii care
traverseaza o solutie si concentratia solutiei respective

I0 = intensitatea luminii incidente

I = intensitatea luminii emergente
C = concentratia solutiei
d = grosimea cuvetei cu solutie
 = coeficient de absorbtie

− C d
I= I 0 10
N.B. - pentru gaze, legea se scrie
de obicei in forma exponentiala

Coeficientul de absorbtie  depinde de lungimea de unda a luminii

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

 Transmisia si extinctia

In spectrofotometrie se folosesc uzual doi
parametri pentru a cuantifica absorbtia:

Transmisia (T)

Extinctia (E)

I 1
T= = 10
− C d
E= log = −log T 
I0 T

T ∈[0, 1] E=  C d

E∈0, ∞

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

 Transmisia si extinctia

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

 Masurarea spectrului de absorbtie

Masurarea extinctiei pentru un interval de lungimi de
unda

Trasarea curbei E = f(λ)

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

 Masurarea spectrului de absorbtie

Spectrul de absorbtie este influentat de:
➔
Concentratie → varfuri mai inalte la concentratii mai mari
➔
Temperatura
➔
pH → influenteaza echilibrul intre formele protonate / neprotonate ale
gruparilor moleculare, forme care pot avea varfuri de absorbtie diferite

Formele dimerice / trimerice ale moleculelor pot avea varfuri
de absorbtie suplimentare

Echilibrul intre formele mono / dimerice etc este influentat
de:
➔
Temperatura → temperaturile crescute favorizeaza formele
monomerice
➔
Concentratia → concentratiile mai mari cresc procentul de forme
dimerice

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

 Activitate experimentala

Masurarea spectrului de absorbtie al unor solutii de
colorant (acridin oranj) cu concentratiile de: 2‰, 4‰, 8‰,
si o concentratie necunoscuta x ‰
➔
Pentru fiecare solutie, masuram extinctia intre 360 nm si 600
nm, cu pasi de 20 nm; datele vor fi trecute intr-un tabel ca cel de
mai jos;
➔
Pe baza datelor din tabel, desenam curbele de absorbtie pentru
cele patru solutii
λ 2 4 8 x

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

 Activitate experimentala

Calculam concentratia x ‰:
➔ Alegem setul de valori ale E care corespund varfului de
absorbtie (sunt suficiente valoarea pentru x ‰ si pentru una
din solutiile cunoscute)
E x = x d
E cunoscuta = C cunoscuta d
Ex xd
=
E cunoscuta  C cunoscuta d

E x C cunoscuta
x=
E cunoscuta
UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie
 Activitate experimentala
Exemplu (Atentie! Nu corespunde cu datele ce se vor obtine la LP!)

Obtinem 3 varfuri de absorbtie, la 415 nm, 500 nm si 570 nm, dupa
cum se vede in figura

Alegem valorile corespunzatoare lungimii de unda de 570 nm (cel
mai mare varf de absorbtie)

λ 2 4 8 x
570 0.75 1.5 3 1.2


Concentratia solutiei
necunoscute va fi (‰):

Ex 8 1.2⋅8
x= ; x=
E8 3
x= 3.2
UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie