CURS- ANALIZA MEDICAMENTULUI

Electroforeza capilara
 INTRODUCERE

Electroforeza capilara este o metoda separativa

de analiza care s-a dezvoltat datorita experientei
dobandite in HPLC si procedeelor mai vechi de
electroforeza. Ea permite separarea atat a
biomoleculelor pentru care HPLC este mai putin
performanta cat si a compusilor cu mase
moleculare mici, dificil de studiat prin procedeele
clasice de electromigrare pe suport.
Electroforeza capilara de inalta performanta
(HPCE) si-a facut debutul in laboratoarele de
biochimie de la inceputul anilor 1990 alaturi de o
alta metoda numita electrocromatografia capilara.
PRINCIPII DE BAZA IN ELECTROFOREZA CAPILARA

Electroforeza capilara corespunde unei adaptari

particulare a metodei generale de electroforeza.
Aceasta metoda separativa se bazeaza pe migrarea
speciilor purtatoare de sarcini electrice globale din
proba aflata in solutie sub efectul unui camp
electric si in contact cu un suport corespunzator.
In tehnica clasica obisnuita, larg utilizata in
domeniul bioanalitic, se utilizeaza benzi de
material plastic acoperite cu o substanta poroasa
impregnata cu un electrolit. Capetele sunt imersate
in doua rezervoare independente, continand acelasi
electrolit si cuplate la electrozii unui generator de
tensiune continua.
 PRINCIPII DE BAZA IN ELECTROFOREZA
CAPILARA

Proba este depusa sub forma unui strat subtire

transversal pe banda, eventual presata intre doua
placi izolante. Speciile hidratate prezente
migreaza intr-un timp variabil cuprins intre cateva
secunde pana la cateva ore spre una dintre
extremitatile benzii. Fiecare compus se diferentieaza
prin mobilitatea sa. Detectia speciilor prezente dupa
migrare se efectueaza in general prin transferul
acestora printr-un procedeu de contact pe o
membrana unde sunt relevate cu ajutorul unor
reactivi specifici. Prelucrarea datelor se face ca si in
CSS.
 PRINCIPII DE BAZA IN ELECTROFOREZA
CAPILARA

In electroforeza capilara suportul plan din

tehnica clasica este inlocuit de un tub capilar
deschis la ambele capete, din sticla de siliciu cu
diametrul variind intre 15 si 150 m. Acest capilar
cu lungimea 20-80 cm este umplut cu un electrolit
tampon.
MOBILITATEA ELECTROFORETICA SI FLUXUL
ELECTRO-OSMOTIC

Particulele aflate in suspensie intr-un lichid la

fel ca si moleculele solvatate pot fi incarcate cu o
sarcina electrica a carei marime si semn depind de
natura lor si a electrolitului si in particular de pH.
Aceasta sarcina provine din fixarea pe suprafata
lor a ionilor continuti in electrolitul tampon. Sub
efectul diverselor fenomene (agitare, temperatura,
vascozitate, diferenta de potential) aceste particule
vor avea viteze de migrare cu atat mai mari cu cat
ele sunt mai mici si au sarcina mai mare.
MOBILITATEA ELECTROFORETICA SI FLUXUL
ELECTRO-OSMOTIC- continuare

Pentru fiecare ion de raza r, viteza limita de

migrare este rezultatul echilibrului intre forta
electrica F care se exercita intr-un camp electric E
cu paricule de sarcina q si fortele de frecare care
decurg din vascozitatea a mediului.
Separarea depinde de asemenea de raportul volum
/ sarcina ionului hidratat. Speciile neutre se separa
greu fiind necesara adaugarea unui agent ionic in
electrolit care sa se asocieze cu acesta si sa
provoace o antrenare diferentiata a lor.
 MOBILITATEA ELECTROFORETICA SI FLUXUL
ELECTRO-OSMOTIC- continuare

Speciile prezente in proba sunt supuse la doua

fenomene principale care se manifesta atat
pentru ioni cat si pentru molecule: este vorba, pe
de o parte, de mobilitatea electroforetica
proprie lor iar, pe de alta, de fluxul
electroosmotic.
 MOBILITATEA ELECTROFORETICA-
ELECTROMIGRATIA

Toti compusii incarcati electric se deplaseaza in

electrolit cu o viteza v care depinde de conditiile
experimentale si de mobilitatea lor electroforetica.
Mobilitatea electroforetica se poate obtine
plecand de la electroforegrama, calculand viteza
electroforetica a compusului intr-un camp E si
tinand cont de viteza electrolitului.
 MOBILITATEA ELECTROOSMOTICA SI
ELECTROSMOZA

Al doilea factor care controleaza migrarea solutiilor

este curgerea electrolitului numit flux electro-
osmotic caracterizat prin mobilitatea electro-
osmotica.
Pentru calcularea mobilitatii electro-osmotice
trebuie determinata viteza electroosmotica. Viteza
electroosmotica este raportul intre lungimea
capilarului parcursa de un marker neutru in timpul
t. Se utilizeaza ca marker o molecula organica
nepolara la pH-ul electrolitului folosit si care este
usor detectabila prin absorbtia in UV apropiat.
 MOBILITATEA ELECTROOSMOTICA SI
ELECTROSMOZA- continuare

Fluxul electro-osmotic aflat la originea

deplasarii tuturor speciilor prezente in proba,
depinde de natura peretelui intern al tubului
capilar.
Acest perete de silice este captusit de grupari
silanice care se ionizeaza daca pH-ul este mai
mare de 3, formand o suprafata cu pozitii anionice
fixe ce creeaza un potential negativ (potential
Zeta) alaturi de un strat cationic.
 MOBILITATEA ELECTROOSMOTICA SI
ELECTROSMOZA- continuare

In interiorul solutiei, campul electrolitic provoaca

migrarea cationilor spre catod. Acesti ioni sunt
sunt solvatati si antreneaza moleculele de apa din
electrolit dirijandu-le spre catod. Anionii se
deplaseaza intr-o maniera contra- electrosmotica.
Daca se trateaza peretele capilar cu un surfactant
de tipul tetraalchilamoniu, polaritatea se
inverseaza, ceea ce conduce la o inversare a fluxului
electrosmotic.
MOBILITATEA ELECTROOSMOTICA SI
ELECTROSMOZA- continuare

In general o suprafata a peretelui capilar

negativa provoaca un flux electro-osmotic
dirijat spre catod si invers, o suprafata
pozitiva provoaca o dirijare a acestuia spre
anod.
Cunoasterea fluxului electro-osmotic este
esentiala pentru practica EC pentru obtinerea
de rezultate reproductibile.
APARATURA UTILIZATA IN ELECROFOREZA CAPILARA

A. Modul de injectare
Pentru introducerea unui microvolum de proba,
care nu trebuie sa depaseasca 1% din lungimea
utila a capilarului, pentru a nu diminua rezolutia,
se utilizeaza procedeele:
a) Injectarea hidrodinamica consta in
aplicarea unei diferente de potential intre cele
doua extremitati ale capilarului. Procedeul poate
fi ameliorat prin crearea unei presiuni de circa
50 mbar in solutia de proba.
b) Injectare electrocinetica se utilizeaza in
electroforeza pe gel si consta in aplicarea unei
diferente de potential intre extremitatile
capilarului pentru crearea unei diferente de
polaritate.
APARATURA UTILIZATA IN ELECROFOREZA CAPILARA

c) Injectarea prin gravitatie bazata pe

diferenta de inaltime intre capetele capilarului

B. Metode de detectie
a) Detectie UV/ VIS
b) Detectia prin florescenta
c) Cuplarea cu un spectrometru de masa
d) Detectare electrochimica
 TEHNICI ELECTROFORETICE

Tehnicile electroforetice sunt urmatoarele:

A. Electroforeza capilara de zona
B. Electroforeza capilara micelara
C. Electroforeza capilara pe gel
D. Electroforeza prin izofocalizare
E. Electrocromatografia capilara
 ELECTROFOREZA CAPILARA DE ZONA

Se mai numeste si electroforeza in solutie libera si

este procedeul electroforetic cel mai frecvent
utilizat. In acest procedeu capilarul este parcurs
de electrolit intr-un mediu tampon fie acid ( fosfat
sau citrat) fie bazic (borat) sau amfolit ( molecule
posedand o functie acida si una bazica). Fluxul
electro-osmotic creste cu pH-ul fazei lichide sau
poate ramane neutru.
Prin aceasta tehnica cationii sunt separati primii,
apoi ansamblul neutru si la sfarsit anionii. Tehnica
nu permite separarea speciilor neutre unele de
altele.
 ELECTROFOREZA CAPILARA MICELARA

Se mai numeste si cromatografie capilara

electrocinetica micelara.
In aceasta varianta, fazei mobile i se adauga un
compus cationic sau anionic pentru formarea de
micele incarcate electric.
Micelele care nu sunt miscibile cu solutia, absorb
compusii neutri mai mult sau mai putin eficace printr-
o afinitate de tip hidrofil/ hidrofob.
Acest tip de electroforeza se aplica moleculelor care
au tendinta de a migra fara separare.
 ELECTROFOREZA CAPILARA PE GEL

Consta in transpunerea electroforezei pe gel de

poliacrilamida sau agaroza. Capilarul este umplut
cu un electrolit continand un gel care produce efect
de filtrare ce retine moleculele mari si reduce
fenomenul de difuziune.
Metoda se preteaza la separarea a trei clase mari de
biomolecule: polipeptide, oligonucleotide
(fragmente de ADN sau ARN) mono si
polizaharide.
 ELECTROFOREZA PRIN IZOFOCALIZARE

Aceasta tehnica cunoscuta in egala masura ca

electroforeza pe suport consta in crearea unui
gradient de pH liniar intr-un capilar cu peretele
tratat cu amfolit. Capilarul este introdus in acid
fosforic la anod si in hidroxid de sodiu la catod,
fiecare compus migreaza si se focalizeaza la pH-ul
care are aceeasi valoare cu potentialul lui
izoelectric.
 ELECTROCROMATOGRAFIA CAPILARA

Acest tip de separare asociaza electromigrarea

ionilor, proprie electroforezei si procesele de
repartitie intre faze prezente in cromatografie.