FACULTATEA DE INGINERIE MEDICALĂ

MASTER: INGINERIE MEDICALĂ

STUDENTĂ: GEORGESCU DIANA-MIHAELA & Militaru

Ramona-Gabriela
GRUPA: IM-1
PROFESOR COORDONATOR: S.I. DR. ING. ADELA BANCIU
 2

CUPRINS

 Definiţie și terminologie

 Condiţii necesare pentru realizarea unei culturi de celule

 Parametrii studiaţi în cazul culturilor de celule

 Linii celulare utilizate frecvent

 Domenii de aplicabilitate

 Bibliografie
 3

Definiție și terminologie

Definiţie:

Termenul de cultură de celule se referă la menţinerea sau creşterea

celulelor in vitro, în condiţii controlate, mai mult de 24 ore. În culturile de
celule, celulele nu sunt organizate în ţesuturi.

Terminologie:

 Cultură primară - cultură iniţiată din celule preluate direct din

organism.

 Linie celulară – cultură ce ia naştere din cultura primară la prima

subcultură stabilă. Celulele liniei celulare cuprind celule descendente
ale celulelor originale, din cultura primară. În anumite situaţii, pentru
imortalizarea culturii primare (proliferarea pe perioadă indefinită),
se realizează hibridizarea celulelor normale cu linii celulare
tumorale.
 4

 Tulpină celulară - este o subpopulaţie de celule derivată dintr-o

cultură primară sau dintr-o linie celulară prin selecţia sau clonarea
celulelor având proprietăţi specifice sau markeri. Proprietăţile sau
markerii trebuie să se menţină în timpul unor cultivări ulterioare.

 Pasaj (subcultură) - transferul sau transplantarea celulelor cu sau

fără diluţie dintr-un vas de cultură în altul. Această manevră este
necesară deoarece majoritatea celulelor manifestă fenomenul de
inhibiţie a creşterii dependentă de densitate, adică blocareaa
mitozei corelată cu creşterea densităţii celulare. Transferul
celulelor este necesar şi din cauza epuizării substanţelor nutritive
din mediul de cultură.

 Explant - fragment de ţesut preluat din organism şi transferat într-

un mediu artificial pentru creştere sau menţinere.

Condiţiile necesare pentru realizarea unei culturi de

celule:

1. Sursa de celule este reprezentată de ţesuturi prelevate de la om,

animale, insecte, plante.

După provenienta lor celulele pot fi:

 Normale (celule diploide cu o durată de viaţă limitată):
- adulte – se cultivă mai greu in vitro, creşterea este relativ înceată,
necesită medii de cultură complexe, şi prezintă timp de latenţă al
dezvoltării ce poate dura 6-10 zile.
- embrionare – se cultivă uşor, prezintă o creştere rapidă care începe
la scurt timp după punerea în cultură.

 Tumorale (celule cu proliferare foarte activă şi de obicei cu viaţă

nelimitată).
Exemplu – celulele HeLa (celule epiteliale umane din carcinom de
cervix, stabilizate şi cultivate in vitro din 1950. Denumirea liniei
celulare HeLa provine de la Henrietta Lacks (numele persoanei de la
care au fost prelevate aceste celule).
 5

Culturile celulare pot fi iniţiate pornind de la celule individuale sau

ţesuturi. Celulele individuale se găsesc în mod natural liber (ex. limfocite,
granulocite). Disocierea celulelor din ţesuturi se poate realiza prin:
- metode enzimatice (cu tripsină, colagenază, pronază, în funcţie de
ţesut)
- metode fizice (mecanic prin răzuire prin site, presare între lame de
sticlă)

2. Mediul de cultură este specific fiecărui tip celular şi trebuie să

asigure condiţii asemănătoare celor din organismul de origine. Mediul
de cultură trebuie să fie steril (sterilizarea nu se face prin fierbere
sau pasteurizare, ci numai prin sterilizare filtrantă folosind pori de
0,22 m). Mediile de cultură cel mai frecvent folosite sunt: RPMI
1640, ISCOVE, DULBECCO, MEM.

Mediul de cultură are o compoziţie complexă şi cuprinde:

 Soluţia salină care asigură izotonia, izoionia, pH-ul şi aportul de
glucoză. Izotonia este asigurată de NaCl iar izoionia de o combinaţie
de săruri (K+, Ca2+, Mg2+, PO4-, CO32-, SO42- , Fe2+, Cu2+, NO3-). pH-ul
optim al mediului de cultură este de 7,2-7,4 şi este asigurat de
sistemele tampon fosfat disodic-fosfat monopotasic, bicarbonat de
sodiu –CO2, HEPES (sistem tampon cu activitate maximă la 7,5 ce se
opune modificărilor rapide de pH). Pentru un control uşor şi rapid al
pH-ului mediului de cultură soluţiile conţin şi un indicator de pH, roşu
fenol, a cărui virarea a culorii se face de la galben (pH 6,6-6,8) la
roşu aprins (pH 7,8-8). Concentraţia glucozei în mediul de cultură
este de 1-4,5%, prezenţa ei fiind absolut necesară pentru susţinerea
metabolismului energetic.

 Elemente proteice – reprezentate de aminoacizi esenţiali şi

neesenţiali precum şi de globulinele şi factorii de creştere existenţi
în serul sanguin. În funcţie de tipul de celule se utilizează ser fetal
de viţel, ser bovin, ser de cal, iepure.

 Vitamine (A, B, C, D, E, K) cu rol în asigurarea viabilităţii celulare.

 Antibiotice (penicilină, streptomicină, neomicină) şi antimicotice

(amfotericina B). Ele împiedică apariţia infecţiilor în mediul de
 6

cultură întrucât serul sanguin conţinut de acesta este un mediu

propice pentru dezvoltarea bacteriilor şi fungilor.

Medii de cultură fără ser - sunt utilizate pentru producerea

vaccinurilor şi a unor produse biofarmaceutice destinate uzului uman.
3. Alte condiţii de cultivare:temperatura de 37OC în atmosferă de CO2 5%
umidificată (în cazul celulelor de provenienţă umană). Concentraţia CO 2 variază
între 2-10%, în funcţie de tipul celular.
Este absolut obligatoriu ca toate manevrele (prelevarea celulelor, prepararea
mediilor, pregătirea vaselor de cultură, investigarea culturilor şi pasajul
celulelor, etc) să fie efectuate în condiţii sterile, în hotă cu flux laminar sau în
hotă bacteriologică cu flacără deschisă.

 Culturi primare (preluate direct dintr-un ţesut sau organ; au un timp de

viaţă limitat şi intră în senescenţă după un număr finit de diviziuni)
Realizarea unei culturi celulare primare cuprinde următoarele etape:
- recoltarea sterilă a organului (fragmentului de ţesut)
- disocierea celulelor din ţesut prin metode enzimatice sau fizice
- însămânţarea celulelor cu o densitate cunoscută în mediul de cultură
- menţinerea plăcilor cu celule însămânţate în atmosferă umedă cu CO 2 la
37oC
- urmărirea zilnică a culturii (viabilitatea, perioada de lag, aderarea,
modificările morfologice)
- schimbarea mediului de cultură la 2-3 zile sau de câte ori este nevoie

Linii celulare stabilizate

• În cazul liniilor celulare se elimină etapa de recoltare. Surse recomandate
pentru procurarea de linii celulare: ECACC (European Collection of Cell
Cultures) şi ATCC (American Type Culture Collection) ; deţin peste
3.400 de linii celulare provenite de la 80 de specii.

Celulele din culturi pot fi stocate în medii de îngheţare speciale în containere

cu azot lichid la –180OC şi pot fi utilizate în studii ulterioare.

Senescenţa celulară replicativă (fenomenul Hayflick)

• Celulele normale nu se pot divide indefinit din cauza fenomenului de
senescenţă replicativă.
 7

• La nivel celular, senescenţa reprezintă un program fiziologic de blocare a

creşterii/proliferării celulare ce poate fi determinat de scurtarea
telomerelor.
• Senescenţa replicativă se mai numeşte şi „fenomen Hayflick”, după
Leonard Hayflick, cercetător american specialist în biologie celulară care
l-a descris pentru prima dată (1961), arătând că numărul de diviziuni
posibile pentru celulele normale în cultură este limitat.

Parametrii studiaţi în cazul culturilor de celule

1. Viabilitatea celulară
2. Aspectul morfologic al culturii (forma şi mărimea celulelor, aspectul
membranei, citoplasmei şi nucleului, prezenţa sau absenţa vacuolelor,
aderarea de substrat)
3. Diviziunea celulară (stadiul ciclului celular)
4. Cinetica de creştere (timpul necesar pentru dublarea populaţiei,
numărul dublărilor de populaţie)
5. Capacitatea de clonare (procentul de celule însămânţate care formează
clone)
6. Determinarea activităţii unor enzime specifice

Există linii tumorale pentru care nu s-au identificat toţi factorii de

creştere necesari pentru cultivarea lor timp îndelugat in vitro şi de aceea
este necesară cultivarea lor in vivo, respectiv inocularea lor la animalele de
laborator.
Exemplu – EL-4, linie eritroleucemică murină.

Evaluarea stării metabolice a celulelor în cultură

Metoda cea mai simplă şi cel mai des utilizata pentru evaluarea stării
metabolice a celulelor în cultură este testul reducerii sării de tetrazoliu
(MTT sau MTS). Metoda se bazează pe capacitatea dehidrogenazelor
mitocondriale şi citoplasmatice de a reduce sarea de tetrazoliu la
formazan. Determinarea spectrofotometrică a absorbanţei la lungimea de
undă corespunzătoare maximului de absorbţie al formazanului (490 nm în
 8

cazul utilizării MTS, 500-600 nm pentru MTT) permite evaluarea

cantitativă a formazanului format şi implicit a capacităţii reducătoare a
celulelor.

Testul TUNEL (Terminal-Uridine-Nucleotide-End-Labeling) Metodă

neradioactivă care detectează rapid şi simplu celulele apoptotice,
permiţând decelarea fragmentelor de ADN de 180pb rezultate prin
fragmentarea intranucleosomală, caracteristică etapelor târzii ale
apoptozei. Metoda se poate utiliza atât pentru suspensii celulare cât şi
pentru secţiuni de ţesuturi.

PROBLEME PRIVIND CULTURILE CELULARE:

CONTAMINAREA CULTURILOR CU BACTERII, FUNGI, SI VIRUSURI

 Contaminarea bacteriană şi fungică. Contaminarea bacteriană este în
general vizibilă cu ochiul liber şi poate fi detectată prin creşterea
bruscă a turbidităţii mediului şi prin schimbarea culorii acestuia ca
rezultat al schimbării pH-ului.
 Contaminarea cu mycoplasma. Efectele contaminării cu mycoplasma
sunt mult mai insidioase decât acelea induse de bacterii şi fungi,
acestea referindu-se la: reducerea ratei de creştere, modificări
morfologice, aberaţii cromozomiale, modificări metabolice,
modificarea antigenicităţii membranei celulare. Contaminarea nu este
decelabilă la microscop din cauza dimensiunilor foarte reduse ale
micoplasmelor (0,2-0,3 μm).
Contaminarea virală. Câteva linii celulare conţin virusuri endogene pe
care le elimină. Aceste linii nu sunt considerate a fi contaminate. Serul
este considerat o sursă potenţială de contaminare cu virusul diareei virale
bovine. Folosirea unui ser contaminat cu virus va determina implicit
infectarea liniei celulare ce va cauza modificări ale ratei de creştere.

Linii celulare utilizate frecvent

 
1. Celulele HeLa sunt celule canceroase cervicale umane, cultivate
pentru prima dată în laborator în 1951 și reprezintă prima linie celulară
continuă. În prezent, există mai multe tulpini de celule HeLa. Primele
 9

celule au provenit dintr-o probă recoltată de la o femeie pe nume

Henrietta Lacks și au fost numite preluând primele două litere ale
numele și prenumelui. Medicul George Gey este cel care a generat
această linie celulară și cel care avea să o distribuie și celorlalți
cercetători din întreaga lume pentru a o folosi la diverse experimente.
Pe celulele HeLa s-a dezvoltat vaccinul poliomielitic, s-au testat diferite
tipuri de toxine și radiații, s-au investigat infecția HIV/SIDA, procesul
de oncogeneză sau medicamente antitumorale. Pe lângă rolul important în
evoluția culturilor celulare, aceste celule au ridicat și numeroase
controverse etice privind confidențialitatea datelor pacienților de la
care se recoltează organe și țesuturi.

2. Linia celulară HEK293 este o linie celulară continuă derivată din

celule embrionare renale umane transformate prin intermediul
adenovirusului tip 5 . Genele virale ce se exprimă în această linie celulară
determină producerea unui număr mare de proteine recombinante.
Aceasta este folosită frecvent pentru transfecții, în special atunci când
se folosesc ca vectori adeno- sau retrovirusuri. Este necunoscut ce tip
de celule sunt HEK293 și este dificil a se concluziona după transformare,
pentru că includerea unei segment viral de 4,5 kilobaze a modificat
semnificativ morfologia celulară și expresia genetică, la aceste
impedimente adăugându-se diversitatea celulară a rinichiului embriologic,
care cuprinde aproape toate tipurile celulare. Se presupune că acestea
ar fi de origine neuronală pe baza mARN și a proteinelor specifice
neuronilor, dar sunt și dovezi ale provenienței din glandele adrenale sau
fibroblaste

3. Celulele stem mezenchimale (MSC) derivă din mezoderm și dau

naștere diferitelor tipuri de țesuturi, printre care os, cartilaj și țesut
adipos. Spre deosebire de mezenchim, care produce atât țesut
conjunctiv, cât și țesut hematopoietic, MSC nu dau naștere la celule
 10

hematopoietice. O caracteristică importantă a acestor celule este aceea

că, într-un mediu optim de cultură, se pot divide, păstrându-și
proprietățile de celulă stem pluripotentă, iar atunci când sunt cultivate
în medii diferite de diferențiere dau naștere la miocite, adipocite,
condrocite sau osteocite.

Selectare liniei celulare adecvate pentru un experiment trebuie

să aibă în vedere mai multe criterii.

     Specia: liniile celulare non-umane impun mai puține restricții de

biosiguranță, dar nu pot fi întotdeauna folosite în anumite experimente
ce studiază expresia unor molecule specifice numai speciei umane.

     Contaminarea: una dintre cele mai frecvente probleme întâlnite în

laboratoarele de culturi celulare este contaminarea culturilor. O infecție
poate altera semnificativ biologia celulelor și compromite rezultatul
experimentelor. Dacă o infecție bacteriană sau fungică este mai ușor de
detectat, cele date de virusuri sau de Mycoplasmaspp . sunt mai dificil de
identificat.

     Autenticitatea liniei celulare: este important ca, la începutul

experimentelor cu o nouă linie celulară, să se verifice dacă linia este sau
nu contaminată cu alte linii. Pentru a identifica precis tipul celular, se
poate folosi tehnica STR (short tandem repeats)  sau cariotiparea. Riscul
de a întâlni o linie celulară „impură” este mare, având în vedere că există
peste patru sute de linii celulare incorect identificate înregistrate în
baza de date ICLAC (International Cell Line Authentication Committee)
 11

     Pasajul: liniile celulare canceroase, din pricina instabilității

genetice, prin pasaje succesive, își vor modifica expresia la nivel
molecular, ceea ce duce la o îndepărtare de celulele inițiale. Pentru a
evita acest inconvenient, se recomandă a se păstra stocuri provenind
dintr-un pasaj mic și decongelarea ulterioară, cu reluarea culturii.
Uneori, modificarea culturilor este vizibilă, cum este cazul celulelor U87,
care, după cultivări succesive, își pierd proprietatea de a crește în
monostrat și se identifică drept sferoizi pe flask.

     Celule normale sau transformate: liniile celulare transformate au o

rată de multiplicare mai mare și se divid infinit, solicită mai puțin ser în
mediu, dar fenotipul lor a fost modificat prin mutații genetice care pot
influența rezultatul experimentului.

     Parametrii de creștere: care sunt condițiile pentru optimizarea

creșterii, densității sau clonării? De exemplu, pentru a se obține la rate
înalte o proteină recombinată, se preferă o linie celulară cu un timp de
dedublare scurt și o rată de creștere mare.

     Cultură finită sau continuă: dacă în culturi finite liniile celulare

exprimă funcțiile corecte, apropiate de cele ale țesutului inițial, culturile
continue sunt mai ușor de menținut in vitro sau de clonat.

     Alte aspecte: dacă se folosește o cultură finită, sunt stocurile

suficiente pentru a realiza toate experimentele? Este linia celulară bine
caracterizată în literatură sau necesită o validare proprie? În cazul în
care se folosesc culturi transformate, trebuie să se realizeze aceleași
experimente și pentru linia normală care este folosită în acest caz ca și
control. Dacă linia celulară nu este stabilă, ea trebuie crioprezervată.

Domeniile de aplicabilitate a culturilor de celule

 12

Utilizarea culturilor de celule ca model experimental prezintă

avantajul de a permite studiul celulelor sustrase influenţei sistemului
nervos şi fluxului sanguin. Culturile celulare sunt ideale pentru studii de
fiziologie şi patologie a celulei şi organitelor celulare, morfologie a celulei
şi a organitelor celulare, biochimie, biologie celulară, biofizică, genetică,
imunologie, farmacologie.

Bibliografie

1. Landry JJ et al. The genomic and transcriptomic landscape of a

HeLa cell line. G3 (Bethesda). 2013
2. 2. Louis N et al. Cloning and sequencing of the cellular-viral
junctions from the human adenovirus type 5 transformed 293 cell
line. Virology. 1997
3. Culturile celulare - Viața Medicală (viata-medicala.ro)
4. Care este diferența dintre cultura celulară primară și cea secundară
- 2021 - Știri (weblogographic.com)