Testele imunologice si metodele

aplicate in cercetare

Definitii

IMUNITATE = rezistenta = modalitate de aparare fata de variati agenti patogeni

IMUNITATE SPECIFICA vs IMUNITATE NESPECIFICA

Apararea adaptativa raspunde inalt specific unui anumit agent patogen,
intalnirea repetata cu acesta ducand la imbunatatirea raspunsului
specificitate
memorie

ANTIGEN (Ag)- substanta endogena sau exogena capabila sa induca un raspuns

imun care consta in stimularea si proliferarea limfocitelor si in sinteza unor
molecule de recunoastere anticorpi (Ac) sau receptori celulari ce se combina
specific in vivo sau in vitro cu Ag declansator.

DETERMINANT ANTIGENIC = EPITOP parte a Ag ce reactioneaza specific cu Ac

sau cu R T-celular

ANTICORP (Ac) - proteina sintetizata ca parte a raspunsului imun la o substanta straina (Ag)
si care se leaga specific la Ag

ANTICORPI MONOCLONALI Ac inalt specifici pt un singur epitop

aplicatii diagnostice: determinare toxine E coli, Shigella, Clostridium difficile,
identificare hormoni, grupe ABO, etc.
aplicatii terapeutice: multiple (ex:Ac anti-IgE)
SERURI POLICLONALE seruri ce contin Ac generati de raspunsul la un Ag care este
obisnuit un mozaic de determinanti antigenici

REACTIA AG-AC: reactia intre epitop (Ag) si paratop (Ac)

realizata prin legaturi electrostatice, hidrofobe, de hidrogen si Van der Waals
guvernata de legea masei:
antigenul liber [Ag] si anticorpii liberi [Ac] interactioneaza reversibil pentru a
forma complexe [Ag-Ac]
relatia intre antigenul liber si cel legat in complexe cu anticorpi este determinata
de constanta de echilibru sau de afinitate Ka care este egala cu raportul intre
constantele de asociere K1 si disociere K2 conform formulei:
[Ag] + [Ac] K1K2 [Ag-Ac]
Ka = K1/K2 = [Ag-Ac]/ [Ag] [Ac]

ANTIGENE CELULARE CU IMPORTANTA IMUNOLOGICA

HLA ag de histocompatibilitate = proteine Ag de suprafata prezente pe
suprafata celulelor nucleate ce provoaca un raspuns imun daca sunt
transferate unui individ genetic diferit (transplant)
AUTOANTIGENE situatie in care proteinele-self nu mai sunt recunoscuta ce
proprii
AG DE GRUP SANGUIN

Tipuri de reactii imunologice in vitro

In functie de modul de evidentiere a rezultatului:
CITIRE DIRECTA
IMUNOMARCARE:
fluorocrom imunofluorescenta
izotopi dozare radioimunologica
enzime dozare imunoenzimatica
In functie de rezultatul final cuantificat:
Reactiile primare teste de evidentiere a recunoasterii specifice a Ag de catre Ac. Teste
cantitative includ imunofluorescenta, RIA, alte metode imunoenzimatice. In general aceste
metode necesita fie antigen purificat, fie marcarea cu radioizotopi, fluorescenta sau enzimatica a
anticorpului, sau implica o metoda de separare a complexelor Ag-Ac de Ag, Ac liberi din solutie.

Reactiile secundare includ reactiile de precipitare in solutie sau gel, aglutinarea directa sau
hemaglutinarea si fixarea complementului.

Reactiile tertiare includ opsonizarea, fagocitoza, chemotaxia, aderenta imuna, degradarea

celulara.

Factori ce influenteaza masurarea reactiilor antigenanticorp sunt:

afinitatea cu cat este mai mare afinitatea anticorpului pentru antigen, cu atat este mai
stabila reactia;
aviditatea reactia intre antigene multivalente si anticorpi multivalenti este mult mai
stabila si mai usor de detectat;
raportul Ag-Ac - marimea complexelor Ag-Ac este corelata cu concentratia de Ag si de Ac;
forma fizica a Ag un Ag particulat va fi depistat prin reactii de aglutinare, un Ag solubil va
fi depistat prin reactii de precipitare.

Reactiile Ag-Ac sunt specifice si reversibile.

Reversibilitatea: complexul Ag-Ac poate fi disociat de caldura, acidifierea mediului (pH<3)
sau aportul de ioni in cantitate mare.

Specificitatea: Ag este capacitatea acestuia de a reactiona specific numai cu receptorii

solubili (Ac) sau membranari a caror productie a fost indusa de stimulul antigenic.
Cunoasterea unuia dintre reactanti (Ag sau Ac ) permite identificarea celuilalt.

Afinitatea este intensitatea reactiei

intre un singur determinant
antigenic si un singur situs
combinativ al unui anticorp. Este
rezultatul sumei intre toate fortele
de atractie si de respingere ce exista
intre determinantul antigenic si
situsul combinativ.

Aviditatea este termenul utilizat

pentru descrierea intensitatii
legaturilor in totalitate intre un
antigen cu multiplii determinanti
antigenici si anticorpi multivalenti.
Deci afinitatea se refera la
intensitatea legaturii intre un
determinant antigenic si un situs
combinativ al unui anticorp, in timp
ce aviditatea se refera in general la
intensitatea legaturilor intre
antigene si anticorpi multivalenti.

Crossreactivitatea se refera la
capacitatea unor anticorpi de a se
combina cu mai mult de un
determinant antigenic sau la
capacitatea unei populatii de anticorpi
de a reactiona cu mai mult de un
antigen.

Crossreactivitatea apare deoarece

antigenul crossreactiv are epitopi
comuni cu antigenul imunizant sau
pentru ca are epitopi cu structura
asemanatoare unui antigen imunizant
(plurispecificitate).

Reactii de aglutinare

Aglutinare = aglomerare de particule (Er, bacterii, latex) = reactie imunochimica specifica de

agregare a unor particule acoperite de Ac sau Ag

aglutinina este folosit pentru a descrie anticorpii care aglutineaza antigenele particulate, nonsolubile

Anticorpii completi sunt cei de tip IgM care se leaga la determinantii antigenici ca pentamer si
induc aglutinarea acestor antigene.

Anticorpii incompleti sunt de tip IgG, se leaga la determinanti antigenici dar nu pot
determina aglutinarea.

Cand Ag utilizat este un eritrocit vorbim despre hemaglutinare

Toti Ac pot teoretic aglutina Ag, cei mai eficienti sunt cei de tip IgM, pt IgG este necesar un
adjuvant de tipul albuminei in reactie, al carui rol este sa reduca distanta intre celulele rosii,
permitand anticorpilor de tip IgG sa lege punti intre celule

Aglutinarea = rezultatul formarii unei

retele de Ag si Ac intr-un numar
suficient de mare care sa permita
vizualizarea cu ochiul liber.

Reactiile de aglutinare sunt sensibile,

pot detecta cantitati mici de Ac.

Nu sunt metode cantitative,

procedand insa la efectuarea de dilutii,
se poate realiza dozarea
semicantitativa.

Hemaglutinare particulele implicate sunt Er, aglutininele se numesc hemaglutinine

Leucoaglutinare particulele aglutinate sunt leucocite

Clasificare:

Teste directe sau active particulele de reactie sunt purtatoare ale Ag specific
(hematii, leucocite, trombocite, bacterii, etc).

Teste indirecte sau pasive particule de reactie incarcate cu un determinant Ag

artificial fixat pe suprafata particulei (hematii, particule latex, microcristale de
colesterol).

Aglutinarea directa

particulele purtatoare ale determinantului Ag sunt puse in contact cu Ac specifici

in mediu lichid salin. Ac se combina cu Ag si formeaza o retea de aglutinare.
Reactia se poate desfasura in tuburi de reactie sau pe placi de sticla sau de opalin.

Aplicatii practice ale aglutinarii directe sunt:

o
Determinarea grupelor sanguine
o
Identificarea aglutininelor la rece
o
Diagnosticul mononucleozei infectioase
o
Diagnosticul salmonelozei

Aglutinarea indirecta

Ag solubil este fixat pe particule variabile, suspensia de particule este pusa in

contact cu serul de cercetat la fel ca in cazul aglutinarii directe.

Aplicatii practice:
o
Diagnosticul sifilisului Ag cardiolipinic fixat pe microcristale de colesterol in
suspensie coloidala reactie pe lama.
o
Diagnosticul sifilisului prin testul de hemaglutinare a Treponemei pallidum
(TPHA) Ag treponemic este fixat pe hematii
o
Diagnosticul tiroiditei autoimune- Ac anti-tiroglobulina: tiroglobulina este
fixata pe hematii
o
Identificare factor reumatoid IgG sau IgM modificati; reactia Waaler-Rose
sau latex-aglutinarea

Aglutinarea artificiala consta in utilizarea unui artificiu tehnic pt a provoca

aglutinarea (cel mai adesea directa) a Ag particulate, de catre Ac ce nu pot
aglutina spontan.
o
Utilizarea de medii macromoleculare albumina bovina, ser uman sau
dextran.
o
Incubarea hematiilor cu enzime proteolitice
o
Adaugarea unei antiglobuline test Coombs
Aglutinarea inversa identificare antigene si nu anticorpi Ac specifici sunt fixati
pe hematii.

Teste calitative de aglutinare sunt utilizate in demonstrarea prezentei unui Ac sau a unui Ag.
Anticorpii sunt mixati cu antigenele particulate si un test pozitiv este indicat de aglutinarea Ag
particulat.

De exemplu se pot mixa eritrocitele unui pacient cu anticorpi in scopul determinarii grupei
sanguine sau se amesteca Er cu grupa cunoscuta cu serul unui pacient primitor pentru a
determina prezenta sau nu de Ac anti Er in serul acestuia.

Teste cantitative de aglutinare utilizate pentru a masura nivelul de Ag particulate. In acest tip
de teste se fac dilutii seriale pe o proba si apoi se adauga un numar fix de Er sau bacterii sau alte
Ag particulate. Dilutia maxima ce produce aglutinare vizibila constituie valoare titru.In figura de
mai jos, test de hemaglutinare cantitativa.

Ocazional, daca este mare concentratia de Ac (dilutii joase), nu apare aglutinare apoi daca proba
este diluata, apare aglutinarea (vezi pacientul 6 in schema de mai sus). Lipsa aglutinarii la
concentratii mari de Ac poarta numele de efect prozone. Lipsa aglutinarii la concentratii mari se
datoreaza excesului de Ac care determina formarea de complexe mici care nu se aglomereaza in
aglutinate.

Hemaglutinarea pasiva

Testul de aglutinare lucreaza numai cu Ag particulate. Cu toate acestea, este

posibila acoperirea Er cu un Ag solubil (ex: viral, polizaharid, haptena) si apoi sa se
foloseasca Er acoperite de Ag solubil pentru a testa/determina prezenta de Ac
specifici, anti-antigen solubil (vezi figura de mai jos). Acest test se numeste
hemaglutinare pasiva, se lucreaza exact ca testele de aglutinare. Este util pentru
detectia Ac anti-Ag solubile si pt detectia Ac anti-virali.

Aglutinarea cu latex

Ac sunt atasati pe suport de latex ce serveste ca marker pentru detectarea reactiei Ag-Ac.
Fiecare particula de latex cu dimensiune de aproximativ 1 micron, poate fi incarcata cu mii de
molecule de Ac.
Particulele de latex-Ac formeaza o suspensie laptoasa si in contact cu proba de cercetat ce
contine antigenul cautat, se formeaza agregate vizibile de complexe Ag-Ac. Figura de mai jos
ilustreaza evenimentele asociate reactiei de aglutinare asociate cu particulele de latex.
In laboratoarele clinice testul este folosit pentru detectarea de Ag microbiene solubile direct
in ser sau lichidul cefalorahidian sau pentru identificarea unor Ag bacteriene din culturi.

Testul antiglobulinic testul Coombs

1. Testul Coombs direct Ac ce se leaga la Er nu determina intotdeauna aglutinare
datorita excesului de Ag sau de Ac sau in cazul modificarilor electrice la nivelul Er
ce impiedica reactiile de legare.
Acesti Ac care se leaga la Er dar nu determina aglutinare se numesc Ac incompleti
definitie functionala si nu una care sa sugereze structura diferita a Ac.
Pt a fi detectati Ac non-aglutinanti de pe suprafata Er se adauga un al doilea Ac
indreptat impotriva Ac de pe Er.
Ac anti-imunoglobulina poate cross-linka Er si determina aglutinarea = test
Coombs direct.

2. Testul Coombs indirect detecteaza prezenta de Ac antir-Er prezenti in ser.

Presupune incubarea Er cu probe de ser, spalarea lor pt indepartarea Ac nelegati si
apoi adaugarea unui al doilea Ac anti-imunoglobulina care va depista Ac legati pe
suprafata Er si va cross-linka celulele

Aplicatii practice detectarea Ac anti Rh in general Ac anti-Rh nu aglutineaza Er. Astfel Er

copilului cu Rh+ nascut din mama Rh- care are Ac anti-Rh, pot fi acoperite cu acesti Ac. Pt a
verifica se face un test Coombs direct. Pt a verifica prezenta Ac anti-Rh in sangele mamei se
face testul Coombs indirect.

Inhibitia hemaglutinarii

Testul de aglutinare poate fi modificat pt a fi folosit la masurarea Ag solubile.

este numit test de inhibitie a hemaglutinarii masoara capacitatea unui Ag solubil de a
inhiba aglutinarea unor Er acoperite cu Ag, de catre Ac.
o cantitate fixa de Ac fata de un Ag este amestecata cu o cantitate fixa de Er acoperite cu Ag.
se adauga cantitati variabile din serul de cercetat care este investigat pt detectarea prezentei
Ag.
daca proba contine Ag, Ag solubil va competitiona cu Ag de pe suprafata Er impiedicand
aglutinarea.
Prin dilutii seriate se masoara cantitatea de Ag in proba necunoscuta prin titrare. Cuantifica in
general Ag solubile.
Metoda este larg utilizata in clinica pentru a determina daca un pacient a fost expus la o
anumita infectie virala (ex: rubeola) sau nu sau pentru teste de sarcina (HCG, Ac anti HCG).

Tipizarea grupelor sanguine

Grupele sanguine sunt definite de prezenta Ag de grup, A, B AB la nivelul Er

Reactivii pt tipizare contin Ac anti-A si B
Mixare sange grup necunoscut cu ser Ac cunoscut identificare prin reactie de
aglutinare = tipizare sanguina directa
2 ml sange recoltat pe anticoagulant, testare imediata sau pastrare la 2-8 grade
Interpretare rezultate:

Aglutinare=reactie Ag-Ac
Aglutinare cu serul antiA = grup A
Aglutinare cu ser antiB = grup B
Aglutinare cu ambele = grup AB
Lipsa aglutinare = gup 0

-Aglomerare vizibila secundar formarii cx Ag-Ac prin interactiunea cu un

Ag particulat cum ar fi particulele de latex

-Depinde de crosslinkarea Ac polivalenti tip aglutinina (IgM)

-asigura o modalitate de detectare a unor variate Ag bacteriene folosind
Ac tipici
-test de rutina pt tipizarea sangelui inainte de transfuzie

Demonstrarea hemaglutinarii folosind Ac anti Er oaie

(control)

-Test de sarcina clasic: inhibitia hemaglutinarii - hapten inhibition determina prezenta sau
absenta beta-HCG (human chorionic gonadotropin)
- Actual test Elisa
- De asemenea de folos pt depistare substante ilegale in sange, Ac antivirali (ex: rubeola)

FIXAREA COMPLEMENTULUI:

Testul de fixare a C (CFT) introdus in 1909 de catre Wasserman, a fost extensiv folosit in
diagnosticul sifilisului

Complementul - proteina prezenta in mod normal in ser

Proteinele complement sunt termolabile, sunt distruse prin incalzire la 56C pt 20 30 min

Complementul se leaga la complexele Ag-Ac

Cand Ag este un Er, acesta va fi lizat

No Ag

Ag
Ag
Ag

Patients
serum

Principiu

Complementul este absorbit pe suprafata complexului Ag-Ac proprietate folosita in

testul de fixare a complementului bpt identificarea unui Ac specific

Sistemul hemolitic continand Er oaie si Ac corespunzatori este folosit ca martor pentru

utilizarea si disponibilitatea complementului

Daca se fixeaza complementul atunci Er oaie nu vor fi lizate = test pozitiv

Daca exista complement disponibil atunci apare hemoliza ce denota test negativ

Componente CFT
Sistemul de analizat
Antigen: solubil sau particulat

Anticorpi: serul uman de cercetat, poate sa aiba sau nu Ac cautati

Complement: ser obtinut de la porcusori de Guinea

Sistemul indicator (Sistem hemolitic)

Eritrocite: de oaie

Receptor: Ac iepure anti-Er oaie preparati prin inocularea Er de oaie la iepure dupa un
protocol standardizat de imunizare

Test pozitiv
Etapa 1:
37C
Antigen + Anticorp + Complement
(din ser)

se fixeaza complementul
1 ora

Etapa 2:
37C
Sistemul Ag-Ac-C + sistemul hemolitic(Er-Ac anti Er)
absenta hemolizei = TEST POZITIV

Test NEGATIV
Etapa 1:
37C
Antigen + Anticorp + Complement
(ABSENT in ser)

NU se fixeaza complementul
1 ora

Etapa 2:
37C
Sistemul Ag-Ac-C + sistemul hemolitic(Er-Ac anti Er)
hemoliza prezenta = TEST NEGATIV

Rezultate si interpretare:

Hemoliza absenta= test pozitiv

Hemoliza a Er = test negativ

Hemoliza placa microtitrare (godeu A3, A4 si B4) si non-hemoliza (godeu

A1, 2, B1,2 3)

Reactiile de precipitare
se folosesc pentru a masura concentratii de Ac sau Ag
Precipitarea implica interactiunea antigenelor solubile cu anticorpii in
proportie corecta, rezultatul fiind obtinerea unui precipitat vizibil
Antigenele solubile = solutii de molecule de natura proteica sau
carbohidrati
Anticorpii care agrega Ag solubile se numesc precipitine, pot sa fie
monoclonali sau policlonali
Reactiile de precipitare se pot desfasura in:
mediu lichid (turbidimetrie, nefelometrie)
solid (imunodifuzie radiala, imunoelectroforeza).

Reactii de precipitare in solutie

Mixarea Ac si Ag in forma solubila in eprubeta poate evolua in doua directii:
Raman in forma solubila
Formeaza precipitat

Prin adaugarea de cantitati crescande de Ag la o cantitate fixa de Ac se

construieste curba de precipitare Heidelberger care poate fi impartita in trei zone:
exces Ac - complexe solubile Ac-Ag
zona de echivalenta - complexe insolubile Ag-Ac, precipitat
Exces de Ag complexe solubile

PRECIPITARE IN MEDIU LICHID

Testul inelului metoda simpla de evidentiere a reactiei Ag-Ac intr-un tub, prin
punerea in contact a unei solutii de Ag cu imunoserul corespunzator. La interfata apare
in cateva minute un inel sau un disc albicios ce corespunde precipitatului Ag-Ac.

Reactia Heidelberger si Kendall posibilitate de cuantificare a reactiei

Ag-Ac prin interactiunea in mai multe tuburi de reactie a unei cantitati
constante de Ac cu concentratii crescute de Ag intr-un volum dat. Apare
precipitat, posibil inca din primele tuburi, creste cantitatea de precipitat in
tuburile urmatoare pt ca apoi sa se reduca in conditiile excesului de Ag
(zone Ag-Ac).
Turbidimetria- Un Ag este plasat intr-o cuva si interactioneaza cu Ac
corespunzator aflat in exces. Se formeaza complexe solubile ce tulbura
proba de cercetat. Se masoara fotometric formarea de complexe

Nefelometria are acelasi principiu ca si turbidimetria, ca metoda de

cuantificare a rezultatului se foloseste insa o lumina laser ce va fi
reflectata de complexele Ag-Ac si preluata/ focusata de niste lentile
speciale intr-un fotometru . Concentratia de Ag din proba studiata este
determinate cu ajutorul unor curbe standard. Necesita aparatura mai
complicata, este insa de folos in determinarea in medii biologice a
moleculelor de imunoglobuline (IgG, IgA, IgM, IgE), fractiuni de
complement C1q, C3, C4, etc.

PRECIPITARE IN MEDIU SOLID

Imunodifuzia radiala Mancini o cantitate constanta de Ac este incorporata omogen in gel de
agar inainte de solidificarea gelului si in godeuri facute in gel se plaseaza dilutii de Ag. Pe
masura ce Ag difuzeaza in gel, reactioneaza cu Ac si cand se atinge punctul de echivalenta
apare un inel de precipitare

Diametrul inelului este proportional cu logaritmul concentratiei de Ag din moment ce

concentratia de Ac este constanta.
Daca apare mai mult de un inel inseamna ca au aparut mai multe reactii Ag-Ac. Acest lucru se
intampla cand se lucreaza cu o mixtura de Ac si de Ag
de folos in determinarea IgG, IgA, IgM, fractiuni de complement C3, alfa-1-antitripsina, etc.

Imunodifuzia radiala dubla Ouchterlony in cadrul acestei metode Ag este plasat

intr-un godeu, Ac monospecific in alt godeu, difuzeaza unul catre celalalt in gel
de agar si apar arce de precipitare vizibile la locul de intalnire.
Aceasta metoda calitativa permite analizarea sistemului Ag-Ac gratie reactiei de
identitate.
foloseste pentru evidentierea proteinei C reactive, proteinelor BenceJones, beta-2-microglobulina, alfa-fetoproteina, produsi de degradare a
fibrinogenului
rezultatele sunt exprimate semicantitativ:
+, ++, +++.

Aspecte ale precipitarii:

1.Reactia de identitate daca doua Ag sunt identice sau au epitopi asemanatori,
liniile lor de precipitare cu Ac vor avea continuitate.
2.Reactia de nonidentitate 2 Ag diferite ce se combina cu 2 Ac, arcele de
precipitare se intersecteaza
3.Reactia de identitate partiala daca cele doua Ag au un epitop comun si un
epitop specific doar uneia dintre antigene, se va forma un arc de cerc continuu si va
aparea atasat un brat secundar epitopului diferit.

in mediu semisolid ce contine Ac

-> Aria este proportionala cu

conc. Ag.

Regiunea de echivalenta

reprezentare shematica imunodifuzie radiala si dubla

reactiile de precipitare in gel determina aparitia de linii de precipitare vizibile
fara precipitate vizibile in regiunea de exces Ag sau Ac

Imunoelectroforeza o mixtura complexa de Ag este plasata in godeuri in gel de agar

si prin electroforeza Ag sunt separate pe seama incarcaturii lor electrice.
dupa electroforeza sunt efectuate santuri in gel si se adauga Ac. Pe masura ce Ac
difuzeaza in gel, apar arce de precipitare la zona de echivalenta.
analiza cantitativa a mixturilor complexe de Ag, analiza componentelor din serul
pacientului
comparand serul pacientului cu serul normal, se poate identifica deficienta uneia
sau mai multor componente serice in proba de cercetat.
Se folosesc imunoseruri de origine animala specific pentru proteina din serul uman.
tehnica permite analizarea proteinelor urinare sau a lichidului cefalorahidian.
este o metoda calitativa, se poate constata aparitia sau nu a precipitarii in raport cu
un martor.

Imunoelectroforeza.

Electroforeza contracurent (elctroimunodifuzia) Ag este plasat in godeuri de agar,

sunt supuse electroforezei atat Ag cat si Ac si apare linie de precipitare ca in figura de
mai jos. Acest test poate fi utilizat numai daca Ac si Ag au incarcatura electrica opusa.
Este un test calitativ desi se poate aprecia si cantitatea prin aprecierea grosimii benzii
de precipitare. Avantajul sau major este rapiditatea testului.

Imunoelectroforeza in racheta
electroforeza in gel ce contine anticorpi Ag migreaza electroforetic catre anod prin
gelul continator de Ac si apare precipitare sub forma de racheta ce poate fi vizualizata
prin colorare.
aceasta metoda permite cuantificarea unui Ag prin comparatia cu o proba standard.

Radioimmunoassay (RIA)/Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) RIA sunt

metode bazate pe masurarea radioactivitatii generate de complexele Ag-Ac.
Marcarea se face fie la nivelul Ag fie la Ac.
Testele ELISA sunt cele bazate pe masurarea unei reactii enzimatice asociate cu formarea
complexelor Ag-Ac. O reactie pozitiva duce la aparitia unui produs colorat ce poate fi
masurat spectrofotometric.
Se folosesc doua alternative de reactie: directa si indirecta.
In metoda directa, proba de cercetat este adaugata peste placa in care sunt fixati Ac
monoclonali in faza solida, se spala dupa incubare si este inlaturat materialul nelegat.
un Ac secundar marcat reactioneaza cu Ag-ul legat de primul Ac.
In metoda indirecta se adauga un Ac anti-Ag de cercetat si un al treilea Ac marcat
enzimatic interactioneaza cu Ac secundar (Sandwich ELISA).
La final se adauga substratul enzimei, atat in metoda directa cat si in cazul celei indirecte.
Cantitatea de produs colorat final reprezinta echivalentul cantitatii de Ag prezent in
proba clinica.

Radioimmuno Assay
- metoda sensibila de masurare hormoni, droguri, vitamine,etc la conc.<0.001 /
- principiu: legare competitiva a unui Ag radiomarcat si a unui Ag nemarcat la o cantitate
limitata de Ac de inalta afinitate

A solid-phase radioimmunoassay (RIA) to detect hepatitis B virus in blood

samples & A standard curve to determine the conc. of HBsAg in unknown serum.

to detect Ab (HIV, HCV)

ELISA

to detect Ag

to detect Ag

Variations in the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique, similar to

RIA except using an Enzyme (alkaline , horseradish peroxidase, & -galactosidase)
: safer & less costly.

Immunoblotting Western Blot separare fractiuni proteice conform

greutatii lor moleculare prin electroforeza in sistem sodium dodecil sulfat
gel poliacrilamida (SD-PAGE).
Proteinele sunt apoi transferate si imobilizate pe o membrane de
nitroceluloza unde pot sa fie identificate prin folosirea unui Ac specific.
Unul din avantajele metodei este acela de a identifica un Ac specific dupa
separarea proteinelor.

Western blotting

: separates the components according to

their molecular weight.

: the proteins in the gel are transferred to the

sheet of nitrocellulose or nylon by the passage
of an electric current.

: probed with Ab & then radiolabeled or

enzyme-linked 2nd Ab.

: a position is visualized by means of an ELISA

reaction.
FIGURE 6-12

Sensitivity of various immunoassays