BANDAREA CROMOZOMILOR UMANI

Prin diferite tratamente (digestie enzimatică, denaturare

termică, etc) şi / sau încorporarea unor coloranţi specifici
pentru ADN (Giemsa, quinacrină, etc), cromozomii metafazici
apar alcătuiţi dintr-o serie continuă de benzi longitudinale,
în care zone intens colorate (benzi G) alternează regulat cu
altele mai slab colorate (benzi R).
Fiecare cromozom are un model caracteristic al poziţiei,
succesiunii, mărimii şi intensităţii benzilor, ce permite
identificarea sa precisă. Acest model este identic în toate
celulele corpului şi la toţi indivizii umani.
Mărimea benzilor este cuprinsă între 1-10 Mb.
Benzile sunt markeri citologici ai structurii interne a cromozomilor;
ele reflectă în primul rând gradul de compactare (condensare) a
fibrei de cromatină în lungul cromozomilor;
Benzile se corelează în mare măsură şi cu organizarea
funcţională a cromozomilor, deoarece definesc o distribuţie
alternativă a eucromatinei (benzi R) şi heterocromatinei (benzi G),
care posedă proprietăţi diferite.
Benzile G şi Q sunt zone din cromozomi bogate în
heterocromatină, mai compactate, ce conţin puţine gene active
şi se replică tardiv, spre sfârşitul fazei S; ele posedă ADN
bogat în A-T (55-60%) şi numeroase secvenţe repetitive
LINES.
Benzile R sunt arii cromozomiale ce conţin eucromatină, puţin
condensată, cu o mare densitate de gene structurale, active;
ADN-ul lor se replică precoce, la începutul fazei S şi este bogat
în perechi de baze G-C (60%), cu numeroase secvenţe
repetitive. De aceea, anomaliile cromozomiale care implică
benzile R au consecinţe clinice importante.
Alcătuirea cariotipului și studiul cromozomilor umani sunt în
prezent de neconceput fără folosirea tehnicilor de bandare.
Anomaliile structurale, implicând modificări în unul sau mai
mulţi cromozomi (deleţii, inversii sau translocaţii), pot fi
incredibil de complexe. Astfel de anomalii (rearanjamente sau
restructurări) pot fi uşor detectate prin studiul metafazelor cu
cromozomi bandaţi sau prin studiul cariotipului alcătuit cu
cromozomi bandaţi (comparativ cu cariotipul normal sau
standard).
Tehnicile de bandare ce pot fi folosite în prezent pentru studiul
cromozomilor umani sunt următoarele:

bandarea G (prin colorare cu Giemsa), a cărei principală

caracteristică este aceea că benzile G formează un model
similar cu acela obţinut după colorarea cu quinacrină (aceasta
este de altfel tehnica cel mai frecvent folosită în laboratoarele
de citogenetică umană);
bandarea R, a cărei caracteristică este aceea că modelul de
benzi este opus în ceea ce priveşte intensitatea colorării celui
obţinut în cazul bandării Q şi G, în sensul că benzile întunecate
(formate prin utilizarea tehnicii de bandare R) corespund celor
non-fluorescente apărute după colorarea cu quinacrină;
 bandarea C, a cărei caracteristică este colorarea exclusivă
a centromerilor şi heterocromatinei constitutive; benzile C
sunt localizate în regiunea pericentromerică;
 bandarea T, a cărei caracteristică distinctivă este formarea
de benzi la capetele braţelor cromozomiale, deci în regiunea
telomerelor;
 bandarea NOR, a cărei caracteristică este colorarea
regiunilor organizatoare nucleolare;
 bandarea profazică, a cărei caracteristică este formarea
unui număr mai mare de benzi, de înaltă rezoluţie, ce face
posibilă identificarea cu maximă precizie a punctelor de
rupere a cromozomilor.
Printre aplicaţiile curente ale tehnicilor de bandare se numără:

deosebirea celor doi cromozomi din grupul G (21 şi 22) de

cromozomul Y;
deosebirea cromozomilor din grupul D;
deosebirea cromozomilor din grupul C (6-12) de cromozomul
(cromozomii) X;
identificarea restructurărilor cromozomiale (deleţii, inversii,
duplicații) și a izocromozomilor.
 Reprezentarea schematică a modelelor de benzi
pe care le produc tehnicile de bandare G, Q, R, T şi C.
Giemsa este colorantul folosit cel mai adesea în analiza
citogenetică. Bandarea cromozomilor metafazici sau pro-
metafazici cu Giemsa poartă denumirea de bandare G.
Majoritatea tehnicilor de bandare G implică pretratamentul
cromozomilor fie cu o sare, fie cu o enzimă proteolitică.
“Bandarea GTG” se referă la procesul în care bandarea G
este precedată de tratarea cromozomilor cu tripsină.
Giemsa colorează preferenţial regiunile ADN care sunt bogate
în adenină (A) şi timină (T).
În general, benzile G pozitive (luminoase) corespund celor
produse de colorarea cu quinacrină, adică benzilor luminoase
Q.
Regiunile cromozomilor bogate în guanină (G) şi citozină (C)
au afinitate redusă pentru Giemsa.
Tehnicile standard de bandare Giemsa (G) permit evidenţierea
pe cromozomii metafazici a 400-600 benzi.
Cu ajutorul tehnicilor de bandare G de înaltă rezoluţie, în cei
24 de cromozomi umani (22 autozomi, plus X şi Y) a fost
posibilă catalogarea a aproape 2.000 de benzi diferite.
Bandarea R are ca rezultat obţinerea reversului modelului de
benzi G, în sensul că benzile G pozitive (luminoase) sunt
întunecate în cazul bandării R, şi invers.
Bandarea R implică pretratamentul celulelor cu o soluţie salină
caldă, care denaturează ADN bogat în adenină şi timină, după
care cromozomii sunt coloraţi cu Giemsa.
Bandarea R este utilă pentru analizarea structurii capetelor
cromozomilor, deoarece acestea sunt de obicei întunecate
după bandarea G.
Celelalte metode (tehnici) de bandare folosite pentru studiul
cromozomilor umani au aplicaţii restrânse, dar distincte.
În cele ce urmează, prezentăm metodele folosite în mod curent
pentru bandarea cromozomilor umani în laboratoarele de
citogenetică medicală.
Bandarea G

Tehnica de bandare G se foloseşte în analiza citogenetică umană

pentru facilitarea identificării anomaliilor structurale.
Etapele de lucru sunt următoarele:

lamele cu preparate cromozomiale fixate şi uscate, plasate pe un

suport pentru lame, sunt introduse într-un termostat reglat la 95°C
şi menţinute la această temperatură timp de 20 minute;
se lasă lamele să se răcească şi apoi se imersează într-o soluţie
de tripsină 0.025%, timp de 10-120 secunde (durata tripsinizării
trebuie stabilită dependent de condiţiile de mediu, materialul
bandat şi stocul de tripsină; se recomandă ca întotdeauna să se
coloreze întâi o singură lamă, să se verifice calitatea bandării, şi
numai dacă aceasta este bună să se coloreze şi celelalte lame);
 se scot lamele din soluţia de tripsină şi se spală imediat în
tampon fosfat Fisher, pentru stoparea acţiunii tripsinei (această
etapă nu este absolut necesară);
 se plasează lamele (cu preparatul de celule în sus) într-un
suport pentru colorare şi se acoperă cu o soluţie conţinând 1
parte colorant Leishman (dacă este cazul, în locul colorantului
Leishman poate fi folosit colorantul Wright) şi 3 părţi soluţie de
lucru pHydrion; durata recomandată a colorării este de 2
minute (colorantul Leishman va forma un precipitat atunci când
va fi adăugat la tamponul pHydrion; de aceea, se recomandă
ca amestecarea celor două componente să se facă chiar
înainte de turnarea peste lame);
 se spală bine lamele în apă distilată, evitându-se însă
decolorarea preparatului;
 se aşează lamele vertical pentru scurgerea apei distilate şi
apoi se plasează pe o placă şofantă (sau într-un termostat) la
temperatura de 60°C, până la uscarea completă.
Tripsina 0.25% (în HBSS fără calciu şi magneziu) se păstrează în
congelator, la o temperatură între -5 şi -20°C. Înainte de folosire se
aduce la temperatura camerei (menţinerea pentru mai mult timp la
temperatura camerei determină denaturarea enzimei).
Soluţia de tripsină 0.025% se prepară în ziua în care se foloseşte,
astfel: se amestecă 5 ml de soluţie de tripsină 0.25% cu 45 ml
soluţie de NaCl 0.9% (se păstrează la temperatura camerei).
Tamponul fosfat Fisher se prepară astfel: se dizolvă o capsulă de
tampon pHydrion (pH 6.8) în 1000 ml apă distilată.
Colorantul Leishman se prepară astfel: într-un balon de sticlă se
toarnă 500 ml alcool metilic (metanol) absolut şi apoi, agitând
continuu, se adaugă 1.0 g de colorant Leishman. Se continuă
agitarea încă 2-3 minute şi apoi se lasă timp de 15 minute înainte
de filtrarea printr-o hârtie de filtru Whatman într-o sticlă brună
perfect uscată. Se păstrează la rece şi întuneric. Înainte de
folosire, colorantul trebuie agitat bine.
Tamponul pHydrion stoc se prepară prin dizolvarea unei capsule
de tampon pHydrion în 100 ml apă distilată. pH-ul tamponului stoc
trebuie să fie 7.0. Se păstrează la o temperatură între 2 şi 8°C.
Soluţia de lucru de pHydrion se prepară astfel: se amestecă 5 ml
de tampon pHydrion stoc cu 95 ml apă distilată. Se păstrează la
temperatura camerei.
Dacă este necesar, lamele pot fi decolorate prin plasarea timp de
1-2 minute într-un vas conţinând fixator (3 părţi alcool metilic
absolut şi o parte acid acetic glacial). După o spălare scurtă în
alcool metilic absolut şi uscarea completă, lamele pot fi re-
tripsinizate şi / sau colorate.
Bandarea GTG

Bandarea GTG obţinută prin digestia cromozomilor cu tripsină,

urmată de colorarea cu Giemsa este cea mai utilizată metodă
de bandare pentru analiza de rutină a cromozomilor.
Deşi modul de formare a benzilor GTG este încă neclar,
se pare că diferenţele dintre benzile GTG pozitive şi negative
sunt determinate de organizarea spaţială a proteinelor
cromozomiale şi a ADN.
Protocol de lucru

Se amestecă o cantitate de 0.4 ml de sânge total, heparinizat,

cu 10 ml mediu de cultură Gibco 1A (Gibco Chromosome
Medium 1A) sau similar, şi se incubează timp de 72 ore la
temperatura de 37ºC;
Se tratează celule cu soluţie de colchicină în concentraţie de
10 mg/ml, timp de 30 minute;
Se incubează suspensia celulară în 0.075 M KCl la
temperatura de 37ºC, timp de 13 minute;
Se fixează celulele într-un amestec proaspăt de metanol - acid
acetic glacial 3:1, la temperatura de 22ºC, timp de 5 minute;
Se efectuează preparate cromozomiale de tip frotiu pe lame
de sticlă curate;
 Se incubează lamele de sticlă într-o soluţie 0.05% de
tripsină (Difco), la temperatura de 37ºC, timp de 15 secunde;
 Se spală lamele în tampon fosfat salin;
 Se colorează preparatul cromozomial cu soluţie Giemsa 5%
(*), timp de 8 minute;
 Se spală lamele cu apă distilată şi se usucă la aer.

(*) Într-o variantă a acestei metode, colorarea se face cu soluţie

Giemsa 10%, timp de 10 minute.
Localizările de pe braţul scurt sunt notate p (petit), iar cele de
pe braţul lung sunt notate q (queue).
Fiecare braţ cromozomial este divizat în regiuni notate p1, p2,
p3, etc., şi q1, q2, q3, etc., numerotate de la centromer înspre
capete.
Regiunile sunt delimitate de puncte de reper, care sunt
trăsături morfologice distincte, ca centromerul, capetele
braţelor cromozomiale şi anumite benzi.
Regiunile sunt divizate în benzi notate p11 (unu-unu, nu
unsprezece), p12, p13, etc., sub-benzi notate p11.1, p11.2,
etc., şi sub-sub-benzi, notate p11.21, p11.22, etc., în fiecare
caz numerotate de la centromer către capete.
Notarea benzilor sub-benzilor și sub-sub-benzilor cromozomiale.