Descărcați ca PPT, PDF, TXT sau citiți online pe Scribd
Descărcați ca ppt, pdf sau txt
Sunteți pe pagina 1din 31
BANDAREA CROMOZOMILOR UMANI
Prin diferite tratamente (digestie enzimatică, denaturare
termică, etc) şi / sau încorporarea unor coloranţi specifici pentru ADN (Giemsa, quinacrină, etc), cromozomii metafazici apar alcătuiţi dintr-o serie continuă de benzi longitudinale, în care zone intens colorate (benzi G) alternează regulat cu altele mai slab colorate (benzi R). Fiecare cromozom are un model caracteristic al poziţiei, succesiunii, mărimii şi intensităţii benzilor, ce permite identificarea sa precisă. Acest model este identic în toate celulele corpului şi la toţi indivizii umani. Mărimea benzilor este cuprinsă între 1-10 Mb. Benzile sunt markeri citologici ai structurii interne a cromozomilor; ele reflectă în primul rând gradul de compactare (condensare) a fibrei de cromatină în lungul cromozomilor; Benzile se corelează în mare măsură şi cu organizarea funcţională a cromozomilor, deoarece definesc o distribuţie alternativă a eucromatinei (benzi R) şi heterocromatinei (benzi G), care posedă proprietăţi diferite. Benzile G şi Q sunt zone din cromozomi bogate în heterocromatină, mai compactate, ce conţin puţine gene active şi se replică tardiv, spre sfârşitul fazei S; ele posedă ADN bogat în A-T (55-60%) şi numeroase secvenţe repetitive LINES. Benzile R sunt arii cromozomiale ce conţin eucromatină, puţin condensată, cu o mare densitate de gene structurale, active; ADN-ul lor se replică precoce, la începutul fazei S şi este bogat în perechi de baze G-C (60%), cu numeroase secvenţe repetitive. De aceea, anomaliile cromozomiale care implică benzile R au consecinţe clinice importante. Alcătuirea cariotipului și studiul cromozomilor umani sunt în prezent de neconceput fără folosirea tehnicilor de bandare. Anomaliile structurale, implicând modificări în unul sau mai mulţi cromozomi (deleţii, inversii sau translocaţii), pot fi incredibil de complexe. Astfel de anomalii (rearanjamente sau restructurări) pot fi uşor detectate prin studiul metafazelor cu cromozomi bandaţi sau prin studiul cariotipului alcătuit cu cromozomi bandaţi (comparativ cu cariotipul normal sau standard). Tehnicile de bandare ce pot fi folosite în prezent pentru studiul cromozomilor umani sunt următoarele:
bandarea G (prin colorare cu Giemsa), a cărei principală
caracteristică este aceea că benzile G formează un model similar cu acela obţinut după colorarea cu quinacrină (aceasta este de altfel tehnica cel mai frecvent folosită în laboratoarele de citogenetică umană); bandarea R, a cărei caracteristică este aceea că modelul de benzi este opus în ceea ce priveşte intensitatea colorării celui obţinut în cazul bandării Q şi G, în sensul că benzile întunecate (formate prin utilizarea tehnicii de bandare R) corespund celor non-fluorescente apărute după colorarea cu quinacrină; bandarea C, a cărei caracteristică este colorarea exclusivă a centromerilor şi heterocromatinei constitutive; benzile C sunt localizate în regiunea pericentromerică; bandarea T, a cărei caracteristică distinctivă este formarea de benzi la capetele braţelor cromozomiale, deci în regiunea telomerelor; bandarea NOR, a cărei caracteristică este colorarea regiunilor organizatoare nucleolare; bandarea profazică, a cărei caracteristică este formarea unui număr mai mare de benzi, de înaltă rezoluţie, ce face posibilă identificarea cu maximă precizie a punctelor de rupere a cromozomilor. Printre aplicaţiile curente ale tehnicilor de bandare se numără:
deosebirea celor doi cromozomi din grupul G (21 şi 22) de
cromozomul Y; deosebirea cromozomilor din grupul D; deosebirea cromozomilor din grupul C (6-12) de cromozomul (cromozomii) X; identificarea restructurărilor cromozomiale (deleţii, inversii, duplicații) și a izocromozomilor. Reprezentarea schematică a modelelor de benzi pe care le produc tehnicile de bandare G, Q, R, T şi C. Giemsa este colorantul folosit cel mai adesea în analiza citogenetică. Bandarea cromozomilor metafazici sau pro- metafazici cu Giemsa poartă denumirea de bandare G. Majoritatea tehnicilor de bandare G implică pretratamentul cromozomilor fie cu o sare, fie cu o enzimă proteolitică. “Bandarea GTG” se referă la procesul în care bandarea G este precedată de tratarea cromozomilor cu tripsină. Giemsa colorează preferenţial regiunile ADN care sunt bogate în adenină (A) şi timină (T). În general, benzile G pozitive (luminoase) corespund celor produse de colorarea cu quinacrină, adică benzilor luminoase Q. Regiunile cromozomilor bogate în guanină (G) şi citozină (C) au afinitate redusă pentru Giemsa. Tehnicile standard de bandare Giemsa (G) permit evidenţierea pe cromozomii metafazici a 400-600 benzi. Cu ajutorul tehnicilor de bandare G de înaltă rezoluţie, în cei 24 de cromozomi umani (22 autozomi, plus X şi Y) a fost posibilă catalogarea a aproape 2.000 de benzi diferite. Bandarea R are ca rezultat obţinerea reversului modelului de benzi G, în sensul că benzile G pozitive (luminoase) sunt întunecate în cazul bandării R, şi invers. Bandarea R implică pretratamentul celulelor cu o soluţie salină caldă, care denaturează ADN bogat în adenină şi timină, după care cromozomii sunt coloraţi cu Giemsa. Bandarea R este utilă pentru analizarea structurii capetelor cromozomilor, deoarece acestea sunt de obicei întunecate după bandarea G. Celelalte metode (tehnici) de bandare folosite pentru studiul cromozomilor umani au aplicaţii restrânse, dar distincte. În cele ce urmează, prezentăm metodele folosite în mod curent pentru bandarea cromozomilor umani în laboratoarele de citogenetică medicală. Bandarea G
Tehnica de bandare G se foloseşte în analiza citogenetică umană
pentru facilitarea identificării anomaliilor structurale. Etapele de lucru sunt următoarele:
lamele cu preparate cromozomiale fixate şi uscate, plasate pe un
suport pentru lame, sunt introduse într-un termostat reglat la 95°C şi menţinute la această temperatură timp de 20 minute; se lasă lamele să se răcească şi apoi se imersează într-o soluţie de tripsină 0.025%, timp de 10-120 secunde (durata tripsinizării trebuie stabilită dependent de condiţiile de mediu, materialul bandat şi stocul de tripsină; se recomandă ca întotdeauna să se coloreze întâi o singură lamă, să se verifice calitatea bandării, şi numai dacă aceasta este bună să se coloreze şi celelalte lame); se scot lamele din soluţia de tripsină şi se spală imediat în tampon fosfat Fisher, pentru stoparea acţiunii tripsinei (această etapă nu este absolut necesară); se plasează lamele (cu preparatul de celule în sus) într-un suport pentru colorare şi se acoperă cu o soluţie conţinând 1 parte colorant Leishman (dacă este cazul, în locul colorantului Leishman poate fi folosit colorantul Wright) şi 3 părţi soluţie de lucru pHydrion; durata recomandată a colorării este de 2 minute (colorantul Leishman va forma un precipitat atunci când va fi adăugat la tamponul pHydrion; de aceea, se recomandă ca amestecarea celor două componente să se facă chiar înainte de turnarea peste lame); se spală bine lamele în apă distilată, evitându-se însă decolorarea preparatului; se aşează lamele vertical pentru scurgerea apei distilate şi apoi se plasează pe o placă şofantă (sau într-un termostat) la temperatura de 60°C, până la uscarea completă. Tripsina 0.25% (în HBSS fără calciu şi magneziu) se păstrează în congelator, la o temperatură între -5 şi -20°C. Înainte de folosire se aduce la temperatura camerei (menţinerea pentru mai mult timp la temperatura camerei determină denaturarea enzimei). Soluţia de tripsină 0.025% se prepară în ziua în care se foloseşte, astfel: se amestecă 5 ml de soluţie de tripsină 0.25% cu 45 ml soluţie de NaCl 0.9% (se păstrează la temperatura camerei). Tamponul fosfat Fisher se prepară astfel: se dizolvă o capsulă de tampon pHydrion (pH 6.8) în 1000 ml apă distilată. Colorantul Leishman se prepară astfel: într-un balon de sticlă se toarnă 500 ml alcool metilic (metanol) absolut şi apoi, agitând continuu, se adaugă 1.0 g de colorant Leishman. Se continuă agitarea încă 2-3 minute şi apoi se lasă timp de 15 minute înainte de filtrarea printr-o hârtie de filtru Whatman într-o sticlă brună perfect uscată. Se păstrează la rece şi întuneric. Înainte de folosire, colorantul trebuie agitat bine. Tamponul pHydrion stoc se prepară prin dizolvarea unei capsule de tampon pHydrion în 100 ml apă distilată. pH-ul tamponului stoc trebuie să fie 7.0. Se păstrează la o temperatură între 2 şi 8°C. Soluţia de lucru de pHydrion se prepară astfel: se amestecă 5 ml de tampon pHydrion stoc cu 95 ml apă distilată. Se păstrează la temperatura camerei. Dacă este necesar, lamele pot fi decolorate prin plasarea timp de 1-2 minute într-un vas conţinând fixator (3 părţi alcool metilic absolut şi o parte acid acetic glacial). După o spălare scurtă în alcool metilic absolut şi uscarea completă, lamele pot fi re- tripsinizate şi / sau colorate. Bandarea GTG
Bandarea GTG obţinută prin digestia cromozomilor cu tripsină,
urmată de colorarea cu Giemsa este cea mai utilizată metodă de bandare pentru analiza de rutină a cromozomilor. Deşi modul de formare a benzilor GTG este încă neclar, se pare că diferenţele dintre benzile GTG pozitive şi negative sunt determinate de organizarea spaţială a proteinelor cromozomiale şi a ADN. Protocol de lucru
Se amestecă o cantitate de 0.4 ml de sânge total, heparinizat,
cu 10 ml mediu de cultură Gibco 1A (Gibco Chromosome Medium 1A) sau similar, şi se incubează timp de 72 ore la temperatura de 37ºC; Se tratează celule cu soluţie de colchicină în concentraţie de 10 mg/ml, timp de 30 minute; Se incubează suspensia celulară în 0.075 M KCl la temperatura de 37ºC, timp de 13 minute; Se fixează celulele într-un amestec proaspăt de metanol - acid acetic glacial 3:1, la temperatura de 22ºC, timp de 5 minute; Se efectuează preparate cromozomiale de tip frotiu pe lame de sticlă curate; Se incubează lamele de sticlă într-o soluţie 0.05% de tripsină (Difco), la temperatura de 37ºC, timp de 15 secunde; Se spală lamele în tampon fosfat salin; Se colorează preparatul cromozomial cu soluţie Giemsa 5% (*), timp de 8 minute; Se spală lamele cu apă distilată şi se usucă la aer.
(*) Într-o variantă a acestei metode, colorarea se face cu soluţie
Giemsa 10%, timp de 10 minute. Localizările de pe braţul scurt sunt notate p (petit), iar cele de pe braţul lung sunt notate q (queue). Fiecare braţ cromozomial este divizat în regiuni notate p1, p2, p3, etc., şi q1, q2, q3, etc., numerotate de la centromer înspre capete. Regiunile sunt delimitate de puncte de reper, care sunt trăsături morfologice distincte, ca centromerul, capetele braţelor cromozomiale şi anumite benzi. Regiunile sunt divizate în benzi notate p11 (unu-unu, nu unsprezece), p12, p13, etc., sub-benzi notate p11.1, p11.2, etc., şi sub-sub-benzi, notate p11.21, p11.22, etc., în fiecare caz numerotate de la centromer către capete. Notarea benzilor sub-benzilor și sub-sub-benzilor cromozomiale.