Tehnici de biologie

moleculara
CURS 1
RECOLTARE PRODUSELOR BIOLOGICE
 Specimen recoltat – Tampoane de exsudat nazofaringian și faringian recoltate
conform procedurilor standard, descărcate în recipient cu mediu de transport care să
asigure viabilitatea virusurilor
 Exsudat nazofaringian – Solicitați pacientului să tușească pentru a mobiliza secrețiile
către faringele posterior. Inclinați spre spate capul pacientului într-un unghi de
aproximativ 70 de grade. Tamponul se introduce cu grijă în narină si se coboară pe
planșeul inferior al acesteia până când se ajunge în nazofarinx. Tamponul se
răsucește de 2-3 ori, după care se extrage ușor. Acesta va fi imersat în recipientul cu
mediu de transport și se închide capacul etanș. În timpul acestei operațiuni pacientul
poate simți o anumită presiune sau discomfort.

Exsudatul faringian se prelevă înainte sau după 4 ore de la toaleta cavităţii bucale
sau ingestia de alimente sau lichide. Se aşează pacientul pe scaun cu faţa spre
sursa de lumină, gâtul în uşoară extensie şi ceafa sprijinită de spătar sau perete. Se
deprimă baza limbii cu apăsătorul şi, în timp ce pacientul pronunţă vocala “a”, se
şterg ferm cu tamponul amigdalele şi peretele posterior al faringelui. Atât la
introducerea cât şi la scoaterea tamponului, se evită atingerea bazei limbii şi a
palatului moale.

Ambele tampoane – nazofaringian si orofaringian – se vor introduce in același
recipient cu mediu de transport.
 Stabilitate probă – eșantioanele trebuie procesate și testate cât mai repede. Daca
acest lucru nu este posibil, proba este stabilă refrigerată (2 – 8°C) maxim 5 zile15.
Probele vor fi etichetate corespunzător si vor fi insotite de Formularul de însoțire
probe recoltate de la cazul suspect de COVID-19.

Recomandări pentru determinarea adenovirusurilor ADN din lichide de puncție

Ajută la diagnosticarea infecțiilor cu adenovirus
 Specimen recoltat – aspirat nazofaringian, spută, lavaj bronhoalveolar, aspirat
traheal, sânge, LCR, lichid ocular sau alte lichide punctie (8).
 
Recipient de recoltare – recipient steril
 Volum probă – 1 mL (în funcție de specimenul recoltat)
 Cauze de respingere a probei – probe transportate neconform
 Stabilitate probă – la temperaturi cuprinse între 2-4oC tip de 7 zile (în funcție
de specimenul recoltat)

8. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. [on-line]:

https://www.mayocliniclabs.com/test-catalog/overview/89074#Overview [Accesat la data
27.03.2022].
 Specimen recoltat pt HBV– sânge venos.

Recipient de recoltare – vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant.
 Cantitate recoltată – cât permite vacuumul.

Cauze de respingere a probei – folosirea heparinei ca anticoagulant.

Prelucrare necesară după recoltare – se separă plasma în maxim 1 zi de la recoltare
prin centrifugare la 800-1600 x g timp de 20 de minute la temperatura camerei, apoi
se transferă intr-o eprubetă de polipropilen (sunt necesari min. 2mL de plasmă) .

Stabilitate probă – plasma separată poate fi păstrată timp de 72 de ore la
temperatura camerei, 7 zile la 2-8°C sau cel puţin 6 săptămâni congelată la -80°C.
Probele pot fi congelate/decongelate de maximum cinci ori fără pierderea ADN-ului
VHB5
 Idem HCV.
 Specimen recoltat pt CMV– a) sange venos; b) o proba de urina spontana; c) lichid
cefalorahidian recoltat prin punctie lombara; d) lichid amniotic.
 Recipient de recoltare – a) vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant; b) eprubeta
pentru urina; c) si d) recipient steril.
 Cantitate recoltata – a) cat permite vacuumul; b), c) si d) minimum 2 mL.

Prelucrare necesara dupa recoltare – probele nu vor fi centrifugate.
 Cauze de respingere a probei – a) probe vechi, coagulate, hemolizate; folosirea
heparinei ca anticoagulant.
 Stabilitate proba – probele de sange, urina, LCR sau lichid amniotic sunt stabile 3 zile
la 2-4°C.
 Testul de diagnostic molecular al infectiilor cu transmitere sexuală – testare
sindromică
 Este recomandat pentru detectarea și identificarea simultană a următoarelor:

Diagnostic molecular – infecții cu transmitere sexuală (secretie vaginala/ cervicala)
 Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoea,
Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Candida albicans, Candida glabrata,
Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida tropicalis, Treponema pallidum,
HSV-1, HSV-2

Diagnostic molecular – infecții cu transmitere sexuală (secretie uretrala):
 Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoea, Mycoplasma
genitalium, Mycoplasma hominis, Candida albicans, Candida glabrata, Candida
parapsilosis, Candida krusei, Candida tropicalis, Treponema pallidum, HSV-1,
HSV-2, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum.
 Specimen recoltat – secreție genitală (uretrală) sau urină (primul jet).

Pregătire pacient – –secreție uretrală – nu necesită o pregătire specială
 -în cazul recoltării unei probe de urină, pacientul nu trebuie să urineze cu cel puțin 2
ore înaintea recoltării.
 Recipient de recoltare – secreție genitală – eNAT 2ml; urină – recipient steril
(urocultor).
 Stabilitate proba – atât probele de secreție genitală, cât și cele de urină sunt stabile 7
zile la 2-8ºC.
 Cauze de respingere a probei – recipiente care nu sunt închise etanș.
 Recomandari pentru determinarea Enterovirusuri – ARN – diagnosticul rapid al
infectiilor SNC cauzate de enterovirusuri.
 Pregatire pacient – nu este necesara.

Specimen recoltat – a) lichid cefalorahidian recoltat prin punctie lombara; b) exsudat
faringian sau nazofaringian; c) materii fecale sau tampon rectal; d) sange EDTA.

Recipient de recoltare – a) recipient steril; b) tampon uscat; c) coprorecoltor fara
mediu de transport sau tampon simplu; d) vacutainer ce contine EDTA ca
anticoagulant.

Cantitate recoltata – a) minimum 2 mL; c) 5 g; d) minimum 2 mL.
 Prelucrare necesara dupa recoltare – probele nu vor fi centrifugate.

Stabilitate proba – probele sunt stabile 48 ore la 2-4°C inainte de extractia acizilor
nucleici.
 Conditii de biosiguranta in laborator

• Probele destinate diagnosticului molecular SARS-CoV-2 vor fi manipulate cu
respectarea acelorași măsuri de biosiguranță ca cele aplicabile în cazul
diagnosticului molecular de gripă.
 • Extracția acizilor nucleici trebuie să se faca în hotă de biosiguranță în laboratoare
de nivel BSL-2.

Prelevare :

• tampoane de Dacron sau poliester;
 • tija de plastic ;

• tub cu mediu de transport pentru virusuri (VTM) suplimentat cu
 antifungice și antibiotice;

https://dst.gov.in/sree-chitra-develops-2-types-swabs-and-viral-transport-medium-covi
d-19-testing
 https://www.cliawaived.com/kaibili-viral-transport-medium-3ml-vial.html
 Prelevare :

• Momentul prelevarii:
 • la debutul infecției

• Probe din tractul respirator superior:

• Exsudat nazofaringian
 • Exsudat faringian

• Testarea combinată a probelor nazofaringiene și faringiene crește sensibilitatea
detecției virusurilor respiratorii →

descărcarea ambelor tampoane de exsudat nazofaringian și faringian, în același tub.
 Dacă nu este disponibil VTM, se pot folosi alte soluții, dupa validare, precum:

• PBS (tampon fosfat salin),
 • ser fiziologic,

• MEM (minimum essential medium, cu stocare la +4°C timp de 7-14 zile)

Stadii avansate de boală, Suspiciune înaltă de infecție și rezultate negative din
probele respiratorii superioare

• spută
 Nu se recomandă sputa indusă din cauza riscului crescut de transmitere prin aerosoli
și/sau

• aspirat endotraheal;

• lavaj bronhoalveolar
 Măsuri de biosiguranță în cursul manipulării probelor:

• Toate probele vor fi considerate potențial infecțioase si trebuie transportate ca
UN3373, „Substanțe biologice categoria B”

• Personalul implicat va utiliza corespunzător echipamentul individual de protecție.
 • Personalul care transportă probele trebuie să fie instruit în privința practicilor
corecte de manipulare a probelor, precum și a procedurilor de decontaminare.
 • decontaminare - se utilizeaza dezinfectanți activi asupra virusurilor invelite
(hipoclorit, alcool, compuși cuaternari de amoniu)
 https://www.cdc.gov/smallpox/lab-personnel/specimen-collection/pack-transport.html
  Probe neconforme

 tampoane în recipient fără mediu de transport pentru virusuri;


• recipiente necorespunzatoare (deteriorate, cu tubul crăpat sau
 capacul deschis);

• nerespectarea condițiilor de transport și conservare (timp, temperatură);

• absența etichetei pe eșantionul de analizat;
 • absența formularului de insotire sau formular completat necorespunzător, cu datele
de identificare a pacientului absente, incomplete, eronate sau indescifrabile.
 Diagnosticul de laborator*

Condiții de biosiguranță
 Testarea produselor patologice recoltate de la o persoană ce întrunește criteriile unui
caz suspect de infecție cu SARS-CoV-2 trebuie realizată în laboratoare cu nivel de
biosiguranță nivel 2 (BSL-2), de către un personal calificat și antrenat conform
procedurilor de biosiguranță si normelor de buna practică microbiologică, inclusiv in
domeniul diagnosticului molecular.
 Izolarea virală pe culturi de celule necesită un laborator de biosiguranță nivel 3 (BSL-
3) și nu este recomandată în prezent în scop diagnostic.
Good laboratory capacity is integral part of strong health system. Availability of PCR as
point of care technology has significantly contributed in early detection of diseases
which helps in timely prevention, treatment, and containment of diseases. It is now
widely recognized that PCR technology has strengthened health systems by firming
laboratory services.
In days to come the utility and application of PCR is bound to increase manifold
apacitatea bună de laborator este parte integrantă a unui sistem de sănătate puternic.
Disponibilitatea PCR ca tehnologie punct de îngrijire a contribuit în mod semnificativ la
detectarea precoce a bolilor, ceea ce ajută la prevenirea, tratamentul și limitarea în
timp util a bolilor. Acum este larg recunoscut că tehnologia PCR a consolidat
sistemele de sănătate prin consolidarea serviciilor de laborator.În zilele următoare,
utilitatea și aplicarea PCR vor crește neapărat
Molecular biology has revolutionized modern diagnostic technology in the past two decades.

Polymerase chain reaction (PCR) has now become the method of choice in early and
accurate diagnosis of most infectious diseases, and has become an indispensable
research tool. With this revolutionary, yet relatively inexpensive, molecular genetics
technology, it is possible to generate millions of DNA copies from a single strand of
DNA.

PCR is the abbreviation for “polymerase chain reaction”. PCR is a method used for
amplifying DNA. In April 1983, Kary Mullis stumbled across a process that could make
unlimited numbers of copies of genes now known as PCR. Since then, PCR has become
popular as a diagnostic tool worldwide.

The name “ polymerase chain reaction” is derived from the deoxyribonucleic acid (DNA)
polymerase used to amplify a piece of DNA by in vitro enzymatic replication.

This process is known as a “chain reaction” because the original DNA template is
exponentially amplified in every cycle of replication. The PCR has been extensively
modified and is widely used in molecular biology, microbiology, genetics, diagnostics,
and clinical, forensic and environmental laboratories, besides several other application.
Biologia moleculară a revoluționat tehnologia modernă de diagnosticare în ultimele două
decenii.Reacția în lanț a polimerazei (PCR) a devenit acum metoda de alegere în
diagnosticul precoce și precis al majorității bolilor infecțioase și a devenit un
instrument de cercetare indispensabil. Cu această tehnologie de genetică moleculară
revoluționară, dar relativ ieftină, este posibil să se genereze milioane de copii ADN
dintr-o singură catenă de ADN.PCR este abrevierea pentru „reacția în lanț a
polimerazei”. PCR este o metodă folosită pentru amplificarea ADN-ului. În aprilie
1983, Kary Mullis a dat peste un proces care ar putea face un număr nelimitat de copii
ale genelor cunoscute acum ca PCR. De atunci, PCR a devenit popular ca instrument
de diagnostic la nivel mondial.Denumirea „reacție în lanț a polimerazei” este derivată
din polimeraza acidului dezoxiribonucleic (ADN) folosită pentru a amplifica o bucată
de ADN prin replicare enzimatică in vitro.Acest proces este cunoscut sub numele de
„reacție în lanț”, deoarece șablonul original de ADN este amplificat exponențial în
fiecare ciclu de replicare. PCR a fost modificat pe scară largă și este utilizat pe scară
largă în biologie moleculară, microbiologie, genetică, diagnosticare și laboratoare
clinice, criminalistice și de mediu, pe lângă alte câteva aplicații.
PCR has significantly helped in early commencement of specific interventions for disease
control, and also plays a critical role in understanding disease epidemiology, thereby
unravelling the transmission dynamics of the disease.
The results of PCR are reproducible and comparable between different laboratories, and
hence are globally accepted.
Affordability has further increased its acceptance and utility in developing countries also.
The utility of this technology was amply demonstrated during the influenza pandemic and
outbreaks of emerging viral infections such as SARS, Ebola, MERS CoV, ZIKA and
many other communicable diseases.
Apart from rapid diagnosis of infectious diseases, PCR can be used in a variety of
applications in forensic and medical areas. Likewise, it can be widely used in a variety
of research purposes in the field of molecular genetics.
PCR a ajutat în mod semnificativ la începerea timpurie a intervențiilor specifice pentru
controlul bolii și, de asemenea, joacă un rol critic în înțelegerea epidemiologiei bolii,
dezvăluind astfel dinamica transmiterii bolii.Rezultatele PCR sunt reproductibile și
comparabile între diferite laboratoare și, prin urmare, sunt acceptate la nivel
global.Accesibilitatea și-a crescut și mai mult acceptarea și utilitatea și în țările în curs
de dezvoltare.Utilitatea acestei tehnologii a fost demonstrată pe larg în timpul
pandemiei de gripă și a focarelor de infecții virale emergente, cum ar fi SARS, Ebola,
MERS CoV, ZIKA și multe alte boli transmisibile.Pe lângă diagnosticarea rapidă a
bolilor infecțioase, PCR poate fi utilizat într-o varietate de aplicații în domeniile
criminalistice și medicale. De asemenea, poate fi utilizat pe scară largă într-o varietate
de scopuri de cercetare în domeniul geneticii moleculare
Basic Lab Setup

Unidirectional workflow!
Safety Gloves, Laboratory Coat
Safety Glasses
Biohazard Container

0.5% sodium hypochlorite, ethanol,

Biological Safety Hood
Vortex Mixer
Centrifuge and/or Microcentrifuge (min. RCF 12,500 x g),
some tests require a refrigerated, high speed centrifuge (min. RCF 24,000 x g)
Dry-heat Temperature Block

0
Incubator (37 C ± 2 C)
 Dedicated Pipettor and Screw-cap Tube Rack,
Multichannel Pipettor and Tips

•Screw-cap tube racks (to hold Master Mix tubes)

PCR System consumables
(tubes, base, tray and retainer).
Analyser Consumables/parts
D-cups

A-rings, A-ring Holder

Thermal Cycler
PCR System 9600 or System 2400
COBAS AMPLICOR™ Analyser