VOLUME 5 NOMOR 1 JUNI 2018 ISSN 2548 – 611X

JURNAL
BIOTEKNOLOGI & BIOSAINS INDONESIA

Homepage Jurnal: http://ejurnal.bppt.go.id/index.php/JBBI

ISOLASI DAN ANALISA GENISTEIN DARI TEMPE BUSUK

MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI KOLOM
Isolation and Analysis of Genistein of Overripe Tempe using Column
Chromatography Method
Hartati Soetjipto*, Yohanes Martono, dan Zulfa Yuniarti
Program Studi Kimia, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas Kristen Satya Wacana, Jl. Diponegoro
No. 52-60 Salatiga 50711 Jawa Tengah
*Email: [email protected]

ABSTRACT
Genistein is one of the aglycone isoflavone compounds in tempe that has various
biochemical activities, including anticancer, antitumor, and antioxidants. Commonly used
isoflavone extraction methods resulted in isoflavone crude extract. The aim of this study was
to isolate the genistein of overripe tempe through determining the appropriate combination of
mobile phases in genistein isolation and the determination of genistein content in both crude
extract and isolate. The overripe tempe was first extracted, then genistein was isolated from
the crude extract using column chromatography method. The determination of mobile phase
combination was done by Thin Layer Chromatography while the genistein content was
quantitatively determined by using High Performance Liquid Chromatography. The results
showed that the appropriate combination of mobile phase for genistein isolation was
chloroform : methanol (15 : 1, v/v). Genistein content in the crude extract and isolates were
4737.50 and 31.36 μg/g extract, respectively. The genistein purity in the isolates was
63.80%, while the purity in the isoflavone extract was 31.98%.

Keywords: genistein, HPLC, isoflavone, overripe tempe, TLC

ABSTRAK
Genistein merupakan salah satu senyawa isoflavon aglikon dalam tempe yang memiliki
bermacam-macam aktivitas biokimia, diantaranya antikanker, antitumor, dan antioksidan.
Metode ekstraksi isoflavon yang umum diterapkan, menghasilkan ekstrak kasar isoflavon
yang masih berupa campuran. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi genistein
dari tempe busuk melalui tahap penentuan kombinasi fase gerak yang tepat dalam isolasi
genistein serta penentuan kandungan genistein baik dalam ekstrak kasar maupun isolat.
Tempe busuk mula-mula diekstrak, selanjutnya genistein diisolasi dari ekstrak kasar
menggunakan metode kromatografi kolom. Penentuan kombinasi fase gerak dilakukan
secara Kromatografi Lapis Tipis, sedangkan kandungan genistein secara kuantitatif
ditentukan dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa kombinasi fase gerak yang tepat untuk isolasi genistein adalah
kloroform : metanol (15 : 1, v/v). Kandungan genistein dalam ekstrak kasar dan isolat
genistein berturut-turut sebesar 4737,50 dan 31,36 μg/g ekstrak. Kemurnian genistein dalam
isolat adalah sebesar 63,80%, sedangkan kemurniannya dalam ekstrak isoflavon adalah
sebesar 31,98%.

Kata Kunci: genistein, HPLC, isoflavon, tempe busuk, KLT

Received: 18 April 2018 Accepted: 12 June 2018 Published: 29 June 2018

88
 J Bioteknol Biosains Indones – Vol 5 No 1 Thn 2018

PENDAHULUAN tersebut, Kuligowski dkk. (2016) menyatakan

ekstraksi kedelai terfermentasi dengan
Isoflavon merupakan senyawa teknik yang berbeda yaitu menggunakan
polifenol yang termasuk dalam golongan pengadukan (stirring) juga menghasilkan
flavonoid. Bahan pangan yang menempati hasil ekstrak dengan kandungan serupa.
urutan pertama kaitannya dengan Dalam penerapannya sebagai
kandungan senyawa isoflavon dan senyawa antikanker, antitumor, dan
derivatnya adalah kedelai. Kandungan total antioksidan, diharapkan diperoleh genistein
isoflavon pada kedelai berkisar antara 34,39 yang lebih murni. Sebab adanya senyawa
hingga 48,95 mg/100 g (Bhagwat et al. lain dapat memberikan kontribusi pada
2008). Terdapat empat bentuk isoflavon di bioaktivitas genistein (Singh-Gupta et al.
dalam kedelai, yaitu glikosida, asetil 2010). Oleh sebab itu, pada penelitian ini
glikosida, malonil glikosida, dan aglikon, akan diisolasi isoflavon genistein dari tempe
yang masing-masing memiliki tiga isomer. busuk pemeraman hari keempat. Pemurnian
Isomer dari isoflavon aglikon yaitu genistein, genistein dari ekstrak kasar akan dilakukan
daidzein, dan glisitein. Menurut Astuti (2008) secara kromatografi kolom, sedangkan
genistein dan daidzein merupakan isoflavon konsentrasi genistein baik dalam ekstrak
utama dalam kedelai, diikuti turunan β- maupun isolat ditentukan dengan
glikosida-nya yaitu genistin dan daidzin. menggunakan Kromatografi Cair Kinerja
Kandungan isoflavon aglikon dalam Tinggi (High Performance Liquid
kedelai meningkat dengan adanya proses Chromatography / HPLC).
fermentasi (Hong et al. 2012). Tempe
merupakan produk fermentasi kedelai yang BAHAN DAN METODE
paling banyak dikonsumsi masyarakat
dibandingkan produk fermentasi lainnya. Bahan dan alat
Kandungan genistein dalam tempe Bahan baku dalam penelitian ini
mencapai lebih dari dua kali lipat adalah tempe yang diperoleh dari pengrajin
dibandingkan kandungannya dalam kedelai tempe di Bugel, Salatiga, Jawa Tengah.
yang belum diolah. Menurut Ahmad et al. Senyawa standar yang digunakan adalah
(2015), kandungan genistein pada kedelai genistein (Sigma Chemical Co, Amerika
sebesar 11,10 mg/100 g sedangkan pada Serikat). Pelarut kimia yang digunakan
tempe sebesar 24,03 mg/100 g. Kandungan adalah n-heksana, etanol, kloroform, dan
isoflavon aglikon dalam tempe diketahui metanol dengan derajat pro analisis produk
masih meningkat dengan bertambahnya E-Merck, Jerman.
waktu pemeraman. Menurut Riyanto dan Peralatan yang digunakan antara lain
Soetjipto (2017), tempe pemeraman hari neraca analitis dengan ketelitian 0,0001 g
keempat mengandung isoflavon genistein (Ohaus PA214), grinder (Philiphs HR-2108),
tertinggi diantara pemeraman hari ke-0 drying cabinet, moisture analyzer (OHAUS
hingga ke-8 yaitu sebesar 26,199 ± 25,146 MB 25), peralatan ekstraksi (Soxhlet),
mg/g. centrifuge, ultrasonikator (Krisbow Ultrasonic
Berbagai penelitian tentang genistein
terus dilakukan sehubungan dengan
bioaktivitas genistein, diantaranya
antikanker, antitumor, dan antioksidan
(Ariani dan Hastuti, 2009). Metode ekstraksi
isoflavon yang umum diterapkan,
menghasilkan ekstrak kasar isoflavon yang
berupa campuran antara berbagai senyawa
isoflavon baik dalam bentuk glikosida
maupun aglikon. Menurut Sartini dkk. (2014),
ekstraksi isoflavon kedelai dengan metode
maserasi menggunakan rotary shaker
menghasilkan ekstrak isoflavon yang terdiri
dari daidzein, genistein, daidzin, dan
genistin. Sama halnya dengan penelitian Gambar 1. Sampel tempe busuk pemeraman hari ke-4

89
Isolasi dan Analisa Genistein dari Tempe Busuk... Soetjipto et al.

cleaner DSA50-GL2-2.5L), rotary evaporator campuran kloroform : metanol berbagai

(Buchi R-114), plat KLT silika gel 60 F254, komposisi. Pengamatan dilakukan di bawah
chamber KLT, seperangkat alat kromatografi sinar ultra violet dengan panjang gelombang
kolom, dan HPLC (Knauer Smartline 5000, 254 nm. Nilai Rf diukur, kemudian
Smartline pump 1000). dibandingkan dengan nilai Rf senyawa
standar genistein. Perhitungan nilai Rf
Preparasi sampel dihitung dengan persamaan berikut:
Sampel tempe yang digunakan adalah
tempe pemeraman hari ke-4 (Gambar 1). jarak yang digerakkanoleh senyawa
Rf 
Sampel dipotong tipis-tipis lalu dikeringkan jarak yang digerakkanoleh permukaan pelarut
pada drying cabinet dengan suhu 50°C
selama 2 hari. Sampel selanjutnya Kromatografi kolom
dihaluskan dengan grinder dan disimpan Fase diam yang digunakan pada
dalam wadah kering untuk analisis lebih kromatografi kolom (Asih 2009 yang
lanjut. dimodifikasi) adalah silika gel, sedangkan
fase gerak yang digunakan adalah kloroform
Pengukuran kadar air : metanol pada komposisi yang memberikan
Sebanyak kurang lebih 1 g sampel pemisahan terbaik pada KLT. Perbandingan
dimasukkan ke dalam alat moisture antara sampel dengan fase diam adalah 1 :
analyzer. Kadar air sampel akan tertera 10 (b/b). Eluat ditampung pada botol
pada layar monitor alat terhitung sebagai penampung fraksi setiap ± 0,5 mL, kemudian
persentase air yang hilang saat proses keseluruhan fraksi yang dihasilkan dianalisis
pemanasan sampel. menggunakan KLT. Fraksi hasil KLT yang
mempunyai pola pemisahan sama (harga Rf
Ekstraksi isoflavon sama) digabungkan, kemudian diuapkan.
Sampel tempe didefatisasi
menggunakan pelarut n-heksana (1:5, b/v) Penentuan kandungan isoflavon genistein
selama 3 jam pada alat Soxhlet Identifikasi isoflavon menggunakan
(Yunindarwati dkk. 2016 yang dimodifikasi). metode HPLC dilakukan dengan
Simplisia yang telah bebas lemak tersebut pengkondisian instrumen HPLC dan
selanjutnya dikeringkan. Sebanyak 25 g pembuatan larutan sampel (César et al.
simplisia kering tersebut diekstraksi dengan 2006 yang dimodifikasi). Larutan sampel
cara ultrasonikasi menggunakan pelarut dibuat dengan melarutkan ekstrak dalam 5
etanol 70% (1:6, b/v) selama 1 jam. Ekstrak mL metanol. Selanjutnya sebanyak 20 μL
cair selanjutnya dipisahkan dengan cara larutan sampel diinjeksikan ke HPLC setelah
sentrifugasi kecepatan rendah (800 rpm) pengkondisian HPLC selesai. Kromatogram
selama 10 menit. Residu yang tersisa HPLC dianalisis dengan menggunakan
diekstraksi kembali sebanyak 2 kali pembanding kromatogram isoflavon
menggunakan pelarut baru. Seluruh ekstrak genistein standar.
cair dikumpulkan dan dipekatkan di rotary Kondisi operasional instrumen HPLC
evaporator hingga didapatkan ekstrak kental. meliputi fase diam Vertex, Euroshper 100-5
Selanjutnya ekstrak kental yang diperoleh C18, 250  4,6 mm (WL 75) dan fase gerak
ditimbang kemudian dihitung rendemennya menggunakan campuran metanol : asam
berdasarkan persamaan berikut: asetat 0,1% dengan perbandingan 48:52
(v/v). Kecepatan alir yang digunakan
Re ndemen  sebesar 1,2 mL/min dengan volum injeksi 20
berat ekstrak μL dan menggunakan detektor UV 254 nm.
 100 %
(berat sampel )  (berat sampel  % kadar air )
Analisis data
Kromatografi lapis tipis Analisis kuantitatif genistein secara
Analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT) HPLC dilakukan dengan metode standar
(Hessler et al. 1997 yang dimodifikasi) eksternal. Konsentrasi genistein dalam
dilakukan dengan menggunakan fase diam sampel dapat diketahui dengan memplotkan
plat silika gel 60 F254 dan fase gerak berupa area puncak analit pada kurva baku standar.

90
 J Bioteknol Biosains Indones – Vol 5 No 1 Thn 2018

HASIL DAN PEMBAHASAN sudah kering sebesar 6,51%. Dibandingkan

dengan penelitian Riyanto dan Soetjipto
Pengukuran kadar air (2017), dimana kadar air serbuk tempe hari
Berdasarkan proses pengukuran, ke-4 yang sudah dikeringkan sebesar
kadar air dari serbuk tempe busuk yang 4,566%, penelitian ini menghasilkan nilai

(10:1) (15:1) (20:1) (25:1) (50:1)

Gambar 2. Hasil analisis KLT perbandingan standar genistein dengan ekstrak isoflavon tempe. (Keterangan: Fase
gerak =CHCl3 : CH3OH (v/v); fase diam = plat silika gel; noda kiri = standar genistein; noda kanan =
ekstrak isoflavon tempe)

Tabel 1. Hasil KLT ekstrak isoflavon tempe dan standar genistein pada berbagai perbandingan fase gerak

Fase gerak CHCl3 : CH3OH (v/v)

Nilai Rf
10 : 1 15 : 1 20 : 1 25 : 1 50 : 1
Standar Genistein 0,50 0,45 0,33 0,28 0,12
Noda 1 0,50 0,45 0,35 0,28 0,12
Ekstrak Noda 2 0,43 0,35 0,27 0,22 0,07
Isoflavon Noda 3 0,33 0,27 0,2 0,17 —
Noda 4 0,25 0,18 — — —

91
Isolasi dan Analisa Genistein dari Tempe Busuk... Soetjipto et al.

kadar air yang lebih tinggi. Menurut Rosida Rf ekstrak yang relatif bernilai sama
dkk. (2009), kadar air sampel dipengaruhi dengan Rf standar membuktikan bahwa
oleh kadar air awal bahan bakunya. Selain noda yang muncul adalah genistein (Tabel
itu, perbedaan ukuran sampel juga sangat 1). Perbandingan kloroform : metanol (10 : 1,
mempengaruhi nilai kadar air sampel v/v) dan (15 : 1, v/v) menghasilkan
tersebut (Purnama dkk. 2012). Nilai kadar air pemisahan 4 noda, kloroform : metanol (20 :
yang diperoleh digunakan untuk menentukan 1, v/v) dan (25 : 1, v/v) 3 noda, dan kloroform
berat kering dari sampel pada perhitungan : metanol (50 : 1, v/v) 2 noda. Semakin
rendemen ekstrak. banyak perbandingan kloroform yang
digunakan, Rf yang dihasilkan semakin
Rendemen ekstrak isoflavon rendah dan noda yang muncul semakin
Ekstrak isoflavon diperoleh melalui sedikit. Hal ini disebabkan karena senyawa
ekstraksi tempe fermentasi hari ke-4, yang akan dipisahkan semakin tertahan
dengan metode ultrasonikasi menggunakan pada fase diam karena pengaruh polaritas
pelarut etanol 70% yang sebelumnya telah baik dari senyawa, fase diam, maupun fase
melewati tahap defatisasi menggunakan gerak. Rf yang beragam merupakan hasil
pelarut n-heksana. Rendemen ekstrak dari berbagai tingkat afinitas antara
isoflavon yang diperoleh sebesar 24,87% komponen campuran dengan fase diam dan
(b/b). Lewidharti dkk. (2015) melaporkan gerak.
bahwa tempe fermentasi hari ke-4 yang Hasil KLT pada fase gerak kloroform :
diekstrak secara maserasi dengan pelarut metanol (10 : 1, v/v) sesuai dengan
metanol 80%, menghasilkan rendemen penelitian Jyoti et al. (2015) dimana Rf dari
sebesar 30,31% (b/b). Dibandingkan genistein standar sebesar 0,50. Noda
dengan hasil penelitian tersebut, penelitian pemisahan yang terbentuk pada fase gerak
ini menghasilkan rendemen ekstrak yang klorofom : metanol (20 : 1, v/v)
lebih rendah. Hal ini disebabkan karena menunjukkan tailing, dimana noda
efisiensi ekstraksi secara ultrasonikasi juga cenderung miring ke arah kanan. Hal ini
dipengaruhi oleh frekuensi gelombang diduga disebabkan karena kondisi chamber
ultrasonik selain dipengaruhi pemilihan yang belum jenuh sehingga mempengaruhi
pelarut, waktu ekstraksi, dan suhu ekstraksi. migrasi fase gerak menjadi tidak lurus.
Paparan gelombang ultrasonik yang Menurut Sherma dan Fried (2003),
terlalu lama dapat mengganggu stabilitas parameter-parameter yang menyebabkan
senyawa isoflavon. Paparan tersebut tailing adalah volume sampel yang
menimbulkan adanya disosiasi ultrasonik berlebihan saat diaplikasikan ke plat KLT,
sehingga terbentuk senyawa radikal. keaktifan plat KLT, jarak pengembang, dan
Kehadiran senyawa radikal (spesies kejenuhan chamber.
berenergi tinggi) tersebut menyebabkan Noda pemisahan yang berhimpit pada
terjadinya reaksi oksidatif pada proses fase gerak kloroform : metanol (50 : 1, v/v)
ekstraksi yang mempengaruhi stabilitas disebabkan karena polaritas fase gerak
senyawa (Rostagno et al. 2009). Perbedaan yang kurang sesuai sehingga tidak mampu
perlakuan pada sampel tempe, termasuk memisahkan komponen senyawa secara
sumber bahan baku pembuatan tempe maksimal. Noda yang berhimpit juga dapat
(varietas, kematangan, dan tempat tumbuh disebabkan oleh volume sampel yang
kedelai), dan cara pengolahan tempe yang berlebihan saat diaplikasikan ke KLT (Bele
digunakan juga berpengaruh terhadap dan Khale 2011).
rendemen ekstrak yang dihasilkan (Suharto Hasil yang diperoleh menunjukkan
dkk. 2017). fase gerak kloroform : metanol (10 : 1, v/v)
memberikan pemisahan yang paling baik
Kromatografi lapis tipis dilihat dari nilai Rf yang dihasilkan.
Hasil analisis kromatografi lapis tipis Senyawa isoflavon yang dipisahkan dengan
(KLT) ekstrak isoflavon pada berbagai fase gerak tersebut, memenuhi parameter
perbandingan fase gerak dilihat di bawah optimum yaitu nilai Rf berada pada
sinar UV 254 nm (Gambar 2). Ekstrak yang pendistribusian di wilayah 0,2-0,8 (Shewiyo
di-KLT dibandingkan dengan standar genistein et al. 2012). Namun untuk fase gerak yang
pada setiap perbandingan fase gerak. digunakan pada kromatografi kolom,

92
 J Bioteknol Biosains Indones – Vol 5 No 1 Thn 2018

diharapkan jarak pemisahan antar noda membentuk noda dengan nilai Rf relatif
lebih panjang (terutama untuk noda sama, digabungkan menjadi satu kelompok
genistein dengan noda berikutnya) fraksi. Hasil dari KLT gabungan,
sehingga nantinya dapat diperoleh senyawa membentuk 4 kelompok fraksi yaitu fraksi A,
yang lebih murni. Sehingga pada kromato- B, C, dan D (Gambar 3).
grafi kolom digunakan fase gerak kloroform Fraksi A merupakan gabungan dari
: metanol dengan perbandingan 15 : 1 (v/v). fraksi ke-22 hingga 33, fraksi B dari fraksi
Hasil KLT yang diperoleh tidak hanya ke-34 hingga 40, fraksi C dari fraksi ke-41
digunakan untuk menentukan kombinasi hingga 45, sedangkan fraksi D dari fraksi
fase gerak yang tepat untuk isolasi, namun ke-46 hingga 60. Fraksi pertama hingga
juga dapat digunakan untuk memperkirakan fraksi ke-21 dan fraksi ke-61 hingga 66
berapa senyawa yang terpisahkan tidak memperlihatkan adanya noda
berdasarkan jumlah noda pemisahan yang pemisahan yang menunjukkan bahwa pada
muncul. Oleh sebab itu, tahapan optimasi fraksi tersebut hanya terdapat fase gerak.
fase gerak untuk isolasi senyawa penting Fraksi A dan B menunjukkan positif
dilakukan sebelum tahapan isolasi itu sendiri. genistein karena terbentuk noda dengan nilai
Rf yang sama dibandingkan dengan Rf
Kromatografi kolom standar genistein, yaitu sebesar 0,47. Fraksi
Terhadap 0,305 g ekstrak isoflavon A dinilai relatif lebih murni sebagai isolat
tempe, dilakukan proses pemisahan genistein secara KLT karena menghasilkan
dengan menggunakan fase diam silika gel noda tunggal, sedangkan fraksi B
60 (70-100 Mesh) sebanyak 3 g (panjang menghasilkan dua noda dimana noda kedua
kolom 20 cm, diameter 1 cm) menggunakan diduga masih termasuk senyawa golongan
fase gerak kloroform : metanol (15 : 1, v/v). isoflavon yang terkandung dalam tempe.
Hasil kromatografi kolom adalah 66 fraksi Fraksi A inilah yang selanjutnya disebut
(tiap fraksi ± 0,5 mL). Selanjutnya terhadap isolat genistein dan digunakan untuk analisis
fraksi-fraksi tersebut dilakukan KLT lanjutan. Fraksi B, C, dan D menghasilkan
gabungan dimana tiap fraksi dianalisis noda sangat tipis. Hal ini diduga karena
menggunakan KLT, fase gerak kloroform : kadar senyawa isoflavon dalam fraksi
metanol (10 : 1, v/v). Fraksi-fraksi yang tersebut sangat rendah.

Gambar 3. Hasil analisis KLT perbandingan standar genistein dengan fraksi-fraksi hasil kromatografi kolom.
(Keterangan: fase gerak = CHCl3 : CH3OH (10 : 1, v/v); fase diam = plat silika gel; noda kiri ke kanan =
standar genistein, fraksi A, fraksi B, fraksi C, dan fraksi D)

93
Isolasi dan Analisa Genistein dari Tempe Busuk... Soetjipto et al.

dilakukan dengan menggunakan metode

Kadar isoflavon genistein standar eksternal dengan memplotkan area
Kadar isoflavon genistein baik dalam puncak analit pada kurva baku standar.
ekstrak kasar isoflavon tempe maupun isolat Kromatogram HPLC ekstrak isoflavon tempe
genistein hasil kromatografi kolom dan isolat genistein ditunjukkan pada
ditentukan secara kuantitatif menggunakan Gambar 4. Puncak genistein ekstrak
HPLC. Analisis kuantitatif genistein isoflavon dan isolat genistein berturut-turut
A

a.

b.

Gambar 4. Kromatogram HPLC (a). ekstrak isoflavon tempe dan (b). isolat genistein

Gambar 5. Reaksi hidrolisis genistin menjadi genistein (Rostagno et al. 2009)

94
 J Bioteknol Biosains Indones – Vol 5 No 1 Thn 2018

muncul pada waktu retensi 27,000 dan (1976), kolom yang digunakan untuk
27,683 menit. Puncak-puncak lain yang kromatografi kolom harus dielusi dengan
terdeteksi diduga merupakan senyawa campuran pelarut yang setidaknya memiliki
golongan isoflavon, salah satu diantaranya polaritas seperti pelarut yang digunakan
yang dominan diduga merupakan daidzein untuk melarutkan sampel. Keterbatasan
(tR = 15,800 menit). tersebut sering menyebabkan pemisahan
Kadar genistein dari hasil analisis dan goresan komponen menjadi tidak baik.
dengan HPLC pada ekstrak isoflavon Bila dibandingkan antara isolat (31,36
sebesar 4737,50 μg/g ekstrak. μg/g ekstrak) dengan ekstrak isoflavon
Dibandingkan dengan hasil penelitian (4737,50 μg/g ekstrak), genistein yang
Yunindarwati dkk.(2016), penelitian ini terisolasi dalam isolat relatif lebih rendah.
menghasilkan ekstrak dengan kadar Hal ini menunjukkan metode isolasi yang
genistein yang lebih tinggi. Yunindarwati dilakukan dengan menggunakan fase diam
dkk. (2016) melaporkan bahwa ekstrak silika gel 60 (70-100 Mesh) dan fase gerak
kedelai terfermentasi Aspergillus oryzae kloroform : metanol (15 : 1, v/v) masih perlu
hari ke-4 mengandung genistein sebesar dikembangkan lebih lanjut agar % recovery
54,373 ± 1,755 μg/g ekstrak. genistein dapat lebih sempurna.
Salah satu penyebab perbedaan Kemurnian genistein dihitung
kadar genistein dalam ekstrak, diduga berdasarkan area puncak kromatogram
disebabkan oleh jenis kapang yang (Gambar 4), yaitu dengan membagi area
digunakan dalam proses pembuatan tempe. puncak genistein dengan total area puncak-
Cheng et al. (2010) menyatakan bahwa puncak yang ada. Sehingga kemurnian
jenis kapang yang berbeda, memiliki genistein dalam isolat sebesar 63,80%.
aktivitas biotransformasi isoflavon yang Dibandingkan dengan kemurniannya dalam
berbeda pula. Menurut Lee dan Chou ekstrak isoflavon sebesar 31,98%,
(2006), Rhizopus sp. no. 2 menunjukkan kemurnian genistein dalam isolat lebih besar
peningkatan tertinggi isoflavon aglikon hampir mencapai 2 lipat. Namun,
dalam fermentasi koji kacang hitam sebesar kemurnian tersebut dinilai masih belum
2,9 hingga 58,9% setelah fermentasi, cukup besar sehingga seperti yang sudah
dibandingkan dengan Aspergillus awamori, disebutkan sebelumnya, metode yang
Aspergillus oryzae, Aspergilllus sojae, dan diterapkan pada penelitian ini masih perlu
Rhizopus azygosporus yang hanya berkisar dikembangkan lebih lanjut.
18,9 – 38,9% setelah fermentasi.
Biotransformasi isoflavon glikosida KESIMPULAN
(genistin) menjadi isoflavn aglikon
(genistein) terjadi akibat reaksi hidrolisis Kombinasi fase gerak yang tepat
oleh aktivitas enzim β-glukosidase. Reaksi dalam isolasi genistein adalah kloroform :
hidrolisis genistin menjadi genistein metanol (15 : 1, v/v). Kandungan genistein
ditunjukkan pada Gambar 5. dalam ekstrak kasar isoflavon tempe busuk
Kadar genistein dalam isolat terukur hari ke-4 dan isolat genistein berturut-turut
sebesar 31,36 μg/g ekstrak. Bila sebesar 4737,50 dan 31,36 μg/g ekstrak.
dibandingkan dengan kadar genistein
dalam ekstrak kasar yang diisolasi (yang DAFTAR PUSTAKA
digunakan untuk kromatografi kolom), yaitu
sebesar 248,66 μg/g ekstrak, maka dapat Ahmad A, Ramasamy K, Majeed ABA, Mani
ditentukan persen perolehan kembali (% V (2015) Enhancement of β-secretase
recovery) yaitu sebesar 12,61%. inhibition and antioxidant activities of
Rendahnya % recovery yang diperoleh tempeh, a fermented soybean cake
diduga disebabkan karena ada sebagian through enrichment of bioactive
genistein yang belum terpisah dengan aglycones. Pharm Biol 53:758–766.
senyawa lain (masih dalam bentuk doi: 10.3109/13880209.2014.942791
campuran) (Gambar 3), selain itu terdapat Ariani SRD, Hastuti W (2009) Analisis
keterbatasan pada sistem kromatografi isoflavon dan uji aktivitas antioksidan
kolom yang mempengaruhi hasil pada tempe dengan variasi lama waktu
pemisahan. Menurut Beller dan Hilleary fermentasi dan metode ekstraksi.

95
Isolasi dan Analisa Genistein dari Tempe Busuk... Soetjipto et al.

Prosiding Seminar Nasional Kimia dan Kuligowski M, Pawłowska K, Jasińska-

Pendidikan Kimia, Pp 568–580. 18 Kuligowska I, Nowak J (2016)
Maret 2009, Surakarta Isoflavone composition, polyphenols
Asih IARA (2009) Isolasi dan identifikasi content and antioxidative activity of
senyawa isoflavon dari kacang kedelai soybean seeds during tempeh
(Glycine max). J Kimia 3:33–40 fermentation. CyTA J Food 15:27-33.
Astuti S (2008) Isoflavon kedelai dan doi: 10.1080/19476337.2016.1197316
potensinya sebagai penangkap radikal Lee IH, Chou CC (2006) Distribution profiles
bebas. J Tek Industri dan Hasil of isoflavone isomers in black bean
Pertanian 13:126–136 kojis prepared with various filamentous
Bele AA, Khale A (2011) An overview on thin fungi. J Agric Food Chem 54:1309-
layer chromatography. Int J Pharma 1314. doi: 10.1021/jf058139m
Sci Res 2:256-267. doi: Lewidharti RS, Soetjipto H, Andini S (2015)
10.13040/IJPSR.0975-8232.2(2).256-67 Dinamika konsentrasi genistein dalam
Beller NR, Hilleary CJ (1976) A sample proses pembusukan tempe kedelai.
preparation technique for column Prosiding Seminar Nasional Kimia dan
chromatography. J Chem Educ 53: Pendidikan Kimia VII. 18 April 2015,
498. doi: 10.1021/ed053p498 Surakarta
Bhagwat S, Haytowitz DB, Holden JM (2008) Purnama FA, Dewi L, Hastuti SP (2012)
USDA database for the isoflavone Kadar air, abu, protein dan karbohidrat
content of selected foods: Release 2.0. pada tahap pembuatan tempe. Skripsi,
Nutrient Data Laboratory, United State Universitas Kristen Satya Wacana
of America Riyanto CA, Soetjipto H (2017) Solvent
Cheng KC, Lin JT, Wu JY, Liu WH (2010) optimization for genistein isolation of
Isoflavone conversion of black soybean “rotten tempe” by high performance
by immobilized Rhizopus spp. Food liquid chromatography method. J
Biotechnol 24: 312-331. doi: Eksakta: 17:111-118
10.1080/08905436.2010.524459 Rosida DF, Sudaryati HP, Constantia F
César IC, Braga FC, Soares CD, Nunan (2009) Kajian peran angkak pada
EA, Pianetti GA, Condessa kualitas tempe kedelai-lamtoro gung
FA, Barbosa TA, Campos LM (2006) (Leucaena leucocephala). J
Development and validation of a RP- Rekapangan 6:64-72
HPLC method for quantification of Rostagno MA, Villares A, Guillamon E,
isoflavone aglycones in hydrolyzed soy Garcia-Lafuente A, Martinez JA (2009)
dry extracts. J Chromatogr B 836:74– Sample preparation for the analysis of
78. doi: 10.1016/j.jchromb.2006.03.030 isoflavones from soybeans and soy
Hessler PE, Larsen PE, Constantinou AI, foods. J Chromatogr A 1216:2–29. doi:
Schram KH, Weber JM (1997) Isolation 10.1016/j.chroma.2008.11.035
of isoflavones from soy-based Sartini, Djide MN, Permana AD, Ismail
fermentations of the erythromycin- (2014) Ekstraksi isoflavon kedelai dan
producing bacterium penentuan kadarnya secara Ultra Fast
Saccharopolyspora erythraea. Appl Liquid Chromatografi (UFLC). J
Microbiol Biotechnol 47:398–404. doi: Sainsmat 3:130-134. doi:
10.1007/s002530050947 10.2685/sainsmat3211202014
Hong GE, Mandal PK, Lim KW, Lee CH Sherma J, Fried B (2003) Handbook of Thin-
(2012) Fermentation increases Layer Chromatography, Third Edition.
isoflavone aglycone contents in black Marcel Dekker Inc, New York
soybean pulp. Asian J Animal Vet Adv Shewiyo DH, Kaale E, Risha PG, Dejaegher
7:502-511. doi: B, Smeyers-Verbeke J, Vander-
10.3923/ajava.2012.502.511 Heyden Y (2012) Optimization of a
Jyoti, Agrawal SS, Saxena S, Sharma A reversed-phase-high-performance thin-
(2015) Phytoestrogen "genistein": Its layer chromatography method for the
extraction and isolation from soybean separation of isoniazid, ethambutol,
seeds. Int J Phramacogn Phytochem rifampicin and pyrazinamide in fixed-
Res 7:1121-1126 dose combination antituberculosis

96
 J Bioteknol Biosains Indones – Vol 5 No 1 Thn 2018

tablets. J Chromatogr A 1260:232–238. Pengaruh lama fermentasi tempe

doi: 10.1016/j.chroma.2012.08.044 terhadap kandungan total senyawa
Singh-Gupta V, Zhang H, Yunker CK, Ahmad fenolik dan isoflavon genistein.
Z, Zwier D, Sarkar FH, Hillman GG ALCHEMY J Penelitian Kimia 13:230-
(2010) Daidzen effect on hormone 240. doi: 10.20961/alchemy.v13i2.5094
refractory prostate cancer in vitro and Yunindarwati E, Ulfa EU, Puspitasari E,
in vivo compared to genistein and soy Hidayat MA (2016) Penentuan kadar
extract: Potentiation of radiotherapy. genistein dan aktivitas hambatan
Pharm Res 27:1115-1127. doi: tirosinase kedelai (Glycine max)
10.1007/s11095-010-0107-9 terfermentasi Aspergillus oryzae. J
Suharto KF, Soetjipto H, Martono Y (2017) Ilmu Kefarmasian Indones 14:1–7

97