Download and Read online, DOWNLOAD EBOOK, [PDF EBOOK EPUB ], Ebooks

download, Read Ebook EPUB/KINDE, Download Book Format PDF

(eBook PDF) Brain Banking (ISSN Book 150)

OR CLICK LINK
http://ebooksecure.com/product/ebook-pdf-brain-
banking-issn-book-150/

Download More ebooks [PDF]. Format PDF ebook download PDF KINDLE.
Full download test bank at ebooksecure.com
More products digital (pdf, epub, mobi) instant
download maybe you interests ...

(eBook PDF) Translational Medicine in CNS Drug

Development, Volume 29

http://ebooksecure.com/product/ebook-pdf-translational-medicine-
in-cns-drug-development-volume-29/

Progress in Heterocyclic Chemistry Volume 29 1st

Edition - eBook PDF

https://ebooksecure.com/download/progress-in-heterocyclic-
chemistry-ebook-pdf/

Cardiology-An Integrated Approach (Human Organ Systems)

(Dec 29, 2017)_(007179154X)_(McGraw-Hill) 1st Edition
Elmoselhi - eBook PDF

https://ebooksecure.com/download/cardiology-an-integrated-
approach-human-organ-systems-dec-29-2017_007179154x_mcgraw-hill-
ebook-pdf/

Netter Atlas of Human Anatomy-Classic Regional

Approach, 8e (Mar 29, 2022)_(0323793738)_(Elsevier) NOT
TRUE PDF 8th Edition - eBook PDF

https://ebooksecure.com/download/netter-atlas-of-human-anatomy-
classic-regional-approach-8e-mar-29-2022_0323793738_elsevier-not-
true-pdf-ebook-pdf/
150 ECG Cases (Fifth Edition) John Hampton - eBook PDF

https://ebooksecure.com/download/150-ecg-cases-fifth-edition-
ebook-pdf/

(eBook PDF) Money Banking Financial Markets and

Institutions

http://ebooksecure.com/product/ebook-pdf-money-banking-financial-
markets-and-institutions/

(eBook PDF) Culturally Responsive Teaching and The

Brain

http://ebooksecure.com/product/ebook-pdf-culturally-responsive-
teaching-and-the-brain/

Atlas of Early Zebrafish Brain Development, Second

Edition

http://ebooksecure.com/product/atlas-of-early-zebrafish-brain-
development-second-edition/

(eBook PDF) Money, Banking, Financial Markets &

Institutions 2nd Edition

http://ebooksecure.com/product/ebook-pdf-money-banking-financial-
markets-institutions-2nd-edition/
 Foreword

This volume on Brain Banking in Neurologic and Psychiatric Diseases in the Handbook of Clinical Neurology series is
the first ever comprehensive book on this topic. Postmortem studies of the human brain provide essential information
that cannot be obtained by in vivo studies in humans or through experimental models in animals. Animal models are
generally models for the symptoms of a neuropsychiatric disorder, rather than a representation of the complete disease.
Moreover, certain human conditions such as suicide have no good animal models. Finally, postmortem tissue is needed
to validate findings in animal models.
A brain bank is a complex organization that provides the international research community with high-quality, well-
characterized, and neuroanatomically well-defined postmortem brain samples of neurologic and psychiatric disorders
and their appropriate controls. Brain banks are necessary, since neurologic and psychiatric patients tend not to die in a
teaching hospital but at home or in nursing homes, where there is no research tradition. Moreover, pathologists do not
usually conduct postmortem examinations on healthy patients without brain disorders, even though the brains from
these subjects are extremely important for use as controls in research projects. Brain banks need staff with a variety
of different competencies, including trained personnel to interact with grieving families, administrative staff to deal
with the database, and neuropathologists and scientific staff to process and disseminate the brain samples.
All aspects of the organization of a brain bank are described extensively in the different chapters of this book, begin-
ning with a description of how donors are obtained, preferably by means of an antemortem donor program. The donors
and their relatives have to be informed, well in advance, about what the procedure entails exactly, and all the necessary
paper work has to be done in advance so that the postmortem time is as short as possible. Alternative strategies for
obtaining brain donations through medicolegal postmortems are also discussed in the volume, as well as ways to obtain
rare cases such as through the Autism BrainNet, a network of brain collection sites in different places in the United
States and Britain.
A thorough characterization of postmortem tissue requires that a comprehensive clinical investigation is conducted
and complete documentation of the patient’s disorder and therapies is obtained. Toxicologic analysis can be extremely
useful. Dissection of a fresh brain according to anatomic borders is not generally part of the neuropathologist’s routine
and therefore requires special training for a neuropathologist working in a brain bank. A systematic and professional
neuropathologic investigation following a standardized protocol for both cases and controls is crucial. Chapters in this
volume indicate that about 20% of the clinical neurologic diagnoses, despite being made in first-rate clinics, have to be
revised or require an extra diagnosis after a complete and thorough neuropathologic review. The neuropathologic
examination is also needed to indicate the stage of the disease, such as the Braak stages for Alzheimer disease. In addi-
tion, accurate clinical and neuropathologic information should ensure that tissue that is, unknowingly, infected with, for
example, prions or human immunodeficiency virus (HIV) is not sent out to research groups. Neurochemical markers
are reviewed in terms of their ability to assess the quality of postmortem brain tissue.
Samples from patients have to be compared to those of controls that are matched for as many of the known con-
founding factors as possible, such as genetic background, systemic diseases, duration and gravity of illness, medicines
and addictive compounds used, age, gender, circadian and seasonal fluctuations, lateralization, agonal state, freezing or
fixation procedures, and storage time. Consequently, brain banks should have a large number of controls available.
Samples should be stored and distributed to the international field of neuroscientists that have open access to the facil-
ity, and the feasibility and quality of their studies should be reviewed and guaranteed by an independent committee.
Brain banking should follow ethical rules such as those described in the code of conduct of the BrainNet Europe
consortium. Fundamental topics that are discussed in the volume include the rights of the persons donating tissue, the
obligations of the brain bank with regard to respect and observance of such rights, informed consent, confidentiality,
protection of personal data, collections of human biologic material and their management, and transparency and
accountability within the organization of a brain bank.
viii FOREWORD
An organization as complex as a brain bank has additional requirements related to information-technology (IT)
infrastructure and database management. A practical guide for designing and implementing an IT system for brain
banking is included in the volume, as also are examples for collecting, managing, and distributing data. A brain bank
is faced with significant costs – while funding tends to come from research and facility grants and donations, these are
all irregular, uncertain, and cover costs for only a fixed period of time. Thus, it is advisable to have a business plan that
identifies the interests of the stakeholders and addresses the implementation of cost efficiency and cost recovery
systems.
This volume also provides useful information on cutting-edge techniques that can be applied to human postmortem
material, such as novel genomic, proteomic, lipidomic, and epigenetic techniques, laser microdissection in combina-
tion with gene expression profiling, novel cell isolation techniques, postmortem cell cultures, donor-derived induced
pluripotent stem cells, tissue-clearing methodologies to study three-dimensional brain circuits, electrophysiologic
recordings in both surgically derived brain tissue and autopsy material, studies that combine postmortem magnetic
resonance imaging and histopathology, and human brain mapping integrating results of quantitative cyto- and
receptor-architectonic techniques.
We were very fortunate to have as volume editors two distinguished scholars who are well versed in brain banking:
Ingeborg Huitinga, Director of the Netherlands Brain Bank, in the Netherlands Institute for Neuroscience, Amsterdam,
and Maree J. Webster, Executive Director of the Stanley Medical Research Institute, Kensington, Maryland. They have
assembled an excellent international and multidisciplinary group of experts and guided them firmly to create this com-
prehensive book. We are very grateful to them and to all the contributors.
As always, it is a pleasure to thank Elsevier, our publisher – and in particular Michael Parkinson in Scotland,
and Mara Conner, Nikki Levy, and Kristi Anderson in San Diego – for their unfailing and expert assistance in the
development and production of this volume.
Michael J. Aminoff
François Boller
Dick F. Swaab
 Preface

Brain banks collect, store, and disseminate postmortem human brain tissue to facilitate research into the normal
function as well as disease etiology of the human central nervous system. Human brains have been essential to expose
the pathologic hallmarks of neurologic diseases such as Alzheimer and Parkinson diseases; postmortem brains from
patients with psychiatric diseases have been less studied. The human brain has recently become a major focus for
neuroscience research worldwide, as illustrated by the billion-euro European Union Human Brain Project (https://
www.humanbrainproject.eu/) and the 100-million-dollar BRAIN initiative to map the human brain (http://blog.
brainfacts.org/2013/04/barack-obama-neuroscientist-in-chief/#.VNswYfmG8mk). These initiatives highlight the
diverse scientific approaches necessary to link structure and chemicals to behavior and cognition.
Sophisticated scanning techniques identified alterations in size, activity, and connectivity in neurologic and
psychiatric brains, but these now need to be mapped at the cellular and molecular level. New powerful (epi-) genomic,
proteomic, and lipidomic expression techniques are now available to identify molecular changes related to brain dis-
eases. Abnormalities and potential therapeutic targets identified in animal models of neurologic and psychiatric
disorders as well as targets identified by genomewide association studies all need to be validated in human brain tissue.
These approaches require substantial numbers of well-characterized, high-quality human brains from patients with
neurologic and psychiatric diseases as well as unaffected control brains. It will be the task of professional brain banks
that are well organized, financially sustainable, and readily accessible to the research community to provide such high-
quality samples. As more and more cutting-edge technologies are evolving and being adapted for postmortem brain
tissue, the demand for such tissue is expanding and leading to many initiatives worldwide to start or professionalize
brain banks.
Thus, we believe it is an important time to produce a volume of the Handbook of Clinical Neurology that focuses on
brain banking for both neurologic and psychiatric disorders. We were honored to be invited to edit the volume and to
have the opportunity, in turn, to invite our colleagues in the various specialties within brain banking to contribute their
expertise. The volume covers the full range of issues that are important to designing, implementing, and maintaining a
successful brain bank for neurologic and psychiatric disorders. Whether starting a new initiative to collect postmortem
brains or attempting to upgrade the protocols and management of an existing brain bank, readers will find valuable
information and guidance within these chapters.
The volume is divided into seven sections that provide overviews and discussion of all aspects of brain banking and
include both practical guides to implementing procedures specific to brain banks, such as the necessary IT infrastruc-
ture and means of obtaining financial sustainability, to scientific papers describing research conducted on postmortem
human brain samples. The first and second sections describe ways to organize programs to procure donors and provide
examples of brain bank networks that can maximize the number of donations. The third section outlines a number of
ethical and legal aspects as well as financial issues that need to be considered when establishing donor programs and
when establishing protocols for managing and distributing the tissue as an open resource to scientists. The fourth and
fifth sections describe the brain dissection, tissue-processing, and quality control protocols that must be considered and
standardized for the needs of each brain-banking initiative. The sixth section considers various aspects of how the clin-
ical donor data, the neuropathologic data, and the data derived from the research on each case are derived, stored, man-
aged, and distributed. The seventh and final section provides some beautiful examples of cutting-edge techniques that
have recently been applied to postmortem human brain tissue. These studies reveal the extent of the fascinating data that
can be derived from high-quality, well-characterized postmortem samples and provide much-needed insight into the
structure and function of the human brain.
We believe that readers will find this volume of the Handbook of Clinical Neurology to be a valuable contribution to
the existing literature by bringing together expertise on all aspects of organizing, managing, and implementing a brain
bank. We sincerely thank all the contributors for helping to bring this volume to fruition.
Ingeborg Huitinga
Maree J. Webster
This page intentionally left blank
 Contributors

I. Alafuzoff S. Berretta
Department of Immunology, Genetics and Pathology, Harvard Brain Tissue Resource Center and Translational
Uppsala University; Department of Clinical and Surgical Neuroscience Laboratory, McLean Hospital, Belmont;
Pathology, Uppsala University Hospital and Rudbeck and Department of Psychiatry and Program in
Laboratory, Uppsala, Sweden Neuroscience, Harvard Medical School, Boston, MA,
United States
D.G. Amaral
The MIND Institute, University of California at Davis, J.-P. Brion
Sacramento, CA, United States Laboratory of Histology, Neuroanatomy and
Neuropathology, ULB Neuroscience Institute,
M.P. Anderson Universit
e Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium
Department of Neurology and Pathology, Beth Israel
Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, S. Chance
Boston, MA, United States Nuffield Department of Clinical Neurosciences,
Academic Unit of Neuropathology, John Radcliffe
K. Ando Hospital, University of Oxford, Oxford,
Laboratory of Histology, Neuroanatomy and United Kingdom
Neuropathology, ULB Neuroscience Institute,
Universit
e Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium; and E.P. Cortes Ramirez
Laboratoire de Neuropathologie Escourolle, H^ opital de Taub Institute for Research on Alzheimer’s Disease and
la Piti
e-Salp^etrière, Paris, France the Aging Brain, Columbia University Medical Center
and New York Brain Bank, Children’s Hospital,
O. Ansorge New York, NY, United States
Nuffield Department of Clinical Neurosciences,
Academic Unit of Neuropathology, John Radcliffe G.M. de Lange
Hospital, University of Oxford, Oxford, Brain Center Rudolf Magnus, Utrecht, The Netherlands
United Kingdom
C. Duyckaerts
R.J. Baldessarini Laboratoire de Neuropathologie Escourolle, H^opital de
Department of Psychiatry, Harvard Medical School, la Piti
e-Salp^etrière, Paris, France
Boston and International Consortium for Psychotic and
Bipolar Disorders Research, McLean Hospital, Belmont, I. Ferrer
MA, United States Pathologic Anatomy Service, Institute of
Neuropathology, Bellvitge University Hospital;
A.-M. Bao Department of Pathology and Experimental
Department of Neurobiology, Key Laboratory of Medical Therapeutics, Faculty of Medicine, University of
Neurobiology of Ministry of Health of China; Zhejiang Barcelona; and Network Center of Biomedical Research
Province Key Laboratory of Neurobiology, Zhejiang on Neurodegenerative Diseases, Institute Carlos III;
University School of Medicine, Hangzhou, China Hospitalet de Llobregat, Llobregat, Spain
xii CONTRIBUTORS
M. Freund C.E. Keller
National Institute of Mental Health, Rockville, MD, Department of Pathology, Henry Ford Hospital, Detroit,
United States MI, United States

J.J.G. Geurts S. Kim

Department of Anatomy and Neurosciences, Stanley Medical Research Institute, Laboratory of Brain
VU Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Research, Rockville, MD, United States

J.R. Glausier N.M. Klioueva

Translational Neuroscience Program, Department of Netherlands Brain Bank, Netherlands Institute for
Psychiatry, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, Neuroscience, Royal Netherlands Academy of Arts and
United States Sciences, Amsterdam, The Netherlands

E. Gr€ unblatt M.S. Kobor

Department of Child and Adolescent Psychiatry and Department of Medical Genetics and Human
Psychotherapy, University Hospital of Psychiatry Early Learning Partnership, University of British
Zurich, Neuroscience Center Zurich and Zurich Center Columbia; Centre for Molecular Medicine and
for Integrative Human Physiology, University of Zurich, Therapeutics, BC Children’s Hospital, Vancouver, BC;
Switzerland and Center for Mental Health, Department Canadian Institute for Advanced Research,
of Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy, Toronto, Ontario, Canada
University Hospital Würzburg, Würzburg, Germany
I. Kramvis
C. Hare Department of Integrative Neurophysiology, Center for
Autism BrainNet, Foundation Associates, New York, Neurogenomics and Cognitive Research, VU University
NY, United States Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands
J. Hedreen Q. Laborde
Harvard Brain Tissue Resource Center, McLean Laboratoire de Neuropathologie Escourolle, H^opital de
Hospital, Belmont, MA, United States la Piti
e-Salp^etrière, Paris, France
P.R. Hof D.A. Lewis
Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine Translational Neuroscience Program, Department of
at Mount Sinai, New York, NY, United States Psychiatry, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA,
United States
I. Huitinga
Netherlands Brain Bank, Netherlands Institute for E. Liebson
Neuroscience, Royal Netherlands Academy of Arts and Department of Psychiatry, Harvard Medical School,
Sciences, Amsterdam, The Netherlands Boston and Psychotic Disorders Division, McLean
Hospital, Belmont, MA, United States
T.M. Hyde
Lieber Institute for Brain Development; Department of A.R. Little
Psychiatry and Behavioral Sciences and Department of National Institute on Drug Abuse, Rockville, MD,
Neurology, Johns Hopkins University School of United States
Medicine, Baltimore, MD, United States
A.A. Lussier
S.A. Islam Department of Medical Genetics, University of British
Department of Medical Genetics, University of British Columbia, and Centre for Molecular Medicine and
Columbia, and Centre for Molecular Medicine and Therapeutics, BC Children’s Hospital, Vancouver, BC,
Therapeutics, BC Children’s Hospital, Vancouver, BC, Canada
Canada
H.D. Mansvelder
L.E. Jonkman
Department of Integrative Neurophysiology, Center for
Department of Anatomy and Neurosciences, VU Neurogenomics and Cognitive Research, VU University
Medical Center, Amsterdam, The Netherlands
Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands
 CONTRIBUTORS xiii
D.C. Mash J. Pickett
University of Miami Miller School of Medicine Brain Autism BrainNet, Foundation Associates, New York,
Endowment Bank, Miami, FL, United States NY, United States

R.M. Meredith T.D. Purves-Tyson

Department of Integrative Neurophysiology, Center for School of Psychiatry, Faculty of Medicine, University of
Neurogenomics and Cognitive Research, VU University New South Wales and Schizophrenia Research Laboratory,
Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands Neuroscience Research Australia, Sydney, Australia

M.I. Mighdoll M.C. Rademaker

Lieber Institute for Brain Development, Johns Hopkins The Netherlands Brain Bank, Netherlands Institute for
University School of Medicine, Baltimore, MD, Neuroscience, Royal Netherlands Academy of Arts and
United States Sciences, Amsterdam, The Netherlands

T. Millar S.H.M. Rademaker

Academic Neuropathology, Centre for Clinical Brain Netherlands Brain Bank, Netherlands Institute for
Sciences, Edinburgh, United Kingdom Neuroscience, Royal Netherlands Academy of Arts and
Sciences, Amsterdam, The Netherlands
M. Miller
The MIND Institute, University of California at Davis, P. Riederer
Sacramento, CA, United States Center for Mental Health, Department of Psychiatry,
Psychosomatics and Psychotherapy, University Hospital
M.R. Mizee
W€urzburg, W€urzburg, Germany
Neuroimmunology Research Group and Psychiatric
Program, Netherlands Brain Bank, Netherlands D.A. Rothmond
Institute for Neuroscience, Amsterdam, Schizophrenia Research Laboratory, Neuroscience
The Netherlands Research Australia, Sydney, Australia
C.-M. Monoranu
P. Schmitz
Department of Neuropathology, Institute of Pathology,
Center for Neuropathology and Prion Research, Ludwig
University of W€
urzburg, Germany
Maximillians University, Munich, Germany
I. Nagakura
The MIND Institute, University of California at Davis, C. Schumann
Sacramento, CA, United States The MIND Institute, University of California at Davis,
Sacramento, CA, United States
C. Ng
National Institute of Mental Health, Rockville, MD, J. Sian-H€ulsmann
United States Department of Medical Physiology, University of
Nairobi, Kenya
S.J.M.C. Palmen
Brain Center Rudolf Magnus, Utrecht, The Netherlands C. Smith
Academic Neuropathology, Centre for Clinical Brain
N. Palomero-Gallagher Sciences, Edinburgh, United Kingdom
Institute of Neuroscience and Medicine (INM-1),
Research Centre J€ulich, J€
ulich; Department of K.-C. Sonntag
Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical Laboratory for Translational Research on
Faculty, RWTH, Aachen, Germany Neurodegeneration, Belmont and Department of
Psychiatry, Harvard Medical School, Boston, MA,
H. Pantazopoulos
United States
Translational Neuroscience Laboratory,
McLean Hospital, Belmont and Department of K. Sullivan
Psychiatry, Harvard Medical School, Boston, MA, Harvard Brain Tissue Resource Center, McLean
United States Hospital, Belmont, MA, United States
xiv CONTRIBUTORS
D.F. Swaab M.J. Webster
Department of Neurobiology, Key Laboratory of Stanley Medical Research Institute, Laboratory of Brain
Medical Neurobiology of Ministry of Health of China; Research, Rockville, MD, United States
Zhejiang Province Key Laboratory of Neurobiology,
Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou, C.S. Weickert
China and Netherlands Institute for Neuroscience, and School of Psychiatry, Faculty of Medicine, University of
Institute of the Royal Netherlands Academy of Arts and New South Wales and Schizophrenia Research
Sciences, Amsterdam, The Netherlands Laboratory, Neuroscience Research Australia, Sydney,
Australia
C. Tamminga
Department of Psychiatry, UT Southwestern, Dallas, TX, T.-U.W. Woo
United States Harvard Brain Tissue Resource Center and Laboratory of
Cellular Neuropathology, McLean Hospital, Belmont;
A. Taylor Department of Psychiatry, Harvard Medical School,
National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Boston, MA, United States
Rockville, MD, United States
H.R. Zielke
M. van der Poel University of Maryland Brain and Tissue Bank,
Neuroimmunology Research Group, Netherlands Baltimore, MD, United States
Institute for Neuroscience, Amsterdam, The Netherlands
K. Zilles
J.P. Vonsattel Institute of Neuroscience and Medicine (INM-1),
Taub Institute for Research on Alzheimer’s Disease and Research Centre J€ulich and JARA-BRAIN, J€ulich-
the Aging Brain and Department of Pathology and Cell Aachen Research Alliance, J€ulich; Department of
Biology, Columbia University Medical Center; and Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical
New York Brain Bank, Children’s Hospital, New York, Faculty, RWTH, Aachen, Germany
NY, United States
 Contents
Foreword vii
Preface ix
Contributors xi

SECTION I Brain donor recruitment strategies

1. The Netherlands Brain Bank for Psychiatry

M.C. Rademaker, G.M. de Lange, and S.J.M.C. Palmen (Amsterdam and Utrecht, The Netherlands) 3

2. Brain donation procedures in the Sudden Death Brain Bank in Edinburgh

C. Smith and T. Millar (Edinburgh, United Kingdom) 17

SECTION II Brain bank networks

3. Autism BrainNet: a network of postmortem brain banks established to facilitate autism research
D.G. Amaral, M.P. Anderson, O. Ansorge, S. Chance, C. Hare, P.R. Hof, M. Miller,
I. Nagakura, J. Pickett, C. Schumann, and C. Tamminga (Sacramento, Boston, New York and Dallas,
United States, and Oxford, United Kingdom) 31

4. The NIH NeuroBioBank: creating opportunities for human brain research

M. Freund, A. Taylor, C. Ng, and A.R. Little (Rockville, United States) 41

SECTION III Ethical aspects of brain banking and management of brain banks

5. Design of a European code of conduct for brain banking

N.M. Klioueva, M.C. Rademaker, and I. Huitinga (Amsterdam, The Netherlands) 51

6. A review of brain biorepository management and operations

H.R. Zielke and D.C. Mash (Baltimore and Miami, United States) 83

7. A new viewpoint: running a nonprofit brain bank as a business

S.H.M. Rademaker and I. Huitinga (Amsterdam, The Netherlands) 93

SECTION IV Brain dissection, tissue processing, and tissue dissemination

8. The New York Brain Bank of Columbia University: practical highlights of 35 years of experience
E.P. Cortes Ramirez, C.E. Keller, and J.P. Vonsattel (New York and Detroit, United States) 105

9. Neurochemical markers as potential indicators of postmortem tissue quality

J. Sian-H€
ulsmann, C.-M. Monoranu, E. Gr€
unblatt, and P. Riederer (Nairobi, Kenya, W€
urzburg, Germany,
and Zurich, Switzerland) 119

SECTION V Neuropathologic diagnosis

10. Minimal neuropathologic diagnosis for brain banking in the normal middle-aged and aged brain
and in neurodegenerative disorders
I. Alafuzoff (Uppsala, Sweden) 131
xvi CONTENTS
11. Brain donation at autopsy: clinical characterization and toxicologic analyses
M.I. Mighdoll and T.M. Hyde (Baltimore, United States) 143

SECTION VI Brain donor data: clinical, genetic, radiologic, and research data storage and mining

12. Information technology for brain banking

P. Schmitz (Munich, Germany) 157

13. Collecting, storing, and mining research data in a brain bank

M.J. Webster and S. Kim (Rockville, United States) 167

14. What can we learn about brain donors? Use of clinical information in human
postmortem brain research
K. Sullivan, H. Pantazopoulos, E. Liebson, T.-U.W. Woo, R.J. Baldessarini, J. Hedreen, and S. Berretta
(Belmont and Boston, United States) 181

15. The art of matching brain tissue from patients and controls for postmortem research
A.-M. Bao and D.F. Swaab (Hangzhou, China and Amsterdam, The Netherlands) 197

SECTION VII Human brain tissue analyses: old and new techniques

16. Considerations for optimal use of postmortem human brains for molecular psychiatry: lessons
from schizophrenia
C.S. Weickert, D.A. Rothmond, and T.D. Purves-Tyson (Sydney, Australia) 221

17. Epigenetic analysis of human postmortem brain tissue

S.A. Islam, A.A. Lussier, and M.S. Kobor (Vancouver and Toronto, Canada) 237

18. Laser microdissection and gene expression profiling in the human postmortem brain
K.-C. Sonntag and T.-U.W. Woo (Belmont and Boston, United States) 263

19. Purification of cells from fresh human brain tissue: primary human glial cells
M.R. Mizee, M. van der Poel, and I. Huitinga (Amsterdam, The Netherlands) 273

20. Proteomics and lipidomics in the human brain

I. Ferrer (Hospitalet de Llobregat, Spain) 285

21. 3D imaging in the postmortem human brain with CLARITY and CUBIC
K. Ando, Q. Laborde, J.-P. Brion, and C. Duyckaerts (Brussels, Belgium and Paris, France) 303

22. Neuronal life after death: electrophysiologic recordings from neurons in adult human brain tissue
obtained through surgical resection or postmortem
I. Kramvis, H.D. Mansvelder, and R.M. Meredith (Amsterdam, The Netherlands) 319

23. Postmortem magnetic resonance imaging

L.E. Jonkman and J.J.G. Geurts (Amsterdam, The Netherlands) 335

24. Cyto- and receptor architectonic mapping of the human brain

N. Palomero-Gallagher and K. Zilles (J€
ulich and Aachen, Germany) 355

25. Mapping pathologic circuitry in schizophrenia

J.R. Glausier and D.A. Lewis (Pittsburgh, United States) 389

Index 419
 Section I

Brain donor recruitment strategies

This page intentionally left blank
Handbook of Clinical Neurology, Vol. 150 (3rd series)
Brain Banking
I. Huitinga and M.J. Webster, Editors
https://doi.org/10.1016/B978-0-444-63639-3.00001-3
Copyright © 2018 Elsevier B.V. All rights reserved

Chapter 1

The Netherlands Brain Bank for Psychiatry

MARLEEN C. RADEMAKER1*, GEERTJE M. DE LANGE2, AND SASKIA J.M.C. PALMEN2
1
The Netherlands Brain Bank, Netherlands Institute for Neuroscience, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences,
Amsterdam, The Netherlands
2
Brain Center Rudolf Magnus, Utrecht, The Netherlands

Abstract
The Netherlands Brain Bank (NBB) performs rapid autopsies of donors who gave written informed
consent during life for the use of their brain tissue and medical files for research. The NBB initiated
the Netherlands Brain Bank for Psychiatry (NBB-Psy), a prospective donor program for psychiatric
diseases. NBB-Psy wants to expand the tissue collections in order to provide a strong incentive to increase
research in psychiatry. The ultimate goal of NBB-Psy is to reduce the burden of psychiatric disorders for
patients, their families, and for society as a whole. NBB-Psy consists of an antemortem and postmortem
donor program. This chapter focuses on the design of NBB-Psy and the antemortem donor program, where
patients and relatives are actively informed on the possibility to become a brain donor. Since the initiation
of NBB-Psy, the number of registered donors with a psychiatric diagnosis has increased from 149 in 2010
to 1018 in May 2016.

INTRODUCTION
disorders was 5.7 billion euros (www.nationaalkompas.nl/
Psychiatric disorders are prevalent and contribute signif- zorg/huidige-kosten/#kostennaarsector). In order to lower
icantly to disease and economic burden worldwide. The morbidity and the economic burden, there is an urgent need
World Health Organization reported an estimated life- for improved treatment strategies which requires a better
time prevalence of any Diagnostic and Statistical understanding of the underlying etiology and pathophy-
Manual of Mental Disorders, fourth edition (DSM-IV: siology of psychiatric disorders.
American Psychiatric Association, 1994) disorder rang- In the past decades, brain imaging, genetic, and ani-
ing from 12% in Nigeria to 47.4% in the United States mal studies have improved our understanding of psychi-
(Kessler et al., 2007). In the Netherlands, the lifetime atric disorders. For example, imaging studies have
prevalence of axis I DSM-IV disorders is 42.7% identified alterations in volume, connectivity, and activ-
(de Graaf et al., 2011). ity of certain brain areas in psychiatric disorders. How-
Disorders of the brain are the largest contributor to the ever, these methods cannot elucidate the molecular and
morbidity burden as measured by disability-adjusted cellular changes that may occur in the human brain.
life-years in the European Union (38.2%) (Wittchen et al., While genetic studies using peripheral blood are able
2011). These disorders are also very costly. In 2010 the to uncover genes that are associated with psychiatric
European economic burden was estimated to be 798 billion disorders, this genetic blueprint does not necessarily
euros, of which 302.4 billion euros were spent on psychi- reflect the gene expression or functional changes in the
atric disorders (Olesen et al., 2011). In the Netherlands brain (Lewis, 2002; Seifuddin et al., 2013). Rodent
alone the total healthcare costs for 2011 were almost models of psychiatric disorders, although helpful in
90 billion euros, of which the total cost for psychiatric modeling psychiatric symptoms such as anxiety, have

*Correspondence to: Marleen C. Rademaker, Department of Psychiatry, University Medical Center, Utrecht, The Netherlands.
E-mail: [email protected]
4 M.C. RADEMAKER ET AL.
limited validity when modeling symptoms such as hallu-
cinations and suicidal thoughts that cannot be simulated
in animal models (Nestler and Hyman, 2010). Therefore,
postmortem research of the human brain is a crucial
additional strategy to advance our understanding of
the mechanisms underlying psychiatric disorders. Post-
mortem research of psychiatric disorders can contribute
to new ways of conceptualizing these disorders, for exam-
ple, by investigating whether symptoms shared by differ-
ent psychiatric disorders, such as withdrawal behaviour in
autism, schizophrenia, and depression, have the same neu-
ropathologic underpinnings. Furthermore, postmortem
research on fresh glial cells, obtained immediately after
brain dissection, can be used to study the impact of envi-
ronmental risk factors in vitro, and may point towards new
pathways of interventions. Postmortem studies may also
facilitate the development and validation of peripheral
markers that may reveal the molecular and cellular under-
pinnings of psychiatric disorders.
Unfortunately, there are only a limited number of
international brain banks that collect postmortem psychi-
atric brains for research purposes (Deep-Soboslay et al., Fig. 1.1. Total number of brain autopsies (1985–2015). AD,
Alzheimer disease; CO, control; FTLD/Tau, frontotemporal
2011). Therefore, the Netherlands Brain Bank (NBB) of
dementia/Tau; MS, multiple sclerosis; Other dem, other
the Netherlands Institute for Neuroscience, in collabora-
dementia; PD, Parkinson disease and related disorders; PSP,
tion with five university medical centers, initiated the progressive supranuclear palsy; Psych, psychiatric disorders;
Netherlands Brain Bank for Psychiatry (NBB-Psy) as Other, other diagnoses; PA not ready, neuropathologic report
part of the NBB. This 5-year program, that started in is not ready yet.
September 2012, oversees a prospective donor program
for psychiatric brain diseases to expand the tissue collec- with multiple sclerosis, and 1260 controls without brain
tion for the purpose of stimulating research in psychiatric diseases. The NBB has also provided tissue from approx-
disorders. With NBB-Psy, we aimed to stimulate post- imately 1200 other diseases, including brain tissue from
mortem psychiatric research by increasing the amount 119 psychiatric cases (depression, bipolar disorder,
of excellent-quality psychiatric human brain tissue and schizophrenia) to 700 research projects all over the
that is available for research. Initially our target was to world (data April 2016). This has resulted in more than
perform 500 brain autopsies of seven psychiatric brain 1700 scientific papers (www.brainbank.nl/research/
disorders in 10 years. The ultimate goal is to reduce publications/). The NBB has more than 3800 registered
the burden of psychiatric disorders for patients, their living donors (Fig. 1.2). Eighty-five percent of the regis-
families, and for society as a whole. tered donors with a psychiatric disorder registered them-
selves as brain donor in the last 2.5 years, after the
The Netherlands Brain Bank initiation of NBB-Psy.

The NBB was officially established in 1985 as a depart-

The initiation of NBB-Psy
ment within the Netherlands Institute for Neuroscience,
one of the institutes of the Royal Netherlands Academy In 2010, 25 years after the initiation of the NBB, only 113
of Arts and Sciences in Amsterdam. The NBB registers (3%) of the brain autopsies were from patients with a psy-
donors with a wide range of brain diseases as well as con- chiatric disorder. At this time the number of requests for
trol subjects. The NBB has performed more than 4000 psychiatric brain tissue at NBB exceeded the available
autopsies since its start in 1985 (Fig. 1.1). The NBB brain tissue inventory. Consequently, in 2011, the initia-
has a worldwide reputation as an excellent brain bank, tive to create NBB-Psy and expand the existing psychi-
performing rapid autopsies of donors who gave written atric brain tissue collections in order to stimulate research
informed consent during life for the use of their brain tis- on psychiatric disorders was drafted.
sue and medical files for research. To date, the NBB has The NBB, which is located in the small country of the
provided researchers with brain tissue from 1000 patients Netherlands, was perfectly suited for this initiative for a
with Alzheimer disease, 285 with Parkinson disease, 240 number of reasons. The relatively compact geographic
 THE NETHERLANDS BRAIN BANK FOR PSYCHIATRY 5
large, well-phenotyped Dutch psychiatric research
cohorts: the participants of these cohorts have been
extensively phenotyped, and consequently are very valu-
able potential brain donors. In consultation with the prin-
cipal investigators (PIs) of these cohorts, the NBB is
allowed to individually approach all cohort participants.

THE NBB-PSY PROGRAM

The NBB-Psy program consists of three parts. The ante-
mortem donor program performs and oversees the donor
recruitment activities, donor registration, and phenotyp-
ing. The postmortem tissue program performs the brain
autopsy, characterization, cell isolation (microglia, astro-
cytes, and the generation of induced pluripotent stem
cells (iPSCs)) and tissue storage. Finally, there is tissue
dissemination to the (inter)national research community.

Organization of the NBB-Psy program

The NBB-Psy program is embedded in the NBB
(Fig. 1.3). The NBB-Psy project is a multicenter collabo-
Fig. 1.2. Total number of registered donors on May 10, 2016.
ration with the University Medical Center Utrecht, Aca-
AD, Alzheimer disease; CO, control; FTLD/Tau, frontotem-
demic Medical Center Amsterdam, Free University
poral dementia/Tau; MS, multiple sclerosis; Other dem, other
dementia; PD, Parkinson disease and related disorders; PSP, Medical Center Amsterdam (VUmc), Radboud Medical
progressive supranuclear palsy; Psych, psychiatric disorders; Center Nijmegen, and Erasmus Medical Center Rotter-
Other, other diagnoses. dam. Before NBB-Psy officially began, all participating
parties signed a consortium agreement. The organization
is divided into several parts. The NBB-Psy management
area means a short postmortem interval. A short postmor- team is responsible for the day-to-day progress of the pro-
tem interval is essential for various analyses, including gram. A steering committee composed of one cohort PI/
transcriptomics, proteomics, and the isolation of viable employee per participating organization and one delegate
cells (Atz et al., 2007; Schmitt et al., 2007). The average representing the patient associations was established to
postmortem interval of brain banks that collect postmor- help guide the strategy of the project. For advice in strate-
tem psychiatric brains for research purposes is 12–34 gic decisions, the steering committee and/or management
hours (Deep-Soboslay et al., 2011), while the average team can consult an international advisory board. The clin-
postmortem interval of the NBB is 6.5 hours (de Jager ical cohort coordinators are mostly PIs of the participating
et al., 2015). The short postmortem interval and the cohorts, and, together with the clinical coordinator, are
immediate dissection protocols are the primary reasons responsible for the individual approach of cohort partici-
why researchers from outside the Netherlands apply pants performed by the research assistants (RAs).
for brain tissue at the NBB. The NBB can collect fresh According to Dutch law, informing people about the
brain tissue: the dissection protocol of the NBB enables possibility of becoming a brain donor, and all consecu-
researchers to obtain large pieces of fresh material. Fresh tive aspects in case a person decides to register, does
brain tissue can be used for the isolation of central ner- not fall under the scope of the Medical Research Involv-
vous system cells like microglia and astrocytes and ing Human Subjects Act and thus does not have to be
allows researchers to perform cell and tissue culture with reviewed by an accredited ethics committee. Neverthe-
these cells. This is becoming more essential as increasing less, in 2009 NBB asked the medical ethics committee
evidence is accumulating to suggest immune involve- of the VUmc to review all procedures and documentation
ment in psychiatric disorders (Patterson, 2009; Steiner of the NBB and all were approved. NBB-Psy also had
et al., 2011). The NBB can access extensive clinical both the medical ethics committee of the VUmc and that
information on each donor: the NBB collects extensive, of Karakter, a child and adolescent mental health organi-
standardized, antemortem clinical information of each zation, review any additional procedures, including the
donor. An English, anonymized, summary is made avail- protocol used to approach potential donors and the inclu-
able for researchers, which is vital for the interpretation sion of additional medical questionnaires. Both commit-
of research findings. The NBB collaborates with various tees approved our additional procedures.
6 M.C. RADEMAKER ET AL.

Fig. 1.3. The organization of Netherlands Brain Bank (NBB) for Psychiatry. KNAW, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences;
e-NBB, electronic Netherlands Brain Bank; IT, information technology; MC, medical center; iPSC, induced pluripotent stem cell.

The antemortem program a brain donor from registering. Second, a co-signature

ensures that people close to the prospective brain
The NBB-Psy antemortem donor program recruits
donor are informed about the registration, which sig-
potential donors from three different programs: estab-
nificantly increases the chance that they will contact
lished psychiatric research cohorts, patient and family
the NBB when the brain donor dies.
associations, and long-stay clinics. NBB-Psy also
5. Eligibility: in determining which brain disorders
recruits through general public relations activities in
qualify for registration, the NBB takes into account
the community (Fig. 1.4).
the current availability of brain samples per disorder,
the number of registered donors per disorder, and the
GENERAL CONDITIONS FOR BRAIN DONOR number of tissue requests from the scientific com-
REGISTRATION munity. People without a neurologic or psychiatric
There are several conditions that must be met when reg- brain disorder, so-called “nondemented controls,”
istering as a brain donor: are always welcome to register as brain donors.

1. Minimum age: to prospectively register as a brain

donor a person must be 18 years of age or older. SEVEN PSYCHIATRIC DISORDERS
The NBB does not allow minors to sign up prospec-
The NBB-Psy program includes seven psychiatric disor-
tively, but brain donation under the age of 18 years
ders that are selected with the following inclusion criteria:
is allowed by means of postmortem parental
authorization. 1. The psychiatric disorder is represented in a Dutch
2. Competence: prospective donors must be competent. research cohort.
3. Residence: prospective donors must reside in the 2. It is feasible to recruit a substantial number of
Netherlands. additional donors through patient associations, clin-
4. Co-signing of the informed consent: although Dutch ical expertise centers, and long-stay psychiatric
law does not require permission of the next of kin, departments.
the NBB requires the co-signature of a next of kin 3. There is interest from the (inter)national scientific
for two reasons. First, to prevent someone who is (tem- research groups in postmortem research in this par-
porarily) incompetent making the decision to become ticular disorder.
 THE NETHERLANDS BRAIN BANK FOR PSYCHIATRY 7

Fig. 1.4. Schematic overview of the components of Netherlands Brain Bank (NBB) for Psychiatry. DSM, Diagnostic and Statis-
tical Manual; MINI-Plus, Mini-International Neuropsychiatric Interview-Plus; eNBB, electronic Netherlands Brain Bank.

Based on these criteria the NBB-Psy selected schizophre- but signed up with one of the seven NBB-Psy disorders,
nia and other psychotic-related diagnoses, bipolar disor- the NBB asked permission to verify their diagnosis
der, major depressive disorder, obsessive-compulsive by requesting the general practitioner to send the most
disorder and body dysmorphic disorder, posttraumatic recent DSM classification from the treating psychiatrist.
stress disorder (PTSD), autism spectrum disorder (ASD), Also, the RA invited every noncohort psychiatric donor
and attention-deficit hyperactivity disorder (ADHD) to to cooperate with a short psychiatric interview, the Mini-
recruit. International Neuropsychiatric Interview (MINI: section
Phenotyping of noncohort NBB-Psy donors, below).
INCLUSION AND EXCLUSION CRITERIA FOR DONOR The RA invited every noncohort control subject to also
REGISTRATION INNBB-PSY participate in the MINI interview (see below), to confirm
the absence of psychopathology. Figure 1.5 shows a flow-
All participants in the psychiatric cohort studies that col-
chart of the NBB’s donor registration process.
laborate with NBB-Psy were eligible to sign up as a
brain donor, including patients, healthy relatives, and
PUBLIC AWARENESS
control subjects. Since cohort participants were already
extensively phenotyped, the cohort participants who Organ donation and body donation for education and
signed up as prospective brain donors were accepted research purposes are regular forms of donation in the
without further verification of their psychiatric classifi- Netherlands. In contrast, brain donation for scientific
cation, or, in case of a healthy subject, the absence of a research is still largely unknown to the majority of the
classification. When people were not in a clinical cohort Dutch population. Over 90 percent of the people
8 M.C. RADEMAKER ET AL.

Fig. 1.5. Flowchart donor registrations for Netherlands Brain Bank (NBB) for Psychiatry. DSM, Diagnostic and Statistical
Manual; MINI +, Mini-International Neuropsychiatric Interview-Plus.

approached by NBB-Psy were not aware of the existence We Need Brains (www.wehebbenhersensnodig.nl),
of the NBB. In our experience, priming the public by the Dutch population was petitioned to consider
repeatedly presenting information on brain donation is registering as brain donors. The campaign raised media
crucial for creating public awareness on the possibility attention on television, radio, and in (online) written
of brain donation. The NBB-Psy increased awareness press. Within the first month of the campaign week,
in a number of ways: almost 1000 people contacted the NBB willing to
consider brain donation.
1. The NBB-Psy program has a website, www.nhb-
psy.nl, with extensive information on the necessity
of psychiatric brains for research but also practical DONOR RECRUITMENT
information on how to become a brain donor. The
PSYCHIATRIC RESEARCH COHORTS
site also includes a page of frequently asked ques-
tions (FAQs) and informational animations. The Netherlands is well known for its large psychiatric
2. NBB-Psy obtained national publicity through news- research cohorts (Table 1.1). One of the main donor
paper articles, and through interviews on national recruitment activities of NBB-Psy was to inform all par-
radio and television. An overview of the articles ticipants individually in these cohorts about the possibil-
and links to radio programs can be found on the ity of becoming a brain donor for scientific research.
website. Table 1.1 shows an overview of the participating cohorts.
3. The NBB-Psy developed informational films, which In these cohorts, patients, as well as family members and
are promoted at every possible occasion, and which control subjects, were extensively phenotyped and often
can be viewed on the NBB YouTube channel as well monitored for several years. Depending on the cohort,
as on the website. information from various tests and interviews, including
4. NBB-Psy used social media, with an active Twitter the Structured Clinical Interview for DSM-IV (SCID),
(@NHBPsy) and Facebook account. Composite International Diagnostic Interview, Inven-
5. A well-known Dutch author, Myrthe van der Meer, tory of Depressive Symptoms, Borderline Personality
diagnosed with bipolar disorder and Asperger syn- Questionnaire, Beck Anxiety Inventory, Mood and
drome, became a brain donor and an active ambas- Anxiety Symptom Questionnaire, Positive and Negative
sador for NBB-Psy. Syndrome Scale, Yale-Brown Obsessive Compulsive
6. NBB-Psy launched a national campaign on the impor- Scale, Autism Diagnostic Interview – Revised, and
tance of brain donation for research on psychiatric Autism Diagnostic Observation Schedule were avail-
disorders in March 2016. With radio commercials, able. In addition, data from structural and/or functional
(digital) posters at train stations and a special website, magnetic resonance imaging (fMRI), single-photon
Another random document with
no related content on Scribd:
 Mutta Linnart Björnsson ehdotti sen sijaan, että hän saattaisi Klara
Gullaa vähän matkaa. Hän oli monta kertaa aikonut tulla laiturille
häntä tapaamaan, eikä hän nyt tahtonut päästää hyvää tilaisuutta
käsistään. Oli hyvinkin tärkeätä, arveli hän, että Klara Gulla saisi
kuulla, mitä sanottavaa hänellä oli.

Klara Gulla ei estellyt sen enempää. Mutta hän huomasi, että

miehen oli vaikea tuoda esille asiaansa, ja siksipä hän ei odottanut
mitään hyvää. Mies yskäsi useampaan kertaan ja etsi sanoja.

»Klara Gulla ei taida tietää, että minä olin viimeinen, joka puhui
Klara Gullan isän, keisarin kanssa, niinkuin meillä oli tapana häntä
nimittää.»

Klara Gulla vastasi, ettei hän sitä ollut kuullut. Ja samalla hän
kiirehti askeleitaan. Hän olisi kernaasti tahtonut niin pian kuin suinkin
päästä tästä keskustelusta eroon.

»Minä seisoin pihalla eräänä päivänä syksyllä ja valjastin hevosta,

sillä aioin lähteä kauppiaaseen», jatkoi Linnart Björnsson, »kun näin
keisarin tulevan juoksujalkaa tietä pitkin. Hänellä oli hyvin kiire, sen
saatoin arvata, mutta hän pysähtyi sittenkin huomatessaan minut, ja
kysyi, olinko nähnyt keisarinnan ajavan tästä ohi. Sitähän minun oli
mahdoton kieltää, ja silloin kyyneleet alkoivat valua hänen
silmistään. Hän oli ollut menossa Bron pitäjään, sanoi hän, mutta
äkkiä hän oli tuntenut niin suurta levottomuutta, että hänen oli
täytynyt kääntyä takaisin. Ja kun hän oli tullut kotiin, oli tupa ollut
tyhjänä. Katrinakin oli poissa. He aikoivat varmaan matkustaa
laivassa, eikä hän tiennyt miten hän pääsisi Borgin laiturille ennen
laivan lähtöä.»
 Klara Gulla pysähtyi. »Hän sai kai ajaa teidän mukananne», sanoi
hän. — »Niin», vastasi isäntä. »Janne oli tehnyt minulle kerran
suuren palveluksen, ja nyt minä tahdoin palkita sen hänelle. Ehkäpä
tein pahasti auttaessani häntä?» — »Ei, syy on kokonaan minun»,
sanoi Klara Gulla. »Minun ei olisi koskaan pitänyt pyrkiä pois hänen
luotaan.»

»Hän itki kaiken matkaa kuin pieni lapsi», sanoi Linnart Björnsson,
»enkä minä tiennyt oikein miten lohduttaa häntä, ja siksi pysyttelin
ääneti. 'Kyllä me ennätämme ajoissa, Janne', sanoin minä vihdoin.
'Älä itke noin kovasti. Nuo pikku laivat, jotka syksyisin kulkevat, eivät
ole kovin nopeakulkuisia'. Mutta tuskin olin sen sanonut, kun hän
tarttui käsivarteeni kiinni ja kysyi luulinko minä, että ne, jotka olivat
ryöstäneet keisarinnan, kohtelisivat häntä pahasti.»

»Ne, jotka olivat ryöstäneet minut!» toisti Klara Gulla ihmeissään.

»Minäkin hämmästyin, aivan kuin Klara Gulla nyt, ja kysyin, keitä

hän tarkoitti. Niin, hän tarkoitti niitä, jotka olivat väijyneet keisarinnaa
koko ajan hänen ollessaan täällä. Kaikki ne viholliset, joita Klara
Gulla oli pelännyt niin kovasti, ettei hän ollut uskaltanut panna
päähänsä kultakruunua eikä edes sanallakaan mainita Portugalliaa,
kaikki ne, jotka nyt olivat hyökänneet Klara Gullan kimppuun ja
vieneet hänet vankeuteen.»

»Vai niin, silläkö tavalla», sanoi Klara Gulla.

»Juuri niin, Klara Gulla», sanoi Linnart Björnsson painokkaasti.

»Klara Gulla kai ymmärtää, ettei Janne itkenyt sen vuoksi, että hänet
oli hyljätty ja jätetty yksin, vaan siksi, että hän luuli Klara Gullan
joutuneen vaaraan.»
 Linnart Björnssonin oli ollut vaikea saada viimeisiä sanoja
suustaan. Ne olivat takertua hänen kurkkuunsa. Ehkäpä hän ajatteli
vanhaa Björn Hindrikssonia ja itseään. Juuri tämä hänen oma
kokemuksensa auttoi häntä ymmärtämään, miten suurta arvoa oli
pantava rakkauteen, joka ei koskaan pettänyt.

Mutta Klara Gulla ei ymmärtänyt sitä vieläkään. Hän oli ajatellut

isäänsä ainoastaan inhoten, aina siitä saakka kun hän oli tullut kotiin.
Hän mutisi itsekseen jotain sellaista, että isä oli hullu.

Linnart Björnsson kuuli mitä hän sanoi, ja se loukkasi häntä.

»Enpä tiedä, oliko Janne niinkään mieletön», sanoi hän. »Minä
sanoin hänelle, etten ollut nähnyt vanginvartijoita Klara Gullan
mukana. 'Eikö Linnart Björnsson todellakaan nähnyt', vastasi hän,
'miten ne vartioivat häntä, kun hän ajoi tästä ohi. Siinä oli Ylpeys ja
Kovuus, siinä oli Pahe ja Huvitus, kaikki ne, joita vastaan hänen
täytyy taistella keisarikunnassaan'.»

Klara Gulla pysähtyi ja kääntyi Linnartiin. »Entäs sitten?» sanoi

hän vain.

»Minä vastasin hänelle, että ne viholliset minäkin olin nähnyt,»

vastasi Linnart Björnsson tylysti.

Klara Gulla naurahti.

»Mutta minä kaduin heti sanojani», jatkoi isäntä.

»Sillä nyt Janne alkoi aivan epätoivoisesti itkeä. 'Rukoilkaa

Jumalaa, kiltti Linnart Björnsson', sanoi hän, 'että voisin pelastaa
pikku tyttöni kaikesta pahasta. Mitä minusta itsestäni vähä, kunhan
hän vain pelastuu'.»
 Klara Gulla astui rivakammin eteenpäin eikä vastannut mitään.
Jokin tunne alkoi repiä ja raastaa hänen sydäntänsä, mutta hän
pakotti sen vaikenemaan. Jos se, mikä piileksi sisällä, pääsisi
valloilleen, niin mitenkä hän silloin voisi sitä kestää.

»Nämä olivat siis ikäänkuin hänen jäähyväissanansa», sanoi

Linnart Björnsson. »Eikä kauan kestänytkään, ennenkuin hän sai
näyttää tarkoittaneensa totta. Klara Gullan ei pidä koskaan luulla,
että Janne hyppäsi järveen vapautuakseen omasta surustaan. Hän
teki sen vain pelastaakseen Klara Gullan vihollisten vallasta.»

Yhä nopeammin ja nopeammin Klara Gulla kiiruhti eteenpäin. Isän

rakkaus, joka oli kestänyt ensi hetkestä aina viimeiseen saakka,
alkoi käydä hänelle selväksi. Mutta hän tahtoi vain paeta pois.
Hänen oli mahdoton kantaa sitä.

»Me pidämme hiukan toisiamme silmällä tässä pitäjässä», jatkoi

Linnart Björnsson seuratessaan Klara Gullaa ilman vähintäkään
ponnistusta. »Mielet olivat hyvinkin Klara Gullaa vastaan heti
keisarin hukuttua. Enkä minä puolestani pitänyt Klara Gullaa sen
arvoisena, että olisin tahtonut ilmaista Klara Gullalle Jannen
viimeisiä ajatuksia ja sanoja. Mutta me olemme nyt muuttaneet
mielemme. Me olemme hyvillämme siitä, että Klara Gulla seisoo
laiturilla ja odottaa isäänsä.»

Klara Gulla pysähtyi. Hänen poskiansa punoitti ja silmät säihkyivät

vihaa.

»Minä seison siellä vain siksi, että pelkään häntä», sanoi hän.

»Klara Gulla ei ole koskaan tahtonut tehdä itseänsä paremmaksi

kuin hän on. Sen me tiedämme. Mutta ehkäpä me ymmärrämme
paremmin kuin hän itsekään, mitä tämän odotuksen alla piilee.
Meilläkin on ollut vanhemmat. Emmekä mekään ole kohdelleet heitä
oikealla tavalla.»

Klara Gulla oli niin suutuksissaan, että hän aikoi sanoa jotakin
hirveää, mutta siitä ei tullut mitään. Hän tahtoi polkea jalkaansa
Linnart Björnssonilie saadakseen hänet vaikenemaan, mutta hän ei
kyennyt siihenkään. Hänellä ei ollut siis muuta neuvoa kuin kääntyä
pois ja juosta tiehensä.

Linnart Björnsson ei seurannut hänen jäljessään. Hän oli sanonut,

mitä hän oli tahtonut saada sanotuksi, eikä hän ollut tyytymätön
aamupäivän työhönsä.
KATRINAN KUOLEMA.

Kun Klara Gulla astui Skrolyckan pieneen tupaan, makasi Katrina

vuoteessaan, kalman kalpeana ja silmät ummessa. Näyttipä siltä,
kuin loppu jo olisi lähestynyt.

Mutta niin pian kuin Klara Gulla seisoi hänen vieressään ja siveli
hänen kättään, katsoi hän eteensä ja alkoi heti puhua.

»Janne kutsuu minua luokseen», sai hän suurella vaivalla

sanotuksi.
»Hän ei kanna minulle kaunaa sen johdosta, että läksin hänen
luotaan.»

Klara Gulla säpsähti. Hän alkoi käsittää, miksi äiti kuoli. Hän, joka
oli ollut uskollinen kokonaisen elämän ajan, oli surrut aivan
kuollakseen sitä, että hän lopuksi oli pettänyt Jannen.

»Ei teidän sen vuoksi tarvitse olla levottomalla mielellä!» sanoi

Klara
Gulla. »Minähän teitä pakotin lähtemään.»

»Sitä on joka tapauksessa ollut niin vaikea ajatella», sanoi Katrina.

»Mutta nyt on taas kaikki hyvin meidän välillämme.»
 Katrina sulki jälleen silmänsä ja makasi aivan hiljaa. Vähäinen
onnen välähdys levisi hänen kuihtuneille kasvoilleen.

Mutta hän alkoi pian taas puhua. Oli sellaista, jota hänen täytyi
saada sanotuksi. Muuten hän ei saisi rauhaa. »Älä ole niin vihoissasi
Jannelle, vaikka hän juoksi sinun jäljissäsi! Hän tarkoitti vain hyvää.
Sinun ei ollut hyvä olla sen jälkeen, kun te jouduitte eroon. Sen hän
tiesi. Eikä hänenkään. Te kuljitte harhaan kumpikin omalla
tavallanne.»

Klara Gulla oli tiennyt, että äiti tulisi sanomaan jotakin senkaltaista,
ja hän oli edeltäpäin karaissut mieltään. Mutta äidin sanat liikuttivat
häntä sittenkin enemmän kuin hän olisi voinut uskoa, ja hän koetti
vastata hänelle ystävällisesti.

»Minä koetan ajatella isää sellaisena kuin hän oli ennen», sanoi
hän.
»Muistattehan te kuinka hyvät ystävät me siihen aikaan olimme?»

Katrina näytti tyytyvän tähän vastaukseen, sillä hän rauhoittui

jälleen. Hän ei suinkaan ollut aikonut sanoa sen enempää, mutta
äkkiä hän alkoi hymyillä tyttärelleen ja hänen kasvonsa ilmaisivat
suurta hellyyttä.

»Minä olen niin iloinen, Klara Gulla», sanoi hän, »että olet tullut
jälleen kauniiksi.»

Nuo sanat ja tuo hymyily mursivat Klara Gullan itsehillitsemisen

kokonaan. Hän laskeutui polvilleen matalan vuoteen ääreen ja alkoi
itkeä. Ensi kertaa kotiin tultuaan hän purskahti oikeaan itkuun.
 »En tiedä, miten te voitte olla niin hyvä minulle, äiti. Minun syyni
on, että te kuolette nyt, ja isänkin kuolemaan olen minä syypää.»

Katrina hymyili edelleen ja koetti hiukan hyväillä kädellään.

»Te olette niin hyvä, äiti, te olette niin hyvä minulle», sanoi Klara
Gulla kesken itkuaan ja nyyhkytyksiään.

Katrina tarttui lujasti tyttären käteen ja kohosi istualleen

vuoteessaan voidakseen antaa vielä viimeisen todistuksensa.
»Kaiken sen hyvän mikä minussa on», sanoi hän, »olen oppinut
Jannelta.»

Tämän jälkeen hän vajosi takaisin päänalukselleen eikä sanonut

enää mitään tajuttavaa. Kuolonkamppailu alkoi, ja hän kuoli
seuraavana aamuna.

Mutta kuolonkamppailun kestäessä makasi Klara Gulla itkien

vuoteen ääressä. Hän makasi siinä ja itki pois kaiken tuskansa,
kuumehoureensa, velkakuormansa. Hänen kyyneleillään ei ollut
loppua.
KEISARIN HAUTAJAISET.

Joulun edellisenä sunnuntaina oli määrä saattaa Katrina hautaan,

eikä sellaisena pyhänä tavallisesti keräydy paljon väkeä kirkolle, sillä
kaikki tahtovat säästää kirkkomatkansa suuriksi juhlapäiviksi.

Mutta kun pieni saattojoukko Askedalista ajoi mäntymäkeä ylös

kirkon ja pitäjäntuvan välitse, nolostuivat he hiukan. Sillä niin suurta
joukkoa, kuin tänä päivänä, oli kirkolla ollut tuskin silloinkaan, kun
vanha Bron rovasti toimitti saarnavuoroaan Svartsjössä kerta
vuodessa tai kun papinvaalia pidettiin.

Olihan itsestään selvää, ettei mies talosta ollut lähtenyt vanhaa

Katrinaa saattamaan, vaan jotakin muuta täytyi olla tekeillä. Ehkäpä
odotettiin jotakuta suurmiestä kirkolle tai ehkäpä jonkun muun kuin
tavallisen papin oli määrä saarnata. Hehän asuivat niin syrjässä
Askedalissa, että paljonkin saattoi pitäjällä tapahtua heidän saamatta
siitä vihiä.

Ruumissaatto pysähtyi niinkuin tavallisesti pitäjäntuvan taakse ja

saattajat laskeutuivat maahan. Sielläkin oli väkeä yhtä paljon kun
mäntymäellä, mutta muuta ihmeellistä ei näyttänyt olevan.
Askedalilaiset alkoivat yhä enemmän ihmetellä, mutta he eivät
tahtoneet kysyä mitään. Saattojoukonhan pitää pysytellä erillään
muista eikä ruveta keskusteluihin niiden kanssa, jotka eivät ota osaa
suruun.

Arkku nostettiin alas laverirattailta, joilla se oli kuljetettu kirkolle, ja

laskettiin mustille pukeille, jotka jo edeltäkäsin olivat pystytetyt
pitäjäntuvan edustalle. Siinä piti nyt sen sekä kaikkien niiden, jotka
kuuluivat siihen, seisoa ja odottaa, kunnes kellot alkaisivat soida ja
pappi ja lukkari olisivat valmiit lähtemään hautausmaalle.

Oikea herran ilma oli kaiken aikaa. Satoi rankasti niin että
sadepisarat ratisivat vasten arkun kantta. Se vain oli varmaa: tuo
ihmisjoukko ei ollut saapunut kirkolle kauniin ilman vuoksi, olkoon
syy heidän tuloonsa mikä hyvänsä.

Mutta näyttipä siltä, kuin ei kukaan olisi välittänyt sateesta eikä

tuulesta tänä päivänä. Väki seisoi hiljaa ja kärsivällisesti taivasalla
etsimättäkään suojaa kirkosta tai pitäjäntuvalta.

Kantajat sekä muutkin, jotka olivat kerääntyneet Katrinan arkun

ympärille, huomasivat, että toisetkin pukit olivat asetetut ulos paitsi
niitä, joilla Katrinan arkku lepäsi. Toinenkin ruumis oli siis siunattava.
Siitäkään he eivät olleet kuulleet mitään. Eikä mitään
ruumissaattoakaan näyttänyt olevan tulossa. Aika oli muuten jo niin
pitkälle kulunut, että sen olisi pitänyt olla paikalla.

Kun kello oli kymmenen minuuttia vailla kymmenen, ja lähtö

hautuumaalle saattoi tapahtua milloin tahansa, huomasivat
askedalilaiset, että kaikki lähestyivät Nolin taloa, joka sijaitsi vain
parin minuutin matkan päässä kirkolta.
 He näkivät nyt, vaikkeivät he tähän asti olleet sitä
huomanneetkaan, että pitäjäntuvalta oli siroitettu kuusenhakoja aina
talon päärakennuksen eteen saakka, ja oven molemmin puolin oli
pystytetty kuusia. Siellä oli siis ruumis talossa. Mutta sittenkään he
eivät voineet käsittää, miten he eivät olleet kuulleet mitään
kuolemantapauksesta sellaisessa talossa. Eikä ikkunoissa
myöskään ollut hursteja, niinkuin tulee olla, kun kuolema käy talossa.

Nyt eteisen ovet avattiin selkosen selälleen ja ulos tuli sittenkin

ruumissaatto. Nolin August astui ensimäisenä surusauva kädessä, ja
hänen jäljessään kantajat arkkuineen.

Saattoon yhtyi sitten koko ihmisjoukko, joka oli odottanut kirkon

edustalla. Tämän vainajan vuoksi he siis olivat saapuneet kirkolle.

He kantoivat arkun pitäjäntuvan edustalle ja laskivat sen toisen

arkun oikealle puolelle. Nolin August siirsi pukkeja, niin että
molemmat arkut joutuivat aivan rinnakkain.

Myöhempi arkku ei ollut yhtä uusi ja kiiltävä kuin Katrinan. Se oli

varmaan saanut monta sadekuuroa kestää jo ennen tätä päivää. Sitä
oli varomattomasti käsitelty, niin että se oli saanut naarmuja ja
kolauksia.

Kaikki askedalilaiset vetivät syvältä henkeään, sillä nyt he alkoivat

ymmärtää. Tuossa arkussa ei maannut ketään Nolin Augustin
sukulaista. Ei minkään suurmiehen vuoksi noin paljon ihmisiä ollut
saapunut kirkolle.

Nyt kaikkien katseet kulkivat Klara Gullaan, nähdäkseen

ymmärsikö hänkin, mistä oli kysymys. Ja hänestä saattoikin selvästi
huomata, että hänkin sen ymmärsi.
 Hän oli seisonut kalpeana ja itkettyneenä kaiken aikaa äitinsä
arkun vieressä, ja kun hän nyt tunsi toisen arkun, jota he kantoivat
Nolin talosta, näytti tämä iloinen yllätys saattavan hänet aivan pois
suunniltaan, niinkuin voi käydä, kun vihdoin saa sen, mitä kauan on
odottanut. Mutta hän rauhoittui pian. Hän hymyili surun voittoisesti ja
siveli pari kertaa hiljaa arkun kantta. »Nyt sinun on oikein hyvä olla»,
näytti hän aikovan sanoa kuolleelle äidillensä.

Nolin August astui Klara Gullan luo ja otti häntä kädestä.

»Ei suinkaan Klara Gullalla ole mitään sitä vastaan, että

järjestimme asiat täten», sanoi hän. »Me löysimme hänet vasta
perjantaina. Arvelin, että se täten olisi Klara Gullalle helpompi.»

Klara Gulla vastasi vain pari sanaa. Ja huulet vapisivat, niin että
niitä tuskin saattoi kuulla.

»Kiitos! Hyvähän se on. Tiedänhän, ettei hän tule minun, vaan

äidin luokse.»

»Hän tulee teidän kummankin luo, sen Klara Gulla saa nähdä»,
sanoi
Nolin August.

Fallan vanha emäntä, joka oli kahdeksankymmenen vuoden

vanha ja monien surujen murtama, oli myös tullut kirkolle
kunnioittamaan Katrinaa, joka niin kauan oli palvellut häntä
uskollisesti ja ollut hänen hyvä ystävänsä. Hän oli ottanut mukaansa
keisarikepin ja hatun, jotka olivat annetut hänelle takaisin. Hän aikoi
laskea ne hautaan Katrinan viereen. Hän arveli, että Katrina
kernaasti tahtoisi saada läheisyyteensä jotain, mikä muistutti
Jannea.
 Nyt Klara Gulla astui hänen luokseen ja pyysi saada keisarikalut,
ja sitten hän asetti pitkän kepin pystyyn Jannen arkkua vasten ja
hatun sen päähän. Väki ymmärsi hänen ajattelevan sitä, ettei hän
ollut antanut Jannen kulkea keisarikoreudessaan palattuansa kotiin.
Hän tahtoi hyvittää sen verran kuin hän saattoi. Paljon ei kuolleen
hyväksi voi tehdä.

Tuskin oli keppi pystytetty arkun viereen, kun kirkon kellot alkoivat
soida, ja samalla tulivat pappi ja lukkari ja suntio sakaristosta ja
asettuivat saaton etunenään.

Sade virtasi kuurottain sinä päivänä, ja kaikeksi onneksi se piti

hiukan väliä, kun seurakunta järjestyi riviin, ensin miehet ja sitten
vaimoväki, ja valmistui saattamaan näitä kahta vanhusta hautaan.

Ne, jotka asettuivat saattoon, näyttivät ikäänkuin itsekin

ihmettelevän sitä, että olivat täällä mukana. Sillä eivät he juuri mitään
surua tunteneet, eivätkä liioin tahtoneet osoittaa kunnioitustaan
kummallekaan vainajalle. Asian laita oli vain sellainen, että kun tieto
oli levinnyt pitkin pitäjää, että Skrolyckan Janne oli löytynyt juuri
sopivaan aikaan, jotta hänet voitaisiin haudata yhteen hautaan kuin
Katrinakin, oli siinä kaikkien mielestä ollut jotain kaunista ja
ihmeellistä, ja he olivat halunneet nähdä, miten kuolema yhdistäisi
jälleen nuo vanhat aviopuolisot.

Eihän kukaan voinut aavistaa, että niin monet ajattelisivat aivan

samoin. Nyt oli nostettu melkein liiaksi melua kahdesta niin köyhästä
ja alhaisesta ihmisestä. Ihmiset katsoivat toisiinsa ja olivat hiukan
häpeissänsä, mutta kun he nyt kerran olivat siellä, niin oli myös
pakko lähteä hautausmaalle.
 Täytyihän heidän itsekseen hiukan hymyilläkin koko asialle, kun
he tulivat ajatelleeksi, että tämä olisi Portugallian keisarille ollutkin
hyvin mieleen. Kahta surusauvaa, sillä toinen oli seurannut
Askedalista mukana, kannettiin hänen ja Katrinan arkun edellä ja
melkein koko pitäjä seurasi mukana saattojoukossa. Sen paremmin
ei olisi voinut käydä, vaikka hän itse olisi saanut olla mukana
järjestämässä.

Ja kukapa tietää, vaikka se olisi ollutkin hänen tointaan. Hän oli

tullut niin kummalliseksi kuolemansa jälkeen, tuo vanha keisari. Hän
oli varmaan jotain sillä tarkoittanut, että oli antanut tyttären niin
kauan odottaa itseänsä, ja aivan varmasti oli joku tarkoitus siinäkin,
että hän oli tullut syvyydestä esiin juuri parhaaseen aikaan.

Kun he kaikki olivat saapuneet leveän haudan partaalle ja arkut

olivat lasketut maan poveen, alkoi lukkari laulaa: »Ma kuljen kohti
kuolemaa ‒ ‒ ‒»

Lukkari Svartling oli tähän aikaan vanha mies. Hänen laulunsa toi
Klara Gullan mieleen toisen vanhan miehen, jonka laulua hän ei ollut
tahtonut kuunnella.

Tuo ajatus tuotti hänelle suurta tuskaa. Hän puristi kädet

sydäntään vastaan ja sulki silmänsä, jotta ne eivät ilmaisisi, miten
syvästi hän kärsi.

Hänen seisoessaan siinä silmät ummessa hän näki edessään

isänsä kasvot, sellaisina kuin ne Klara Gullan nuorena ollessa olivat
olleet ja jolloin isä ja tytär olivat niin hyviä ystäviä.

Hän näki ne sellaisina kuin ne olivat eräänä aamuna kovan

lumituiskun jälkeen, jolloin tiet olivat ummessa ja isän oli täytynyt
kantaa hänet kirkkoon.

Hän näki ne edessään sellaisina, kuin ne olivat sinä päivänä,

jolloin Klara Gulla meni kirkolle punaisessa leningissään. Ei kukaan
ollut näyttänyt niin onnelliselta ja hyvältä kuin Janne sillä kertaa.
Sitten Jannen onni oli sammunut, eikä Klara Gullakaan ollut enää
oikein tyytyväinen.

Klara Gulla koetti pysyttää silmiensä edessä nämä kasvot. Ne

tekivät hänelle niin hyvää. Katsellessaan niitä nousi voimakas
hellyyden aalto hänen rinnastansa.

Nuo kasvot tahtoivat hänelle vain hyvää. Niitä ei tarvinnut lainkaan

pelätä.

Sehän oli vain vanha, kiltti Skrolyckan Janne. Ei hän tahtonut

tuomita Klara Gullaa, ei hän tahtonut saattaa onnettomuutta ja
rangaistusta ainoalle lapselleen.

Klara Gulla tuli niin ihmeellisen rauhalliseksi. Hän oli tullut keskelle
rakkauden maailmaa, nyt kun hän saattoi nähdä isänsä sellaisena
kuin hän oli ollut ennen. Mitenkä hän saattoi olettaa, että isä vihaisi
häntä? Hän tahtoi vain antaa anteeksi.

Minne ikänä Klara Gulla meni ja mitä ikänä hän teki, siellä isäkin
tahtoi olla ja suojella häntä. Ei hän pyytänyt mitään muuta.

Vieläkin kerran Klara Gulla tunsi suuren hellyydentunteen

kohoavan sydämestään kuin valtavan aallon ja täyttävän koko hänen
olentonsa. Ja samalla hän tiesi, että kaikki oli hyvin. Nyt hän ja isä
olivat yksi, niinkuin ennenkin. Nyt, kun Klara Gulla rakasti häntä, ei
mitään sovitettavaa enää ollut.
 Klara Gulla heräsi ikäänkuin unesta. Hänen katsellessaan isänsä
hyviä kasvoja oli pappi suorittanut hautauksen. Ja nyt hän lausui pari
sanaa kokoontuneelle kansalle. Hän kiitti heitä, että he olivat tulleet
niin lukuisin joukoin näihin hautajaisiin. Mies, joka täällä oli vihitty
lepoon, ei ollut suuri eikä ylhäinen, mutta ei kellään koko
paikkakunnalla ollut niin lämmintä ja rikasta sydäntä kuin hänellä.

Sitten hän lausui myös pari sanaa Klara Gullalle. Hän oli saanut
osakseen suurempaa rakkautta vanhemmiltaan kuin kukaan muu
hänen tietääksensä, ja sellaisen rakkauden täytyi kääntyä
siunaukseksi.

Kun pappi sanoi sen, käänsivät kaikki katseensa Klara Gullaan ja

he ihmettelivät sitä näkyä, mikä heitä nyt kohtasi.

Siinä Skrolyckan Klara Fina Gulleborg, joka oli saanut nimensä

itse auringon mukaan, seisoi vanhempiensa haudalla ja hänen
kasvonsa loistivat ikäänkuin ne olisivat olleet kirkastuneet.

Hän oli yhtä kaunis kuin sinä sunnuntaina, jolloin hän tuli kirkolle
punaisessa leningissään, jollei vielä paljoa kauniimpikin.
 *** END OF THE PROJECT GUTENBERG EBOOK
PORTUGALLIAN KEISARI ***

Updated editions will replace the previous one—the old editions will
be renamed.

Creating the works from print editions not protected by U.S.

copyright law means that no one owns a United States copyright in
these works, so the Foundation (and you!) can copy and distribute it
in the United States without permission and without paying copyright
royalties. Special rules, set forth in the General Terms of Use part of
this license, apply to copying and distributing Project Gutenberg™
electronic works to protect the PROJECT GUTENBERG™ concept
and trademark. Project Gutenberg is a registered trademark, and
may not be used if you charge for an eBook, except by following the
terms of the trademark license, including paying royalties for use of
the Project Gutenberg trademark. If you do not charge anything for
copies of this eBook, complying with the trademark license is very
easy. You may use this eBook for nearly any purpose such as
creation of derivative works, reports, performances and research.
Project Gutenberg eBooks may be modified and printed and given
away—you may do practically ANYTHING in the United States with
eBooks not protected by U.S. copyright law. Redistribution is subject
to the trademark license, especially commercial redistribution.

START: FULL LICENSE

THE FULL PROJECT GUTENBERG LICENSE
 PLEASE READ THIS BEFORE YOU DISTRIBUTE OR USE THIS WORK

To protect the Project Gutenberg™ mission of promoting the free

distribution of electronic works, by using or distributing this work (or
any other work associated in any way with the phrase “Project
Gutenberg”), you agree to comply with all the terms of the Full
Project Gutenberg™ License available with this file or online at
www.gutenberg.org/license.

Section 1. General Terms of Use and

Redistributing Project Gutenberg™
electronic works
1.A. By reading or using any part of this Project Gutenberg™
electronic work, you indicate that you have read, understand, agree
to and accept all the terms of this license and intellectual property
(trademark/copyright) agreement. If you do not agree to abide by all
the terms of this agreement, you must cease using and return or
destroy all copies of Project Gutenberg™ electronic works in your
possession. If you paid a fee for obtaining a copy of or access to a
Project Gutenberg™ electronic work and you do not agree to be
bound by the terms of this agreement, you may obtain a refund from
the person or entity to whom you paid the fee as set forth in
paragraph 1.E.8.

1.B. “Project Gutenberg” is a registered trademark. It may only be

used on or associated in any way with an electronic work by people
who agree to be bound by the terms of this agreement. There are a
few things that you can do with most Project Gutenberg™ electronic
works even without complying with the full terms of this agreement.
See paragraph 1.C below. There are a lot of things you can do with
Project Gutenberg™ electronic works if you follow the terms of this
agreement and help preserve free future access to Project
Gutenberg™ electronic works. See paragraph 1.E below.
1.C. The Project Gutenberg Literary Archive Foundation (“the
Foundation” or PGLAF), owns a compilation copyright in the
collection of Project Gutenberg™ electronic works. Nearly all the
individual works in the collection are in the public domain in the
United States. If an individual work is unprotected by copyright law in
the United States and you are located in the United States, we do
not claim a right to prevent you from copying, distributing,
performing, displaying or creating derivative works based on the
work as long as all references to Project Gutenberg are removed. Of
course, we hope that you will support the Project Gutenberg™
mission of promoting free access to electronic works by freely
sharing Project Gutenberg™ works in compliance with the terms of
this agreement for keeping the Project Gutenberg™ name
associated with the work. You can easily comply with the terms of
this agreement by keeping this work in the same format with its
attached full Project Gutenberg™ License when you share it without
charge with others.

1.D. The copyright laws of the place where you are located also
govern what you can do with this work. Copyright laws in most
countries are in a constant state of change. If you are outside the
United States, check the laws of your country in addition to the terms
of this agreement before downloading, copying, displaying,
performing, distributing or creating derivative works based on this
work or any other Project Gutenberg™ work. The Foundation makes
no representations concerning the copyright status of any work in
any country other than the United States.

1.E. Unless you have removed all references to Project Gutenberg:

1.E.1. The following sentence, with active links to, or other

immediate access to, the full Project Gutenberg™ License must
appear prominently whenever any copy of a Project Gutenberg™
work (any work on which the phrase “Project Gutenberg” appears, or
with which the phrase “Project Gutenberg” is associated) is
accessed, displayed, performed, viewed, copied or distributed: