집락형성단위

Colony-forming unit
인간 조혈모세포는 조혈모세포를 참고하세요.

미생물학에서 집락 형성 단위(colony-forming unit, CFU, cfu 또는 Cfu)는 통제된 조건에서 이진 핵분열을 통해 증식할 수 있는 생존 가능한 샘플 내 미생물 세포(세균, 곰팡이, 바이러스 등)의 수를 추정하는 단위입니다. 집락 형성 단위로 계산하려면 미생물을 배양해야 하며 살아있든 죽었든 모든 세포를 세는 현미경 검사와 대조적으로 생존 가능한 세포만 세어야 합니다. 세포 배양에서 집락의 시각적인 모습은 상당한 성장을 필요로 하며, 집락을 셀 때 집락이 하나의 세포에서 발생했는지, 아니면 한 무리의 세포에서 발생했는지는 불확실합니다. 결과를 집락 형성 단위로 표현하는 것은 이러한 불확실성을 반영합니다.

이론.

박테리아와 펩톤수로 만든 희석액을 한천 플레이트(식품 샘플의 경우 한천 플레이트 수 또는 임상 샘플의 경우 트립티카제 소이 한천)에 넣고 표시된 패턴으로 기울여서 플레이트 위에 펴 바릅니다.

플레이트 카운팅의 목적은 영양 배지, 온도 및 시간의 특정 조건에서 집락을 생성하는 능력을 기반으로 존재하는 세포의 수를 추정하는 것입니다. 이론적으로 하나의 생존 세포는 복제를 통해 집락을 형성할 수 있습니다. 하지만, 자연적으로 고립된 세포는 예외이며, 식민지의 시조는 아마도 함께 퇴적된 세포 덩어리였을 것입니다.[1][2] 또한 많은 박테리아들이 사슬 모양(예: Streptococcus) 또는 덩어리 모양(예: 포도상구균)으로 자랍니다. CFU에 의한 미생물 수의 추정은 대부분의 경우 이러한 이유로 샘플에 존재하는 살아있는 세포의 수를 과소 계산할 것입니다. CFU의 계수는 모든 집락이 하나의 생존 가능한 미생물 세포에 의해 분리되고 설립된다고 가정하기 때문입니다.[3]

플레이트 수는 표준 크기의 페트리 플레이트에서 30~300 CFU 범위에 걸쳐 대장균에 대해 선형입니다.[4] 따라서 샘플이 이 범위에서 CFU를 산출하려면 샘플을 희석하고 여러 희석액을 플레이팅해야 합니다. 일반적으로 10배 희석액이 사용되며 희석 시리즈는 선택된 희석액 범위에 걸쳐 2 또는 3의 복제물로 플레이팅됩니다. 종종 100 µl가 플레이팅되지만 최대 1ml까지 더 많은 양이 사용됩니다. 도금량이 많으면 건조 시간이 증가하지만 추가 희석 단계가 필요할 수 있으므로 정확도가 높아지지 않는 경우가 많습니다.[5] CFU/플레이트를 선형 범위의 플레이트에서 읽은 다음 원본의 CFU/g(또는 CFU/mL)를 수학적으로 추론하여 도금된 양과 희석 계수를 계산합니다.

알 수 없는 농도의 박테리아 용액을 연속적으로 희석하여 셀 수 있는 수의 박테리아가 있는 플레이트를 하나 이상 얻기도 합니다. 이 그림에서 "x10" 플레이트가 계산에 적합합니다.

이 방법의 장점은 다른 미생물 종들이 미시적으로나 거시적으로 서로 분명히 다른 집락을 생성할 수 있다는 것입니다. 집락 형태는 존재하는 미생물을 식별하는 데 매우 유용할 수 있습니다.[6]

유기체의 현미경 해부학에 대한 사전 이해는 관찰된 CFU/mL가 ml당 생존 세포의 수와 어떻게 관련되는지 더 잘 이해할 수 있습니다. 또는 희석을 수행하기 전에 샘플을 와동시켜 CFU당 평균 세포 수를 줄일 수도 있습니다. 그러나 많은 미생물은 섬세하고 소용돌이에 놓였을 때 생존 가능한 세포의 비율이 감소할 것입니다.[7]

로그 표기법

집락 형성 단위의 농도는 로그 표기를 사용하여 표현할 수 있으며, 여기서 표시된 값은 농도의 기본 10 로그입니다.[8][9][10] 이를 통해 오염 제거 프로세스의 로그 감소를 단순 감산으로 계산할 수 있습니다.

사용하다

콜로니 형성 단위는 다음과 같은 많은 미생물 플레이팅 및 계수 방법에서 결과를 정량화하는 데 사용됩니다.

  • 약 40 ~ 45 °C로 냉각된 용융 한천을 사용하여 시료를 페트리 플레이트에 현탁시키는 Pour Plate 방법(열로 인한 세포 사멸을 최소화하기 위해 응고 지점 바로 위). 영양 한천이 응고되면 플레이트를 배양합니다.[11]
  • 스프레드 플레이트 방법은 샘플(적은 부피)을 영양 한천 플레이트의 표면에 펴고 계수를 위해 배양하기 전에 건조되도록 합니다.[11]
  • Membrane Filter 방법은 샘플을 Membrane Filter를 통해 여과한 다음 필터를 영양 한천 플레이트(세균이 위로 향함)의 표면에 배치하는 방법입니다. 배양하는 동안 성장하는 세포를 지원하기 위해 필터를 통해 영양소가 침출됩니다. 대부분의 필터의 표면적이 표준 페트리 플레이트의 표면적보다 작기 때문에 플레이트 카운트의 선형 범위는 더 적을 것입니다.[11]
  • Miles and Misra Methods 또는 드롭 플레이트 방법은 연속적으로 각 희석액에서 매우 작은 부분 샘플(보통 약 10 마이크로리터)을 Petri 접시에 떨어뜨리는 방법입니다. 함께 자랄 때 CFU가 손실되는 것을 방지하기 위해 집락이 매우 작은 동안 드롭 플레이트를 읽어야 합니다.[12]

그러나 한천 플레이트를 사용해야 하는 기술로는 시료의 순도를 확인할 수 없고 액체 속에서 세포를 일일이 셀 수 없기 때문에 유체 용액을 사용할 수 없습니다.[13]

집락을 세는 도구

"클릭 카운터"와 펜으로 CFU를 열거하는 전통적인 방법입니다. 집락이 너무 많으면 CFU는 요리의 일부분만 세는 것이 일반적입니다.

집락을 세는 것은 전통적으로 펜과 클릭 카운터를 사용하여 수동으로 수행됩니다. 이 작업은 일반적으로 간단한 작업이지만 많은 플레이트를 열거해야 하는 경우 매우 힘들고 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 또는 반자동(소프트웨어) 및 자동(하드웨어+소프트웨어) 솔루션을 사용할 수 있습니다.[14][15][16]

CFU를 계산하기 위한 소프트웨어

소프트웨어 도구를 사용하여 플레이트 사진에서 집락을 열거할 수 있습니다. 실험자는 일반적으로 숫자를 세는 데 필요한 각 판의 사진을 찍은 다음 모든 사진을 분석합니다(이것은 간단한 디지털 카메라 또는 웹캠으로도 할 수 있습니다). CFU를 수동으로 계산하는 데 몇 분이 걸리는 것과 달리, 한 장의 사진을 찍는 데는 10초도 걸리지 않기 때문에 일반적으로 이 방법은 많은 시간을 절약합니다. 또한 더 객관적이며 집락의 크기와 색상과 같은 다른 변수를 추출할 수 있습니다.[17]

  • OpenCFU[1]는 사용자 친화성, 속도 및 견고성을 최적화하도록 설계된 자유 오픈 소스 프로그램입니다. 다양한 필터와 제어는 물론 현대적인 사용자 인터페이스를 제공합니다. OpenCFU는 C++로 작성되며 영상 분석에 OpenCV를 사용합니다.[18]
  • NICE는 이미지에서 집락을 쉽게 셀 수 있는 방법을 제공하는 매트랩(Matlab)으로 작성된 프로그램입니다.[19][20]
  • ImageJ 및 CellProfiler: 일부 ImageJ 매크로[21] 및 플러그인과 일부 CellProfiler 파이프라인을[22] 사용하여 콜로니를 카운트할 수 있습니다. 이는 종종 사용자가 효율적인 워크플로우를 달성하기 위해 코드를 변경해야 하지만 유용하고 유연한 것으로 판명될 수 있습니다. 한 가지 주요 문제는 처리 알고리즘과의 상호 작용을 지루하게 만들 수 있는 특정 GUI가 없다는 것입니다.

기존 데스크톱 컴퓨터를 기반으로 한 소프트웨어 외에도 안드로이드와 iOS 기기용 앱은 반자동 및 자동 콜로니 카운팅이 가능합니다. 통합 카메라는 한천 플레이트의 사진을 촬영하는 데 사용되며 내부 또는 외부 알고리즘을 사용하여 사진 데이터를 처리하고 집락 수를 추정합니다.

자동화 시스템

인간이 개별 세포를 세는 많은 연구 기술이 관련된 오류 가능성이 높기 때문에 자동화된 시스템 중 많은 것이 인간의 오류에 대응하기 위해 사용됩니다. 이 오류에 취약한 기술은 세포 수가 적을 때 주 액체 매질의 계산 농도에 큰 영향을 줄 수 있는데, 투과광의 도움을 받아 연구자들이 정기적으로 수동으로 세포 수를 세기 때문입니다.[27]

이미지 처리를 사용하는 자동 콜로니 카운터입니다.

완전 자동화된 시스템은 일부 생명 공학 제조업체에서도 사용할 수 있습니다.[28][29] 하드웨어와 소프트웨어가 특정 설정에서 함께 작동하도록 설계되었기 때문에 일반적으로 독립 실행형 소프트웨어만큼 가격이 비싸고 유연하지 않습니다.[30] 또는 일부 자동 시스템은 나선형 도금 패러다임을 사용합니다.[31]

MATLAB의 시스템과 같은 자동화된 시스템 중 일부는 세포를 염색할 필요 없이 셀 수 있도록 합니다. 이를 통해 집락을 얼룩으로 미생물을 죽일 위험 없이 다른 실험에 재사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 자동화 시스템의 단점은 먼지와 스크래치 모두 매우 다양한 형태와 외관을 형성할 수 있기 때문에 혈액 한천 플레이트에 먼지 또는 스크래치가 있는 미생물을 구별하기가 매우 어렵다는 것입니다.[32]

대체단위

집락 형성 단위 대신 MPN(Most Probable Number) 및 MFU([33]Modified Fishman Unit) 매개 변수를 사용할 수 있습니다. Most Probible Number 방법은 생존 가능한 세포를 계수하고 미립자가 플레이트 계수를 비실용적으로 만드는 제품에서 저농도의 세포를 계수하거나 미생물을 계수할 때 유용합니다.[34] 수정된 피쉬맨 유닛은 생존 가능하지만 배양할 수 없는 박테리아를 고려합니다.

참고 항목

참고문헌

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