User:Kaguya-Taketori/MC
分子克隆（Molecular Cloning）是一種分子生物學的常用技術。分子克隆的克隆字面意思是「複製」，在分子克隆中專指產生一群含有目的載體的宿主細胞[1]。
分子克隆可分爲兩個主要步驟：先構建重組DNA（即目的載體。重組意指DNA分子的擁有來源不同的幾個部分），再利用宿主細胞對構建的載體進行複製。分子克隆中最常用的載體和宿主細胞分別是質粒（plasmid）以及大腸桿菌（E. coli）。該技術路線操作簡便，且細菌繁殖極快，可以在短期內收穫大量重組DNA分子。理論上，該路線僅需要不到一週時間就可以完成。但質粒和大腸桿菌的組合也存在一定的侷限性。比如，質粒一般來說只能允許10kb以下的目的片段插入，因而根據情況可能需要使用λ噬菌體、黏粒、酵母人工染色体（YAC）等載體[2]。
分子克隆是基因工程的重要一環，在生命科學研究中具有重要地位，許多研究在不使用分子克隆技術將難以進行。分子克隆是RNA干擾、基因敲除/敲入、基因編輯等技術的基礎。除了用於基礎研究外，生產重組蛋白、構建轉基因生物、實行基因治療也需要用到分子克隆技術。另外，在農業、法醫、考古等領域，分子克隆也扮演着重要的角色。
經典的分子克隆
[编辑]經典的分子克隆使用質粒作爲載體，大腸桿菌作爲宿主細胞。利用該路線，研究者可以在短期內獲得大量的載體：對幾個菌落或者幾毫升的菌液進行質粒小提一般可以獲得幾微克或幾十微克的質粒，而對數百毫升的菌液進行質粒中提或大提可以獲得毫克級的質粒。
載體的選擇
[编辑]在進行分子克隆前，選擇合適的載體是十分必要的。首先，選擇的載體應該滿足後續實驗的需求。質粒載體需要能在大腸桿菌體內進行自我複製，並含有可以對其進行篩選的基因或標記（如中間插入了多酶切位點的lacZ基因或抗生素抗性基因等）。[3]:379。如果是對一個基因進行研究，那麼該基因的插入位點應該置於一個啓動子的控制之下。這個啓動子在後續載體會轉入的宿主（如植物細胞或哺乳動物細胞）中要是可用的[4]:237-239。從結構上說，質粒載體的大小首先應適中，太長或太短都會使得實驗變得困難。另外，目的片段的插入位點應該有合適的酶切位點。一般從生物技術公司或其他途徑得到的質粒，在插入位點都會有一段擁有多個酶切位點的片段（稱爲多酶切位點片段（MCS））[3]:379。雖然現今已有反向PCR等特殊的方法將片段插入到載體上無合適酶切位點的位置，但實驗過程將會因此變得麻煩許多[5]。
質粒載體的命名通常是小寫的「p」+實驗室代號+編號，例如最早構建的質粒載體pBR322即表示由代號BR的實驗室構建的序號爲322的質粒載體。pBR322長4361bp，是一種帶有Amp（氨苄黴素）以及Tet（四環素）抗性的質粒載體，當片段插入抗性基因中央時，攜帶該質粒的細菌會失去對該抗生素的抗性，進而可以對含有目的片段的載體進行篩選[6]。除pBR322外，一些較爲常用的載體還有能進行藍白斑篩選的pUC8、含有強啓動子T7的原核表達質粒pET28（同樣能進行藍白斑篩選）等等[7]。
質粒本身有一定的侷限性。比如，目的片段的長度如果大於10kb（千鹼基對），則應該考慮換用噬菌體或黏粒（cosmid）等容量更大的載體[1]。
目的片段的選擇與獲取
[编辑]通常來說，目的片段（insert）是一個基因或者一個轉錄盒的cDNA。但目的片段亦可以是待研究的啓動子等[1]。目前，較爲常用的獲取目的片段的方法是使用高保證的Taq酶對該物種的基因組DNA進行PCR（注意務必應使用經過改造的高保真酶，因爲Taq酶錯配率較高，將導致插入片段中大概率含有單鹼基突變[3]:164-165）。如果已經對待研究的物種完成了測序，而且已確定待研究的基因或啓動子，只需要搜尋該片段及周圍區域的序列，然後設計特異性的引物即可[3]:157-159[8]。但如果尚未確認需要研究的目的片段，則需要先使用定位克隆等基因篩選技術確定需要研究的片段[9]。
除此之外，還可以使用酶切或反轉錄的方法先構建基因組文庫（Genome Library）或cDNA文庫（cDNA Library）。如果該基因與某些抗生素基因或營養素合成基因相鄰，那麼帶有含該段插入序列的質粒的細菌可以在某種特定培養基中生長，而其他細菌則會在培養過程中死亡。利用上述原理，可以篩選出含有這類目的片段的載體，對含有目的質粒載體的菌體進行擴增培養。另外，還可以設計特異性探針，利用雜交探針技術鑑定出所需的菌落，然後進行培養擴增。當上述步驟完成後，就可以直接進入分離提取步驟[3]{{rp|134-152}
亞克隆
[编辑]亞克隆是指將目的片段與載體連接的過程。目前，亞克隆的傳統方法是通過PCR及限制酶處理實現。另外，新出現的In-fusion技術的應用面也越來越廣。
如果目的片段兩端所具有的酶切位點與載體預期插入位點上的酶切位點相同，且預期不會產生不需要的副產物，那麼就可以分別對含有目的片段的DNA和載體進行酶切。酶切選用單酶切還是雙酶切需要根據實際情況而定。如果目的片段兩段的酶切位點是相同的，那麼可以選用單酶切。選用單酶切時，載體也只會出現一個切口。單酶切的不足之處是，在後續的連接操作中，載體和目的片段容易發生自連，最後得到的連接產物可能是兩個載體自連產生的環狀DNA或接有兩個以上目的片段的目的載體。不過，使用磷酸酶可以降低載體自連。雙酶切法可以有效防止載體自連或目的片段自連，但不足之處又在於操作複雜，且對載體和。用瓊脂糖凝膠電泳分離出不同大小的片段，再通過胶回收
載體的引入及克隆
[编辑]載體的分離提取
[编辑]在得到大量含有目的質粒的細菌後，下一步需要考慮的問題是如何將質粒自這些細菌中分離提取，即如何提取質粒。雖然目前通行的質粒提取方法
其他的分子克隆載體
[编辑]使用分子克隆技術的研究
[编辑]實際應用
[编辑]參見
[编辑]參考
[编辑]- ^ 1.0 1.1 1.2 Jocelyn E. Krebs; et al. Genes XI. JONES&BARTLETT LEARNING. 2014: 46–51. ISBN 978-7-04-039649-2.
- ^ Garret, Grisham. Biochemistry. Belmont, CA, Brooks/Cole,: Cengage Learning. 2010: 380.
- ^ 3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 William S. Klug, Michael R. Cummings, Charlotte A. Spencer. ESSENTIALS OF GENETICS (Six Edition). 北京: 高等教育出版社. 2007.
- ^ T.A. Brown原著，魏群等譯. 基因克隆和DNA分析（Gene Cloning and DNA Analysis）第五版. 北京: 高等教育出版社. 2006. ISBN 978-7-04-022085-8.
- ^ Malathi Raman, Karen Martin. One solution for cloning and mutagenesis: In-Fusion® HD Cloning Plus. Nature Methods 11 (2014).
- ^ Watson, N. A new revision of the sequence of plasmid pBR322. Gene. 1988, 70 (2): 399–403. PMID 3063608. doi:10.1016/0378-1119(88)90212-0.
- ^ pET28a. Havard University Medical School. [2017-07-17]. （原始内容存档于2017-07-17）.
- ^ Plasmid Cloning by PCR. Addgene. [2017-07-17]. （原始内容存档于2017-07-17）.
- ^ Hartwell LH, Hood L, Goldberg ML, Reynolds AE, Silver LM, Veres RC. Genetics: from genes to genomes. Boston: McGraw-Hill Higher Education. 2008. ISBN 0-07-284846-4.