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Norma Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa.
12-12-95 Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretara de Salud. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-092-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. METODO PARA LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA. JOSE MELJEM MOCTEZUMA, Director General de Control Sanitario de Bienes y Servicios, por acuerdo del Comit Consultivo Nacional de Normalizacin de Regulacin y Fomento Sanitario, con fundamento en los artculos 39 de la Ley Orgnica de la Administracin Pblica Federal; 38, fraccin II, 47 de la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin; 194 fraccin I de la Ley General de Salud; 2o. fraccin III, 34, 37, 40 y dems aplicables del Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios; 8o. fraccin IV y 13 fraccin I del Reglamento Interior de la Secretara de Salud, y CONSIDERANDO Que con fecha 23 de marzo de 1994, en cumplimiento de lo previsto en el artculo 46 fraccin I de la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin, la Direccin General de Control Sanitario de Bienes y Servicios present al Comit Consultivo Nacional de Normalizacin de Regulacin y Fomento Sanitario, el anteproyecto de la presente Norma Oficial Mexicana. Que con fecha 15 de septiembre de 1994, en cumplimiento del acuerdo del Comit y lo previsto en el artculo 47 fraccin I de la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin, se public en el Diario Oficial de la Federacin el proyecto de la presente Norma Oficial Mexicana a efecto que dentro de los siguientes noventa das naturales posteriores a dicha publicacin, los interesados presentarn sus comentarios al Comit Consultivo Nacional de Normalizacin de Regulacin y Fomento Sanitario. Que en fecha previa, fueron publicadas en el Diario Oficial de la Federacin las respuestas a los comentarios recibidos por el mencionado Comit, en trminos del artculo 47 fraccin III de la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin. Que en atencin a las anteriores consideraciones, contando con la aprobacin del Comit Consultivo Nacional de Normalizacin de Regulacin y Fomento Sanitario, se expide la siguiente: NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-092-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. METODO PARA LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA. En la elaboracin de la presente Norma participaron los siguientes organismos e instituciones: SECRETARIA DE SALUD Direccin General de Control Sanitario de Bienes y Servicios Instituto Nacional de Diagnstico y Referencia Epidemiolgica. INDRE Laboratorio Nacional de Salud Pblica SECRETARIA DE PESCA (AHORA: SECRETARIA DE MEDIO AMBIENTE, RECURSOS NATURALES Y PESCA) Instituto Nacional de la Pesca INDUSTRIAS VINICOLAS PEDRO DOMECQ, S.A. DE C.V. JUGOS DEL VALLE, S.A. DE C.V. LECHE INDUSTRIALIZADA CONASUPO, S.A. DE C.V. LICONSA SIGMA ALIMENTOS, S.A. DE C.V. SOCIEDAD MEXICANA DE NORMALIZACION Y CERTIFICACION, S.C. NORMEX INDICE 0 INTRODUCCION

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1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION 2 FUNDAMENTO 3 REFERENCIAS 4 DEFINICIONES 5 SIMBOLOS Y ABREVIATURAS 6 REACTIVOS Y MATERIALES 7 APARATOS E INSTRUMENTOS 8 PREPARACION DE LA MUESTRA 9 PROCEDIMIENTO 10 EXPRESION DE RESULTADOS 11 INFORME DE LA PRUEBA 12 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES 13 BIBLIOGRAFIA 14 OBSERVANCIA DE LA NORMA 15 VIGENCIA 0. Introduccin Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la tcnica comnmente utilizada es la cuenta en placa. En realidad esta tcnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos presentes. La variedad de especies y tipos diferenciables por sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxgeno disponible, etc., hacen que el nmero de colonias contadas constituyan una estimacin de la cifra realmente presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el adecuado. Por otra parte el recuento de termoflicos, psicroflicos y psicotrficos es importante para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Para obtener resultados reproducibles y por lo tanto significativos, es de suma importancia seguir fielmente y controlar cuidadosamente las condiciones. Esta tcnica puede aplicarse para la estimacin de microorganismos viables en una amplia variedad de alimentos. 1. Objetivo y campo de aplicacin 1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece el mtodo para estimar la cantidad de microorganismos viables presentes en un alimento, agua potable y agua purificada, por la cuenta de colonias en un medio slido, incubado aerbicamente. 1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el Territorio Nacional para las personas fsicas o morales que requieran efectuar este mtodo en productos nacionales y de importacin, para fines oficiales. 2. Fundamento El fundamento de la tcnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de eleccin despus de un cierto tiempo y temperatura de incubacin, presuponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo de la muestra bajo estudio. El mtodo admite numerosas fuentes de variacin, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores. 3. Referencias Esta Norma se complementa con lo siguiente: NOM-109-SSA1-1994 Procedimiento para la Toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. * NOM-110-SSA1-1994 Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. 4. Definicin

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Para fines de esta norma se entiende por: Unidades Formadoras de Colonias (UFC), trmino que debe utilizarse para reportar la cuenta de colonias en placa, las cuales pueden surgir de una clula o de un cmulo de clulas. 5. Smbolos y abreviaturas Cuando en esta norma se haga referencia a las siguientes abreviaturas y smbolos se entiende por: g gramo l litro ml mililitro C grado Celsius pH potencial de hidrgeno % por ciento UFC unidades formadoras de colonias h hora 6. Reactivos y materiales 6.1 Reactivos Los reactivos que a continuacin se mencionan, deben ser grado analtico. Cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada, con pH cercano a la neutralidad. Medio de Cultivo. Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuenta estndar). FORMULA INGREDIENTES CANTIDADES Extracto de levadura 2,5 g Triptona 5,0 g Dextrosa 1,0 g Agar 15,0 g Agua 1,0 l Preparacin del medio de cultivo. Suspender los componentes del medio deshidratado en un litro de agua. Hervir hasta total disolucin. Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables de capacidad no mayor de 500 ml, cantidades de aproximadamente la mitad del volumen del mismo. Esterilizar en autoclave a 121 1,0 C, durante 15 minutos. El pH final del medio debe ser 7,0 0,2 a 25C. Si el medio de cultivo es utilizado inmediatamente, enfriar a 45C 1,0 C en bao de agua y mantenerlo a esta temperatura hasta antes de su uso. El medio no debe de fundirse ms de una vez. En caso de medios deshidratados seguir las instrucciones del fabricante. El medio de cultivo anterior es el de uso ms generalizado. Para algunos alimentos en particular se requerir de un medio de cultivo especial que se debe indicar al describir la tcnica para ese alimento. 6.2 Materiales Todo el material que tenga contacto con las muestras o los microorganismos debe estar estril. Se requiere, los materiales mencionados en la NOM-110-SSA1-1994, Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. 7. Aparatos e instrumentos Se requiere, adems de los mencionados en la NOM-110-SSA1-1994, Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico, los siguientes: Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de 1,0C, provista con termmetro calibrado. Contador de colonias de campo obscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadrculada y lente amplificador. Registrador mecnico o electrnico. Microscopio ptico.

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Bao de agua con o sin circulacin mecnica, provista con termmetro calibrado con divisiones de hasta 1,0 C y que mantenga la temperatura a 45 1,0 C. 8. Preparacion de la muestra Para la preparacin de la muestra seguir la NOM-110-SSA1-1994, Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. 9. Procedimiento 9.1 Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin; la adicin de medio de cultivo y homogenizacin, se puedan realizar cmoda y libremente. Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculacin y correr por duplicado. 9.2 Despus de inocular las diluciones de las muestras preparadas segn la NOM-110-SSA1-1994, Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico, en las cajas Petri, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar. 9.3 Incluir una caja sin inculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad. 9.4 El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos. 9.5 Incubar las cajas en posicin invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, segn el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, vase el cuadro 1. CUADRO 1 Grupo Bacteriano Temperatura Tiempo de Incubacin Termoflicos aerobios 55 2C 48 2 h * Mesoflicos aerobios 35 2C 48 2 h Psicrotrficos 20 2C 3 - 5 das Psicroflicos 5 2C 7 - 10 das 9.6 En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el error en la cuenta. 9.7 Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de mohos y levaduras), incluyendo las colonias puntiformes. Hacer uso del microscopio para resolver los casos en los que no se pueden distinguir las colonias de las pequeas partculas de alimento. 10. Expresin de resultados 10.1 Clculo del mtodo. 10.1.1 Despus de la incubacin, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 25 a 250 colonias, usando el contador de colonias y el registrador. Las placas de al menos una de tres diluciones deben estar en el intervalo de 25 a 250. Cuando slo u dilucin est en el intervalo apropiado, vase el cuadro 2, na ejemplo 1. Calcular la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha dilucin y reportar. 10.1.2 Cuando dos diluciones estn en el intervalo apropiado, determinar la cuenta promedio dada por cada dilucin antes de promediar la cuenta de las dos diluciones para obtener la cuenta en placa por gramo o mililitro, vase el cuadro 2, ejemplo 2. 10.1.3 Con el fin de uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde las placas presenten situaciones no contempladas en los ejemplos anteriores, se presentan las siguientes guas: 10.1.3.1 Placas con menos de 25 colonias.- Cuando las placas corridas para la menor dilucin muestran cuentas de menos de 25 colonias, contar el nmero de colonias presentes en dicha dilucin, promediar el nmero de colonias y multiplicar por el factor de dilucin para obtener el valor estimado de cuenta en placa. Aclarar en su informe esta situacin agregando la leyenda "valor estimado", vase el cuadro 2, ejemplo 3. 10.1.3.2 Placas con ms de 250 colonias.- Cuando el nmero de colonias por placa exceda de 250, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribucin de colonias.

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Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del rea de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 2, respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri de 100 mm de dimetro contiene 65 cuadros de la cuadrcula del contador. Aclarar en el informe esta situacin agregando la leyenda "valor estimado", vase el cuadro 2, ejemplo 4. 10.1.3.3 Colonias extendidas.- Las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes formas: 10.1.3.3.1 Cadenas de colonias no separadas claramente entre s, que parecen ser causadas por la desintegracin de un cmulo de bacterias. 10.1.3.3.2 Colonias que se desarrollan en pelcula entre el agar y el fondo de la caja. 10.1.3.3.3 Colonias que se desarrollan en pelcula en la orilla de la caja sobre la superficie del agar. 10.1.3.3.4 Colonias de crecimiento extendido y en algunas ocasiones acompaadas de inhibicin del crecimiento, que en conjunto exceden el 50% de la caja o represin del crecimiento que por s mismo excede el 25% de la superficie de la caja. 10.1.3.3.5 Cuando es necesario contar en cajas que contienen colonias extendidas que no estn incluidas en 10.1.3.3.4, contar cualquiera de los tipos 10.1.3.3.1, 10.1.3.3.2 10.1.3.3.3, como provenientes de una sola fuente. En el caso de las colonias del tipo 10.1.3.3.1, si la caja contiene una sola cadena, contar como una sola colonia, si la caja contiene varias cadenas que parecen originarse de fuentes separadas, contar cada cadena como colonia individual. No contar cada colonia de la cadena individualmente. Las colonias del tipo 10.1.3.3.2 y 10.1.3.3.3 generalmente se observan como crecimiento diferenciable de otras colonias y se cuentan como tales. Los crecimientos tipo 10.1.3.3.4, reportarlos como crecimiento extendido. En caso de que una dilucin se encuentre dentro del rango y otra dilucin presente colonias de crecimiento extendido, reportar la dilucin en la que se pueden contar las colonias, vase el cuadro 2, ejemplo 5 10.1.4 Placas sin colonias.- Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias, reportar la cuenta en placa como menor que una vez el valor de la dilucin ms baja usada, vase el cuadro 2, ejemplo 6. 10.1.5 Placas corridas por duplicado, una con crecimiento dentro del intervalo adecuado y otra con ms de 250 colonias.- Cuando una placa tiene entre 25 y 250 colonias y su duplicado ms de 250 colonias, contar ambas placas incluyendo la que est fuera del intervalo para determinar la cuenta en placa, vase el cuadro 2, ejemplo 7. 10.1.6 Placas corridas por duplicado, una placa de cada dilucin dentro del intervalo de 25 a 250 colonias.Cuando una placa dentro de diferentes diluciones contiene el nmero de colonias especificadas en el intervalo, contar el nmero de colonias de las cuatro placas para calcular la cuenta en placa, vase el cuadro 2, ejemplo 8. 10.1.7 Placas corridas por duplicado, ambas placas de una dilucin dentro del intervalo de 25 a 250 y slo una de la otra dilucin dentro del mismo. Contar las cuatro cajas incluyendo aqulla con menos de 25 o ms de 250 colonias, para calcular la cuenta en placa, vase el cuadro 2, ejemplo 9. 10.1.8 Despus de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas, multiplicar por la inversa de la dilucin para obtener el nmero de UFC por mililitro o gramo de la muestra. Redondear la cifra obtenida en la cuenta de manera que slo aparezcan dos dgitos significativos al inicio de esta cifra. Para redondear, elevar el segundo dgito al nmero inmediato superior cuando el tercer dgito de la derecha sea cinco o mayor (por ejemplo: 128 redondear a 130). Si el tercer dgito es cuatro o menos, reemplazar el tercer dgito con cero y el segundo dgito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400): 11. Informe de la prueba Reportar como: Unidades formadoras de colonias,___ UFC/g o ml, de bacterias aerobias en placa en agar triptona extracto de levadura o agar para cuenta estndar, incubadas ________ horas a _______ C. CUADRO 2 Clculo de los valores de la cuenta en placa (Ensayos por duplicado) Ejemplo Colonias contadas UFC/g o ml

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nmero 1 2 3 4 5

1: 100 > 250a > 250 > 250 18 14 > 250 > 250 > 250 > 250

1: 1000 178 190 220 238 2 0 > 250 > 250 240 235

0 0 < 100c > 250 240 250000 > 250 268 8 > 250 216 280000 > 250 262 9 > 250 215 230000 > 250 235 > 250 275 270000 > 250 225 12. Concordancia con normas internacionales Esta Norma no tiene concordancia con normas internacionales. 13. Bibliografa 13.1 Secretara de Comercio y Fomento Industrial. 1992. Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin. Diario Oficial de la Federacin. Mxico, D.F. 13.2 Secretara de Salud. 1984. Ley General de Salud. Diario Oficial de la Federacin. Mxico, D.F. 13.3 Secretara de Salud. 1988. Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios. Mxico, D.F. 13.4 Secretara de Comercio y Fomento Industrial. NOM-008-SCFI-1993. Norma Oficial Mexicana. Sistema General de Unidades de Medida. 13.5 Bacteriological Analytical Manual. 1984. Food and Drugs Administration FDA. Bureau of Foods. Division of Microbiology. 6a Ed. Washington D.C. 13.6 NORMA-Z-013/02. 1981. Gua para la Redaccin, Estructuracin y Presentacin de las Normas Oficiales Mexicanas. Secretara de Comercio y Fomento Industrial. 13.7 Tomasiewicz, D. M., et al. 1980. The most suitable number of colonies on plate for counting. Journal of Food Protection. 43: 4. 13.8 Vanderzant F., Carland S., y Don F. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. American Public Health Association. Washington, D.C. 1992. 14. Observancia de la norma La vigilancia del cumplimiento de la presente Norma corresponde a la Secretara de Salud. 15. Vigencia La presente Norma Oficial Mexicana, entrar en vigor con carcter de obligatorio a los 30 das siguientes a partir de su publicacin en el Diario Oficial de la Federacin. Sufragio Efectivo. No Reeleccin. Mxico, D.F., a 10 de noviembre de 1995.- El Director General, Jos Meljem Moctezuma.- Rbrica. 6 7

1: 10000 16 17 25 28 0 0 512 495 34 crecimiento extendido 0 24 19 23 42 20 26 32 26

180000 250000 1600b 5000000b 290000

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