Anlisis microbiolgico: Documento aclaratorio NT-32 Rev.

3 Abril 2012

Pgina INDICE 1. 2. 3. 4. INTRODUCCIN ...................................................................................................................................... 1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN .......................................................................................................... 2 MTODOS DE ENSAYO ............................................................................................................................ 2 CARACTERSTICAS DE FUNCIONAMIENTO DE LOS MTODOS. VALIDACIN. ........................................... 3 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 5. 6. Mtodos normalizados (Tipo I) ............................................................................................................ 3 Mtodos alternativos (Tipo II) .............................................................................................................. 3 Mtodos basados en mtodos de referencia (Tipo III) ........................................................................ 4 Comprobacin del funcionamiento de mtodos Tipo I, II y III.............................................................. 4 Otros mtodos (Tipo IV) ....................................................................................................................... 5

ESTIMACIN DE INCERTIDUMBRE .......................................................................................................... 5 ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS DE ENSAYO ...................................................... 5 6.1. 6.2. Control interno ..................................................................................................................................... 6 Control externo (intercomparaciones) ................................................................................................. 6

7.

REFERENCIAS .......................................................................................................................................... 7

ANEXO I: CEPAS DE REFERENCIA

1.

INTRODUCCIN

El desarrollo y realizacin de anlisis de control microbiolgico es una herramienta que tiene una repercusin decisiva en el mbito de la salud pblica, la tecnologa alimentaria y el Medio Ambiente. Los laboratorios que realizan estos ensayos trabajan en un entorno de creciente exigencia y responsabilidad, tanto legal como social, que reclama un nivel de calidad y de confianza extraordinarios. Por ello, tanto los mtodos de ensayo como los laboratorios que realizan los anlisis deben asegurar, al mximo nivel permitido por el desarrollo cientfico y tcnico, la fiabilidad de los resultados. Esto implica que, adems de reunir los criterios tcnicos que aseguren su validez, deben ser realizados con una serie de garantas, que permitan obtener resultados comparables, con independencia del laboratorio que los ejecute. En este sentido, el empleo de mtodos de referencia, reconocidos y aceptados, es la herramienta ms eficaz para obtener estas garantas En la actualidad, existe una amplia disponibilidad de mtodos de ensayo (por ejemplo normas de ensayo que tienen reconocimiento internacional como mtodos de referencia) que establecen el estndar cientfico a considerar, llegando incluso, cada vez con ms frecuencia, a convertirse en mtodos oficiales al ser invocados en la reglamentacin. Por otra parte, los criterios de acreditacin de ENAC deben mantenerse siempre en lnea con las tendencias que las comunidades cientfica y tecnolgica establecen como ms apropiadas, establecidas en este caso por mtodos de referencia, como normas y documentos similares. Por esta razn, se considera necesario poner de manifiesto las ventajas que aporta a los laboratorios el uso de mtodos de referencia normalizados, como va principal para garantizar la validez de los mtodos y la fiabilidad de los resultados, frente a mtodos de elaboracin propia que requieren de procesos complejos de validacin.
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En la elaboracin de este documento han participado la Sociedad Espaola de Microbiologa (SEM), la Agencia Espaola de Seguridad Alimentaria y Nutricin (AESAN), el Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino (MARM) y la Asociacin de Entidades de Ensayo, Calibracin y Anlisis-FELAB (EUROLABEspaa-Asociacin Espaola de Laboratorios de Ensayo, Calibracin y Anlisis / AELI Asociacin Espaola de Laboratorios Independientes). Asimismo, se ha previsto la posibilidad de incorporar anexos a este documento, relativos a cuestiones tcnicas de inters, elaborados en su caso, en colaboracin con organizaciones tcnicas competentes. 2. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN

El objetivo de este documento es establecer los criterios a utilizar por ENAC para la acreditacin de los laboratorios que realizan ensayos microbiolgicos. No debe entenderse esta nota como un documento en el que se establece una metodologa para la validacin de mtodos de ensayo sino como unas directrices que faciliten tanto la implantacin en los laboratorios de los aspectos aqu recogidos, como su evaluacin por parte de ENAC. Asimismo, se incluye un anexo sobre manipulacin y conservacin de cepas referencia, elaborado en colaboracin con la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT).

3.

MTODOS DE ENSAYO

La norma UNE-EN ISO/IEC 17025 en su apartado 5.4.2 establece que El laboratorio debe utilizar mtodos de ensayo que satisfagan las necesidades del cliente y sean apropiados para el uso previsto. Por tanto, debe tenerse en cuenta el mbito de aplicacin, tanto por el laboratorio en cuanto a la seleccin de los procedimientos de ensayo y su validacin, como por el organismo de acreditacin en las evaluaciones que realice. Adems, la norma establece que cuando el cliente no especifique el mtodo a utilizar, el laboratorio debe seleccionar los mtodos apropiados que hayan sido publicados en normas internacionales, regionales o nacionales, por organizaciones tcnicas reconocidas o en libros o revistas cientficas especializados o especificados por el fabricante de equipos . Por tanto, en el caso de elegir un procedimiento de ensayo interno, es recomendable que se parta de mtodos de referencia que sean ampliamente aceptados, conocidos y aplicados en el sector. As pues, debido al marco en que se ubica la aplicacin y uso de los ensayos microbiolgicos, se podra establecer la siguiente clasificacin de mtodos, atendiendo al nivel de confianza que aportan y que, por tanto, marcarn el nivel de informacin adicional que ENAC requerir relativa a su validez: Tipo I: Mtodos normalizados. Son mtodos desarrollados por un organismo de normalizacin o por otras organizaciones bien establecidas, cuyos mtodos son generalmente aceptados por el sector tcnico en cuestin (ILAC G 18) (Ej.: ISO, NF, NMKL, UNE, EN, AOAC, APHA etc.) Nota: Un mtodo normalizado ha sido exhaustivamente estudiado y describe de forma clara y exacta las condiciones de realizacin del ensayo. Sus caractersticas de funcionamiento deben ser acordes con el uso previsto. Estos mtodos normalizados son considerados mtodos de referencia ya que pueden ser utilizados para evaluar otros mtodos desarrollados para la misma determinacin (ISO 16140).

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Tipo II: Mtodos alternativos. Mtodos que han sido validados por comparacin con el mtodo de referencia que corresponda, de acuerdo a un estndar aceptado (ej. ISO 16140, ISO/TR 13843, ISO 17994 etc.) y son generalmente reconocidos por la comunidad cientfica y tecnolgica como equivalentes al mtodo de referencia. Tipo III: Mtodos basados en mtodos de referencia . Mtodos descritos en procedimientos internos del laboratorio, que estn basados claramente en mtodos de referencia y que no suponen una modificacin tcnica respecto del mtodo de referencia que ponga en cuestin su validez tcnica. Deben mantenerse actualizados en relacin con el mtodo de referencia en que se fundamentan. Nota: En cualquier caso, se consideran modificaciones tcnicas respecto del mtodo de referencia, aquellas que pongan en cuestin su validez tcnica, como por ejemplo, cambios relevantes en un medio de cultivo, cambios en las condiciones de incubacin (tiempo/temperatura), etc. Tipo IV: Otros mtodos. Son aquellos mtodos desarrollados por el propio laboratorio o por cualquier otra parte (un fabricante o proveedor de equipos, de medios de cultivo etc.), y que no disponen del reconocimiento de los mtodos de referencia o de los mtodos alternativos. Nota: En los Anexos Tcnicos nicamente los mtodos del Tipo I reflejarn la norma o documento de referencia. Los mtodos englobados en los Tipos II, III y IV figurarn en el Anexo Tcnico como Procedimiento Interno. Como parte de los procedimientos de ensayo, se deben incluir tambin los procedimientos para la preparacin de las muestras en relacin con el alcance solicitado, pues se trata de un aspecto crtico en determinados alcances (ej.: alimentos). Existen normas reconocidas que regulan la manipulacin previa de los objetos de ensayo (ej. serie de normas ISO 6887, UNE-EN ISO 8261) y que deben ser consideradas como una referencia adecuada.

4.

CARACTERSTICAS DE FUNCIONAMIENTO DE LOS MTODOS. VALIDACIN.

Los mtodos de ensayo presentados para su acreditacin deben estar validados. Segn la norma UNE-EN ISO/IEC 17025 la validacin es la confirmacin, a travs del examen y el aporte de evidencias objetivas, de que se cumplen los requisitos particulares para un uso especfico previsto. Para ello, es necesario conocer las caractersticas de funcionamiento del mtodo. Por otra parte, la extensin de las actividades de validacin a realizar por el laboratorio depender del tipo de mtodo seleccionado: 4.1. Mtodos normalizados (Tipo I) Los mtodos normalizados entendidos como de referencia no requieren una validacin completa. El laboratorio debe, tal y como establece la norma UNE-EN ISO/IEC 17025:2005 confirmar que puede aplicar correctamente los mtodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos.

4.2. Mtodos alternativos (Tipo II) A efectos de validacin, los mtodos alternativos se tratarn como los mtodos de referencia. No obstante, para que ENAC entienda que un mtodo se puede considerar como mtodo alternativo deber disponer de evidencias de su validacin. En caso de que dichas evidencias no estn disponibles ser responsabilidad del laboratorio solicitante el aportarlas.
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4.3. Mtodos basados en mtodos de referencia (Tipo III) Los mtodos basados en mtodos de referencia no precisan de una validacin completa. No obstante el laboratorio deber realizar la necesaria comprobacin de su funcionamiento.

4.4. Comprobacin del funcionamiento de mtodos Tipo I, II y III El laboratorio debe justificar la seleccin del nmero y tipo de matrices en funcin del alcance de acreditacin y sta debera basarse en la informacin tomada de referencias bibliogrficas o estndares internacionales (ej.: Anexo B de UNE-EN ISO 16140, ISO/TS 19036). A continuacin se indican las caractersticas de funcionamiento que al menos se deben confirmar en el caso de mtodos de referencia, alternativos y basados en mtodos de referencia teniendo en cuenta la naturaleza del mtodo: - Mtodos cuantitativos: Recuperacin En cuanto a la estimacin de la recuperacin debera evaluarse a partir de valores de referencia. Estos valores podran obtenerse por comparacin con mtodos de referencia, a partir de muestras inoculadas con materiales de referencia o cepas de referencia o a partir de resultados de interlaboratorios. Reproducibilidad Se considera una referencia adecuada las pautas establecidas en el documento tcnico ISO/TS 19036:2006. Hay que tener en cuenta que, se debe realizar el clculo de la precisin (reproducibilidad) en muestras con diferentes niveles de contaminacin (ISO 19036:2006 y su modificacin). En el caso de muestras con alto nivel de contaminacin se deben realizar las correspondientes diluciones decimales para permitir el recuento de las placas, dentro del intervalo que se establece en documentos de referencia (ej. normas ISO 8199 e ISO 7218). - Mtodos cualitativos: Lmite de deteccin La estimacin del lmite de deteccin requiere del empleo de suspensiones de inculo con niveles de concentracin bajos. El propio intervalo de confianza a estos bajos niveles hace que, desde un punto de vista estadstico, no se pueda conocer de forma exacta si un determinado inculo contiene o no el microorganismo a detectar. Por tanto, es aceptable comprobar el mtodo con bajos niveles de inculos de microorganismos diana de forma que se evalen diferencias entre las distintas matrices, analistas, equipos etc., verificndose la capacidad del laboratorio para obtener resultados reproducibles y eficaces a estos niveles.

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Asimismo, puede obtenerse informacin sobre las caractersticas de funcionamiento de los mtodos de: Actividades de control de calidad interno : Los resultados obtenidos en las actividades de control de calidad interno aplicando el mtodo de ensayo a confirmar, pueden ser utilizados en la comprobacin del mtodo (ej. verificacin de nuevas matrices). Participacin en Intercomparaciones (Control de calidad externo): Los resultados obtenidos en la participacin en intercomparaciones, tambin pueden ser utilizados para la comprobacin de un mtodo. Para ello, el laboratorio deber evaluar la idoneidad y calidad del programa de intercomparacin, valorando si es adecuado utilizar la informacin proporcionada por el ejercicio en la comprobacin. Puede tomarse como referencia lo dispuesto al respecto en G-ENAC-09 o ISO/TS 19036.

4.5. Otros mtodos (Tipo IV) La norma UNE-EN ISO/IEC 17025 en su apartado 5.4.2 establece que el laboratorio debe validar los mtodos no normalizados y los mtodos que disea o desarrolla para confirmar que los mtodos son aptos para el fin previsto. La validacin debe ser tan amplia como sea necesario para satisfacer las necesidades del tipo de aplicacin o del campo de aplicacin dados. Por tanto, para este tipo de mtodos, el laboratorio deber evaluar su idoneidad para su mbito de aplicacin as como las actividades necesarias a realizar para garantizar su validez tcnica. En este sentido las actividades recogidas en el apartado 4.4 que se han considerado como vlidas para asegurar la adecuacin al uso, no permiten garantizar de forma completa la validez de los mtodos definidos como Tipo IV ni su caracterizacin ya que stas deben estar fundamentadas en referencias vlidas (ej.: ISO 16140, ISO /TR 13843, UNE-EN ISO 17994) ENAC deber disponer de evidencias completas de que dichos mtodos han sido adecuadamente validados. El laboratorio deber disponer de toda la informacin sobre el trabajo experimental realizado para la validacin del mtodo.

5.

ESTIMACIN DE INCERTIDUMBRE

La estimacin de Incertidumbre no es de aplicacin a mtodos cualitativos ni NMP. En el caso de ensayos microbiolgicos de recuento en productos agroalimentarios se ha publicado la ISO/TS 19036:2006 que puede utilizarse como referencia. En el caso de anlisis microbiolgico de aguas existe el documento ISO 29201, el cual est en desarrollo.

6.

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS DE ENSAYO

En la norma UNE-EN ISO/IEC 17025 se establece que el laboratorio debe disponer de un control de calidad para realizar el seguimiento de la validez de los ensayos.

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En el mbito de los ensayos microbiolgicos, la implantacin de actividades de control de calidad adecuadas resulta especialmente importante, dado que no siempre es posible caracterizar de forma completa el funcionamiento de estos procedimientos de ensayo. No obstante, es factible establecer sistemas que permitan garantizar el adecuado control de los procedimientos de ensayo microbiolgicos. El aseguramiento de la calidad debe ser tanto interno como externo y puede aplicarse de diferentes formas:

6.1. Control interno Control de las condiciones de trabajo: proporciona informacin sobre la esterilidad de los medios y materiales auxiliares utilizados y en general, sobre la buena prctica en la realizacin de los ensayos. Deben existir criterios para la desviacin permitida. Ensayos cuantitativos: Control de la precisin: muestras naturales sin inocular y/o muestras naturales inoculadas Control de recuperacin: muestras segn lo establecido en el apdo. 4.4 (Recuperacin) Ensayos cualitativos: El control de calidad interno debe incluir actividades que garanticen un adecuado control del mtodo a niveles bajos de contaminacin (ver apdo. 4.4 Lmite de deteccin)

Estas actividades de control de calidad deben realizarse en la medida de lo posible con muestras naturales tanto positivas (inoculadas o contaminadas naturalmente) como negativas.

6.2. Control externo (intercomparaciones) La participacin en intercomparaciones permite una evaluacin del sesgo de forma que el laboratorio pueda demostrar que se mantiene dentro de los criterios de aceptacin definidos por normas, reglamentos, por el cliente o por el laboratorio. Todas las actividades de aseguramiento de la calidad debern planificarse de forma que, en el tiempo y en funcin del alcance del mtodo se incluya una adecuada representacin de la variedad de matrices con las que trabaja el laboratorio, complementndose as los resultados obtenidos en la validacin inicial. Por ltimo, la periodicidad de las actividades de control de calidad tanto interno como externo deber establecerse considerando diversos factores como pueden ser: - La robustez del mtodo utilizado (en funcin de los controles especficos incluidos en el mismo, mtodo de referencia o de rutina, pruebas de confirmacin, datos de validacin, vigencia del mtodo etc.) - La frecuencia con la que el laboratorio ejecuta dichos anlisis (dado que se debe asegurar que el laboratorio mantiene la destreza en la ejecucin del mismo en cuanto a los materiales, equipos y cualificacin del personal) - Los resultados histricos de aseguramiento de calidad, as como la correcta evaluacin de los mismos.

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- Los resultados obtenidos en el conjunto de acciones de evaluacin de la calidad (ej. siembra por duplicado de placas, verificacin del factor de dilucin, interlaboratorios, muestras blancas, control de medios de cultivo, controles ambientales, cualificacin del personal etc.)

7.

REFERENCIAS Reglamento (CE) n 2073/2005, de la Comisin, de 15 de noviembre de 2005, relativo a los criterios microbiolgicos aplicables a los productos alimenticios. G-ENAC-04 Rev. 1 Gua para la acreditacin de laboratorios de anlisis microbiolgicos. G-ENAC-09 Rev. 1 Gua para la expresin de la incertidumbre en los ensayos cuantitativos. ILAC-G18:04/2010. Guideline for the Formulation of Scopes of Accreditation for Laboratories UNE-EN ISO 16140:2003 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal. Protocolo para la validacin de mtodos alternativos. ISO/TR 13843:2000 Water quality Guidance on validation of microbiological methods. ISO 17994:2004 Water quality Criteria for establishing equivalence between microbiological methods. ISO 19458:2006 Water quality -Sampling for microbiological analysis. ISO 8199:2005 Water quality General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture. ISO/TS 19036:2006 Microbiology of food and animal feeding stuffs Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations. UNE-EN ISO 6887-1:2004 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y alimentacin animal. Preparacin de las muestras de anlisis, suspensin inicial y diluciones decimales para examen microbiolgico. Parte 1: Reglas generales para la preparacin de las muestras de anlisis, suspensin inicial y diluciones decimales. UNE-EN ISO 6887-2:2004 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y alimentacin animal. Preparacin de las muestras de anlisis, suspensin inicial y diluciones decimales para examen microbiolgico. Parte 2: Reglas especficas para la preparacin de carne y productos crnicos. UNE-EN ISO 6887-3:2004 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal. Preparacin de las muestras de ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para examen microbiolgico. Parte 3: Reglas especficas para la preparacin de pescados y productos de la pesca. UNE-EN ISO 6887-4:2004 y UNE-EN ISO 6887-4/AC:2005 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal. Preparacin de las muestras de ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para examen microbiolgico. Parte 4: Reglas especficas para la preparacin de productos distintos a leche y productos lcteos, carne y productos crnicos y, pescados y productos de la pesca. UNE-EN ISO 8261:2002 Leche y productos lcteos. Directrices generales para la preparacin de muestras para anlisis, suspensiones iniciales y diluciones decimales para el anlisis microbiolgico.
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UNE-EN ISO/IEC 17025:2005 Evaluacin de la conformidad. Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibracin. UNE-ENV ISO 11133-1:2001. Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal. Gua para la preparacin y produccin de medios de cultivo. Parte 1: Directrices generales para el aseguramiento de la calidad para la preparacin de medios de cultivo en el laboratorio. UNE-ENV ISO 11133-2:2006. Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal. Gua para la preparacin y produccin de medios de cultivo. Parte 2: Gua prctica para las pruebas de rendimiento de medios de cultivo. ISO 7218: 2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs. General rules for microbiological examinations CEN ISO CD 11133: 2009. Microbiology of food, animal feeding stuffs, food production environment and water Preparation, production, storage and performance testing of culture media. ISO 29201. Water Quality The variability of test results and the uncertainty of measurement of microbiological enumeration methods.

El presente documento se distribuye como copia no controlada. Puede consultar su revisin en la pgina web de ENAC o internamente en red.

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Anlisis microbiolgico: Documento aclaratorio NT-32 Rev. 3 Abril 2012 Anexo I

CEPAS DE REFERENCIA

1. Nmero de pases que se pueden realizar a una cepa procedente de CC/BRC (Coleccin de
Cultivos Microbianos reconocida o Centro de Recursos Biolgicos Microbianos) : La reconstitucin de la cepa y su primera siembra en medio de cultivo es slo una activacin y no debe considerarse un pase. La activacin es una etapa necesaria y crtica y debe hacerse en los medios de cultivo indicados por la Coleccin. El laboratorio debe conservar registros de dicha etapa. Los pases que se hayan realizado en la Coleccin de procedencia no deben ser tenidos en cuenta por el laboratorio ni afectan al nmero de pases que puede realizar (los pases realizados en la Coleccin forman parte de los Antecedentes de la cepa y quedan registrados en la ficha de cada cepa que la Coleccin debe mantener actualizada). El laboratorio debe demostrar que el nmero de pases que realiza a las cepas no afecta a sus caractersticas (en funcin de su uso previsto). Debe tenerse en cuenta que a mayor nmero de pases mayor riesgo de contaminacin y de que se produzcan mutaciones.

2. Verificacin de las cepas procedentes de CC/BRC en el laboratorio:

No es necesario que el laboratorio confirme la identidad de la cepa de referencia ya que sta viene aportada con el certificado. Las verificaciones a realizar por el laboratorio dependern, en cada caso, del uso previsto de la cepa. Por tanto, el laboratorio deber confirmar en el laboratorio nicamente las caractersticas (bioqumicas, morfolgicas, etc.) que le afecten segn el uso de dicha cepa en su laboratorio. Por otro lado, en cada pase debe evaluarse la viabilidad y la pureza.

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