PRÁCTICA No. 7 Lab. Micología
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7 GNERO CNDIDA Objetivo general: Que el alumno se familiarice con las especies del gnero Cndida, comprenda a este gnero como Hongos oportunistas y sea capaz de diagnosticar candidiasis en el laboratorio de anlisis clnicos. Fundamento. CRHOMagar Candida El CRHOMagar Candida es un medio cromgeno usado para la identificacin de levaduras del gnero Candida. Tambin se usa como un medio de aislamiento e identificacin primaria de levaduras en general, a partir de diferentes especmenes biolgicos. Se trata de un medio comercial que contiene sustancias cromgenas que confieren coloracin particular a algunas colonias de especies de Candida. En 1994 Odds y Bernaerts describieron el CHROMagar Candida como un nuevo medio de cultivo para el aislamiento y la posible identificacin de levaduras con importancia clnica en micologa mdica en un periodo de 24 a 48 horas, con base en un amplio contraste de colores en las colonias. El mtodo permite, adems, la identificacin de mltiples especies en un espcimen ms fcilmente que con un medio micolgico normal. El propsito primordial de esta revisin es dar a conocer la importancia de la utilizacin y factibilidad del uso cotidiano del CHROMagar Candida en la identificacin de las diversas especies de Cndida en aislamientos mucocutneos. Ballest y su grupo y Ycesoy y Marol reportaron para el CHROMagar Candida sensibilidad de 88 a 99% y especificidad de 96 a 100% para las cepas de C. albicans. Para las cepas no albicans el mtodo tuvo sensibilidad de 90 a 96% y especificidad de 88 a 100%. Garca Martos y su grupo describieron que la sensibilidad y la especificidad fueron superiores a 97% para el conjunto de las cepas aisladas de Candida sp, y de 100% para C. albicans y C. tropicalis en ambos parmetros; de 97.3 y 99% para C. glabrata, de 92.3 y 99.6% para C. krusei y de 90.3 y 99.6% para C. parapsilosis.
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Prueba del tubo germinal o filamentacin Es una prueba til para diferenciar C.albicans/C.dubliniensis de Cndida NO albicans. Se realiza a partir de una colonia fresca (24-48 h de crecimiento) utilizando plasma fresco o suero humano con glucosa incubando a 37 C por mximo 3 horas.El tubo germinal es una extensin filamentosa de la levadura, sin estrechamiento (constriccin) en su sitio de unin con la blastoconidia, que da lugar a hifas verdaderas. Slo C. albicans/C.dubliniensis son capaces de producir verdaderos tubos germinales; sin embargo, otras especies como C. tropicalis pueden producir seudohifas de aspecto similar a los tubos germinales pero con blastoconidias ms grandes que las de C.albicans. Para considerar una prueba como positiva deben observarse ms de 5 tubos germinales. Formacin de Clamidoconidias Esta prueba se realiza en medios pobres como cornmeal, papa zanahoria, agar casena, agar tomate, agar tabaco, entre otros, con tween 80, incubados por 72 horas a 25C. Las clamidoconidias son formas de resistencia, redondas u ovales, de 6-12 m de dimetro y pared gruesa, con aspecto de esporas, presentes en las seudohifas. Pueden ser laterales o terminales, en acmulos, pares o tripletas.
Se denomina as a ciertos hongos saprfitos que en algunas oportunidades invaden el organismo humano o de otros animales, gracias a determinados factores predisponentes del husped. Los saprfitos que se aslan de ciertas enfermedades son: Mucor, Absidia, Rhizopus, Aspergillus, Cephalosporium, etc. Los que viven saprofiticamente y adems cohabitan en mucosas o piel como Candida, Cryptococcus, Geotrichum, son aislados, frecuentemente; en ciertos pacientes que ofrecen condiciones favorables para su proliferacin, tales como los tratados con drogas antineoplsicas, corticoides, antibiticos y los que presentan disproteinemia o debilidad orgnica generalizada. Para realizar un diagnstico correcto de una micosis producida por un hongo oportunista hay que extremar todos los cuidados posibles, pues podra
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tratarse de una contaminacin accidental de los materiales o muestras extradas y procesadas; por lo tanto deben tenerse muy en cuenta: a) Hallazgo del mismo tipo de parsito en muestras extradas con varios das de intervalo. b) Desarrollo del mismo hongo en todos los sembrados. c) Pruebas serolgicas positivas. d) Estudio de las causas predisponentes. e) Mejora o curacin con el tratamiento adecuado. CANDIDOSIS
DEFINICIN
Micosis primaria o secundaria ocasionada por levaduras endgenas y oportunistas del gnero Cndida, especialmente C. albicans. Las manifestaciones clnicas son localizadas, diseminadas o sistmicas; pueden afectar piel, mucosas, estructuras profundas y rganos internos. Las alteraciones histopatolgicas varan desde inflamacin mnima hasta supuracin o granuloma. La evolucin es aguda, subaguda o crnica. ETIOPATOGENIA Los agentes causales son las levaduras anascosporadas. Se han descrito 81 especies, de las cuales al menos siete causan enfermedades en seres humanos. El gnero Candida, en sentido amplio, es dimorfo. Las especies ms comunes son:
Candida albicans. Candida guilliermondii. Candida parapsilosis. Candida kruseii. Candida tropicalis. Candida pseudotropicalis. Candida stellatoidea. C. albicans se ha dividido en varios biotipos, y por sus caractersticas antignicas, en los grupos (serotipos) A y B.
Estos hongos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, pero C. albicans solo se encuentra como endosaprfito del tubo digestivo de
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mamferos y aves. En seres humanos son comensales de la cavidad bucal, tubo digestivo y mucosa vaginal. La mayor parte de las levaduras tambin s encuentran en la piel sana, excepto C. albicans y C. tropicalis, que se llegan a aislar de regin perianal, peribucal y dedos. Hay resistencia natural a la infeccin, pero no est bien definida, quizs depende de factores inhibidores, concentraciones sricas elevadas de hierro, potenciales de xido-reduccin y competencia entre levaduras por nutrimentos. Es probable que los neutrfilos sirvan como defensa primaria contra invasin y diseminacin. La infeccin ocurre a partir de un foco endgeno y en pocas ocasiones, del medio externo. Los hongos actan como oportunistas y se convierten en patgenos cuando hay alteraciones de inmunidad celular, como inmunodeprimidos; a consecuencia de cambios fisiolgicos de la flora normal. La forma congnita puede ocurrir por invasin ascendente con afeccin de la membrana corioalantoidea. En la candidosis mucocutnea crnica los linfocitos T pierden su capacidad para reaccionar contra el estmulo antignico general o contra antgenos especficos de Candida. La candidosis puede ser enfermedad ocupacional o transmitirse por contacto sexual. Los factores predisponentes son mltiples y muchas veces combinarse.
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La gravedad de la infeccin depende sobretodo de las alteraciones primarias del husped ms que de las propiedades patgenas del hongo. El microorganismo causal ms frecuente y virulento es C. albicans, son menos patgenas C. stellatoidea y C. tropicalis. En pacientes con SIDA se encuentra con mayor frecuencia C. albicans serotipo B, pero al parecer no son cepas en particular virulentas.
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En la vaginitis se presenta inflamacin, leucorrea blanquecina, espesa y grumosa; prurito intenso, sobre todo premenstrual y extensin de las lesiones a vulva y perin. La mucosa vaginal muestra placas blanquecinas, amarillentas o seudomembranosas. Los intertrigos son primarios o por extensin de una localizacin en mucosas; afectan pliegues, como los axilares, submamarios, inguinales, surco interglteo, espacios interdigitales de manos y pies. Se caracterizan por eritema, descamacin y piel macerada, bordes marcados por un collarete de escamas y lesiones satlite papulares, vesiculares o pustulosas, prurito y dolor. La forma neonatal se presenta como muguet o con lesiones vesiculares o pustulosas diseminadas que afectan sobre todo el tronco, aparecen desde el nacimiento y curan solas en una a cuatro semanas; en ocasiones persisten varios meses. En adictos a drogas predominan las lesiones foliculares en cabeza y cara; tambin hay formas secundarias grandes en quemados. La paroniquia es una inflamacin periungueal dolorosa, a veces con salida de pus a la presin; despus sobreviene la afeccin ungueal. Hay oniclisis, o engrosamiento y deformacin de la ua, presencia de estras transversales y cambios de color que van del blanco amarillento al verde, caf (marrn) o negro. La candidosis mucocutnea crnica se inicia en la lactancia o la niez; se relaciona con anormalidades genticas: agenesia o displasia del timo, con agammaglobulinemia o sin ella y la consecuente disfuncin linfocitaria, defectos de la funcin de leucocitos, endocrinopatas. Puede ser idioptica o acompaar a una deficiencia de zinc. Cuando se presenta en adultos afecta a mayores de 35 aos de edad y se relaciona con enfermedades malignas internas.
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Bucal. Digestiva. Mucocutnea Vaginitis y balanitis. Bronquial y pulmonar. Localizada Intertrigos. Cutnea Paroniquia y onicomicosis. Vesiculopustular y folicular.
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DIAGNSTICO MICOLGICO
Materiales:
El estudio se realiza sobre escamas de piel, uas, esputos, pus, flujo vaginal.
Examen microscpico directo: Entre porta y cubreobjeto se observan pus, esputo, flujo, etc. Pueden realizarse coloraciones como la de Gram, ya que las levaduras son gram positivas. Los raspados de piel y uas se colocan sobre el portaobjeto con una gota de NaOH al 30%, calentando suavemente al mechero para aclarar el material corneo de la piel. Se observarn las levaduras brotantes y, frecuentemente seudomicelio. Cultivo: Las siembras se realizarn en Sabouraud glucosado con y sin antibiticos. Las levaduras ya aparecen formando una colonia blanquecina y cremosa a las 24-48 horas de incubacin a 28 y 37C.
La Candida es una levadura imperfecta que no produce ascosporos en el bloque de yeso; sembrada en agar harina de maz o medios especiales que se pueden adquirir en el comercio, origina seudomicelio, lo que no sucede con las levaduras perfectas. En este medio la C. albicans produce clamidosporas que son caractersticos de esta especie. Existen medios de cultivos diferenciales para las distintas especies de Candida. Incubando a 37C una suspensin de levaduras en estudio en 0.5 cm 3 de suero humano inactivado, despus de 2 a 4 horas la C. albicans y la C. stellatoidea forman filamentos, mientras que las otras especies no lo hacen. Otra reaccin bioqumica es la reduccin de sales de trifeniltetrazolio, incorporadas al Sabouraud glucosado al 0.10% (previa esterilizacin a de atmsfera durante 20 minutos), sembrando por estras en el tubo e incubando 24 a 48 horas a 28C.
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La reduccin de estas sales por las distintas especies de Candida da colores que van desde el blanco (C. albicans) hasta el rojo violceo (C. tropicalis). Se realiza tambin la prueba bioqumica de fermentacin de azcares (zimograma). Se prepara un caldo base con agregado de un indicador (prpura de bromocresol en alcohol al 1.6%) al 1000, colocando campanitas de Durham invertidas en el medio de cultivo. Cuando se carecen de stas pueden utilizarse las tapitas de ampollas usadas que las suplen perfectamente y son mucho ms econmicas. Los azcares por utilizar son glucosa, sacarosa, maltosa y lactosa al 1%. Estos se agregan al medio de cultivo y se esterilizan a de atm durante 15 minutos. Tambin se pueden esterilizar previmente por filtracin o agregando cloroformo a la solucin del azcar (concentrada). Se agita y se deja reposar 24 horas. Luego se agrega aspticamente con pipeta estril a cada tubo el volumen de solucin madre de cada azcar que permita obtener una concentracin final de 1% en el medio. Se siembran las levaduras en estudio y se incuban a 37C durante 48-72 horas. La acidificacin del medio se revela por el viraje del indicador del violeta al amarillo, y la fermentacin, por el desprendimiento de gas que se acumula en las campanitas. CARACTERES BIOQUMICOS DE LAS ESPECIES DE CANDIDA
FILAMEN TO EN SUERO + + + + ZIMOGRAMA GLU SACA MAL LAC COSA ROSA TOSA TOSA AG A AG O AG A AG O AG AG AG AG AG AG AG AG O O AG O O O O O AG O O O
ESPECIES
C. ALBICANS
C. stellatoidea C. tropicalis C. pseudotropicalis C. guillier mondii C. kruseii C. parapsilosis
Reaccin intradrmica: Se usa muy poco, ya que la gran mayora de las personas reaccionan positivamente a la intradermorreaccin de la Candida, aun no estando enfermas. Por lo tanto, no debe utilizarse, pues no ofrece ninguna seguridad en cuanto al resultado. Puede ser til en procesos alrgicos aplicando el antgeno en forma decreciente para desensibilizar.
Tcnicas inmunolgicas:
La aglutinacin tiene poco valor. La tcnica de fijacin del complemento es ms segura, pero presenta el inconveniente de dar reacciones cruzadas con antgenos de Histoplasma, Blastomyces dermatitidis y Coccidioides immitis. Las reacciones de inmunodifusin son las ms seguras y demuestran la presencia de precipitinas sricas en casos de candidiasis sistmicas. Material y reactivos. Muestra de (proporcionada docente). Equipo. Microscopio Observaciones. Cndida por el Hisopo estril Mechero Bunsen Porta y cubreobjetos
Se observan medios Sabouraud con colonias Cndida inoculadas por equipo, de los cuales tomaron la muestra para prueba de CHROMagar.
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Observacin microscpica de la Candida de la muestra: Medio de cultivo: Agar Sabouraud Color: amarillo claro con color anaranjado Aspecto: gelatinoso Consistencia: blanda Estructura: algunas seudohifas Visto a: 40x
Candida:
Medio de cultivo: CHROMagar Color: dos de los equipos tuvieron como resultado colonias de color caf oscuro y un colonia de otro equipo present una coloracin verde claro a oscuro, pudiendo inferir que se trata de Candida dubliniensis. Aspecto: gelatinoso Consistencia: blanda
Conclusin. Con esta prctica se aprendi a realizar algunas de las pruebas para identificar el gnero Candida, en las pruebas de tubo germinativo o filamentacin tuvimos un resultado negativo y la de clamidoconidias no se realiz. En el CHROMagar slo se puede decir que uno de las tres muestras inoculadas en el agar, tuvo cambio de color significativo, como se mencion anteriormente, se deba que puede tratarse de C. dubliniensis o alguna otra especie de Cndida. Bibliografa. Micologa Mdica, R. Arenas; Ed. Interamericana; Pg. 223-232
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