Cap15 Rojo Neutro

Ensayo de citotoxicidad aguda con celomocitos de lombriz de tierra
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Ensayo de citotoxicidad aguda

con celomocitos de la lombriz
de tierra Eisenia foetida
Ral Uribe Hernndez
C lasificacin
del ensayo :
Principio de la prueba
Los organismos vivos integran el efecto txico causado por la exposicin a
diferentes xenobiticos o contaminantes, y responden de manera integral en
sus diferentes niveles de organizacin (subcelular, celular, tejidos, rganos y
sistemas) al efecto adverso de compuestos o mezclas de ellos. Los bioensayos
proveen una medida ms directa de la toxicidad ambiental relevante en los
sitios contaminados que los anlisis qumicos, ya que integran la respuesta
de los factores ambientales y de los compuestos txicos.
La citotoxicidad de los compuestos puede ser aborada a travs de pruebas
cuyo fundamento es la absorcin de colorantes supravitales. Tal es el caso
de la aplicacin de la prueba de citotoxicidad con Rojo Neutro-50 (Babich y
Borenfreund, 1992). Las pruebas de citotoxicidad con este colorante supravital y modelo biolgico han sido utilizadas ampliamente en la evaluacin de
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226 Ensayos para suelos
diversas sustancias, como los plaguicidas y metales pesados (Reinecke et

al., 2002).
Este ensayo se basa en la deteccin de los daos que producen los compuestos txicos sobre la integridad de la membrana de los lisosomas en las clulas
y sobre el control del flujo del colorante a travs de la misma. La acumulacin
del Rojo Neutro ocurre por entrampamiento de la forma protonada del colorante dentro del ambiente cido del lisosoma o por unin del Rojo Neutro
a cargas cidas fijas, tales como polisacridos cidos dentro de la matriz del
lisosoma. Como respuesta se observa una disminucin en la capacidad de las
clulas para asimilar y retener al colorante Rojo Neutro en el interior de los
lisosomas, la cual es indicadora de la viabilidad celular.
Material
Cajas Petri de 110 mm; frascos de vidrio con tapn de rosca de 100 mL; jeringa desechable de 10 mL; matraces Erlenmeyer de 100 y 250 mL; matraces
Erlenmeyer con tapn de rosca de 50 y 125 mL; micropipetas de 10, 50,500 y
1000 L; pipetas graduadas de 1,5 y 10 mL; pipetas Pasteur; probetas de 50 y
100 mL; tubos con tapn de rosca de 120 mm; tubos de centrifuga de 15 mL
con tapn de rosca; tubos de ensayo de 13 X 100 mm y vasos de precipitados
de 50 y 100 mL.
Equipo
Agitador vrtex; balanza analtica; cmara Neubauer; campana de flujo laminar; centrfuga; espectrofotmetro de UV-Visible; incubadora hasta 60 C; microscopio de contraste de fases; balanza analtica y campana de extraccin.
Reactivos
2-Cloroacetamida; cido actico; Rojo Neutro 50 g/mL en solucin amortiguadora de fosfatos; azul de tripano al 0.4%; dimetilsulfxido (DMSO); etanol
absoluto; formol al 40%; cloruro de calcio; medio RPMI-1640; solucin de
sales LBSS (NaCl 71.5 mM, KCl 4.8 mM, CaCl2 3.8 mM, KH2PO4 0.4 mM,
Na2CO3 4.2 mM, MgSO4 1.1 mM, Na2HPO4 0.3 mM), ajustada a pH 7.3.
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Organismos de prueba
Como material biolgico se emplean celomocitos obtenidos de organismos
adultos de la lombriz de tierra E. foetida con clitelo en la parte anterior del
cuerpo y con peso entre 300 y 600 mg.
Procedimiento de la prueba
Obtencin de los celomocitos
Cada lombriz se lava en una solucin de NaCl al 4% y se coloca sobre papel filtro humedecido con la misma solucin (figura 15.1). Se le aplica un
masaje suave en los ltimos segmentos de la regin posterior del cuerpo y
posteriormente se coloca en una caja Petri sobre un trozo de hielo, durante
2 minutos.
Se le practica una incisin superficial a nivel de la regin abdominal, posterior al segmento donde se encuentra el clitelo. El fluido celmico se extrae
por medio de una pipeta Pasteur y se coloca en tubos de vidrio con 5 mL de
solucin LBSS. Posteriormente, el fluido se lava con solucin LBSS, centrifugando a 2000 rpm a 4 C durante 10 minutos. Finalmente, el botn celular se
resuspende en 1 mL de solucin LBSS.
Figura 15.1. Lombriz adulta de la especie Eisenia foetida
Cuenta celular y determinacin de la viabilidad

La suspensin celular (0.1 mL) se mezcla en un tubo de ensayo con 0.02 mL
de azul de tripano al 0.4 % y se agita. Despus de 3 minutos de reposo, se
colocan 20 L de la mezcla en la cmara Neubauer con un cubre objetos sobrepuesto. Se cuenta el nmero de clulas teidas de azul en el cuadrante del
centro y en los cuatro de las orillas. El nmero de clulas por mL es calculado
multiplicando el promedio de los cuadrantes por el factor de dilucin y por
el volumen de la cmara (104). La viabilidad se calcula dividiendo el nmero
de clulas viables entre el total y multiplicado por 100.
Viabilidad celular =
Nmero de clulas no teidas

Nmero de clulas totales
* 100
Ensayo de citotoxicidad con Rojo Neutro

En tubos de ensayo se preparan las diluciones de la muestra problema en una
serie logartmica. En la campana de flujo laminar se adicionan 50 L de la
suspensin celular en cada uno de los tubos y se agregan 1 mL del medio de
cultivo RPMI 1640. Todos los tubos se incuban a 22 C por 24 horas en una
atmsfera de CO2 al 5% (figura 15.2).
La mezcla de cada tubo se centrifuga a 2,500 rpm por 5 minutos para
eliminar los compuestos txicos. Las clulas se resuspenden en una solucin
amortiguadora de fosfatos y se vuelven a centrifugar. El botn celular se
resuspende nuevamente en 1 mL de una solucin del colorante Rojo Neutro
(50 g/mL). Posteriormente, todos los tubos son incubados por 3 horas en
las mismas condiciones descritas anteriormente. El colorante se elimina por
centrifugacin a 2,500 rpm durante 5 minutos y el botn celular se resuspende
rpidamente en una solucin de amortiguadora de fosfatos. A cada tubo se le
agregan 1.3 mL de solucin de cido actico al 1% y etanol al 50% y se dejan
reposar a temperatura ambiente por 15 minutos.
La absorbancia de las muestras se lee en un espectrofotmetro de luz visible
a 540 nm. El porcentaje de viabilidad se calcula con la absorbancia obtenida,
tomando como referencia al testigo con 100 % de viabilidad (Prez-Zapata et
al., 1998). Se calcula la concentracin letal cincuenta efectuando una regresin
lineal entre las concentraciones y los porcentajes de viabilidad transformados
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Figura 15.2. Preparacin de diluciones para la prueba de citotoxicidad

en celomocitos de lombriz de tierra
a logaritmo. El resumen general de las condiciones de la prueba se presenta

en la tabla 15.1.
Para las pruebas definitivas se utiliza un intervalo de concentraciones ms
reducido (en serie geomtrica), seleccionando aquellos tratamientos en los que
se observaron efectos adversos, para insertar entre alguno de ellos este nuevo
intervalo de concentraciones (por ejemplo: 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 %). Se
elabora la curva dosis-respuesta de las diferentes concentraciones siguiendo
el procedimiento descrito anteriormente.
En cada ensayo de debe incluir un control del disolvente agregando a las
muestras, un control positivo con 2-cloroacetamida y un control negativo en
el que se adiciona medio RPMI-1640.
Expresin de resultados
La prueba de citotoxicidad aguda en celomocitos de lombriz de tierra determina el potencial de toxicidad letal en el cultivo, expresado como la concentra-

Tabla 15.1. Condiciones recomendadas para las pruebas de citotoxicidad
con celomonitos de lombriz de tierra
Tipo de ensayo
Temperatura
Calidad de luz
Volumen del recipiente
Volumen de la solucin de prueba
Edad del cultivo usado como inculo
Densidad celular inicial
Nmero de rplicas
Incubacin
Medio de cultivo
Factor de dilucin
Duracin de la prueba
Respuesta evaluada
Resultado final
Criterios de aceptacin de la prueba
Control positivo
In vitro
22 1 C
Oscuridad
Tubos de 3 o 5 mL
1.0 mL
24 horas
104 a 105 clulas/mL
Tres
Con CO2 al 5 %
RPMI-1640
10
24 horas
Viabilidad celular
CL50
Viabilidad celular igual o >90 % del control
2-cloroacetamida a 35 mg/L
Fuentes: USEPA, 1996; OECD, 1984
cin letal media (CL50). Se utiliza el mtodo Probit, tambin conocido como
mtodo de unidades probabilsticas, para evaluar la relacin dosis-respuesta
de un contaminante sobre un organismo en trminos de la CL50 y su precisin
o intervalo de confianza. Para ello se asigna el valor Probit de tablas correspondiente al porcentaje de mortalidad obtenido para cada concentracin
(Loomis, 1978). Despus se efectua una regresin lineal mediante el mtodo
mnimos cuadrados, y utilizando los valores obtenidos de la ecuacin de la
recta se calcula la CL50, considerando el valor de la y a la mitad del nmero
de individuos utilizados en cada lote o tratamiento. Finalmente se calcula el
intervalo de confianza al 95% por medio de la desviacin estndar y el valor
de tablas del estadstico de t de student.
Bibliografa
Babich, H. y E. Borenfreund. 1992. Neutral Red Assay for Toxicology in vitro. En: Ronald
R. Watson (editor). In vitro Methods of Toxicology. Handbooks in Pharmacology
and Toxicology. CRC Press, Boca Raton, EE.UU.
Loomis, T. A. 1978. Fundamentos de Toxicologa. Primera edicin. Editorial Acribia,
Zaragoza, Espaa. 274 pp.
231
Organization for Economical Cooperation and Development (OECD). 1984. Earthworm

acute toxicity test. Guideline for Testing of Chemicals 207. OCDE, Pars 8 pp.
Prez-Zapata, A. J., M. L. Vega-Barrita y R. Uribe-Hernndez. 1998. Estudio in vitro
del efecto del plomo en la biosntesis de porfirinas. Anales de la Escuela Nacional
de Ciencias Biolgicas 44: 127-139.
Reinecke, S.A., B. Helling y A. Reinecke. 2002. Lysosomal response of earthworm
(Eisenia foetida), coelomocytes to the fungicide copper oxychloride and relation
to life-cycle parameters. Environmental Toxicology Chemistry 21: 1026-1031.
United States Environmental Protection Agency (USEPA). 1996. Earthworm subchronic toxicity test. Ecological Effects Test Guidelines. 712-C-96-167. OPPTS
850.6200, Washington DC., EE.UU. 11 pp.

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Figura 15.2. Preparacin de diluciones para la prueba de citotoxicidad

a logaritmo. El resumen general de las condiciones de la prueba se presenta

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Fuentes: USEPA, 1996; OECD, 1984

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Organization for Economical Cooperation and Development (OECD). 1984. Earthworm

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