Curso 2022/2023

PRÁCTICAS DE TOXICOLOGÍA ALIMENTARIA

PRÁCTICAS A REALIZAR

1. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON SEMILLAS DE LECHUGA

(Lactuca sativa L.)

2. DETERMINACIÓN DE ETANOL POR MICRODIFUSIÓN EN FLUÍDOS

3. DETERMINACIÓN DE NITRITOS EN PRODUCTOS CÁRNICOS (Bello y

col., 2000)

4. EXTRACCIÓN Y MEDIDA DE NITRATOS EN ALIMENTOS VEGETALES

5. DETERMINACIÓN DE METALES PESADOS EN MUESTRAS DE

PESCADO

6. CURVAS DOSIS RESPUESTA. PROBLEMAS DE TOXICOLOGÍA.

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1. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON SEMILLAS DE LECHUGA

(Lactuca sativa L.)

El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) es una

prueba estática de toxicidad aguda que se puede utilizar para evaluar los
efectos fitotóxicos de compuestos puros o de mezclas complejas en el proceso
de germinación de las semillas y en el desarrollo de las plántulas durante los
primeros días de crecimiento. Como puntos finales para la evaluación de los
efectos fitotóxicos, se determina la inhibición en la germinación y en la
elongación de la radícula y del hipocotilo.

A diferencia de la prueba tradicional de germinación de semillas, la evaluación

del efecto en la elongación de la radícula y del hipocotilo de las plántulas
permite ponderar el efecto tóxico de compuestos solubles presentes en niveles
de concentración tan bajos que no son suficientes para inhibir la germinación,
pero que sin embargo pueden retardar o inhibir completamente los procesos de
elongación de la radícula o del hipocotilo, dependiendo del modo y sitio de
acción del compuesto.

De esta manera, la inhibición en la elongación de la radícula e hipocotilo

constituyen indicadores subletales muy sensibles para la evaluación de efectos
biológicos en vegetales, aportando información complementaria a la
proporcionada al estudiar el efecto en la germinación.

Material
Placas Petri de 100 mm de diámetro
Matraces aforados de 50 mL
Pipetas volumétricas de 1, 2, 5 y 10 mL
Regla u otro elemento de medición
Pinzas
Toallas de papel
Bolsas plásticas
Papel de filtro Whatman No. 3 (o equivalente), 90 mm de diámetro.

Equipo
Cámara oscura de temperatura controlada (22 ± 2 °C).

Reactivos
Agua dura reconstituida (APHA, 1992). Para su preparación se recomienda
utilizar reactivos grado ACS y agua destilada en vidrio o de calidad Millipore
Super Q

Organismos de prueba
En este ensayo se usan semillas de lechuga de la especie L. sativa L variedad
mantecosa.

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Preparación de las diluciones

Para realizar una curva dosis respuesta se recomienda preparar un mínimo de

5 o 6 diluciones de la muestra o compuesto a estudiar de manera que se
obtengan valores de toxicidad intermedios entre el 100 y 0%. Para la
preparación de cada dilución se utiliza agua dura reconstituida, realizando el
control negativo con el agua de dilución empleada. En el laboratorio se
indicarán las diluciones a emplear.

Desarrollo de la prueba
Para llevar a cabo el ensayo se coloca en cada placa Petri un disco de papel
de filtro. Se marca correctamente cada caja con la dilución correspondiente, así
como la fecha y hora de inicio y término del bioensayo. Se satura el papel de
filtro con 4 o 5 mL de la dilución evitando que se formen bolsas de aire.
Con la ayuda de una pinza, se colocan cuidadosamente 20 semillas, dejando
espacio suficiente entre ellas para permitir la elongación de las raíces. Se tapan
las cajas y se colocan en bolsas plásticas para evitar la pérdida de humedad.
Dado que algunas variedades de semillas de lechuga requieren oscuridad para
que se produzca la germinación (semillas fotoblásticas negativas), las placas
Petri deben cubrirse de la luz inmediatamente después de colocar las semillas
en su interior y durante el período de ensayo.
Incubar por 96 horas (4 días) a una temperatura de 22 ± 2 ºC. Realizar
repeticiones para cada dilución ensayada.

Medida de los puntos finales de evaluación de la fitotoxicidad

Cada punto final se evalúa comparando el efecto generado en los organismos

expuestos a la muestra con respecto a la respuesta en los organismos del
control negativo, sujetos a las mismas condiciones de ensayo, excepto por la
ausencia de muestra. Terminado el período de exposición (96 horas), se
procede a cuantificar el efecto en la germinación y en la elongación de la
radícula y del hipocotilo.

Efecto en la germinación

Se registra el número de semillas que germinaron normalmente, considerando

como criterio de germinación la aparición visible de la radícula.

Efecto en la elongación de la radícula e hipocotilo

Utilizando una regla o papel milimetrado, se mide cuidadosamente la longitud

de la radícula y del hipocotilo de cada una de las plántulas, correspondientes a
cada concentración del compuesto tóxico o dilución de muestra y a los
controles. La medida de elongación de la radícula se considera desde el nudo
(región más engrosada de transición entre la radícula y el hipocotilo) hasta el
ápice radicular. La medida de elongación del hipocotilo se considera desde el
nudo hasta el sitio de inserción de los dos cotiledones.

Antes de retirar las plántulas de las placas Petri para evaluar el efecto en los
puntos finales anteriormente mencionados, es importante realizar una

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observación detallada del estado general de las mismas y del crecimiento de la

radícula sobre el papel de filtro. Informar cualquier indicador de fitotoxicidad o
de crecimiento anormal en las plántulas tratadas y en los controles (ápices
radiculares con necrosis, pelos absorbentes poco desarrollados, radículas con
crecimiento ensortijado, necrosis en los cotiledones, etc.). La necrosis
(presencia de tejido muerto) se evidencia como manchas localizadas de
coloración parda, blanca o marrón. Al evaluar el efecto en la germinación, se
debe consignar además aquellas semillas con germinación anormal
(emergencia de cotiledones o cotiledones e hipocotilo solamente, pero sin
emergencia de la radícula) o con desarrollo de hongos.

Expresión de resultados

Se realizan los siguientes cálculos:

• Promedio y desviación estándar de la elongación de la radícula y del
hipocotilo de las plántulas de cada repetición
• Porcentaje de inhibición del crecimiento de la radícula y del hipocotilo con el
promedio de elongación para cada dilución respecto del promedio de
elongación del control negativo
• Porcentaje de inhibición en la germinación
• Elaborar la gráfica dosis-respuesta, colocando en la ordenada el porcentaje
de inhibición y en la abscisa la concentración.

Los efectos cuantificados sobre la elongación de la radícula o del hipocotilo son

efectos subletales. La inhibición en la germinación podría considerarse como
un efecto letal siempre y cuando podamos corroborar que finalizada la
exposición a una muestra las semillas no germinaron por muerte del embrión y
que no existe simplemente un retraso en el proceso de germinación,
manteniéndose la viabilidad de la semilla.

2. DETERMINACIÓN DE ETANOL POR MICRODIFUSIÓN EN FLUÍDOS

En esta práctica se determinará el alcohol etílico presente en diferentes fluidos

(sangre entera, suero, plasma, orina, homogeneizado de tejido,…) empleando
la técnica de microdifusión.
Material y reactivos

Cámaras de Conway
Matraces aforados de 50 mL
Pipetas volumétricas de 1, 2, 5 y 10 mL
Bolsas plásticas
Papel parafilm

Equipo
Estufa con temperatura controlada (37 ± 2 °C).

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Reactivos

Disolución de dicromato de potasio en ácido sulfúrico: Se pesan 3,75 gr de

dicromato de potasio y se disuelven en 150 ml de agua destilada, calentando si
fuera necesario. A continuación se agregan 280 ml de ácido sulfúrico
concentrado en forma lenta y agitando continuamente. Durante esta operación
se mantiene refrigerado el recipiente. Una vez adquirida la temperatura
ambiente se completa a un volumen de 650 ml con agua destilada.
Disolución saturada de Carbonato de potasio: Se pesan 112 g de carbonato
de potasio anhidro y se disuelven en agua destilada. Dejar a temperatura
ambiente y llevar a un volumen de 100 ml.
Disolución madre de alcohol: Se prepara una solución al 1% en peso de
etanol, midiendo 1,27 ml de alcohol absoluto o 1,34 ml de alcohol 95º y se lleva
a un volumen de 100 ml con agua destilada.
Disoluciones de los testigos: Preparar a partir de la solución madre testigos
conteniendo, 0,5; 1,0; 2,0 y 3,0 g /l
Procedimiento
Se coloca en el compartimento interno de la cámara de Conway 2 ml de
disolución de dicromato de potasio en medio ácido. En el compartimento
externo se coloca 1 ml de solución saturada de carbonato de potasio como
agente liberante. Se coloca la tapa hasta cerrar parcialmente y se deposita en
el otro extremo del compartimento externo 1 ml del fluído a evaluar
(sangre/orina/humor vitreo/plasma/suero) o 4 ml de tejido homogeneizado. Se
cierra y se aplica un movimiento rotatorio sobre una superficie plana, a fin de
mezclar la muestra con el reactivo liberante. Es importante colocar la solución
de carbonato de potasio en el lado opuesto al que se halla la muestra de
sangre sin que tomen contacto hasta que la cámara este perfectamente
tapada. Si se mezclaran antes de tapar, comenzaría la liberación de alcohol de
inmediato y se cometería error por defecto. Las cámaras cerradas se tapan con
papel parafilm para asegurar la estanqueidad.
Se procede de forma similar en otra cámara de Conway colocando 1 ml de
testigo en lugar de la muestra.
Se deja difundir a 37°C durante 24 horas. La reacción de óxido reducción del
etanol con el dicromato de potasio (Naranja), dará como producto final un
compuesto color verde.
Una vez cumplido el tiempo de difusión, se trasvasa el contenido del
compartimento interno en forma cuantitativa, luego enjuagar el mismo con 2 ml
de agua destilada y recolectar dicho volumen en el mismo tubo y se mezcla por
inversión. Se preparar un blanco de reacción en un tubo graduado de 10 ml,
colocando 2 ml de solución sulfúrica de dicromato de potasio, se agregan 2 ml

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de agua destilada y se mezcla. Una vez homogeneizado se realiza la lectura en

espectrofotómetro a 600 nm llevando a cero con agua destilada. Se puede
realizar una curva de calibración con testigos de concentraciones conocidas
crecientes de etanol y calcular el valor en la muestra a partir de la curva
obtenida.

3. DETERMINACION DE NITRITOS EN PRODUCTOS CARNICOS

Según el Código Alimentario Español, los productos cárnicos pueden tener un

contenido en nitrito sódico no superior a 150 ppm.
El empleo de nitrito y/o nitrato en la elaboración de derivados cárnicos es
esencial para conseguir su color típico y para garantizar la ausencia de
Clostridium botulinum.
Sin embargo, la utilización de nitrito conlleva un problema sanitario dada la
posibilidad de formación de nitrosaminas al combinarse con aminas
secundarias, algunas de las cuales se han revelado como mutagénicas, y
posiblemente carcinogénicas y teratogénicas en animales de experimentación.

En cuanto a la toxicidad aguda, muy infrecuente ya que sólo se produce a

grandes dosis, es debida a que los nitritos transforman la hemoglobina en
metahemoglobina pudiendo provocar asfixia interna.
Estas cuestiones han provocado grandes controversias sobre la conveniencia
de utilizar nitrito en el curado de la carne, por lo que resulta fundamental
controlar el contenido en nitritos que presentan los derivados cárnicos.

Fundamento
La medida de nitritos se realiza mediante su transformación en un compuesto
Azo de color rojo. Tras la extracción de los nitritos presentes en la muestra con
agua alcalina caliente, provocaremos la transformación en dos pasos:
1. En medio ácido se da la reacción de una amina primaria, la sulfanilamida,
con el nitrito de la muestra. Se nos formará una sal de diazonio.
2. A continuación se acopla una amina aromática, N-(1,naftil)-etilendiamina,
para dar lugar al compuesto Azo de color rojo.

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Por último se lee la absorbancia en un espectrofotómetro a 540 nm y se

cuantifica la respuesta. Para ello se elabora una recta patrón partiendo de una
disolución que contiene 0,25 por mil de nitrito sódico.

Material y aparatos
Probeta graduada
Erlenmeyer de 250 mL con tapón
Pipetas
Matraz aforado de 100 mL
Embudo y papel de filtro
4 Tubos de ensayo
Espectrofotómetro
Recta patrón: 5 matraces aforados de 100 mL y 5 tubos de ensayo (por mesa)

Reactivos
Agua alcalina caliente: alcalinizar ligeramente (pH= 8-9) 1 L aproximadamente
de agua destilada con NaOH 0,1N (1% de NaOH es suficiente). Calentar hasta
ebullición antes de su empleo.
NaOH 0,1 N
Reactivos Carrez: Ferrocianuro potásico al 15%
Acetato de zinc al 30%

Sulfanilamida al 1 %: Disolver 1 g de sulfanilamida en 100 mL de una solución

de CIH 1,5 N. Guardar en frasco topacio.
Acido clorhídrico 1,5 N.
Cloruro de N-(1,naftil)-etilendiamina al 0,1%.
Solución patrón de Nitrito sódico al 0,25 por mil.

Preparación del extracto

Se parte de una muestra representativa de unos 200 g. Si se trata de
embutidos se retira la tripa. Se parte con cuchillo la muestra en rodajas de 0.5-
1 cm y éstas en pequeños cubos que son pasados varias veces por la
picadora, hasta obtener una mezcla homogénea.

Se pesan con precisión 10 g de la muestra picada en un erlenmeyer de 250

mL. Se añaden 60 mL de agua alcalina caliente y se homogeniza. El

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erlenmeyer (tapado con papel de aluminio) se lleva a un baño con agua y

agitación continua a 80ºC durante 1 hora.
Tras la extracción se añaden 5 mL de cada uno de los reactivos Carrez
(agentes clarificantes) agitando después de cada adición, y se enfría a
temperatura ambiente.
Se transfiere el contenido total a un matraz aforado de 100 mL, filtrándolo sobre
papel de filtro plegado sobre un embudo. Lavar el recipiente original con
pequeñas cantidades de agua destilada hasta el enrase.

Valoración de la muestra
Antes de comenzar la valoración agitar varias veces el matraz, para conseguir
que el nitrito se reparta homogéneamente.
Se toman 0,6 mL del filtrado en un tubo de ensayo, se añaden 2,4 mL de agua
destilada y 3 mL de la solución de sulfanilanida, se agitan y se añaden 3 mL del
reactivo de N-(1,naftil)-etilendiamina, se vuelven a agitar.
Transcurridos 20 minutos se determina la absorbancia a 540 nm.
El blanco se prepara de igual forma pero sustituyendo el N-(1,naftil)-
etilendiamina por 3 mL de agua destilada.

Construcción de la recta patrón

Se toman de la solución patrón (nitrito sódico al 0,25 por mil) alícuotas de 2 mL,
1 mL y 0,5 mL y se llevan a 100 mL con agua destilada. El contenido de estas
soluciones es respectivamente: 5, 2,5 Y 1,25 μg/mL de nitrito sódico. Se toman
10 mL de las disoluciones de 2,5 y 1 ,25 μg/mL y se llevan a 100 mL con agua
destilada. El contenido de estas disoluciones será 0,25 μg/mL y 0,125 μg/mL
respectivamente.
El tratamiento de estas soluciones patrón es el mismo que para las muestras
(apartado anterior). Los tiempos de incubación deberán coincidir para que la
extrapolación sea correcta.
Se procede a la construcción de la recta patrón, leyendo absorbancias frente a
concentraciones, expresadas en μg/mL de nitrito sódico.

Cálculos
Se calcula el contenido de nitrito sódico de la muestra expresado en p.p.m. por
medio de la fórmula:
CxV
p.p.m NaNO2 =
M
Siendo: C: Concentración en nitrito sódico, determinada sobre la recta patrón,
expresada en μg/mL.
M: Peso de la muestra en g.
V: Volumen en mL al que se ha llevado el extracto

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4. EXTRACCIÓN Y MEDIDA DE NITRATOS EN ALIMENTOS VEGETALES

Extracción de NO3- en material vegetal

Material Aparatos Reactivos

Mortero con mano Balanza de precisión (0,001g)
Tubos de centrífuga Centrífuga DEI (NO3-)
Filtro de 9 cm
Vasos de precipitados 50 mL
Embudo
Tubos de ensayo, Pipeta 10 ml

Procedimiento
Se homogeniza 1 g de hoja fresca (o cocida) y troceada con 10 ml de H2O en
un mortero, se pasa a un tubo y se centrifuga a 3000 r.p.m. 10 minutos y se
filtra el sobrenadante. Se toman 5 mL de filtrado y se introducen en un vaso de
precipitados de 50 mL. Se añaden 5 mL de disolución eliminadora de
interferencias de NO3-. La medida se realiza mediante electrodos selectivos de
iones.

Referencias: SOIL TESTING AND PLANT ANALYSIS. Third Edition (1990). R.

L. Westerman (ed). Soil Science Society of America Book Series nº3. Soil
Science Society of America, Inc. USA.

5. DETERMINACIÓN DE METALES PESADOS EN ALIMENTOS

FUNDAMENTO
Los metales pesados son un grupo de elementos químicos que presentan una
densidad relativamente alta y cierta toxicidad para el ser humano. Muchos de
los metales que tienen una densidad alta no son especialmente tóxicos y
algunos son elementos esenciales en el ser humano, independientemente de
que a determinadas concentraciones puedan ser tóxicos en alguna de sus
formas. Sin embargo, hay una serie de elementos que en alguna de sus formas
pueden representar un serio problema medioambiental y es común referirse a
ellos con el término genérico de "metales pesados". La peligrosidad de los
metales pesados es mayor al no ser química ni biológicamente degradables.
Una vez emitidos, principalmente debido a la actividad industrial y minera,
pueden permanecer en el ambiente durante cientos de años, contaminando el
suelo y acumulándose en las plantas y los tejidos orgánicos. Además, su
concentración en los seres vivos aumenta a lo largo de la cadena alimentaria
(biomagnificación). Los metales pesados tóxicos más conocidos son el
mercurio, el plomo y el cadmio.

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La mayoría de las técnicas de análisis empleadas, tanto clásicas como

instrumentales, requieren disponer de la muestra en disolución, y muy pocas
son capaces de permitir llevar a cabo el análisis directo en muestras sólidas.
Para utilizar estas técnicas se necesita un tratamiento adecuado de la muestra
para su empleo correcto.

El reglamento (CE) nº 333/2007 de la Comisión de 28 de marzo de 2007

establece los métodos de muestreo y análisis para el control oficial de los
niveles de Pb, Cd, Hg, Sn inorgánico, 3-MCPD y benzo(a)pireno en los
productos alimenticios, y se seguirá en esta práctica.

El procesado de la muestra global consta fundamentalmente de 3 etapas:

- Reducción del tamaño de partícula (trituración)
- Homogeneización
- Reducción del tamaño de muestra

En esta práctica el procesado de las muestras sólidas se realizará mediante

secado (80ºC) en una cápsula de porcelana durante un periodo de 24 horas.
Posteriormente las muestras son molidas en mortero de porcelana para evitar
posibles contaminaciones y tamizadas por un tamiz de 0.2 mm.

Una vez obtenida la muestra seca, molida y tamizada, se procede a su

digestión. Entre los métodos más habituales están la digestión asistida por
microondas y la digestión en autoclave.

Un horno de microondas genera ondas electromagnéticas en la frecuencia de

microondas (2450 MHz) en el intervalo de energía de 500-1100 vatios; son
ondas de radio de alta frecuencia. La radiación produce la excitacion del enlace
O-H (enlace presente en el agua y otros muchos compuestos) causando el
calentamiento de la muestra rápidamente. Esta elevación de la temperatura en
un medio fuertemente ácido-oxidante, es la que origina la digestión de la
materia orgánica.

Después de la digestión se procede a la determinación de los metales pesados.

Se pueden utilizar diversas técnicas. En estas prácticas utilizaremos la
espectrofotometría de absorción atómica (EAA) para la determinación de Cu y
Cd.

Un átomo en estado gaseoso puede absorber energía a una determinada

longitud de onda característica del elemento y pasar a un estado excitado.
Igualmente un átomo excitado al volver al estado elemental emite energía en
forma de radiación electromagnética de longitud de onda característica del
elemento. Según la ley de Beer-Lambert la cantidad de energía adsorbida o
emitida es proporcional a la concentración del elemento en disolución dentro de
un cierto rango de concentraciones.
Un espectrofotómetro de absorción o emisión atómica es un aparato capaz de
atomizar y excitar átomos a partir de disoluciones y de cuantificar la energía
emitida o absorbida.

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Atomización y excitación: Los extractos en disolución son aspirados y

mezclados con aire en un nebulizador. El aerosol formado se va transformando
hasta alcanzar la llama donde ocurre la atomización y excitación:

EMISION

Llama Atomización Excitación Ionización

M+A- → MºAº → Mº + Aº → M* → M+

ABSORCION

Emisión: Ciertos elementos alcanzan fácilmente el estado excitado simplemente

con el calor de una llama. Para estos elementos se puede determinar la energía
emitida al volver al estado fundamental y de esta manera cuantificar su
concentración en disolución.

Absorción atómica: Para otros elementos la energía de llama necesaria para

obtener un elevado porcentaje de átomos retornando al estado fundamental habría
de ser superior a la normalmente empleada de aire-acetileno, por lo que su
determinación, con esta llama se hace por Absorción Atómica (AA). Para ello es
necesario el aporte de otra fuente de energía: una lámpara que emita luz
característica para cada elemento. La diferencia entre la energía emitida por la
lámpara antes y después de pasar por la llama nos dará la absorción del elemento
que queremos medir en la muestra.
Los resultados obtenidos se compararán con los contenidos máximos de
contaminantes fijados en el reglamento (CE) nº 629/2008 de la comisión de 2 de
julio de 2008.

PROCEDIMIENTO DIGESTIÓN EN AUTOCLAVE

La digestión mediante autoclave se realiza de la manera siguiente:

Se pesan 0,250 g de la muestra de alimento seca y molida en un recipiente de

vidrio; se añaden lentamente 4 ml de HNO3 69%, 2 ml H2O2 al 33% y 3 ml de
H2O destilada. Se cierra el recipiente y se introduce en autoclave durante 30
minutos a 125ºC y una presión de 1,5 kg/cm3.

Tras la digestión, el extracto se filtra con papel de filtro Whatman 42, se enrasa a
25 mL con H2O y se almacena en tubos a 4ºC hasta el análisis de Cu y Cd en EAA.

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