Practica 4.

PRCTICA 4
ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON SEMILLAS DE LECHUGA

(Lactuca sativa L.)
1. INTRODUCCIN
El efecto txico o la respuesta txica es cualquier cambio en el funcionamiento normal del

organismo que ha sido producido por la exposicin a una sustancia txica, para este efecto se
consideran solamente los cambios irreversibles o que permanecen un periodo prolongado despus
de la exposicin. Para el efecto de toxicologa ambiental las exposiciones se clasifican en
exposiciones crnicas, subcrnicas y agudas. Las exposiciones crnicas duran entre el 10 % y el
100% de la vida del organismo, las exposiciones crnicas son menores al 10% del periodo vital y las
exposiciones agudas suceden en un solo evento y abarcan periodos cortos como de 24 a 120 horas.
El objetivo de realizar pruebas de toxicidad aguda es identificar el potencial toxicolgico de

compuestos qumicos ya sean comerciales o presentes en el ambiente. Este tipo de pruebas son
ms factibles de hacer debido a que el tiempo de exposicin es corto.
El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa) es una prueba esttica de
toxicidad aguda (120 horas de exposicin) en el que se pueden evaluar los efectos fitotxicos de
compuestos puros o de mezclas complejas en el proceso de germinacin de las semillas y en el
desarrollo de las plntulas durante los primeros das de crecimiento. Como puntos finales para la
evaluacin de los efectos fitotxicos, se determina la inhibicin en la germinacin y la inhibicin en la
elongacin de la radcula y del hipocotilo (Figura 1).
Es importante destacar que durante el perodo de germinacin y los primeros das de desarrollo de
la plntula ocurren numerosos procesos fisiolgicos en los que la presencia de una sustancia txica
puede interferir alterando la supervivencia y el desarrollo normal de la planta, siendo por lo tanto una
etapa de gran sensibilidad frente a factores externos adversos. Por otra parte, muchas de las
reacciones y procesos involucrados son generales para la gran mayora de las semillas, por lo que la
respuesta de esta especie y los datos obtenidos a partir de la aplicacin de esta prueba son en gran
medida representativos de los efectos en semillas o plntulas en general. El xito o aptitud de una
plntula para establecerse en un ambiente determinado es de gran importancia para garantizar la
supervivencia de la especie. La evaluacin del desarrollo de la radcula y del hipocotilo, constituyen
indicadores representativos para determinar la capacidad de establecimiento y desarrollo de la
planta.
A diferencia de la prueba tradicional de germinacin de semillas, la evaluacin del efecto en la

elongacin de la radcula y del hipocotilo de las plntulas permite ponderar el efecto txico de
compuestos solubles presentes en niveles de concentracin tan bajos que no son suficientes para
inhibir la germinacin, pero que sin embargo pueden retardar o inhibir completamente los procesos
de elongacin de la radcula o del hipocotilo, dependiendo ello del modo y sitio de accin del
compuesto. De esta manera, la inhibicin en la elongacin de la radcula e hipocotilo constituyen
indicadores subletales muy sensibles para la evaluacin de efectos biolgicos en vegetales,
aportando informacin complementaria a la proporcionada al estudiar el efecto en la germinacin.
Este ensayo puede ser aplicado para la evaluacin de la toxicidad de compuestos puros solubles, de
aguas superficiales (lagos, ros), aguas subterrneas, aguas para consumo humano, aguas
residuales domsticas e industriales, adems de lixiviados de suelos, sedimentos, lodos u otras
matrices slidas (Bowers et al, 1997; Cheung et al, 1989; Dutka, 1989). A diferencia de otras
pruebas en las que se consideran algas o plantas acuticas sumergidas como organismo de
diagnstico, el bioensayo con semillas permite evaluar la fitotoxicidad de muestras coloreadas o con
elevada turbiedad de manera directa y sin necesidad de filtracin previa, reducindose as las
interferencias debidas al pretratamiento y simplificando el procedimiento de prueba.
Figura 1. Proceso de germinacin y morfologa de la semilla y la plntula de lechuga Lactuca sativa L.
2. OBJETIVO
Los alumnos evaluarn los efectos fitotxicos de una solucin que contiene un elemento
contaminante, en el proceso de germinacin de las semillas y en el desarrollo de las plntulas de
lechuga (Lactuca sativa L.) durante los primeros das de crecimiento.
3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
*Semillas de lechuga de la especies L. sativa L variedad mantecosa

Cajas Petri de 100 mm de dimetro
Matraces aforados de 50 mL
Pipetas volumtricas de 1, 2, 5 y 10 mL
Regla u otro elemento de medicin
Pinzas
Toallas de papel
Bolsas plsticas negras
**Papel de filtro Whatman No. 3 (o equivalente), 90 mm de dimetro.
*Las semillas de lechuga se adquieren en establecimientos locales, procurando que sean
semillas sin ningn tratamiento (sin fungicidas o plaguicidas), con buen poder germinativo y
baja variabilidad en la elongacin de la radcula e hipocotilo.
**El papel de filtro que se seleccione como sustrato de germinacin debe tener las siguientes
caractersticas: trama amplia y porosa que asegure una buena capacidad de retencin de
lquido; resistencia de la fibra del papel para que las radculas crezcan por su superficie sin
atravesarlo, situacin que dificultara la remocin de las plntulas sin daarlas; ausencia de
residuos txicos (por ejemplo, blanqueadores; y que no promueva el desarrollo de hongos (no
asociados a las semillas).
4. METODOLOGA
De acuerdo al esquema de la figura 2, el procedimiento del ensayo de toxicidad que realizars,

deber seguir los pasos enlistados:
Colocar en cada una de 6 cajas Petri numeradas (C1 ..C6) un disco de papel filtro.
Colocar en las cajas 5ml de las siguientes diluciones:
(evitando que se formen bolsas de aire).
C1. Control negativo1: agua dura reconstituida
C2. Control negativo 2: agua de crecimiento.
C3. Control positivo: 15 mg/l de CuSO4 o ZnCl2
C4. Solucin problema 1: 2,5mg/l de CuSO4 o ZnCl2
C5. Solucin problema 2: 5mg/l de CuSO4 o ZnCl2
C6. Solucin problema 3: 10 mg/l de CuSO4 o ZnCl2
Etiquetar cada caja con los siguientes datos: solucin, fecha y hora de inicio y trmino,
materia, y mesa de trabajo.
Con la ayuda de una pinza colocar 20 semillas en cada caja, uniformemente distribuidas en
toda la caja. Tapar las cajas.
Colocar las cajas en bolsas de plstico negras, para evitar la prdida de agua por
evaporacin y para no inhibir la germinacin, debido a que las semillas son fotoblsticas
negativas.
Incubar a 22 C durante 120 horas.
Realizar 3 repeticiones para cada ensayo.
Figura 2. Esquema general del procedimiento de prueba de toxicidad
con semillas de lechuga Lactuca sativa L.
5. RESULTADOS
El efecto medido en este bioensayo es la inhibicin de la elongacin de la radcula, hipocotilo y de la
germinacin (Figura 2). Como resultado final se espera obtener la CE50 o CI50 o % de inhibicin. Los
valores sern aceptados si el porcentaje de germinacin es superior al 90% en el control negativo.
I. Observar cuidadosamente cada caja y anotar cualquier indicador de fitotoxicidad como
necrosis, pelos poco desarrollados, radculas con crecimiento ensortijado. La necrosis
se manifiesta como manchas de color pardas, blancas o marrones.
II. Utilizando una regla medir la longitud de la radcula y del hipocotilo de casa plntula.
III. La medida de la elongacin de la radcula se considera desde el nudo hasta el pice
radicular.
Antes de cada medicin se recomienda congelar las cajas y descongelarlas conforme se van
midiendo, el objetivo de la congelacin y la descongelacin es obtener las plntulas menos rgidas.
La medida de elongacin del hipocotilo se considera desde el nudo hasta el sitio de insercin de los
dos cotiledones.
6. EXPRESIN DE RESULTADOS
Para la expresin de resultados se realizarn los siguientes clculos:
I. Promedio y desviacin estndar de la elongacin de la radcula y del hipocotilo de
las plntulas de cada repeticin.
II. Porcentaje de inhibicin del crecimiento de la radcula y del hipocotilo con el
promedio de elongacin para cada dilucin respecto del promedio de elongacin
del control negativo
III. Porcentaje de inhibicin de la germinacin
IV. Con los datos anteriores realizar una grfica dosis-respuesta, colocando en el eje de
las ordenadas el porcentaje de inhibicin y en el eje de las abscisas la
concentracin.
Bibliografa:
Pea E.C., Carter D.E. y Ayala-Fierro F. 2001. Toxicologa Ambiental: Evaluacin de
Riesgos y Restauracin Ambiental. Disponible en Southwest Hazardous Waste Program
website http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/.

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El efecto txico o la respuesta txica es cualquier cambio en el funcionamiento normal del

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Figura 1. Proceso de germinacin y morfologa de la semilla y la plntula de lechuga Lactuca sativa L.

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