Practica 10 Salmonella
Practica 10 Salmonella
Practica 10 Salmonella
Contenido
Introduccin: ....................................................................................................................................... 3
Objetivos: ............................................................................................................................................ 4
Fundamentos: ................................................................................................................................... 4
Pre-enrriquesimiento y enriquecimiento:....................................................................................... 4
Agares selectivos: ............................................................................................................................ 4
Pruebas bioqumicas: .................................................................................................................. 5
Mesofilicos aerobios: ...................................................................................................................... 9
Reactivos, materiales y equipo: .......................................................................................................... 9
Metodologa: ..................................................................................................................................... 11
Enriquecimiento ............................................................................................................................ 11
Pre-enriquecimiento ..................................................................................................................... 11
Aislamiento ................................................................................................................................... 12
Pruebas bioqumicas ..................................................................................................................... 13
Pruebas bioqumicas confirmatorias............................................................................................. 15
Mesofilicos aerobios y coliformes: ................................................................................................ 16
Resultados: ........................................................................................................................................ 17
Pruebas bioqumicas: .................................................................................................................... 17
Mesofilicos aerobios: .................................................................................................................... 19
Resultados de Mesofilicos Aerobios y organismos coliformes: ................................................ 19
Crecimiento de salmonella en agares selectivos: ............................................................................. 19
Anlisis de resultados: ....................................................................................................................... 22
Conclusin: ...................................................................................................................................... 22
Bibliografa ........................................................................................................................................ 23
Introduccin:
Las bacterias del genero Salmonella son una de las bacterias patgenas ms importantes
que pueden
otros
tales
como
la
leche
sus
derivados.
El gnero Salmonella pertenece a la familia enterobacteriaceae. Son bacilos Gramnegativos y su tamao oscila entre 1 y 3 m de longitud entre .5 y 7 m de dimetro.
Generalmente poseen flagelos peritricos que les dan movilidad. Son bacterias anaerobias
facultativas que fermentan la glucosa produciendo cido y gas. (Casi todas las especies
de salmonella producen sulfhidrico a partir de las protenas y son capaces de
descarboxilizar
algn
aminocido.
Objetivos:
Fundamentos:
Pre-enrriquesimiento y enriquecimiento:
Pre-enriquecimiento: es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no
selectivo, que permite restaurar las clulas de Salmonella daadas a una condicin
fisiolgica estable.
Enriquecimiento selectivo: empleado con el propsito de incrementar las poblaciones de
Salmonella e inhibir otros organismos presentes en la muestra.
Agares selectivos:
Seleccin en medios slidos, en este paso se utilizan medios selectivos que restringen el
crecimiento de otros gneros diferentes a Salmonella y permite el reconocimiento visual
de colonias sospechosas.
Verde Brillante (VB):
Salmonella presenta colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por
medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas. En
este si se puede considerar positivo ya que las colonias presentan las caractersticas de
salmonella.
Salmonella Shigella Agar:
La diferenciacin de los organismos entricos se logra mediante la incorporacin de
lactosa en el medio. Los organismos que fermentan lactosa producen cido que, en
presencia del indicador rojo neutro, propicia la formacin de colonias de color rojo. Los
organismos no fermentadores de lactosa forman colonias incoloras. Este ltimo grupo
incluye la mayora de los patgenos intestinales, incluidos Salmonella y Shigella. El
tiosulfato sdico y el citrato frrico permiten la deteccin de produccin de cido
sulfhdrico, como lo demuestran las colonias con centros de color negro.
MacConkey Agar:
Las peptonas proporcionan los nutrientes. Cristal violeta inhibe las bacterias gram
positivas, en especial los enterococos y estafilococos. La diferenciacin de los
microorganismos entricos se logra mediante la combinacin de lactosa y el indicador de
pH rojo neutro. Se producen colonias incoloras o de color de rosa a rojo segn la
capacidad del aislado para fermentar carbohidratos.
Para salmonella el crecimiento de colonias va de incoloras a color beige.
Pruebas bioqumicas:
Este paso permite la identificacin gnerica de los cultivos de Salmonella y la eliminacin
de cultivos sospechosos falsos.
Agar Hiero Lisina (LIA):
contiene
glucosa
(dextrosa)
que
es
rpidamente
fermentada
por
el
que a su vez reacciona con los grupos guandicos de la arginina, que est presente en las
peptonas que constituyen el medio, dando una coloracin rojiza.
Prueba del citrato:
Determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono.
Algunas bacterias pueden obtener energa empleando el citrato como nica fuente de
carbono. En las bacterias la utilizacin del citrato comprende un sistema enzimtico que
incluye, por una parte, la enzima citrato permeasa, que permite el paso del citrato a travs
de la membrana, y por otra, la enzima citrato liasa, que desdobla el citrato en acetato y
oxalacetato. El acetato es excretado y el oxalacetato es descarboxilado para generar
piruvato.
Hidrolisis de la urea:
Se determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos molculas
de amonaco por accin de la enzima ureasa.
La urea es una diamina del cido carbnico (carbamida), la hidrlisis de la urea es
catalizada por una enzima especfica la ureasa, para dar dos molculas de amonaco. En
solucin, la urea se hidroliza, dando carbonato de amonio como producto final. Esta
enzima est vinculada con la descomposicin de los compuestos orgnicos. La ureasa
rompe por hidrlisis el enlace entre el N2 y el C siendo el N2 disociado a amonaco.
SIM+AGAR:
Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro
de hidrgeno en un mismo tubo.
El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la
triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso
interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina
con el aldehido del reactivo de Kovacs o de Erlich, para originar un compuesto de color
rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen
alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de
sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a
partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.
TSI:
Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la
fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos
de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la
produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ ,
los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color
negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance
osmtico.
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del
indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio
se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro
proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.
Rojo fenol +Manitol:
Para la identificacin bioqumica de microorganismos basndose en su capacidad para
fermentar el manitol.
La peptona de casena proporciona los nutrientes necesarios para el desarrollo de los
microorganismos. El manitol es el carbohidrato fermentable, se manifiesta por un cambio
de color del indicador el rojo de fenol que vira de rojo a amarillo. La deteccin de gas se
observa por la formacin de vaco o burbuja en la campana de Durham. Los tubos con el
medio de cultivo se inoculan con cultivos puros de las bacterias a investigar. Incubar 24
48 h a 35C.
Mesofilicos aerobios:
La tcnica se basa en contar las unidades formadoras de colonias o UFC presentes en
un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio
de cultivo de eleccin despus de un cierto tiempo de incubacin a la temperatura
adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra bajo
estudio; ese microorganismo o microorganismos son capaces de formar la colonia, es
decir una UFC. Para que las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las
diluciones decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo; la
tcnica para realizar este procedimiento se describe en Preparacin y dilucin de
muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico.
Reactivos
Equipo
1 Matraz
Erlenmeyer
Agua destilada
Estufa
34 Tubos de
ensayo
40 Cajas Petri
Alcohol
Agar Cuenta
Estndar
Agar Rojo violeta
bilis
Caldo Selenito
Caldo Tetrationato
Cuenta colonias
5 Pipetas de 1 ml
Cinta
1 Asa
Balanza analtica
Muestra utilizada
Papel estraza
Algodn
1 Pizeta
1 Esptula
2 Botellas de
dilucin
2 Mecheros
Material de
proteccin
Metodologa:
Pre-enriquecimiento
Pesar
de agua
peptonada y disolver
en 225ml de agua.
Enriquecimiento
Aislamiento
Pesar:
12.2g de Salmonella,
11.6g verde brillante,
9.7g Mac conkey y
disolver en 200ml de
agua los 3 agares.
Dejar
solidificar
sembrar por asada.
Pruebas bioqumicas
Pesar: citrato de
Simmons, SIM+agar,
TSI, LIA, Caldo RMVP,
caldo urea, rojo fenol
+ manitol (para todo
el grupo, calentar y
esterilizar
por
equipo).
Dejar
solidificar
SIM+agar
verticalmente y LIA,
TSI, citaro de simons,
inclinados.
Incubar 43C
c) Aislamiento en medios
de cultivo diferenciales
Incubar 43C
18-24 h
18-24 h
Agar verde Brillante o
sulfito de Bismuto
Incubar
24 2 h/ 35
2C
Pruebas bioqumicas
Javier:
Agar: salmonella
shigella
Caldo: selenito
Pretratamiento
Jairo:
Agar: Mc Conkey
Caldo: selenito
Pretratamiento
Monse:
Agar: salmonella
shigella
Caldo: selenito
Pretratamiento
Mariana:
Agar: Salmonella
Shuigella
Caldo: selenito
Sin pretratamiento
Citrato de
Simmons
-Inclinado
estra
SIM+
agar
Picadura
5 gotas
de
reactivo
de
Kovac
TSI
LIA
-Inclinado
estra
-Asada
Caldo
RM-VP 1
Caldo
RM-VP 2
Caldo
urea
-Asada
-Asada
-Asada
RM+3
gotas de
rojo de
metilo
VP + Naftol(10
gotas )+
KOH 40% (5
gotas)
Rojo fenol
+ manitol
-Asada
10-1
1ml
10-2
1ml
1ml
10-4
Resultados:
Pruebas bioqumicas:
Medio
Monse
Mariana
Javier
Jairo
Imagen
Citrato de
Simmons
Azul
Azul
Azul
Azul
SIM+ Agar
Aro negro
Verde oliva +SH2
Aro negro
Verde oliva +SH2
Aro negro
Verde oliva +SH2
Aro negro
Verde oliva +SH2
TSI
Positivo
(+)
Positivo
(+)
Positivo
(+)
Positivo
(+)
LIA
Crecimiento(+)
Cambio de color (-)
Crecimiento(+)
Cambio de color (-)
Crecimiento(+)
Cambio de color (-)
Crecimiento(+)
Cambio de color (-)
Caldo RMVP
+ KOH
+Naftol
Solo se form un
aro negro
(-)
Solo se form un
aro negro
(-)
Caldo RMVP
+Rojo de
metilo
Coloracin roja
(+)
Coloracin roja
(+)
Coloracin roja
(+)
Coloracin roja
(+)
Caldo urea
Coloracin naranja
(-)
Coloracin rosa
(+)
Coloracin rosa
(+)
Coloracin rosa
(+)
Rojo fenol
+Manitol
Coloracin amarilla
(+)
Coloracin amarilla
(+)
Coloracin amarilla
(+)
Coloracin amarilla
(+)
62.5%
75%
75%
75%
Mesofilicos aerobios:
Caja
A
-1
210 + extendida
-2
3700
incontable
3 extensiones
6600 colonias
-3
Extensin en
toda la caja
3 Extensiones
3000 Colonias
Agar Mc.Conkey
con
pretratamiento
del caldo
selenito
-4
1 extensin
110000 Colonias
2 Extensiones
200000 Colonias
Agar salmonella
con
pretratamiento
del caldo
tetrationato
Agar Mc.Conkey
con
pretratamiento
del caldo
tetrationato
Salmonella sin
pretratamiento
del caldo
selenito
Agar Mc.Conkey
sin
pretratamiento
con caldo
selenito
Agar salmonella
sin pretrataiento
con caldo
tetrationato
Agar Mc.Conkey
sin
pretratamiento
con caldo
tetrationato
Anlisis de resultados:
Especificacin
de
la
NMX-F-065-1984.
ALIMENTOS.
SALCHICHAS.
Conclusin:
Con la practica anterior se pudo conocer el fundamento de los medios de cultivo utilizados
para el aislamiento, ya que cada medio de cultivo permita nicamente el crecimiento de
salmonella, siendo posible identificar las colonias de acuerdo a la forma nica en que se
presentan las colonias en cada medio selectivo, con esta metodologa se pudo aislar la
salmonella e interpretar su presencia en la muestra analizada.
Este anlisis realizado a la muestra de salchicha tambin nos permiti darnos cuenta que
la presencia de este microorganismo no siempre es debida a una mala higiene de la
empresa productora, sino que el propio producto cuneta con caractersticas propias que
ayudan al desarrollo del microorganismo como lo es el contenido de grasa de la salchicha
y la alta Aw, factores que ayudan a que el microorganismo se desarrolle de manera
natural.
Bibliografa
Camacho, A. M. (2009). Cuenta en placa de bacterias. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico., 10.
NORMAS, N.-F.-0.-1. A. (1984). COLPOS. Recuperado el 13 de NOVIEMBRE de 2016, de COLPOS:
http://www.colpos.mx/bancodenormas/nmexicanas/NMX-F-065-1984.PDF
UNAM. (2003). Mtodo para la determinacin de Salmonella spp. en alimentos. Norma Oficial
Mexicana para la deteccion del genero Salmonella, 24.