Cromatografìa en Capa Fina de Pigmentos Vegetales

Laboratorio 5: Separacin por Extraccin y Cromatografa
Resumen
En esta prctica de laboratorio se pretende extraer y reconocer los pigmentos vegetales de

hojas verdes, en particular de la espinaca. Para esto se realiza una extraccin simple de la
fase orgnica y separacin de los pigmentos de la mezcla por cromatografa en capa fina
con cloroformo como fase mvil. Ambos procesos se sustentan en las diferencias de
solubilidad de los pigmentos en determinados disolventes. En forma complementaria se
observa y analiza el proceso de extraccin continua con aparato de Soxhlet en la obtencin
de aceite de maravilla. Como resultado se identifican los pigmentos presentes en las hojas
de espinaca y una aproximacin de su solubilidad en cloroformo. Adems se reconoce el
funcionamiento y utilidad de una extraccin continua.
1. Introduccin
La coloracin de las hojas de los vegetales se debe a ciertos pigmentos

comnmente afiliados con los procesos fotosintticos, estos pigmentos se dividen en
clorofilas y carotenoides. Entre las clorofilas se encuentran la clorofila a y clorofila b, de
coloracin verde azulado y verde amarillento respectivamente Estas se diferencian tan solo
en un grupo metilo en la primera y un aldehdo en la segunda. Por otro lado, entre
carotenoides se encuentran los carotenos y las xantfilas. Los carotenos son hidrocarburos
de tonos entre amarillo y naranjo. Las xantfilas son derivados oxigenados de los carotenos
de coloracin amarilla. [1]
Para separar los pigmentos presentes en hojas verdes se utiliza inicialmente una
extraccin simple. La extraccin es un mtodo de purificacin utilizado generalmente para
compuestos orgnicos, se basa en la diferencia de solubilidad del compuesto en dos
disolventes inmiscibles. En una extraccin simple se utiliza un disolvente con una gran
solubilidad para el compuesto a purificar, el cual se llama extractor (generalmente un
disolvente orgnico), y un disolvente con afinidad a las posibles impurezas (generalmente
agua). Se utiliza un embudo de decantacin, el cual permite separar las fases de ambos
disolventes por su densidad. Comnmente quedan emulsiones de fase acuosa suspendidas
en la fase orgnica, y para eliminarlas se suele utilizar una sustancia higroscpica como
desecante.[2]
Una vez extrados, los pigmentos se reconocen mediante una cromatografa en capa
fina. La cromatografa es un mtodo que se utiliza para separar y/o identificar los
componentes de una mezcla. Una cromatografa se realiza en un medio adsorbente, el cual
tiende a retener con una fuerza definida a cada componente de la mezcla (fase
estacionaria), y se utiliza un disolvente como fase mvil, que tiende a desplazar los
componentes con cierta fuerza segn su afinidad. La retencin de los componentes en la
fase estacionaria depende de la proporcin de la fuerza de adsorcin y la afinidad con el
disolvente. La cromatografa en capa fina es una tcnica de anlisis cualitativo en que se
utiliza un disolvente lquido voltil como fase mvil, y una placa recubierta de un material
adsorbente. El lquido sube por capilaridad a travs de la placa. Adems debe realizarse en
un medio cerrado para que ste se sature con vapor. Los componentes de la muestra se
pueden identificar por el factor de retencin (Rf), una relacin entre la distancia recorrida por
un componente x y la recorrida por el disolvente, pero este es difcilmente reproducible ya
que existen muchos factores que lo afectan.[3]
Complementariamente se realiza una extraccin continua para separar aceite vegetal
presente en semillas de maravilla. Este mtodo de extraccin se utiliza en casos que la fase
orgnica sea difcil de separar. Se realiza con un aparato de Soxhlet, en el cual un
disolvente voltil circula por evaporacin y condensacin arrastrando el compuesto a
separar. Al finalizar se evapora el disolvente dejando el compuesto puro.[4]
Tabla 1. Propiedades de los reactivos. [handbook]

Reactivo Masa molar (g/mol) Momento dipolar (D) Densidad (g/mL)
Agua 18.02 1.85 0.998

Acetona 58.08 2,88 0.791
n-hexano 86.18 0 0,660
Cloroformo 119.4 1.04 1,47
A partir de los antecedentes entregados se plantean las siguientes hiptesis:
Los pigmentos de la espinaca deberan separarse mediante una extraccin simple.

La mezcla de hexano y acetona debera ser eficiente en la extraccin de los
pigmentos de espinaca.
El cloroformo debera ser una fase mvil eficiente en la separacin de los pigmentos.
La espinaca debera presentar pigmentos verdes como la clorofila.
Los pigmentos de menor polaridad deberan presentar un mayor factor de retencin.
Objetivo general
Separacin y reconocimiento de pigmentos de espinaca mediante tcnicas de
extraccin simple y anlisis por cromatografa en capa fina.
Objetivos Especficos
Separacin mediante extraccin simple utilizando acetona y hexano.
Reconocimiento mediante cromatografa en capa fina de los compuestos presentes
en las hojas de espinaca.
Comparacin de las afinidades de los compuestos presentes en la espinaca por la
fase mvil en una cromatografa en capa fina.
2. Parte experimental
2.1 Reactivos
Espinaca (Spinacea oleracea L.)
Metanol (CH3O), ISN
Acetona (C3H6O), Winkler
Hexano (C6H14), ISN
Cloroformo (CHCl3), ISN
Sulfato de sodio (Na2SO4), Merk
Semillas de maravilla
Eter, el ms econmico.
Cromatoplaca slice-gel G60, Merk
2.2 Materiales
Embudo de decantacin
Argolla
Vaso de precipitado de 100mL (2)
Vaso de precipitado de 250mL
Vidrio de reloj
Probeta de 25mL
Bagueta
Capilar de vidrio
Aparato de Soxhlet
Manta calefactora
Papel filtro
2.3 Procedimiento
Hago unos lindos dibujitos con las indicaciones.
3. Resultados y Discusin
3.1 Extraccin de pigmentos de espinaca
Los resultados para la extraccin de los pigmentos de espinaca en la mezcla

acetona:hexano se presentan a continuacin:
Tabla 2. Resultados obtenidos en la extraccin lquido-lquido de hojas de espinaca.

Procedimiento Observaciones
Lavado con MetOH El alcohol toma color verde
+ Acetona:Hexano Al macerar las hojas se forman dos fases
Mezcla + 10mL de agua Al agregarlo al embudo de decantacin ms agua y

agitacin se acentan las dos fases
+agua Se agrega agua para comprobar la fase acuosa. La fase

inferior aumenta su volumen, y la superior lo mantiene.
+Na2SO4 anhidro La sal se aglomera en el fondo del vaso, la solucin
En la extraccin simple se aade Acetona en primer lugar como extractante de los

pigmentos de las hojas de espinaca. Los pigmentos a separar son insolubles en agua, pero
solubles en compuestos orgnicos, como acetona y hexano. [ref handbook, y otro]
La acetona por su polaridad (tabla 1) podra extraer parte del agua presente en las vacuolas
de las clulas vegetales. [libro biologa] Esto podra explicar la formacin de dos fases, la
inferior de agua-acetona, y la superior de hexano.
Al agitar la mezcla, los pigmentos disueltos en la fase acuosa (agua y acetona) pasaran al
hexano (fase orgnica) por diferencias de solubilidad, lo que explica la coloracin verde de
esta fase.[ref handbook]
Al aadir agua se logra identificar la fase orgnica (superior) y acuosa (inferior).

Al agregar Sulfato de sodio anhidro se forma una sal heptahidratada, capturando el
agua presente en la mezcla en su red cristalina. [ref]
Na2SO4 + 7H2O Na2SO47H2O ecuacion (1)
3.2 Separacin de los pigmentos por cromatografa
La fase orgnica obtenida se analiza mediante cromatografa en capa fina (CCF),

cuyos resultados se presentan a continuacin:
Imagen 2. Cromatoplaca extracto de espinaca
Tabla 3. Valores de Rf y colores obtenidos en la CCF.

Compuesto Rf Color
A 0,0192 Verde amarillento
B 0,0673 Amarillo
C 0,1731 Azul grisceo
D 0,9904 Amarillo
Los valores de Rf de la tabla 3, se obtienen a partir de la imagen 2 y la ecuacin (1):
Desplazamiento i
Factor de retencin Rfi= Desplazamiento disolvente (2)
Las referencias indican que la hoja de espinaca presenta cuatro pigmentos, clorofila
a, clorofila b, carotenos y xantfilas, que probablemente correspondan a las manchas
obtenidas.[paper]
Si bien todos estos compuestos presentan una baja polaridad, esta vara en cada pigmento
debido a su estructura:
Figura 3.1: Clorofila a Figura3.2: clorofila b
Como se aprecia en la figura 3.1 y 3.2, la clorofila a y b se diferencian por un grupo metilo
(-CH3) (figura 3.1), y un aldehdo (-CHO) (figura 3.2). La presencia del grupo aldehdo causa
una mayor polaridad de la clorofila b respecto a la clorofila a.[ref]
Figura 4.1: a-caroteno

figura 4.2: lutena (xantofila)
Como se aprecia en la imagen 4.1 y 4.2 los carotenos y xantfilas presentan una estructura
muy similar, pero se diferencian por los hidroxilos (u otro grupo oxigenado) de las xantfilas.
Por esta diferencia estructural, las xantfilas tendrn una polaridad mucho mayor que los
carotenos (cuya polaridad es casi inexistente).
Conociendo los posibles pigmentos, su color y una estimacin de su polaridad es posible

identificarlos entre los compuestos obtenidos en la cromatoplaca.
El compuesto A podra corresponder a clorofila b debido a su coloracin verde amarillento.

La polaridad de la clorofila b tendra como consecuencia una baja interaccin con
cloroformo, por lo que en la cromatografa debera tener un bajo factor de retencin, lo que
concuerda con el Rf de A.
Los compuestos B y D presentan una coloracin amarilla que podra corresponder tanto a
carotenos como xantfilas. Estas dos se diferencian en su polaridad. Los carotenos
presentan una mayor afinidad por el cloroformo al ser hidrocarburos (de muy baja
polaridad), por lo que su factor de retencin debera ser alto, mientras el factor de retencin
de las xantfilas debera ser cercana a cero por su mayor polaridad. El Rf del compuesto B
indica una relativamente alta polaridad. Por otro lado el Rf del compuesto D es cercano a 1,
Rf experimental de los carotenos en cloroformo. [Handbook de cromatografa]
El color del compuesto C se acerca a la coloracin de la clorofila a. La diferencia de

coloracin (de verde azulado a azul-gris) podra ser causada por la degradacin de la
clorofila por la accin del calor, formando feofitina. El Rf de la clorofila a debera ser mayor
al de la clorofila b por su mayor afinidad con el cloroformo, lo que concuerda con el
compuesto C, suponiendo el compuesto A como clorofila b. [paper]
3.3 Extraccin continua
El disolvente del baln se evapora y pasa por el tubo lateral, al llegar a la columna
refrigerante se condensa y cae sobre la muestra. Aumenta el volumen de disolvente sobre
la muestra hasta llenar el sifn, entonces pasa por el tubo interno regresando al baln. Al
circular a travs de las semillas parte de los aceites, de baja polaridad, deberan disolverse
en el ter, mientras las sales, agua y otras impurezas no solubles en ter deberan quedar
en el filtro. Tras un tiempo prolongado se debera tener una gran concentracin de aceite en
el disolvente. Este se podra obtener evaporando el ter. Para comprobar el rendimiento de
la extraccin se podra comparar la masa inicial y tras la extraccin.
4. Conclusin
Se logra separar los pigmentos de la espinaca mediante una extraccin simple

utilizando hexano como fase orgnica, y acetona-agua como fase acuosa.
Se reconocen mediante cromatografa en capa fina los compuestos presentes en la
espinaca como clorofila a, clorofila b, caroteno y xantofila.
Los carotenos presentan mayor afinidad por la fase mvil (cloroformo), las menores
afinidades por el cloroformo la presentan las xantofilas, clorofila a y clorofila b.
5. Bibliografa

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En esta prctica de laboratorio se pretende extraer y reconocer los pigmentos vegetales de

La coloracin de las hojas de los vegetales se debe a ciertos pigmentos

Tabla 1. Propiedades de los reactivos. [handbook]

Agua 18.02 1.85 0.998

n-hexano 86.18 0 0,660

Cloroformo 119.4 1.04 1,47

A partir de los antecedentes entregados se plantean las siguientes hiptesis:

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3.1 Extraccin de pigmentos de espinaca

Los resultados para la extraccin de los pigmentos de espinaca en la mezcla

Tabla 2. Resultados obtenidos en la extraccin lquido-lquido de hojas de espinaca.

Lavado con MetOH El alcohol toma color verde

+ Acetona:Hexano Al macerar las hojas se forman dos fases

Mezcla + 10mL de agua Al agregarlo al embudo de decantacin ms agua y

+agua Se agrega agua para comprobar la fase acuosa. La fase

+Na2SO4 anhidro La sal se aglomera en el fondo del vaso, la solucin

En la extraccin simple se aade Acetona en primer lugar como extractante de los

Al aadir agua se logra identificar la fase orgnica (superior) y acuosa (inferior).

Na2SO4 + 7H2O Na2SO47H2O ecuacion (1)

3.2 Separacin de los pigmentos por cromatografa

La fase orgnica obtenida se analiza mediante cromatografa en capa fina (CCF),

Imagen 2. Cromatoplaca extracto de espinaca

Tabla 3. Valores de Rf y colores obtenidos en la CCF.

A 0,0192 Verde amarillento

C 0,1731 Azul grisceo

Los valores de Rf de la tabla 3, se obtienen a partir de la imagen 2 y la ecuacin (1):

Figura 4.1: a-caroteno

Conociendo los posibles pigmentos, su color y una estimacin de su polaridad es posible

El compuesto A podra corresponder a clorofila b debido a su coloracin verde amarillento.

El color del compuesto C se acerca a la coloracin de la clorofila a. La diferencia de

3.3 Extraccin continua

Se logra separar los pigmentos de la espinaca mediante una extraccin simple

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