Separación de pigmentos vegetales por cromatografía en capa fina

Universidad El Bosque
Química Orgánica

Integrantes: Alejandra Supelano, Mariana Alzate, Laura Alvarado

Resumen
Se realizó la separación de los pigmentos presentes en las hojas de Spinacia oleracea, y en la pulpa del Capsicum
annuum, por medio del método de cromatografía en capa fina; Y usando dos fases móviles con el fin de evidenciar
las diferencias entre los dos resultados. Las fases móviles en cuestión consisten en una mezcla de éter etílico con éter
de petróleo y la otra en una mezcla de éter etílico con tolueno. Además, en ambos casos se usó etanol como solvente
y placas de sílica gel como fase estacionaria.En la primera prueba, gracias tanto a la pigmentación como a los
coeficientes de repartición, se lograron identificar 5 pigmentos provenientes de la espinaca lo cuales corresponden al
β-caroteno, clorofila a y b y las xantofilas luteína y violaxantina. Sin embargo, no se logró ninguna separación con la
muestra sembrada del pimentón. Por otra parte, en la segunda cromatografía debido a que solo se logró una
separación parcial no fue posible de identificar qué pigmentos en específico se encontraban en cada mancha, aunque,
en la muestra del pimentón, debido a la coloración naranja, es posible llegar a la conclusión de que se trataba de un
caroteno.

Resultados

Imagen 1. Resultados usando mezcla de éter etílico y éter Imagen 2. Resultados usando mezcla de éter etílico y
de petróleo como fase móvil. tolueno 4:1 como fase móvil.

Pigmento en espinaca Rf cromatografía N° 1 Rf cromatografía N° 2

β-caroteno 0,98 cm _____

Clorofila a 0,85 cm 0,96 cm

Clorofila b 0,80 cm 0,96 cm

Luteína 0,75 cm 0,77 cm

Violaxantinas 0,66 cm 0,77 cm

Análisis de Resultados
Para la separación de los pigmentos de dos muestras pertenecientes a espinaca y pimentón se realizaron dos
montajes de cromatografía en capa fina, en las cuales se tomó como fase estacionaria una placa de sílica gel, de
carácter altamente polar, con un estructura que consta de una red de enlaces silicio-oxígeno, y enlaces O-H en su
superficie; y como fase móvil una mezcla de eter de petróleo -éter etílico para el primer montaje, y éter
etílico-tolueno para el segundo, que también poseen un carácter polar pero siendo este inferior al de la fas
estacionaria. (Nichols, 2022)
Una vez que las muestras vegetales han sido maceradas utilizando etanol, estas han de ser ubicadas sobre una línea
previamente marcada a 0,5 cm de uno de los extremos de la placa de sílica gel, utilizando un tubo capilar y
aplicando pacientemente 10 gotas (esperando que se seque cada gota) por cada muestra, evitando así la expansión
de las muestras sobre la placa. Posteriormente la fase estacionaria se ubica en una cámara cromatográfica donde ya
se ha ubicado la fase móvil correspondiente, esta última al entrar en contacto va a ascender a lo largo de placa por
capilaridad (facilitada por la porosidad de la fase estacionaria) y se va a observar como cada pigmento se ubica a una
distancia determinada respecto al origen.
Dicha separación puede ser explicada desde dos perspectivas diferentes aunque complementarias entre sí. Por un
lado está la interacción entre la muestra y la fase móvil, dado que esta última es menos polar que la fase estacionaria,
aquellos compuestos más polares tendrán una afinidad menor con la fase móvil que aquellos no polares y por ende
tendrán menos tiempo de elución movil y viajaran mas lento. Por otro lado está la interacción entre la muestra y la
fase estacionaria, siendo que si la fuerza de las fuerzas intermolecular que los compuestos forman con la placa de
sílica gel es alta, ello favorecerá a la fase estacionaria y pasan gran parte del tiempo adherido a la placa. (Nichols,
2022)
Para cuantificar qué tan lejos se ubican los pigmentos con relación al solvente se introduce el concepto de
coeficiente de reparto (Rf), que se define como la distancia recorrida por el pigmento sobre la distancia recorrida por
el eluyente.
De tal forma que, una vez que el eluyente ha alcanzado la otra marca al otro extremo de la placa, se ha retirado de la
cámara cromatográfica, y se ha evaporado el solvente se pueden determinar las distancias de cada mancha en
relación al su origen , así como la distancia total que recorrió el eluyente, permitiendo obtener el coeficiente de
reparto para cada uno de los pigmentos observados, que cabe resaltar es inversamente proporcional a la polaridad del
compuesto, es decir que entre menor sea el Rf mayor es su polaridad y viceversa Este valor podría ser usado
directamente para la identificación de una sustancia, sin embargo está condicionado por múltiples factores e
implicaría su replicación de forma experimental, lo cual no es sencillo, no obstante, dado que estos pigmentos han
sido previamente estudiando su orden relativo de separación va a ser siempre el mismo. (Torossi, 2007).
Solo en el primer montaje y para el caso de la espinaca se pudieron identificar adecuadamente los pigmentos, siendo
estos: β-caroteno, Clorofila a, Clorofila b, Luteína, Violaxantinas, de menor a mayor polaridad respectivamente.
Respecto a la muestra de pimentón, solo fue posible la identificación de uno de sus pigmentos en el segundo montaje
En el segundo montaje solo fue posible diferenciar los pigmentos clorofila y xantofilas para la espinaca y capsantina
para el pimentón.
La separación de los pigmentos arrojó mejores resultados cuando se realizó la prueba con éter de petróleo y éter
etílico como fase móvil. Una posible explicación de lo ocurrido radica en la polaridad de las fases móviles y la
relación que esta característica tiene sobre el coeficiente de reparto, dado que son directamente proporcionales. Por
lo cual el tolueno-éter etílico al ser más polar va atraer más los compuestos polares, haciendo que pasen más tiempo
en esta y aumente la distancia a la que se va a retener en la fase estacionaria, por longitud de la placa los demás
compuestos van a quedar agrupados en el frente del disolvente, como se evidencia en la tabla 1 los Rf de los
pigmentos de la espinaca para el montaje 1 fueron menores que aquellos en el montaje 2.

Conclusiones
- El coeficiente de reparto indica la polaridad de los pigmentos en la muestra, entre menor sea el valor, mayor
polaridad poseen y por ende se encuentran a menos distancia del origen, y viceversa.
- El montaje con la fase móvil de éter de petróleo-éter etílico arrojó resultados favorables al evaluarse
respecto a la muestra de espinaca, mientras que no se pudo realizar una identificación a la muestra de
pimentón.
- El montaje con la fase móvil de éter etílico-tolueno no fue igual de efectivo que el montaje previo en cuanto
a la muestra de espinaca se refiere, pero sí se obtuvo una separación en la muestra de pimentón, aunque esta
fue poco útil.
- Los pigmentos identificados experimentalmente para la muestra de espinaca fueron: β-caroteno, Clorofila a,
Clorofila b, Luteína, Violaxantinas, ordenados de mayor a menor polaridad respectivamente

Referencias
Nichols, L .(2022) 2.3D:Teoría de la separación. LibreTexts
Šesták, Z. (1959). Paper chromatography of chloroplast pigments. Chromatographic Reviews, 1, 193-208.
Camavilca Córdova, M., & Leyla Aliaga, M. J. (2015). Identificación de antocianinas y carotenoides en flores de
mastuerzo (Tropaeolum majus) por cromatografía en capa fina.
 Torossi, F. (2007). Una experiencia sencilla con fundamentos complejos: la separación de pigmentos
fotosintéticos mediante cromatografía sobre papel. Real sociedad española de química.
Martines, A. (2003). Carotenoides. Universidad de Antioquia