Trabajo Fin de Master Azidiol
Trabajo Fin de Master Azidiol
Trabajo Fin de Master Azidiol
Alumna:
Milagro Borrs Llopis
Director Acadmico
M Pilar Molina Pons
Rafael Lisandro Althaus
Marta Roca Marugn, por estar presente y por su apoyo desde el principio en
cada proyecto.
Por otro lado, los lmites de deteccin, calculados a partir de las muestras sin
refrigerar y sin conservante, para los diferentes mtodos, fueron generalmente
inferiores a los lmites proporcionados por las casas comerciales y tambin a los
Lmites Mximo de Residuos establecidos por la UE para la leche de vaca.
I. INTRODUCCIN.. 1
Entre estas sustancias hay que destacar a los agentes antimicrobianos, que
se definen, de forma general, como productos que son capaces de destruir o inhibir el
crecimiento de otros microorganismos y, adems, son efectivos a bajas
concentraciones (Mateos, 2002).
Por otro lado, en cuanto a la distribucin del consumo de los distintos grupos
de antimicrobianos para uso teraputico animal en Europa, aunque los datos
disponibles estn poco actualizados, se desprende que son las tetraciclinas con un
66% los antibiticos de mayor consumo seguidos de los macrlidos con un 12% y un
9% las penicilinas (IFAH, 1999).
2
Introduccin
Hay que tener en cuenta, que desde un punto de vista tecnolgico, la presencia
de sustancias farmacolgicas en la leche cruda afecta a los procesos bacterianos en la
elaboracin de productos fermentados como queso y yogur se ralentizan, pudiendo
retrasar la acidificacin, una mayor dificultad en el cuajado y la maduracin (Mourot y
Loussouarn, 1981; Brady y Katz, 1987; Suhren, 1995), llegando incluso a inhibirse
completamente por causa de los residuos de antibiticos, ya que afectan a la flora
lctica dando lugar a procesos de mala calidad (Packham y col., 2001).
Tampoco hay que olvidar la importancia que tiene la presencia de residuos para
el propio ganadero, ya que puede llevar a la inmovilizacin y posterior destruccin de
la leche en caso de resultados no conformes por parte de las autoridades, al ser
calificada como no apta para consumo humano segn el Reglamento 853/2004/CEE.
3
Introduccin
4
Introduccin
5
Introduccin
6
Introduccin
ENTREGA
Trasvase
entre
cisternas
RECEPCIN
Exportacin
Rechazo
Importacin
7
Introduccin
Mtodos ms empleados
Confirmacin
Cribado
+
Laboratorios de No Especficos Microbiolgicos
control - Mtodos
cualitativos
Especficos Enzimticos
Explotaciones ganaderas y inmunoenzimticos
centros lcteos Unin a receptores
8
Introduccin
vista prctico se necesita que estos mtodos sean rpidos, por ello se utilizan mtodos
enzimticos o de unin a receptores ya que son especficos de una sustancia o grupo,
muy rpidos y de fcil manejo. Los ms utilizados en Espaa son el Beta Star,
TwinSensor y el SNAP, entre otros.
En los laboratorios de control este Real Decreto establece que para todas las
muestras recibidas se utilicen mtodos que, al menos, detecten residuos de
betalactmicos y de tetraciclinas y en el caso que se utilice un mtodo sensible a
ambos grupos de sustancias y el resultado fuera no conforme, el laboratorio proceder
a la identificacin del grupo. Por ello, se emplean mtodos microbiolgicos los cuales
indican la presencia o ausencia de residuo, son baratos y de fcil manejo. Los ms
utilizados en Espaa son el BRT-AiM, Delvotest y Eclipse.
La toma de muestras tiene como objetivo obtener una muestra representativa del
volumen total de leche que contiene el tanque o la cisterna. En el citado Real Decreto
se seala que antes de tomar la muestra hay que homogenizar convenientemente la
leche del tanque o cisterna, para aconseguir un buena mezcla de todos los
componentes especialmente de la grasa, celulas somticas y grmenes; para facilitar
que la muestra sea lo ms respresentativa posible y estas deben ser identificadas
correctamente con etiquetas.
9
Introduccin
Por otro lado, en los controles obligatorios en los centros lcteos la toma de
muestras ser realizada por el tcnico de calidad del centro lcteo. Se recogern dos
muestras de todas las cisternas a su llegada al centro lcteo antes de su descarga,
una de las muestras se enviara al laboratorio de anlisis donde se determinar el
punto crioscopico, grasa, protena, extracto seco magro, clulas somticas, colonias
de grmenes a 30C y presencia de residuos de antibiticos y la otra muestra servir
para la realizacin in situ de una prueba de deteccin de residuos de antibiticos. Se
debern identificar con una etiqueta individual para identificar la muestra de leche y
comunicar los resultados de los anlisis a la base de datos Letra Q.
10
Introduccin
A partir de los resultados del citado estudio se pudo deducir que la presencia
de azidiol parece presentar lecturas de absorbancia ms elevadas que aquellas sin
conservantes y que, en todos los casos, las lecturas fueron superiores en los tiempos
ms bajos de incubacin (2 h 30 min.), disminuyendo sus valores conforme el tiempo
de anlisis aumenta.
Tambin Molina y col. (2003a) en otro estudio sobre el efecto del uso de dos
conservantes, dicromato potsico y azidiol, sobre la respuesta del mtodo BRT AiM Y
Delvotest en la leche de oveja dedujeron que el dicromato potsico inhiba totalmente
el crecimiento del Geobacillus stearothermophilus mientras que con el azidiol se
obtena una selectividad del 90,2% para el BRT AiM y del 91% en el Delvotest,
valores inferiores a los obtenidos en muestras sin conservante. Esas mismas muestras
calentadas a 82 C durante 10 minutos, mejoraron la selectividad del mtodo hasta un
94,8% y un 95,3%, respectivamente. Poniendo de manifiesto la mejora de los
resultados con el calentamiento de las muestras previo al anlisis para reducir la
incidencia de resultados falsos positivos.
Otros autores (Montero y col., 2005) tambin estudiaron el efecto del uso de
azidiol como conservante en las muestras de leche de oveja sobre la respuesta del
mtodo Eclipse 100ov, no encontrndose resultados falsos positivos, sin embargo
estos autores sealan una incidencia significativa de resultados dudosos en las
muestras que contenan conservante (8,6%) en comparacin con las muestras sin
conservante (0,6%).
11
Introduccin
leche de oveja, Roca y col. (2007), concluyeron que la presencia de azidiol no influy
sobre la selectividad y sensibilidad de los mtodos siempre que se prolongue la
incubacin15 minutos ms del tiempo recomendado por el fabricante.
Para evaluar la robustez y fiabilidad del test Eclipse la casa comercial Zeu-
Inmunotec, SL, en el ao 2008, realiz una reevaluacin de la sensibilidad del test en
un amplio grupo de antimicrobianos a diferentes concentraciones, adems las
muestras de leche se suplementaron con azidiol. Obtuvieron un ligero aumento del
tiempo de viraje, con respecto a muestras de leche sin azidiol (10-15 minutos) debido
a las propiedades inhibitorias del conservante y la sensibilidad a algunos antibiticos
se ve ligeramente incrementada.
12
Introduccin
Del mismo modo Roca y col. (2009), en un anlisis sobre la influencia de las
condiciones de almacenamiento sobre la estabilidad de las penicilinas en la leche,
empleando HPLC para la cuantificacin de las perdidas, obtiene que la penicilinas son
molculas que presentan porcentajes de degradacin elevados cuando las muestras
de leche son refrigeradas a 4 C.
13
Introduccin
A su vez, Roca y col. (2008) tambin obtuvo un efecto significativo del tiempo
de refrigeracin a 4 C sobre la estabilidad de tetraciclinas en la leche, ya que las
concentraciones disminuan conforme aumentaba el tiempo de refrigeracin.
La importancia que tiene tanto para la industria lctea, como para el productor
de leche y la seguridad alimentaria la posible interferencia del tiempo de refrigeracin
de la leche sobre los mtodos microbiolgicos de deteccin de antimicrobianos,
plantea la necesidad de llevar a cabo estudios que evalen el efecto que causan los
tiempos de refrigeracin as como, el efecto de la presencia de azidiol en las muestras
de leche, ya que como se ha expuesto estos factores pueden interferir en los
resultados de los mtodos empleados en la deteccin de los residuos de
medicamentos.
14
Objetivos
II. OBJETIVOS
La presencia de residuos de medicamentos veterinarios en la leche supone un
riesgo para la salud pblica, adems de ocasionar problemas en la industria lctea por
su influencia negativa en los procesos de elaboracin de algunos productos lcteos.
Por ello, el objetivo general de este trabajo ha sido estudiar el efecto de los
factores relacionados con la toma de muestras de leche (conservante y
almacenamiento), sobre la respuesta de algunos de los mtodos microbiolgicos de
cribado ms utilizados en Espaa (BRT AiM, Delvotest Accelerator y Eclipse 100)
en la deteccin de los antibiticos sealados en el R.D 1728/2007 (amoxicilina,
ampicilina y oxitetraciclina), as como la penicilina G debido a su frecuencia de uso en
vacuno lechero. De modo ms especfico, los objetivos planteados en el estudio han
sido:
15
MATERIAL Y MTODOS
Material y Mtodos
16
Material y Mtodos
17
Material y Mtodos
18
Cuadro 2. Sustancias antimicrobianas y concentraciones empleadas
Sustancias Concentracin Concentracin Ref,
Disolvente
antimicrobianas 1er experimento (g/Kg) 2 experimento (g/Kg) comercial
LMR L.D
Penicilinas Mtodo (g/Kg)
(g/Kg)
Ref,
BRT AiM 3-4 0 / 0,25 / 0,5 / 0,75 / 1 / 1,25 / 1,5 / 1,75 / 2 / 2,25 / 2,5 / 2,75 comercial
Amoxicilina 4 4 DELVOTEST 2-3 0 / 1 / 1,25 / 1,75 / 2 / 2,25 / 2,5 / 2,75 / 3 / 3,25 / 3,75 H2O Sigma A-8523
BRT AiM 4 0 / 0,25 / 0,5 / 0,75 / 1 / 1,25 / 1,5 / 1,75 / 2 / 2,25 / 2,5 / 2,75
Ampicilina 4 4 DELVOTEST 4 0 /1,5 / 1,75 / 2 / 2,5 / 2,75 / 3 / 3,25 / 3,5 / 3,75 / 4 / 4,5 H2O Sigma A-9518
ECLIPSE 100 5 0 / 1 / 1,25 / 1,5 / 1,75 / 2 / 2,25 / 2,5 / 2,75 / 3 / 3,5 / 3,75
BRT AiM 2-3 0 / 0,25 / 0,5 / 0,75 / 1 / 1,25 / 1,5 / 1,75 / 2 / 2,25 / 2,5 / 2,75
Penicilina G 4 4 DELVOTEST 1-2 0 / 0,25 / 0,5 / 0,75 / 1 / 1,25 / 1,5 / 1,75 / 2 / 2,25 / 2,50 / 2,55 H2O Sigma Pen-Na
LMR L.D
Tetraciclinas Mtodo
(g/Kg) (g/Kg)
Oxitetraciclina 100 200 DELVOTEST 250-500 0 / 200 / 225 / 250 / 275 / 300 / 325 / 350 / 375 / 400 / 425 / 450 HCl 0,1N Sigma O-5750
ECLIPSE 100 140 0 / 60 / 80 / 100 / 120 / 140 / 160 / 180 / 200 / 220 / 240 / 260
LMR: Lmite mximo de residuos; LD: Lmite de deteccin proporcionado por la casa comercial
l
19
Material y Mtodos
Para la realizacin del test hay que colocar 100 L de muestra en cada pocillo
e incubar en el escner-incubador proporcionado por la casa (DELVO SCAN) con
capacidad para 4 placas individuales, donde cada una se incuba de forma
independiente.
20
Material y Mtodos
4. ANLISIS ESTADSTICO
21
Material y Mtodos
( LD + 2 R j + 3 A )
e 0 1
FR j
(
1 e 0 1
LD + 2 R j + 3 A )
(Ecuacin II)
95 FR j
%PAA 100 (Ecuacin III)
95
22
RESULTADOS Y DISCUSIN
Resultados y Discusin
V. RESULTADOS Y DISCUSIN
Con el propsito de evaluar el efecto del tiempo de refrigeracin y la presencia
de azidiol en las muestras de leche sobre la sensibilidad de los mtodos BRT AiM,
Delvotest Accelerator y Eclipse 100 y, por otra parte calcular las perdidas relativas
de actividad antimicrobiana, se realiz un ensayo para la amoxicilina, ampicilina y
oxitetraciclina, dado que en el RD 1728//2007 se establece que los mtodos
empleados en la prueba de deteccin de antibiticos tienen que ser capaces de
detectar al menos estos antibiticos a niveles del Lmite Mximo de Residuos (LMR), y
para la penicilina G dada su frecuencia de utilizacin en ganado vacuno lechero
(Zorraquino y col. 2007).
23
Resultados y Discusin
Cuadro 3. Sensibilidad del mtodo BRT AiM para los antibiticos betalctamicos
y la oxitetraciclina
Horas Amoxicilina Ampicilina Penicilina G Oxitetraciclina
(da) (4 g/Kg) (4 g/Kg) (4 g/Kg) (200 g/Kg)
24
Resultados y Discusin
Cuadro 5. Sensibilidad del mtodo Eclipse 100 para los antibiticos betalctamicos
y la oxitetraciclina
Horas Amoxicilina Ampicilina Penicilina G Oxitetraciclina
(da) (4 g/Kg) (4 g/Kg) (4 g/Kg) (200 g/Kg)
25
Resultados y Discusin
Por otro lado, hay que destacar que la diferencia de resultados entre mtodos
puede ser debida a los diferentes LD presentados por los fabricante, ya que para un
mismo antibitico los LD varan entre mtodos. Por ejemplo, el LD para la amoxicilina
en el mtodo BRT AiM se encuentra entre 3-4 g/Kg, Delvotest Accelerator entre 2-3
g/Kg y Eclipse 100 5 g/Kg.
26
Resultados y Discusin
2.1. Penicilinas
2.1.1. Amoxicilina
27
Resultados y Discusin
Por ello, al realizar el anlisis estadstico de las diferentes horas respecto a las
muestras sin refrigerar (Cuadro 8), se observ que en la respuesta de los mtodos
Delvotest Accelerator y Eclipse 100 aparecieron diferencias significativas a las 48
horas de conservacin, en cambio en la respuesta del mtodo BRT AiM hasta las 72
horas no se apreciaron diferencias.
28
Resultados y Discusin
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2
Amoxicilina (g/Kg)
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2
Amoxicilina (g/Kg)
29
Resultados y Discusin
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 1 2 3 4
Amoxicilina (g/Kg)
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 1 2 3 4
Amoxicilina (g/Kg)
30
Resultados y Discusin
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5
Amoxicilina (g/Kg)
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5
Amoxicilina
31
Resultados y Discusin
Para poder estimar estas perdidas, ya que los mtodos utilizados presentan
una respuesta cualitativa, en primer lugar se calcularon los lmites de deteccin (LD), a
partir de las ecuaciones de prediccin obtenidas (Cuadro 7) en muestras de leche sin
conservante y sin refrigerar. Estos lmites de deteccin corresponden a las
concentraciones de antibitico que deberan hallarse originalmente en las muestras de
leche para que produzcan un 95% de resultados positivos segn el criterio propuesto
por FIL-ISO (2002) para mtodos microbiolgicos e interpretaciones visuales.
32
Resultados y Discusin
33
Resultados y Discusin
Cuadro 10. Efecto del tiempo de refrigeracin y del azidiol sobre el porcentaje de
resultados positivos en los mtodos microbiolgicos para leche con amoxicilina
Horas de refrigeracin 0 24 48 72
BRT AiM
Sin conservante 95 90 83 71
Azidiol 98 97 94 88
Delvotest Accelerator
Sin conservante 95 84 59 28
Azidiol 99 95 84 59
Eclipse 100
Sin conservante 95 85 63 33
Azidiol 98 93 80 55
34
Resultados y Discusin
BRT AiM
s/c azidiol
100
80
60
%PAA
40
25
20
13
5 7
0 1
0
24 48 72
Tiempo de refrigeracin (horas)
Delvotest Accelerator
s/c azidiol
100
80 71
60
%PAA
39 39
40
20
13 12
0
0
24 48 72
Eclipse 100
s/c azidiol
100
80
65
60
%PAA
43
40
34
15
20
10
0
0
24 48 72
Tiempo de refrigeracin (horas)
Figura 12. Efecto del tiempo de refrigeracin sobre las prdidas relativas de actividad
antimicrobiana (PAA) de amoxicilina leche sin conservante y con azidiol
35
Resultados y Discusin
36
Resultados y Discusin
2.1.2. Ampicilina
Los resultados del anlisis estadstico de los factores concentracin de
antibitico, presencia de conservante en las muestras de leche y tiempo de
refrigeracin sobre la respuesta de los mtodos microbilogos BRT AiM, Delvotest
Accelerator y Eclipse 100 referentes a la ampicilina se presentan en el Cuadro 11,
donde se seala que todos los factores resultaron altamente significativos (p<0,001), a
excepcin de la presencia de azidiol en el mtodo BRT AiM cuyo nivel de significacin
result menor (p<0,01).
37
Resultados y Discusin
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8
Ampicilina (g/Kg)
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8
Ampicilina (g/Kg)
38
Resultados y Discusin
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6
Ampcilina (g/Kg)
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6
Ampicilina (g/Kg)
39
Resultados y Discusin
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6
Ampicilina (g/Kg)
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6
Ampicilina (g/Kg)
40
Resultados y Discusin
Cuadro 13. Efecto del tiempo de refrigeracin sobre la respuesta de los mtodos
microbiolgicos en muestras de leche con ampicilina
0-24 horas 0-48 horas 0-72 horas
Mtodo
Valor 2
Valor p Valor
2
Valor p Valor 2 Valor p
BRT AiM 3,409 0,0648 14,867 0,0000 12,825 0,0003
Delvotest Acc. 34,572 0,0000 57,540 0,0000 93,145 0,0000
Eclipse 100 18,088 0,0000 80,565 0,0000 131,849 0,0000
41
Resultados y Discusin
En los mtodo Delvotest Accelerator (3,22 g/Kg) y Eclipse 100 (3,80 g/Kg)
los lmites de deteccin calculados en este estudio para la ampicilina fueron superiores
a los obtenidos en el BRT AiM (1,33 g/Kg). Pero en todos los casos estos valores
fueron menores a los indicados por los fabricantes 5, 4 y 4 g/Kg, respectivamente.
Esta diferencia de valores podra ser debida a la diferente metodologa utilizada en
este estudio, ya que se utiliz un mtodo estadstico basado en la regresin logstica.
Por otro lado, Roca y col. (2007) en un estudio sobre validacin de los mtodos
de deteccin de residuos de antibiticos comercializados en Espaa, en el caso de la
ampicilina las sensibilidades fueron del 100% al LMR para los mtodos BRT AiM y
Delvotest Accelerator y de un 67% para el Eclipse 100.
42
Resultados y Discusin
Cuadro 15. Efecto del tiempo de refrigeracin y del azidiol sobre el porcentaje de
resultados positivos en los mtodos microbiolgicos para leche con ampicilina
Horas de refrigeracin 0 24 48 72
BRT AiM
Sin conservante 95 91 86 77
Azidiol 98 96 94 89
Delvotest Accelerator
Sin conservante 95 81 48 17
Azidiol 100 98 91 69
Eclipse 100
Sin conservante 95 83 55 24
Azidiol 99 96 87 38
43
Resultados y Discusin
BRT AiM
s/c azidiol
100
80
60
%PAA
40
19
20
4 10 6
0 0
0
24 48 72
Tiempo de rerigeracin (horas)
Delvotest Accelerator
s/c azidiol
100
82
80
60
%PAA
49
40
27
20
15
0 4
0
24 48 72
Tiempo de refrigeracin (horas)
Eclipse 100
s/c azidiol
100
75
80
60
%PAA
42 38
40
20
13
0 0
0
24 48 72
Tiempo de rerigeracin (horas)
Figura 19. Efecto del tiempo de refrigeracin sobre las prdidas relativas de actividad
antimicrobiana (PAA) de ampicilina leche sin conservante y con azidiol
44
Resultados y Discusin
En segundo lugar se observa que las perdidas a las 72 horas fueron mayores
en los mtodos Delvotest Accelerator y Eclipse 100, que como ya se ha comentado
anteriormente en el caso de la amoxicilina, esto puede ser debido al propio
fundamento de estos mtodos.
2.1.3. Penicilina G
Del mismo modo que en los casos anteriores, en el Cuadro 17 se exponen las
ecuaciones calculadas mediante el modelo logstico y los valores del porcentaje de
concordancia para cada unos de los mtodos estudiados. Para el mtodo BRT AiM la
concordancia fue de un 94,32%, en cambio para Delvotest Accelerator y Eclipse 100
la concordancia fue menor con valores del 81,72 y 85,22%, respectivamente.
45
Resultados y Discusin
Con las horas de refrigeracin los mtodos presentaron una menor porcentaje
de resultados positivos en muestras de leche con penicilina G que para la amoxicilina
y la ampicilina. Sobre todo es el Delvotest Accelerator el que present una mayor
disminucin de resultados positivos que mejor considerablemente en las muestras
con azidiol si se compara con los otros mtodos.
46
Resultados y Discusin
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
Peniclina (g/Kg)
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
Penicilina G (g/Kg)
47
Resultados y Discusin
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Penicilina (g/Kg)
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Penicilina G (g/Kg)
48
Resultados y Discusin
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5
Penicilina G
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Penicilina G (g/Kg)
49
Resultados y Discusin
Cuadro 18. Efecto del tiempo de refrigeracin sobre la respuesta de los mtodos
microbiolgicos en muestras de leche con penicilina G
Por otro lado, en el anlisis del efecto del azidiol en las diferentes horas de
refrigeracin (Cuadro 19), se pone de manifiesto que el mtodo BRT AiM con
muestras refrigeradas y con azidiol hasta las 48 horas no present resultados
significativamente diferentes con respecto a los obtenidos con las muestras sin
conservante. En cambio, el Delvotest Accelerator y Eclipse 100 ya en el primer da
(24 horas) los resultados obtenidos con las muestras sin conservante y las muestras
con azidiol fueron significativamente diferentes (p<0,05), por lo que en estos mtodos
para realizar el anlisis de residuos de antibiticos sera aconsejable conservar las
muestras con azidiol hasta su anlisis.
50
Resultados y Discusin
Por otra parte, el lmite de deteccin obtenido para el BRT AiM (0,78 g/Kg) es
inferior al obtenido por Althaus y col. (2002) cuando utiliza este mismo mtodo con
leche de oveja y lecturas fotomtricas (2 g/Kg), tambin son inferiores a los 1,5 g/Kg
(Heeschen y Blthgen, 1995), 1-2 g/Kg (Frank, 1995) y 2-3 g/Kg (Zaadhof y col.
1997) para diferentes versiones de BRT con muestras de leche de vaca.
Por ltimo, el lmite del Eclipse 100 (2,38 g/Kg) es inferior al calculado por
Montero y col. (2005) al utilizar otra versin del mtodo Eclipse 100 ov en leche de
oveja (5 g/Kg).
Por otro lado, en un informe realizado por Roca y col. (2007) sobre validacin
de mtodos de deteccin de residuos de antibiticos, las sensibilidades para los
mtodos BRT AiM y Delvotest Accelerator fue del 100% a una concentracin de 2
g/Kg (0,5LMR), sin embargo para el mtodo Eclipse 100, a esta misma
concentracin, la sensibilidad result de un 74%.
En dicho Cuadro se observa que en todos los mtodos los resultados positivos
fueron menores a medida que transcurren las horas de conservacin y que estos
resultaron mayores ya en las muestras sin refrigerar, cuando estaba presente el
51
Resultados y Discusin
Cuadro 20. Efecto del tiempo de refrigeracin y del azidiol sobre el porcentaje de
resultados positivos en los mtodos microbiolgicos para leche con penicilina G
Horas de refrigeracin 0 24 48 72
BRT AiM
Sin conservante 95 64 16 2
Azidiol 98 83 34 5
Delvotest Accelerator
Sin conservante 95 36 2 0
Azidiol 100 88 18 1
Eclipse 100
Sin conservante 95 82 53 22
Azidiol 99 95 82 53
52
Resultados y Discusin
BRT AiM
s/c azidiol
98
100 95
83
80
64
60
%PAA
33
40
13
20
0
24 48 72
Tiempo de refrigeracin (horas)
Delvotest Accelerator
s/c azidiol
98 100
100
81 99
80
62
60
%PAA
40
20
8
0
24 48 72
Tiempo de refrigeracin (horas)
Eclipse 100
s/c azidiol
100
77
80
60
%PAA
44 45
40
20 13 14
0
0
24 48 72
Tiempo de refrigeracin (horas)
Figura 26. Efecto del tiempo de refrigeracin sobre las prdidas relativas de actividad
antimicrobiana (PAA) de penicilina G leche sin conservante y con azidiol
53
Resultados y Discusin
2.2. Oxitetraciclina
54
Resultados y Discusin
Cuadro 23. Efecto del tiempo de refrigeracin sobre la respuesta de los mtodos
microbiolgicos en muestras de leche con oxitetraciclina
0-24 horas 0-48 horas 0-72 horas
Mtodo
Valor 2 Valor p Valor 2 Valor p Valor 2 Valor p
BRT AiM 137,320 0,0000 61,421 0,0000 286,245 0,0000
Delvotest Acc. 0,000 1,0000 0,0000 1,0000 143,033 0,0000
Eclipse 100 0,000 1,0000 21,994 0,0000 56,988 0,0000
55
Resultados y Discusin
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 20 40 60 80 100
Oxitetraciclina (g/Kg)
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 20 40 60 80
Oxitetraciclina (g/Kg)
56
Resultados y Discusin
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Oxitetraciclina (g/Kg)
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Oxitetraciclina
57
Resultados y Discusin
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 50 100 150 200 250
Oxitetraciclina (g/Kg)
0h 24 h 48 h 72 h
100
80
Frecuencia positivos (%)
60
40
20
0
0 50 100 150 200 250
Oxitetraciclina
58
Resultados y Discusin
59
Resultados y Discusin
Cuadro 25. Efecto del tiempo de refrigeracin y del azidiol sobre el porcentaje de
resultados positivos en los mtodos microbiolgicos para leche con oxitetraciclina
Horas de refrigeracin 0 24 48 72
BRT AiM
Sin conservante 95 36 2 0
Azidiol 98 61 4 0
Delvotest Accelerator
Sin conservante 95 94 94 93
Azidiol 98 98 97 97
Eclipse 100
Sin conservante 95 92 87 80
Azidiol 97 95 92 87
Adems, por lo general en los tres mtodos las perdidas de las muestras con
azidiol fueron prcticamente iguales que en las muestras sin conservante, por lo que
en este caso conservar las muestras con azidiol no permite obtener menores perdidas.
Como se ha comentado anteriormente, la presencia de conservante retrasa el
crecimiento microbiano, por lo que las muestras con azidiol pueden contener menos
enzimas producidas por los microorganismos, como betalactamasas. Este hecho
podra ser ms manifiesto en el caso de los betalactmicos en donde la refrigeracin
durante ms o menos tiempo sera la causa de una mayor liberacin de
betalactamasas, en especial en muestras sin conservante con mayores prdidas de
actividad de estos antibiticos pero no tendra porque influir a otro grupos o familias de
antimicrobianos, como es el caso de las tetraciclinas.
60
Resultados y Discusin
BRT AiM
s/c azidiol
98 95 100
100
80 100
63
60
%PAA
36
40
20
0
24 48 72
Tiempo de refrigeracin (horas)
Delvotest Accelerator
s/c azidiol
100
80
60
%PAA
40
20
1 0 1 0 2 0
0
24 48 72
Tiempo de refrigeracin (horas)
Eclipse 100
s/c azidiol
100
80
60
%PAA
40
20 16
3 8 8
0 3
0
24 48 72
Tiempo de refrigeracin (horas)
Figura 33. Efecto del tiempo de refrigeracin sobre las prdidas relativas de actividad
antimicrobiana (PAA) de oxitetraciclina leche sin conservante y con azidiol
61
Resultados y Discusin
63
Conclusiones
V. CONCLUSIONES
De los resultados de este trabajo se deducen una serie de conclusiones sobre
la influencia de los factores metodolgicos empleo de conservante y tiempo de
refrigeracin de las muestras de leche sobre la respuesta de los mtodos
microbiolgicos de cribado:
64
Conclusiones
Los lmites de deteccin, calculados a partir de las muestras sin refrigerar y sin
conservante, para los diferentes mtodos, son generalmente inferiores a los
lmites proporcionados por las casas comerciales y tambin a los Lmites
Mximo de Residuos establecidos por la UE para la leche de vaca.
Desde un punto de vista prctico, se puede resumir que sera conveniente que
las casas comerciales aproximen los lmites de deteccin al LMR para evitar
resultados no conformes y evitar penalizaciones injustas a los ganaderos. Por otro
lado, resultara conveniente refrigerar las muestras de leche el mnimo tiempo posible
antes de su anlisis, y en caso de tener que refrigerar la leche sera conveniente
utilizar azidiol, ya que las prdidas son menores con la presencia de conservante.
65
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