Bioetanol
Bioetanol
Bioetanol
“OBTENCIÓN DE BIOETANOL A
PARTIR DE HIDROLIZADOS DE
RESIDUOS DE FRUTA”
JULIO, 2017
Agradecimientos
A Ana Díaz, mi cotutora, por todos los consejos, la dedicación, las horas
empleadas, su enorme disponibilidad, su positividad y por el gran esfuerzo dedicado en
este trabajo.
A los compañeros del máster, por el sufrimiento y las alegrías compartidas, las
tardes de clase, las comidas en la facultad, los días en el laboratorio, y por hacer de
este año un bonito recuerdo.
Por supuesto a mis padres, por el enorme esfuerzo que hacen día tras día para
que yo pueda llegar a ser lo que me proponga, y por creer en mí.
RESUMEN
La población mundial es dependiente de la energía, la cual está basada casi al
90% en los combustibles fósiles y la energía nuclear. Pero en las últimas décadas, con el
aumento de la población y el uso masivo de las tecnologías, comenzó a crecer la
preocupación por el agotamiento de las reservas de petróleo y el deterioro ambiental.
Sumado a la creciente producción de residuos, con necesidad de revalorizarse, ha
surgido la necesidad de analizar la posibilidad de producir biocombustibles a partir de
residuos.
Con el objetivo de reducir ambos problemas, este proyecto forma parte de una
línea de investigación con biocombustibles utilizando, como materia prima para
generarlos, residuos, en lugar de cultivos con función alimentaria, lo que evita
problemas éticos. Para ello, residuos de fruta del supermercado (cáscara y pulpa de
plátano y cáscara de naranja) se sometieron a pretratamientos hidrotérmicos a diferentes
condiciones, 120ºC, 128ºC y 135ºC, con el fin de analizar el proceso que maximiza la
cantidad extraída de azúcares fermentables. En los caldos obtenidos se midió la
concentración de compuestos inhibidores (furfural, HMF y ácido acético) que tienen
potencialidad de inhibir el proceso fermentativo. Para finalmente realizar un ensayo de
fermentación para el caso de la pulpa de plátano.
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Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
ABSTRACT
In the case of orange peel, none of the treatments increased the concentration of
reducing sugars. For the banana peel, the treatment with the best results was at 120ºC,
with an efficiency of 43%. For the banana pulp the optimal conditions were at 135ºC,
reaching an efficiency of 90%. The concentration of fermentable sugars obtained was
higher in this last case, obtaining 36.8 g/ 100 g of dry residue. Therefore, this case was
chosen to carry out the fermentation.
When measuring the inhibitory compounds, the presence of the three was
detected in some samples, but at levels lower than the minimum inhibitory
concentrations, so they do not suppose any impediment for the fermentative process.
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Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Consumo de energía primaria en 2015 en España. Fuente: APPA, 2015. ........ 6
Figura 2. Perspectivas de crecimiento de la demanda mundial de energía primaria.
Fuente: AIE y D. Secretaría Técnica de Repsol, 2013. .................................................... 7
Figura 3. Estructura básica de los carbohidratos.. .......................................................... 17
Figura 4. Estructura de la glucosa y la fructosa. ............................................................. 18
Figura 5. Estructura de la sacarosa y la lactosa .............................................................. 18
Figura 6. Estructura del almidón .................................................................................... 19
Figura 7. Participación del grupo aldehído en disacáridos reductores y no reductores.. 19
Figura 8. Estructura de la celulosa ................................................................................. 21
Figura 9. Estructura de la hemicelulosa. ........................................................................ 22
Figura 10. Precursores de la estructura de la lignina ...................................................... 22
Figura 11. Esquema general de la estructura del material lignocelulósico .................... 23
Figura 12. Esquema del proceso de generación de bioetanol a partir de biomasa
lignocelulósica. ............................................................................................................... 24
Figura 13. Representación esquemática del proceso de pretratamiento ......................... 24
Figura 14. Representación esquemática del proceso de hidrólisis. ................................ 28
Figura 15. Principales compuestos de degradación originados en el pretratamiento e
hidrólisis de la biomasa lignocelulósica. ........................................................................ 31
Figura 16. Reacción de fermentación de la glucosa. ...................................................... 33
Figura 17. Pérdida y desperdicio de alimentos per cápita (Kg/años, en las fases de
consumo y pre-consumo, según diferentes áreas geográficas. ....................................... 37
Figura 18. Distribución de las pérdidas de fruta y hortalizas en las diferentes etapas de la
cadena alimentaria de diferentes áreas geográficas. ....................................................... 38
Figura 19. Jerarquía de gestión de residuos aplicada a los Biorresiduos. Fuente:
MAPAMA, 2013 ............................................................................................................ 40
Figura 20. Cáscara de naranja, de plátano y pulpa de plátano cortada en trozos de 2 mm.
........................................................................................................................................ 43
Figura21. Muestras de pulpa de plátano trituradas junto con agua destilada, antes y
después del tratamiento hidrotérmico. .......................................................................... 44
Figura 22. Muestras de pulpa de plátano trituradas junto con agua destilada, antes, y
después del tratamiento a 135ºC.. ................................................................................... 45
Figura 23. Muestras de cáscara de plátano para medir azúcares potenciales, antes de
meter al autoclave, y después del tratamiento. ............................................................... 47
Figura 24. Curva de calibración para determinar los azúcares totales. .......................... 48
Figura 25. Patrones de glucosa para realizar la curva de calibrado de los azúcares
totales. ............................................................................................................................. 49
Figura 26. Curva de calibración para determinar los azúcares reductores. .................... 50
Figura 27. Patrones de glucosa para realizar la curva de calibrado de los azúcares
reductores........................................................................................................................ 50
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Figura 28. Muestras por triplicado de los diferentes residuos resultado de la fase de
deshidratación en la estufa a 60ºC durante 48 horas, antes, y después de meter en la
estufa............................................................................................................................... 52
Figura 29. Cromatógrafo Agilent 1200 .......................................................................... 53
Figura 30. Cromatógrafo de gases CLARUS 400 (Perkin Elmer) ................................. 54
Figura 31. Curva de calibración del etanol ..................................................................... 55
Figura 32. Azúcares potenciales en cada uno de los substratos. .................................... 58
Figura 33. Azúcares potenciales, totales y reductores obtenidos a partir de los residuos
sin tratar.. ........................................................................................................................ 62
Figura 34. Azúcares totales, reductores y potenciales a partir de residuos tratados por
hidrólisis térmica a 120ºC y a partir de residuos sin tratar.. ........................................... 64
Figura 35. Azúcares totales, reductores y potenciales a partir de residuos tratados por
hidrólisis térmica a 128ºC y a partir de residuos sin tratar.. ........................................... 66
Figura 36. Azúcares totales, reductores y potenciales a partir de residuos tratados por
hidrólisis térmica a 135ºC y a partir de residuos sin tratar.. ........................................... 67
Figura 37. Variación del porcentaje de extracción de azúcares reductores en función de
la temperatura en las diferentes muestras analizadas. .................................................... 70
Figura 38. Presencia y concentración de furfural e HMF detectado mediante HPLC. .. 71
Figura 39. Concentraciones de furfural, HMF y ácido acético de las muestras sometidas
a tratamiento hidrotérmico y la muestra de pulpa de plátano tratado con el método de
análisis de azúcares potenciales. ..................................................................................... 76
Figura 40. Azúcares totales, reductores y potenciales de la muestra de pulpa de plátano
utilizada como sustrato en la fermentación, sin realizar tratamiento y después de
someter a tratamiento hidrotérmico a 135ºC .................................................................. 78
Figura 41. Evolución de la concentración de azúcares totales y reductores a lo largo del
proceso fermentativo ...................................................................................................... 80
Figura 42. Concentración de etanol correspondiente al tiempo final de la fermentación.
........................................................................................................................................ 82
Figura 43. Evolución de la concentración de etanol durante el proceso fermentativo. .. 83
Figura 44. Evolución de la concentración de azúcares totales y de etanol, durante la
fermentación ................................................................................................................... 84
Figura 45. Evolución del pH a lo largo de la fermentación. ........................................... 85
Figura 46. Observación en placa de colonias de S. cerevisiae, correspondiente a las 62
horas de fermentación. .................................................................................................... 86
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LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Composición de la cáscara de naranja, pulpa de plátano y cáscara de naranja,
expresada en porcentaje de materia seca. Fuentes: USDA; Granda et al., 2005; Lenihan
et al., 2011; García et al., 2012; ASPROCAN, 2016. .................................................... 41
Tabla 2. Humedad de los substratos expresado en porcentaje ....................................... 56
Tabla 3. Resultado del análisis de los azúcares potenciales ........................................... 58
Tabla 4. Resultado de las muestras sin tratar (“en fresco”).. .......................................... 60
Tabla 5. Concentración de azúcares totales y reductores y su relación expresado en
porcentaje, de los residuos tras el tratamiento hidrotérmico a 120ºC. ........................... 63
Tabla 6. Concentración de azúcares totales y reductores y su relación expresado en
porcentaje, de los residuos tras el tratamiento hidrotérmico a 128ºC. ........................... 65
Tabla 7. Concentración de azúcares totales y reductores y su relación expresado en
porcentaje, de los residuos tras el tratamiento hidrotérmico a 135ºC. ........................... 66
Tabla 8. Porcentaje de extracción de azúcares reductores en las muestras sometidas a los
diferentes tratamientos hidrotérmicos. ........................................................................... 69
Tabla 9. Concentración de furfural en ppm, y área determinada por análisis mediante
HPLC. ............................................................................................................................. 72
Tabla 10. Concentración de hidroximetilfurfural (HMF) en ppm, y área determinada por
análisis mediante HPLC. ................................................................................................ 73
Tabla 11. Concentración de ácido acético en ppm, y área determinada por análisis
mediante HPLC. ............................................................................................................. 75
Tabla 12. Azúcares totales, reductores y potenciales expresados en g azúcar/100 g de
residuo seco, de la muestra de pulpa de plátano utilizada como sustrato en la
fermentación, sin realizar tratamiento y después de someter a tratamiento hidrotérmico a
135ºC. También se indica la relación de azúcares reductores y totales, y el porcentaje de
extracción........................................................................................................................ 77
Tabla 13. Concentraciones azúcares totales y reductores antes de iniciar la fermentación
y del tiempo final de la misma, expresadas en g de azúcar en 100 g de residuo seco.
También se indica el porcentaje de relación de azúcares reductores y totales. .............. 79
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1. INTRODUCCIÓN
Desde el inicio de los tiempos hasta la actualidad, el ser humano ha tenido
distintas necesidades como proveerse de luz, fuego, comida, etc. Por tanto, abastecerse
de energía ha sido una de las preocupaciones más importantes. En un principio, el
hombre utilizaba los animales, los vegetales, la fuerza del viento y del agua para obtener
energía. Sin embargo, tras el desarrollo industrial, pasó a utilizar como fuente de
energía, recursos fósiles como el carbón, el petróleo y el gas natural (De Juana et al.,
2003).
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Cabe destacar que, en España, a pesar de que los combustibles fósiles presentan
una fuente importante de energía, se ha mostrado una tendencia a aumentar el consumo
de energías renovables, y disminuir el de petróleo y gas natural desde el año 2008 hasta
el 2015. La energía nuclear y la procedente del carbón permanecen más estables
(APPA, 2015). Esta tendencia se estima también para la demanda mundial de energía,
como se observa en la Fig. 2, donde se produce una disminución en la demanda mundial
de petróleo, pasando del 31% en el año 2013, al 26% estimado para el 2040. Así mismo,
se prevé un aumento del 4% en el uso de las energías renovables, donde se incluyen los
biocombustibles.
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habitual (Alarcón, 2010). Por tanto, el término biocombustible sirve para denominar al
grupo de productos energéticos y materias primas renovables que se originan a partir de
materia prima de origen orgánico. Incluyen el bioetanol, el biobutanol, el biodiesel, los
aceites vegetales, el biometanol, los aceites de pirolisis, el biogás y el biohidrógeno
(Dermirbas, 2009).
Para que la producción de un biocombustible sea viable, tiene que cumplir los
siguientes requisitos: suponer beneficios ambientales con respecto a los combustibles
fósiles y competir con ellos económicamente, tener una producción suficiente como
para satisfacer la demanda, y producir una ganancia energética en comparación con la
invertida en el proceso de producción (Orlando et Chaparro, 2009).
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con el objetivo de liberar las tierras de cultivo para alimentos y recortar las emisiones de
gases de efecto invernadero causadas por el aumento del uso de tierra para producir
biocombustibles (OCDE/FAO, 2016).
Desde el punto de vista económico, en el año 2015, los precios mundiales del
bioetanol y del biodiesel continuaron en declive como resultado de la disminución de
los precios del petróleo y de las materias primas para biocombustibles. En ese mismo
año, aumentó la demanda de estos biocombustibles en el sector del transporte debido
sobre todo a la influencia de las políticas nacionales, las cuales crearon normativas
específicas obligando al uso de mezclas de biocombustibles con gasolina en las
principales economías. También, el aumento de la demanda se debió al constante uso de
combustible en todo el mundo. Se espera que en los próximos años los precios
internacionales se recuperen y la producción mundial de bioetanol aumente todavía más
(OCDE/FAO, 2016).
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A esto, también hay que sumarle otros inconvenientes como la gran cantidad de
agua que se consume para regar los cultivos destinados a la producción de bioetanol, los
agroquímicos utilizados en los mismos y la deforestación que ha generado este tipo de
cultivo, entre otros. Todo ello ha provocado la búsqueda de una alternativa a la
utilización de estos biocombustibles que utilizan cultivos alimenticios (Salinas et Gasca,
2009).
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2. MARCO TEÓRICO
2.1. Biocombustibles
2.1.1. ¿Qué son los biocombustibles?
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2.2. Bioetanol
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➢ Monosacáridos
Son azúcares no hidrolizables puesto que son las unidades más pequeñas. Son
moléculas cristalizables, solubles en agua y directamente fermentables. Ejemplos de
monosacáridos son la glucosa y la fructosa (Fig. 4).
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➢ Disacáridos
➢ Polisacáridos
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➢ Celulosa
La celulosa es un polisacárido formado por la unión de monómeros D-glucosa
mediante enlaces β-(1,4) glucosídicos. Las cadenas lineales de celulosa se unen entre sí
mediante puentes de hidrógeno, como se observa en la Fig. 8, formando una estructura
cristalina resistente e insoluble. Como en todo polímero, uno de sus parámetros más
importantes es la fracción cristalina. En el caso de la celulosa, el valor de esta fracción,
que oscila entre 50 y 90%, es importante debido a que, mientras que la fracción amorfa
es fácilmente hidrolizable, la cristalina es mucho más resistente (Barroso, 2010). Este es
uno de los factores que hará necesaria la realización de pretratamientos para obtener
bioetanol (Haghighi et al., 2013).
➢ Hemicelulosa
La hemicelulosa está formada por cadenas cortas, principalmente de pentosas y
hexosas, como se puede ver en la Fig. 9. Además, contiene pequeñas cantidades de
ácidos orgánicos, cuya función principal es unir la celulosa y la lignina. Este polímero
no es cristalino y es hidrolizado fácilmente (Cunningham et al, 1994).
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➢ Lignina
La lignina es un polímero no carbohidrato que se entremezcla con la celulosa y
la hemicelulosa y, proporciona la rigidez a los materiales lignocelulósicos. Puede
retirarse mediante distintos pretratamientos con la finalidad de romper la matriz
lignocelulósica y así facilitar que la celulosa y la hemicelulosa puedan ser hidrolizadas.
En la Fig. 10 se encuentran algunos compuestos encargados de formar la lignina
(Tomás, 2009).
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Figura 11. Esquema general de la estructura del material lignocelulósico. Fuente: Robledo
et al., 2012.
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2.4.1. Pretratamiento
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➢ Pretratamiento mecánico
- Trituración mecánica: Consiste en una molienda que reduce la
cristalinidad de la celulosa, aumenta la superficie específica y densidad
aparente, y facilita la hidrólisis posterior. Tiene el inconveniente de su alto
consumo energético, que depende tanto del tamaño final de partícula al que
se muela el material, como del tipo de material a triturar.
➢ Pretratamientos térmicos
- Explosión por vapor: Combina altas temperaturas (180-240ºC) y
presiones junto con una brusca descompresión posterior, provocando
disgregación y ruptura de las fibras, y despolimerización y rotura de enlaces.
Se obtiene un producto fibroso cuya celulosa es más accesible a la hidrólisis
(Tomás, 2009).
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➢ Pretratamiento físico-químico
- Explosión por vapor con amoníaco (AFEX): Similar a la
explosión por vapor en el que la biomasa es impregnada con amoníaco
líquido, a una temperatura en torno a los 90ºC durante 30 minutos
aproximadamente, junto con una brusca descompresión posterior. Modifica
las características estructurales de la lignina, favoreciendo el acceso de las
enzimas celulolíticas y polimeriza las hemicelulosas.
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➢ Pretratamientos químicos
- Oxidación húmeda: La biomasa se somete a la acción de agua a
elevadas temperaturas (160-180ºC) en presencia de oxígeno. La
solubilización de hemicelulosas suele ser más alto que en otros
pretratamientos, y la celulosa presenta un alto grado de desestructuración,
aumentando el rendimiento de la hidrólisis posterior.
➢ Pretratamientos biológicos
- Se basa en la acción de microorganismos con la propiedad de
generar maquinaria enzimática capaz de hidrolizar los polímeros
constituyentes de la materia prima. Los microorganismos más efectivos son
los hongos de la podredumbre blanca, blanda y parda. El principal
inconveniente es que la tasa de hidrólisis es demasiado lenta (Pérez, 2008).
2.4.2. Hidrólisis
Segunda etapa del proceso de pretratamiento que consiste en romper los
carbohidratos complejos en azúcares simples para utilizarlos como sustrato en la
posterior fermentación. La celulosa se hidroliza en monosacáridos de D-glucosa,
mientras que la hemicelulosa lo hace en pentosas y hexosas (manosa, glucosa, xilosa,
etc.)
En la Fig. 14 se muestra un esquema del efecto que tiene la hidrólisis en los
carbohidratos.
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Figura 14. Representación esquemática del proceso de hidrólisis. Fuente: Pérez, 2008
➢ Hidrólisis ácida
➢ Hidrólisis básica
➢ Hidrólisis enzimática
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específicas de la reacción que catalizan por lo que se pueden obtener altos rendimientos
de hidrólisis y se evita la formación de productos de degradación. Las reacciones
enzimáticas tienen lugar en condiciones suaves de temperatura y pueden emplearse
enzimas como celulasas, amilasas y amiloglucosidasas. Estas enzimas se encargan de
degradar polisacáridos como la celulosa y el almidón.
Este tipo de hidrólisis, presenta ventajas con respecto las hidrólisis ácida y
básica, ya que no provoca corrosión de los materiales, los costes de equipamiento son
menores, no se necesita el empleo de agentes químicos y no se producen compuestos
inhibidores de la fermentación. Por otro lado, presenta largos tiempos de reacción, los
precios de las enzimas suelen ser elevados, y los monosacáridos y disacáridos que se
forman como producto de la hidrólisis pueden dificultar la progresión de la misma.
➢ Hidrólisis hidrotérmica
Estas ventajas hacen que este tratamiento sea uno de los más utilizados en la
industria, y por ello se ha seleccionado en este trabajo para degradar los polisacáridos de
los residuos en azúcares fermentables.
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➢ Compuestos inhibidores:
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➢ Detoxificación
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Hay diversos métodos físico-químicos, pero los de mayor difusión son los que
emplean hidróxidos de cualquier tipo para aumentar el pH hasta 10, y así formar
precipitados con sales de calcio, los cuales son retirados antes de la fermentación. Este
método es el más conocido, no sólo por sus resultados exitosos en reducción de
inhibidores y altos rendimientos en fermentación, sino igualmente por su bajo costo
frente a otras metodologías. Por otro lado, al comparar los métodos físicos y químicos
con los biológicos, estos últimos han venido tomando notoriedad, en especial en cuanto
al uso de cepas bacterianas y fúngicas, ya que la biorremedación ofrece ventajas
económicas, de proceso y ambientales (Sánchez et al., 2010).
2.4.4. Fermentación
Una vez que por hidrólisis se han obtenido las pentosas y hexosas a partir del
material lignocelulósico y se han eliminado los compuestos inhibidores, en caso de que
los hubiera, se lleva a cabo la fermentación que constituye la tercera fase en la
producción de bioetanol.
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carbono en forma de gas y unas moléculas de ATP que consumen los propios
microorganismos en su metabolismo celular.
Los principales microorganismos que llevan a cabo este tipo de fermentación son las
levaduras, Saccharomyces cerevisiae, en concreto, es la especie utilizada con mayor
frecuencia, pero no es el único microorganismo con el que se pueden obtener
biocombustibles. Este tipo de cepas se aísla de remolacha azucarera y, por lo tanto, se
considera que está bien adaptada para la fermentación de sustratos ricos en azúcar. Su
alto rendimiento se convierte en una excelente opción para la obtención de alcohol
(Artime, 2014).
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Este concepto, hace referencia a las pérdidas de alimentos que ocurren al final de
la cadena alimentaria (venta minorista y consumo final), más relacionado con el
comportamiento de los vendedores minoristas y los consumidores.
Una de las causas por las que existe el hambre en el mundo, es por el desperdicio
de alimentos, ya que representa una oportunidad perdida en la lucha por mejorar la
seguridad alimentaria global.
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Figura 17. Pérdida y desperdicio de alimentos per cápita (Kg/años, en las fases de
consumo (en rojo) y pre-consumo (naranja), según diferentes áreas geográficas. Fuente:
FAO, 2012.a.
Los residuos de frutas y hortalizas son muy abundantes. Como se puede ver en la Fig.
18, en casi todas las zonas geográficas sobrepasan el 50% de la cantidad producida, es
decir, se tiran una de cada dos piezas de fruta u hortaliza generada. Sólo se salen de la
media la zona industrializada de Asia, con el valor más bajo, y Europa. Para los
cereales, las pérdidas son del 30%, un 20% para cultivos oleaginosos y legumbres,
carne y productos lácteos, y un 35% para el pescado (FAO, 2012.b.).
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Figura 18. Distribución de las pérdidas de fruta y hortalizas en las diferentes etapas de la
cadena alimentaria de diferentes áreas geográficas. Fuente: FAO (2012.b)
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Una de las acciones que se realizan para abordar este problema es la recogida
selectiva de biorresiduos. Este término hace referencia a residuos vegetales de las zonas
verdes y jardines, residuos alimenticios y de cocina, así como residuos procedentes del
procesado de alimentos.
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3. MATERIALES Y MÉTODOS
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A B
Figura 21. Muestras de pulpa de plátano trituradas junto con agua destilada, antes (A) y
después (B) del tratamiento hidrotérmico.
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A B
Figura 22. Muestras de pulpa de plátano trituradas junto con agua destilada, antes (A), y
después (B) del tratamiento a 135ºC.Muestra que, debidamente preparada, servirá como
medio de cultivo de la fermentación.
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El volumen final retirado del biorreactor durante el proceso fue en todos los casos,
inferior o igual al 20% del volumen inicial.
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botella Pyrex de 250 mL y se añadió agua destilada hasta alcanzar 89.11 g. La solución
diluida se autoclavó a 121ºC y 1 atm durante 1 hora. La muestra se enfrió a temperatura
ambiente y se filtró con papel de filtro de 20µm, mediante una bomba de vacío para
eliminar las partículas restantes. El pH se ajustó entre 6 y 7 con NaOH 6M, NaOH 1M y
HCl 1M. Las muestras se congelaron hasta el momento de ser analizadas. Todos los
azúcares extraídos con este método se analizaron como azúcares reductores, ya que se
considera una conversión total de los carbohidratos complejos a carbohidratos simples.
En este caso, las muestras también cambian de aspecto después del tratamiento,
como se observa en la Fig. 23.
A B
Figura 23. Muestras de cáscara de plátano para medir azúcares potenciales, antes de
meter al autoclave (A), y después del tratamiento (B).
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120
Concentración de glucosa (ppm)
100
80
60
40
y = 80,32x - 2,31
20
R² = 0,999
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
Absorbancia (λ=492)
Figura 24. Curva de calibración para determinar los azúcares totales, realizada con
patrones de glucosa desde 20 hasta 100 ppm y medida en espectofotómetro a 492 nm.
48
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
Figura 25. Patrones de glucosa para realizar la curva de calibrado de los azúcares totales.
De izquierda a derecha, las muestras corresponden al blanco, patrón de 20 ppm, de 40, de
60, 80 y 100 ppm.
49
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
1200
1000
Concentración glucosa (ppm)
800
600
400
y = 2016,2x + 46,14
200 R² = 0,9999
0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Absorbancia (λ=540)
Figura 26. Curva de calibración para determinar los azúcares reductores, realizada con
patrones de glucosa desde 200 hasta 1000 ppm y medida en espectofotómetro a 520 nm.
Figura 27. Patrones de glucosa para realizar la curva de calibrado de los azúcares
reductores. De izquierda a derecha, las muestras corresponden al blanco, patrón de 200
ppm, de 400, de 600, 800 y 1000 ppm.
50
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
Siendo:
51
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
Figura 28, puede verse la diferencia de las muestras con humedad, y sin ella, después de
haber estado 48 horas en la estufa.
A B
Figura 28. Muestras por triplicado de los diferentes residuos (cáscara de plátano, pulpa de
plátano y cáscara de naranja, de arriba abajo) resultado de la fase de deshidratación en la
estufa a 60ºC durante 48 horas, antes (A), y después de meter en la estufa (B).
52
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
Cabe aclarar que los límites de detección del equipo para el furfural y el HMF
fueron de 1 ppm, y para el ácido acético de 5 ppm.
53
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
Antes de ser analizadas, las muestras se diluyeron con agua Milli-Q en función
del tiempo de fermentación, siendo mayor la dilución de la muestra correspondiente a la
última toma. En cada una de las muestras se añadió una cantidad conocida de patrón
interno. Finalmente se filtraron por un tamaño de poro 0.45 µm y se introdujeron en los
viales para su análisis.
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Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
2500
Concentración etanol (ppm)
2000
1500
1000
500 y = 0,0025x
R² = 0,9909
0
0 200000 400000 600000 800000 1000000
Área
Figura 31. Curva de calibración del etanol, realizada con patrones de etanol desde 10 ppm
hasta 2000 ppm.
55
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
4. RESULTADOS Y DISCUCIÓN
4.1. Caracterización de los substratos
4.1.1. Contenido de humedad
Los substratos que se emplearon como material de partida para el desarrollo de los
experimentos fueron residuos de plátano y naranja, en base a las características descritas
en el apartado 3.2.
Humedad
Media de Humedad
Humedad de cada
Residuo triplicados media total
triplicado (%)
(%) (%)
86,71 86,49 87,08 86,76 ± 0,23
Cáscara plátano 86,65 86,88 86,63 86,72 ± 0,14 87,50 ± 1,32
88,66 89,29 89,13 89,03 ± 0,33
68,75 69,85 69,77 69,46 ± 0,61
Pulpa plátano 63,12 65,56 66,98 65,22 ± 1,95 68,98 ± 3,54
72,4 72,07 72,28 72,25 ± 0,17
74,8 74,44 75,34 74,86 ± 0,46
Cáscara naranja 74,62 74,5 74,74 74,62 ± 0,12 75,16 ± 0,74
76,29 75,82 75,90 76,01 ± 0,25
56
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
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Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
Tabla 3. Resultado del análisis de los azúcares potenciales expresados en g de azúcar en 100 gramos de residuo
seco.
50
45
40
g azúcar/100 g residuo seco
35
30
25
20
15
10
5
0
Cáscara Pulpa plátano Cáscara
plátano naranja
Figura 32. Azúcares potenciales en cada uno de los substratos, expresados en gramos de
azúcar por cada 100 gramos de residuo seco.
58
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
Una vez que se tiene el dato del total de carbohidratos de las muestras, se analizó la
cantidad de azúcares, tanto totales como reductores, que se podrían extraer de los
substratos sin someter a tratamiento de hidrólisis (“en fresco”) empleando únicamente
agua como agente de extracción.
Hay que diferenciar entre los azúcares y los carbohidratos. Normalmente, el término
azúcares se refiere únicamente a monosacáridos y disacáridos, y son solubles en agua.
Los carbohidratos son moléculas más complejas, compuestas por más de dos moléculas
de azúcar. En cuanto a la diferencia entre azúcares totales y reductores, estos últimos
permiten estimar la cantidad de azúcares sencillos directamente fermentables (glucosa y
fructosa), mientras que los azúcares totales incluyen tanto a los reductores como a otros
compuestos que no son directamente fermentables por la mayor parte de los
microorganismos, como la sacarosa. Dentro de los carbohidratos totales se encuentran
compuestos que necesitan un pretratamiento de hidrólisis para convertirse en azúcares
fermentables.
59
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
Tabla 4. Resultado de las muestras sin tratar (“en fresco”). Se indican los gramos de
azúcar obtenido por cada 100 gramos de residuo seco.
60
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
En la Fig. 33, se puede ver gráficamente la relación entre los azúcares totales,
reductores y los potenciales en los tres substratos. La extracción de azúcares, tanto
totales como reductores en fresco, es mayor en la pulpa de plátano. Cabe esperar que el
valor de azúcares potenciales sea mayor que el de azúcares totales, y por tanto, que el de
reductores. Esto es así en la cáscara de plátano y en la cáscara de naranja, pero en la
pulpa de plátano, el valor de azúcares potenciales obtenido es menor que el de azúcares
totales. Esto puede deberse a que durante el tratamiento para extraer los azúcares
potenciales, explicado en el apartado 3.6.,ciertos compuestos de la pulpa, en vez de
extraerse como azúcares, se transformen en inhibidores, como veremos más adelante, u
otros compuestos que no hayan sido analizados.
61
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
50
45
40
g azúcar/100 g residuo seco 35
30
25
20
15
10
0
Cáscara plátano Pulpa plátano Cáscara naranja
Figura 33. Azúcares potenciales, totales y reductores obtenidos a partir de los residuos sin
tratar. Se expresan como gramos de azúcar extraídos por cada 100 gramos de residuo
seco.
➢ Temperatura 120ºC
62
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
A la vista de la Tabla 5 y la Fig. 34, se puede observar que tanto los azúcares
totales como reductores de la pulpa de plátano, son los que se extraen en mayor cantidad
tras el tratamiento a 120ºC durante 5 minutos.
63
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
60
40
30
20
10
0
Fresco Trat. Fresco Trat. Fresco Trat.
120ºC 120ºC 120ºC
Cáscara plátano Pulpa plátano Cáscara naranja
Figura 34. Azúcares totales, reductores y potenciales a partir de residuos tratados por
hidrólisis térmica a 120ºC y a partir de residuos sin tratar. En ambos casos se expresan
como gramos de azúcar extraídos por cada 100 gramos de residuo seco.
➢ Temperatura 128ºC
Este tratamiento se realizó del mismo método que el anterior, pero modificando
la temperatura de tratamiento a 128ºC.
64
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
Relación
Az totales (g/100 g Az reductores (g/100 g reductores
Residuo residuo seco) residuo seco) /totales (%)
Cáscara plátano 23,00 ± 0,62 9,03 ± 0,34 39,28
Pulpa plátano 57,50 ± 5,67 30,91 ± 2,11 53,76
Cáscara naranja 34,08 ± 0,71 17,33 ± 1,55 50,84
65
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
70
50
40
30
20
10
0
Fresco Trat. Fresco Trat. Fresco Trat.
128ºC 128ºC 128ºC
Cáscara plátano Pulpa plátano Cáscara naranja
Figura 35. Azúcares totales, reductores y potenciales a partir de residuos tratados por
hidrólisis térmica a 128ºC y a partir de residuos sin tratar. En ambos casos se expresan
como gamos de azúcar extraídos por cada 100 gamos de residuo seco.
➢ Temperatura 135ºC
Relación
Az totales (g/100 g Az reductores (g/100 reductores/totales
Residuo residuo seco) g residuo seco) (%)
Cáscara plátano 15,23 4,33 28,43
Pulpa plátano 65,02 36,79 56,59
Cáscara naranja 36,04 16,39 45,47
66
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
70
g azúcar/100 g residuo seco
60
50
40
30
20
10
0
Fresco Trat. Fresco Trat. Fresco Trat.
135ºC 135ºC 135ºC
Cáscara plátano Pulpa plátano Cáscara naranja
Figura 36. Azúcares totales, reductores y potenciales a partir de residuos tratados por
hidrólisis térmica a 135ºC y a partir de residuos sin tratar. En ambos casos se expresan
como gramos de azúcar extraídos por cada 100 gramos de residuo seco.
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Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
Cabe destacar que, entre todos los tratamientos realizados en este trabajo, el
tratamiento a 120ºC para la cáscara de plátano, es el que consiguió una mayor
extracción respecto a la muestra no tratada. No le ocurre lo mismo en los otros
tratamientos, ya que a 128ºC no se consigue aumentar la extracción de azúcares
reductores y a 135ºC, la concentración de estos es menor que en las muestras sin tratar.
También hay que destacar que en el tratamiento a 120ºC y 128ºC, se extrajo el total de
los azúcares respecto a los potenciales reductores determinados.
68
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
Extracción
Extracción en Trat. 120ºC Extracción Extracción
Residuo fresco (%) (%) Trat. 128ºC (%) Trat. 135ºC (%)
Cáscara plátano 49,1 70,3 44,6 21,8
Pulpa plátano 75,0 76,5 75,6 90,0
Cáscara naranja 41,0 39,9 38,3 36,7
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Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
100
90
80
70
60
50
%
40
30
20
10
0
FRESCO TRAT. 120ºC TRAT. 128ºC TRAT. 135ºC
70
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
HMF
Furfural
4.4.1. Furfural
71
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
la producción de etanol del 97% (Banerjee et al., 1981). En artículos más recientes se
estima la concentración mínima inhibitoria en 4 g/l (Taherzadeh et al., 2000).
También se han publicado estudios que demuestran que el furfural puede ser
convertido por organismos fermentativos a un compuesto menos inhibitorio (ácido
furfurílico y ácido furoico (Andersen et al, 2012), activando la fermentación y
conduciéndola a altos rendimientos de etanol (Fernández et al., 2009).
Área Concentración
Temperatura Residuo (mAUs) furfural
(ppm)
Cáscara de plátano - <1
120ºC Pulpa de plátano - <1
Cáscara de naranja - <1
Cáscara de plátano 15 <1
128ºC Pulpa de plátano 63 <1
Cáscara de naranja - <1
Cáscara de plátano 197 3,05
135ºC Pulpa de plátano 266 4,12
Cáscara de naranja 329 5,10
Tratamiento Pulpa de plátano 498 7,72
potenciales
72
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
Área Concentración
Temperatura Residuo
(mAUs) HMF(ppm)
Cáscara de plátano - <1
120ºC Pulpa de plátano 204 1,08
Cáscara de naranja 79 <1
Cáscara de plátano 130 <1
128ºC Pulpa de plátano 1011 5,51
Cáscara de naranja 474 2,56
Cáscara de plátano 237 1,26
135ºC Pulpa de plátano 3365 18,46
Cáscara de naranja 1643 8,99
T. potenciales Pulpa de plátano 1103 6,02
73
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
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Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
Tabla 11. Concentración de ácido acético en ppm, y área determinada por análisis
mediante HPLC.
75
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
180
160
140
Concentración (ppm)
120
100
80
60
40
20
0
CP-120 PP-120 CN-120 CP-128 PP-128 CN-128 CP-135 PP-135 CN-135 PP-POT
76
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Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
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Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
60
50
g azúcar/100 g residuo seco
40
30
20
10
0
Fresco Trat. 135ºC
4.5.2. Azúcares
79
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Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
80000
70000
80
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
4.5.3. Etanol
A partir de esta fórmula, se deduce que por cada mol de glucosa consumido se
producen dos moles de etanol. Sin embargo, este rendimiento es solamente teórico, ya
que no toda la glucosa consumida es convertida en etanol, sino que un porcentaje será
utilizado para la síntesis de las estructuras celulares y mantenimiento de la célula. Bajo
condiciones ideales se ha estimado una eficacia del proceso de fermentación alcohólica
por S. cerevisiae del 85% (Vázquez et al., 2007).
81
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
Etanol 4-metil-2-pentanol
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Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
18000
16000
8000
6000
4000
2000
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (horas)
Por cada mol de glucosa se producen dos moles de etanol, con lo que la
producción teórica de etanol sería de 0,5 gramos de etanol producido por gramo de
glucosa consumido. Teniendo en cuenta el azúcar consumido, que como se mencionó
anteriormente se calcula con los datos de los azúcares totales, y la densidad de etanol se
puede calcular la concentración teórica en 2,4% (v/v) de etanol. Teniendo en cuenta el
valor real y el teórico, la fermentación tiene un rendimiento del 70,3% respecto al
azúcar consumido, porcentaje algo menor que el referenciado (85%).
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Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
0 10 20 30 40 50 60 70 80
18000 80000
16000
14000 60000
12000
50000
10000
40000
8000
30000
6000
4000 20000
2000 10000
0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (horas)
4.5.4. pH
84
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Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
5,2
4,8
4,6
pH
4,4
4,2
3,8
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (horas)
4.5.5. Microbiología
85
Celia Hernández Galindo
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Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
5. CONCLUSIONES
87
Celia Hernández Galindo
Obtención de bioetanol a partir de hidrolizados de residuos de fruta
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Celia Hernández Galindo