Guía 6.

Extracción y verificación de la actividad de las enzimas: succínico

deshidrogenasa y citocromo oxidasa y estudio del efecto de algunos
inhibidores

I. EL PROBLEMA

Realizar experimentalmente la extracción de enzimas a partir de un tejido animal.

Verificar in vitro la actividad de las enzimas que se extrajeron mediante el uso de

aceptores electrónicos coloreados.

Reconocer el efecto de los inhibidores en la actividad de las enzimas y sobre la

fosforilación oxidativa y el ciclo de Krebs.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

La mitocondria es el organelo citoplasmático en donde se lleva a cabo la

respiración celular representada en vías metabólicas como el ciclo de Krebs y la
fosforilación oxidativa. Posee dos membranas: la externa altamente permeable
por proteínas de membrana llamadas porinas y la interna con pliegues o crestas y
de permeabilidad altamente selectiva (ver figura 1).

Figura 1. La mitocondria
El ciclo de Krebs

Es una ruta aerobia cuyos complejos multienzimáticos se localizan en la matriz

mitocondrial con excepción de la succínico deshidrogenasa proteína integral de la
membrana interna.

Este proceso metabólico permite la descarboxilación de los esqueletos

carbonados que le llegan en forma de Acetil CoA, provenientes de diferentes
compuestos (carbohidratos, ácidos grasos, aminoácidos). Esta vía metabólica
oxidativa está asociada a la reducción de las coenzimas FAD y NAD +, que
finalmente ingresan a la cadena de transporte electrónico para su reoxidación (ver
figura 2).

Figura 2. Ciclo de Krebs

Figura 2. Ciclo de Krebs

Acción de la succínico deshidrogenasa.

La succínico deshidrogenasa, succinato deshidrogenasa o complejo II es una

enzima que remueve dos protones y dos electrones del succinato para dar origen
al fumarato, oxidación asociada a la coenzima FAD +, que transfiere los electrones
a la cadena de transporte electrónico. Este proceso lo inhibe en forma competitiva
la presencia de otros ácidos dicarboxílicos como el malonato, oxalacetato y y
oxalato, los cuales se unen fuertemente al sitio activo de la enzima, situación que
genera la acumulación de succinato.

El proceso se puede observar in vitro mediante el uso de un aceptor electrónico

artificial como el azul de metileno que tiene color en su estado oxidado e incoloro
cuando se reduce, en la medida que se reoxida la coenzima FAD. Cuando éste
indicador de oxido – reducción se encuentra en contacto con el O 2 del aire se
reoxida tomando de nuevo la coloración azul y formando peróxido de hidrógeno.
Cuando el azul de metileno se encuentra en contacto con el oxígeno del aire, se
reoxida tomando la coloración azul y formando peróxido de hidrógeno, por esta
razón el sistema se aísla mediante una capa de aceite mineral.

La cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa

La cadena de transporte de electrones o cadena respiratoria como parte de la

fosforilación oxidativa es un proceso que se lleva a cabo en la membrana interna
mitocondrial y está constituido por una serie de complejos enzima-coenzima de
oxidorreductasas y ferroproteínas. (ver figura 3)

A través de la cadena de transporte de electrones se realiza la reoxidación de las

coenzimas NADH+ H+ y FADH2 producidas en las rutas catabólicas, ya que permite
el transporte de los electrones hasta el O 2, que es el aceptor final reduciéndose
para formar agua.

Este flujo de electrones es exergónico por esto tres complejos enzimáticos de la

cadena respiratoria utilizan la energía liberada para bombear protones al espacio
intermembrana de las mitocondrias, generando un potencial electroquímico que
pormueve después el regreso de los protones a la matriz mitocondrial y la síntesís
de ATP a través del complejo V o la ATP sintasa.

Acción de la citocromo oxidasa.

El complejo citocromo oxidasa o complejo IV es el componente final de la cadena

respiratoria y está constituido por el citocromo a y a 3 y dos iones Cu ++.
Aproximadamente el 90% del consumo celular del oxígeno se debe a la acción de
este complejo que cataliza la reducción del oxígeno para formar agua.

Esta enzima es sensible a la presencia de aceptores más fuertes como es el caso

de ión cianuro (CN-), azida (N3-), monóxido de carbono (CO) y otros inhibidores
que bloquean irreversiblemente este complejo enzimático. Con ello se ve
interrumpido el transporte electrónico y se deja de utilizar el O 2 generando una
condición de cianosis celular.

La actividad del complejo citocromo C oxidasa se puede demostrar mediante la

oxidación de aceptores electrónicos artificiales como la p-fenilendiamina (pFDH 2)
en presencia del sistema de citocromos de los complejos de la cadena
respiratoria. Esta sustancia es muy reactiva así que se condensa y polimeriza
fácilmente originando mezclas de pigmentos oscuros.
 Figura 3. Cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa

La siguiente ecuación química representa la acción de esta sustancia indicadora

de las reacciones de oxido – reducción en los sistemas in vitro.

III. REACTIVOS.

Buffer de fosfatos 0,1M pH = 7,4 Succinato de sodio, 1% en buffer

p – fenilendiamina, 1% en agua *Cianuro de potasio, 0,05M en agua
Azul de metileno 0,01% en agua *Azida de sodio, 0,5% en agua
Oxalato de sodio, 1,5% en buffer Malonato de sodio, 1% en buffer
Arena lavada Agua destilada
Aceite mineral Hielo

IV. MATERIALES.

12 Tubos de ensayo - gradilla Balanza

3 Pipetas (1, 2 y 5 mL) Baño termostatado
1 Vaso de precipitados (250 mL) Centrífuga
2 Tubos de centrífuga Trípode – mechero
 1 Erlenmeyer Placa de calentamiento
1 Mortero – pistilo Bisturí – cuchilla
1 Termómetro Pipeta Pasteur.
1 Espátula

MATERIAL DE PRUEBA.

Tejido muscular, hepático, cardíaco de vaca, conejo o ave, bien fresco (traído del
matadero ese mismo día).

V. PROCEDIMIENTO.

Extracción y preparación de las enzimas y coenzimas.

Procedimiento para el monitor: pesar una muestra de aproximadamente 6 g de

tejido libre de sangre y colocarla en un mortero con arena lavada, enfriada
previamente en un baño de hielo. Proceder a macerar cuidadosamente hasta
formar una pasta suave adicionando poco a poco tres porciones (cada una de 5
mL) de buffer fosfato pH 7,4, hasta completar un volumen de aproximadamente 18
mL. Transferir la mezcla a un erlenmeyer de 150 mL y mantenerlo en un baño con
hielo durante 15 minutos, mezclando ocasionalmente. Pasar la muestra a tubos
de centrífuga y centrifugar a 1500 rpm por 7 minutos. Transferir el sobrenadante a
otro erlenmeyer de 150 mL y marcarlo como extracto enzimático; mantenerlo en
baño de hielo hasta su uso posterior

Seguimiento de la reacción catalizada por la citocromo oxidasa.

Preparar una serie de tubos debidamente marcados según las indicaciones de la

Tabla 1, hasta adicionar el agua. Dejar los tubos incubando a 37ºC durante 10
minutos y sin retirarlos del baño agregar el extracto enzimático y la p-
fenilendiamina, agitar bien, este momento corresponde al tiempo cero, observar y
registrar el tiempo en que aparece el complejo coloreado, el color final y la
intensidad del color.

Tabla 1. Seguimiento de la reacción catalizada por la citocromo oxidasa

Tubos

Blanco 1 2 3 4
Reactivos (mL)

Buffer fosfatos pH 7,4 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Malonato de sodio 0,0 0,0 0,0 1,0 0,0

Cianuro de potasio 0,0 0,0 1,0 0,0 0,0

Azida de sodio 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0

 Agua destilada 2,0 1,0 0,0 0,0 0,0

Extracto enzimático 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

p-fenililendiamina 0,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Seguimiento de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa

Prepare una serie de tubos debidamente marcados según las indicaciones de la

tabla 2. Antes de agregar el extracto enzimático, deje los tubos incubando a 37ºC
durante 10 minutos, y sin retirarlos del baño agregue el extracto enzimático,
inmediatamente agite bien y coloque el aceite mineral. Tome como tiempo cero el
momento en que colocó el extracto enzimático y anote el tiempo en que cambia el
color, color e intensidad de color final.

Tabla 2. Seguimiento de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa

Tubos
Blanco 1 2 3 4 5
Reactivos
mL
Buffer fosfato pH 7.4 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 1,0
Succinato de sodio 1% 0,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Azul de metileno 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0,5
Malonato de sodio 1%. 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 0,0
Oxalato de sodio 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0
Extracto enzimático 1,0 0,5 1,0 1,5 1,0 1,0
Aceite mineral 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1,0

VI. BIBLIOGRAFÍA.

- Mathews C., Van Holde K., Ahern K G. (2002). Bioquímica. 3 ed. Madrid: Addison
Wesley.

- Plummer, D. (1981). Bioquímica práctica. México: Mc Graw Hill Latinoamericana.

- Nelson, David. L. y Cox, Michael. Lehninger. Principles of Biochemistry. 3 ed.

New York: Worth Publischer, 1993.

PREINFORME E INFORME
Extracción y verificación de la actividad de las enzimas: succínico deshidrogenasa
y citocromo oxidasa y estudio del efecto de algunos inhibidores

Nombre: Paola Andrea Castañeda Fecha: 2018/05/03 Grupo: 1.3

CUESTIONARIO PARA EL PREINFORME.

En una hoja responda las siguientes preguntas

1- La ecuación de las reacciones que catalizan las enzimas a utilizar en la

práctica.

 Reacción citocromo oxidasa

 Reacción Succinato deshidrogenasa

2-Para los órganos a utilizar mencione brevemente si su metabolismo es más

fermentativo (anaerobio) o aerobio, tenga en cuenta el color característico de los
citocromos que hacen parte de la fosforilación oxidativa.
 El tejido muscular realiza metabolismo anaerobio de las reservas de energía
(glucógeno) ruta metabólica que no necesita oxígeno en situaciones de actividad
física en un lapso de tiempo corto produciendo ácido láctico, mientras que en
actividades de larga duración la producción de ATP es regulada por la
metabolización aerobia de los hidratos de carbono y lípidos. Los dos tipos de
metabolismo se llevan a cabo simultáneamente, lo que determina si es anaerobio
o aerobio es la cantidad de oxígeno para realizar la actividad. (William E.
Prentice, 2001)

Tejido hepático realiza el metabolismo aerobio por la actividad y cantidad de

lactato deshidrogenasa en este se lleva a cabo la oxidación del piruvato, la
fosforilacion oxidativa que requiere de oxígeno para producirse, al igual se lleva a
cobo la gluconeogénesis, lipogénesis y la fosforilación oxidativa

Tejido cardiaco realiza fosforilación oxidativa que requiere de oxígeno, la mitad

de las células son mitocondrias es aerobio, y su combustible preferido son los
ácidos grasos, con los cuales realiza la β oxidación, y otros combustibles como la
glucosa y el lactato.

3- tabla con los valores de potencial redox para todos los componentes de la
cadena respiratoria, así como del azul de metileno y la p-fenilendiamina,
compuesto que se usarán para evidenciar la actividad de las enzimas
citocromo oxidasa y succínico deshidrogenasa.

Tomado de (Universidad Autonoma de Mexico)

(National Center For Biotechnology Information.1975)
4- De acuerdo con el fundamento teórico de la guía y la bibliografía describa
brevemente los cambios de color en el azul de metileno y la p-fenilendiamina
cuando:

a- La citocromo oxidasa y la succínico deshidrogenasa se encuentran sin

inhibidores.

La citocromo oxidasa oxida al citocromo c el cual a su vez oxida a la p-

fenilendiamina como el azul de metileno se reduce da una coloración azul.

El succinato deshidrogenasa enzima oxidoreductasa esté presente en el

metabolismo más exactamente en el ciclo de Krebs, la conversión de
succinato a fumarato el FAD se reduce, y el azul de metileno se reduce, por
ser un agente oxido reductor, al estar oxidado pasa a estar reducido con una
coloración azul oscura.

b- La citocromo oxidasa y la succínico deshidrogenasa se encuentran con los

inhibidores (cianuro, azida, malonato u oxalato).

Cuando el citocromo oxidasa se encuentra con los inhibidores cianuro, azida,

este se acopla a la forma oxidada del hierro por lo tanto no se oxida el
citocromo c y por ende el citocromo c no oxida la p-fenilendiamina y quedara
con una coloración transparente.

1. Seguimiento de la reacción catalizada por la citocromo oxidasa

Para este análisis se espera que al adicionar buffer de fosfatos amortigüe los
diferentes cambios de pH, al adicionar extracto enzimático al cianuro este
reaccionara con el grupo hemo a3 del complejo enzimático, inhibiendo la cadena
respiratoria, al igual que la azida, a diferencia del malonato que es un inhibidor
competitivo de la succínico deshidrogenasa, por lo cual no afecta, ya que se
producen enzimas reducidas como el NAD, hasta la conversión de ATP, el p-
fenilendiamina dará una coloración oscura en el tubo 4. En muestras con tejidos
aerobios su coloración será mas oscura.

2. Seguimiento de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa

 Con base en la consulta realizada en el preinforme escriba los resultados
esperados

Para este procedimiento se espera que al adicionar buffer de fosfatos amortigüe

los diferentes cambios de pH, al agregar el aceite vegetal este impedirá que el
azul de metileno identifique las reacciones en la ruta y con el extracto enzimático
al malonato y oxalato de sodio se inhibirán la enzima succínico deshidrogenasa
impidiendo que se reduzca la coenzima FAD, y así el azul de metileno dará una
coloración transparente correspondiente a su forma oxidada, a diferencia del tubo
1,2,3 donde la coloración debe ser azul, ya que se llevara a cabo todo el ciclo.

Diagrama de flujo

Fichas técnicas. Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio.

Aspect Peligrosidad Primeros auxilios y medidas Forma de

Nombre Fórmula
o * de higiene eliminación
Na2HPO4 y Líquid N.A  Tras inhalación: tomar
Buffer de aire fresco. Llamar a
K2HPO4 o Básicos
fosfatos emergencia.
  En caso de contacto con
la piel: quitar las prendas
contaminadas, lavar la
piel con agua (En
ducha). Llamar a un
médico.
 Tras contacto con los
ojos: lavar con
abundante agua (15
min). Llamar al
oftalmólogo.
 Tras ingestión: beber
agua máximo dos vasos.
Llamar a un médico.
(Plus & Kgaa, 2003).
Succinato de C₄H₄Na₂O₄ Sólido N.A  Tras inhalación: tomar Básicos
sodio aire fresco.
 En caso de contacto con
la piel: quitar las prendas
contaminadas, lavar la
piel con agua (En
ducha).
 Tras contacto con los
ojos: lavar con
abundante agua (15
min).
 Tras ingestión: beber
agua máximo dos vasos.
Llamar a un médico.
(Plus & Kgaa, 2003).
C₆H₈N₂ Sólido  Tras inhalación: tomar Básicos
1.4 aire fresco. tras parada
fenilendiamina respiratoria: proceder
respiración instrumental
Llamar a emergencia.
 En caso de contacto con
la piel: quitar las prendas
contaminadas, lavar la
piel con agua (En
ducha). Llamar a un
médico.
 Tras contacto con los
ojos: lavar con
abundante agua (15
min). Llamar al
oftalmólogo.
 
 Tras ingestión: beber
agua máximo dos vasos.
Llamar a un médico.
(Plus & Kgaa, 2003).
Cianuro de KCN Sólido  Tras inhalación: tomar Básicos.
potasio aire fresco. tras parada
respiratoria: proceder
respiración instrumental
Llamar a emergencia.
 En caso de contacto con
la piel: quitar las prendas
contaminadas, lavar la
piel con agua (En
ducha). Llamar a un
médico.
 Tras contacto con los
ojos: lavar con
abundante agua (15
min). Llamar al
oftalmólogo.
 Tras ingestión: beber
agua máximo dos vasos.
Llamar a un médico.
(Plus & Kgaa, 2003).

Azul de C₁₆H₁₈ClN₃S x Sólido  Tras inhalación: tomar Metales

metileno H₂O aire fresco. pesados
 En caso de contacto con
la piel: quitar las prendas
contaminadas, lavar la
piel con agua (En
ducha).
 Tras contacto con los
ojos: lavar con
abundante agua (15
min).
Tras ingestión: beber agua
máximo dos vasos. Llamar
a un médico. (Plus & Kgaa,
2003).

Azida de NaN3 Sólido  Tras inhalación: tomar Básicos

sodio aire fresco.
 En caso de contacto con
la piel: quitar las prendas
 contaminadas, lavar la
piel con agua (En
ducha).
 Tras contacto con los
ojos: lavar con
abundante agua (15
min).
Tras ingestión: beber agua
máximo dos vasos. Llamar
a un médico. (Plus & Kgaa,
2003).

Oxalato de C₂Na₂O₄ Sólido  Tras inhalación: tomar Básicos

sodio aire fresco.
 En caso de contacto con
la piel: quitar las prendas
contaminadas, lavar la
piel con agua (En
ducha).
 Tras contacto con los
ojos: lavar con
abundante agua (15
min).
Tras ingestión: beber agua
máximo dos vasos. Llamar
a un médico. (Plus & Kgaa,
2003).
Malonato de Na2(C3H2O4) Sólido N.A  Tras inhalación: tomar Básicos
sodio aire fresco.
 En caso de contacto con
la piel: quitar las prendas
contaminadas, lavar la
piel con agua (En
ducha).
 Tras contacto con los
ojos: lavar con
abundante agua (15
min).
Tras ingestión: beber agua
máximo dos vasos. Llamar
a un médico. (Plus & Kgaa,
2003).
*
Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable (F),
extremadamente inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn), irritante (Xi) y/o
peligroso para el medio ambiente (N). Pictogramas SGA

Bibliografía

 Universidad Nacional Autónoma de México. Cadena respiratoria terminal.

Obtenido de universidad nacional autónoma de mexico:
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/termodinamica_biologica/cadenarespi
ratoriaterminal.pdf
 National Center For Biotechnology Information.(1975). Tetrametil p-
fenilendiamina
 Oxidasa. Obtenido de ncbi:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC376574/pdf/applmicro00124-
0079.pdf
 Plus, D. H. A., & Kgaa, M. (2003). Ficha de Datos de Seguridad, (1907), 1–
5.
 Safety, M., & Sheet, D. (2012). Barfoed Reagent, 1–4.
 Santa Cruz Biotechnology, I. (2014). Ficha De Datos De Seguridad. Santa
Cruz Biotechnology, 1(1907), 1–7. https://doi.org/www.scbt.com