MANUAL DE BIOL MOL Enero 2019
MANUAL DE BIOL MOL Enero 2019
MANUAL DE BIOL MOL Enero 2019
MANUAL DE PRÁCTICAS
DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y
CELULAR
DOCENTE:
__________________________________________
ENERO-JUNIO 2019
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 1/73
01
21 06 2017 21 08 2017
ÍNDICE
No Título Página
1 Directorio 2
2 Introducción 3
9 Índice de prácticas 11
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 2/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Directorio
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 3/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Introducción
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 4/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Habilidades.
Reconocerá la organización del genoma y función desde un punto de vista molecular y
celular.
Identificará la estructura y fisiología del núcleo y del DNA como portador de la información
genética y su empaquetamiento.
Entenderá el flujo, regulación y expresión de la información genética en los seres vivos.
Conocerá y describirá los principales métodos de estudio de la célula.
Transmitirá información a otros profesionales y a un público no especializado.
Asimilará el mapa metabólico global del humano ante salud y la enfermedad.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 5/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Actitudes.
El alumno:
Trabajará en equipo para la elaboración de tareas y prácticas de laboratorio, dominará
el lenguaje y tendrá capacidad de comunicación para orientar y emitir criterios en el
equipo de trabajo que le serán útiles para su desempeño profesional en la práctica
clínica.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 6/73
01
21 06 2017 21 08 2017
11. Para pipetear los líquidos utilice siempre una bombilla pipeteadora, está estrictamente
prohibido succionar directamente con la boca.
12. Cuando caliente tubos de ensayo hágalo siempre en la parte superior del líquido y con
agitación suave, nunca por el fondo del tubo, y debe estar inclinado y no apuntar hacia
ninguna persona.
13. No deben transportarse innecesariamente los reactivos de un sitio a otro del
laboratorio. Sí tuviese que hacerlo extreme precauciones.
14. El área de trabajo tiene que mantenerse siempre limpia y ordenada, sin libros, abrigos,
bolsas o sustancias químicas vertidas.
15. La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr, jugar, empujar,
gritar, etc.
16. No se puede hacer ningún experimento o procedimiento de laboratorio no autorizado.
17. No utilice un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento.
18. No utilice material de cristal en mal estado ya que aumenta el riesgo de accidentes.
19. El material y los aparatos utilizados tienen que dejarse siempre limpios y en perfecto
estado de uso.
20. Todas las sustancias químicas tienen que ser manejadas con mucho cuidado de
acuerdo con las Hojas de Seguridad de cada una de las sustancias, por eso es
importante que se familiarice con las etiquetas de seguridad que vienen en cada uno
de ellos.
21. En caso de trabajar con reactivos químicos, no inhale los vapores de productos
químicos y trabaje siempre en vitrinas extractoras, especialmente cuando manipule
productos tóxicos, irritantes, corrosivos o lacrimógenos.
1. Dar la alarma.
2. Ponerse a salvo.
3. Ayudar a las personas si está capacitado para ello y el peligro no representa un riesgo
para su seguridad.
4. Avisar al responsable del laboratorio.
5. Evacuación del aula en caso necesario.
6. En caso de fuego evacuar el laboratorio, por pequeño que este sea.
7. Avisar a todos los compañeros de trabajo sin que se extienda el pánico y conservando
siempre la calma.
8. Retirar los productos químicos inflamables que estén cerca del fuego.
Fuego en el cuerpo:
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 7/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Quemaduras:
1. Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas, etc., se
tratarán lavando la zona afectada con agua fría durante 10-15 minutos.
2. En caso de cualquier incidente informar inmediatamente al docente responsable de la
práctica.
Cortes:
1. Las cortadas se tienen que lavar bien, con agua abundante, con corriente en chorro,
durante 10 minutos como mínimo.
2. En caso de cualquier incidente informar inmediatamente al docente responsable de la
práctica.
1. Las sustancias químicas que se hayan vertido sobre la piel han de ser lavados
inmediatamente con agua corriente abundantemente, como mínimo durante 15
minutos.
2. Las duchas de seguridad instaladas en los laboratorios serán utilizadas en aquellos
casos en que la zona afectada del cuerpo sea grande y no sea suficiente el lavado de
la tarja.
3. Recuerde que la rapidez en el lavado es muy importante para reducir riesgo de
afectación a la piel.
4. En caso de cualquier incidente informar inmediatamente al docente responsable de la
práctica.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 8/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 9/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 10/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Presentación Requerimientos de portada: Logos Portada con Logos Portada sin logos o Portada sin datos de No presenta portada.
Máximo puntaje: Institucionales, Título del trabajo, datos Institucionales pero los los datos de identificación, Logos
1.0 del/los autores, Fecha de Realización, otros datos de identificación están Institucionales o
Nombre del docente y de la materia, identificación están Incompletos. presenta errores.
semestre y grupo. incompletos. Ponderación: 0.4 Ponderación: 0.0
Ponderación: 1.0 Ponderación: 0.8 Ponderación: 0.6
Desarrollo Realiza de forma precisa, concisa y en Realiza en más del Realiza en no más No realiza de forma No participa en el
experimental tiempo las instrucciones de trabajo. 70% las instrucciones del 50% las correcta ninguno de desarrollo de la
Actitudes
Máximo puntaje: Mantiene disciplina, registra los datos y de forma correcta, instrucciones de los procedimientos. práctica.
forma correcta, No participa y
3.0 participa en las actividades de la práctica. registra datos en forma
registra en forma y registra resultados
y tiempo. tiempo los datos obtenidos.
Ponderación: 3.0 Ponderación: 2.0 obtenidos. Ponderación: 0.5
Ponderación: 1.0 Ponderación: 0.0
Cuestionario Responde o elabora todas las respuestas Responde o elabora Responde o elabora Responde o elabora No responde el
Máximo del cuestionario de forma correcta, indaga una respuesta de forma dos respuestas de tres o más cuestionario.
puntaje: 2.0 y analiza la información relacionada con incorrecta, aunque forma incorrecta. respuestas de forma
los ciclos metabólicos. analice la información. incorrecta.
Ponderación: 2.0 Ponderación: 1.5 Ponderación: 1.0 Ponderación: 0.5 Ponderación: 0.0
Análisis de Presenta resultados claros y precisos, Presenta resultados Presenta resultados Los resultados No realiza análisis de
Resultados ajustándose al objetivo. Asimila la claros y sin precisión. sin claridad ni presentados no se resultados.
Máximo puntaje: información, aplica conocimientos básicos Se ajustan al objetivo precisión y estos ajustan al objetivo de
de biología molecular y celular. de la misma. Expresa difícilmente se la práctica. No puede
2.0
Demuestra capacidad para resolver capacidad analítica ajustan al objetivo de evidenciar todos los
problemas en el ámbito metabólico de la pudiendo evidenciar los la práctica, resultados.
salud y enfermedad. Genera marcos resultados. demostrando limitada
conceptuales del funcionamiento capacidad analítica.
molecular y celular y desarrolla método
analítico. Evidencia los resultados.
Ponderación: 2.0 Ponderación: 1.5 Ponderación: 1.0 Ponderación: 0.5 Ponderación: 0.0
Discusión y Sintetiza las ideas y las relaciona con los Logra cierta coherencia No logra sintetizar Las que ideas que No realiza discusión
Habilidades
conclusión objetivos y la teoría. Compara entre las ideas y las ideas y objetivo expresa son ni conclusión de
Máximo puntaje: información obtenida con la publicada en objetivo de la práctica y de la práctica y las totalmente resultados.
1.5 la literatura. Interpreta el estado de salud las contrasta de forma contrasta de forma discordantes con el
según datos de laboratorio. Transmite adecuada contra le inadecuada contra le objetivo de la
información a profesionales y personal no teoría. teoría. práctica y no hace
especializado. contraste contra le
Ponderación: 1.5 Ponderación: 1.0 teoría. Ponderación: 0.0
Ponderación: 0.5 Ponderación: 0.2
Bibliografía Aprende a buscar información Presenta las citas No cumple con la No cumple con la No presenta
Máximo puntaje: bibliográfica veraz y actualizada y la requeridas sin la cantidad de citas y si cantidad de citas o bibliografía.
0.5 presenta en cantidad y calidad: tres citas, calidad esperada: No las presenta no están
actualizadas como máximo 5 años y en actualizadas. actualizadas y actualizadas ni en el
formato Vancouver o APA. formato definido. formato definido.
Ponderación: 0.5 Ponderación: 0.3 Ponderación: 0.2 Ponderación: 0.1 Ponderación: 0.0
Calificación Final. 10 puntos, equivalentes al 10% de la evaluación del período.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 12/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Índice de prácticas
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 13/73
01
21 06 2017 21 08 2017
PRÁCTICA 1.
INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR.
INSTRUMENTACIÓN.
Introducción.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 14/73
01
21 06 2017 21 08 2017
3. METODOLOGÍA.
3.1. Materiales, reactivos y equipo:
3.2. Procedimiento.
1. Explicación por parte del profesor el funcionamiento de cada uno de los equipos y/o
instrumental utilizado en el laboratorio de Biología Molecular
2. Determinación del error de exactitud y precisión para la medición del volumen utilizando
agua destilada.
a. Coloque la balanza analítica sobre una superficie nivelada.
b. Coloque una caja Petri sin tapa dentro de la balanza analítica y tare
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 15/73
01
21 06 2017 21 08 2017
10 10 g
10
10
5 5g
5
5
1 1g
1
1
0.750 750 mg
0.750
0.750
0.500 500 mg
0.500
0.500
0.100 100 mg
0.100
0.100
0.075 75 mg
0.075
0.075
0.050 50 mg
0.050
0.050
0.025 25 mg
0.025
0.025
0.010 10 mg
0.010
0.010
0.005 5 mg
0.005
0.005
0.001 1 mg
0.001
0.001
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 16/73
01
21 06 2017 21 08 2017
4. Análisis de resultados.
Actividad. Realizar un análisis de los resultados obtenidos del desarrollo experimental, puede
utilizar: tablas, gráficas, dibujos, fotografías, entre otros.
Se deben de reportar esquemas y/o imágenes del equipo y/o instrumentos utilizados en esta
práctica, cada uno debe de tener su descripción física y funcional.
Además debe explicar a detalle las diferencias obtenidas entre los las mediciones realizadas,
así como la forma en la que determino él % de error de exactitud y la precisión.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 17/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Actividad: Realizar un análisis de los datos obtenidos respecto a los esperados y explicar
cuáles son las principales fuentes de error y cómo puede afectar en las mediciones.
Realizar una conclusión sobre la importancia de la práctica para el aprendizaje de la materia.
Por último deberá realizar una conclusión si se cumplió con el objetivo planteado.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 18/73
01
21 06 2017 21 08 2017
6. Bibliografía consultada:
Núm. Autor (es) Libro (nombre) Año Edición Editorial País Pag.
1
2.-Mencione tres ventajas que tienen las pruebas de diagnóstico molecular sobre las pruebas
inmunológicas.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 19/73
01
21 06 2017 21 08 2017
RÚBRICA DE EVALUACIÓN
Desarrollo experimental Puntaje: 3.0 Puntaje: 2.0 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje:0.0
Máximo puntaje: 3.0
Cuestionario Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 2.0
Análisis de Resultados Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Habilidades
Calificación Final.
Firma:_____________________________________
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 20/73
01
21 06 2017 21 08 2017
PRÁCTICA 2.
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE CROMOSOMAS Y
SEPARACIÓN DE ADN POR ELECTROFORESIS EN GEL DE
AGAROSA.
Introducción.
En ingeniería genética y Biología Molecular los plásmidos son una de las herramientas
más poderosas ya que se utilizan como vectores, a los cuales se les puede insertar nuevas
secuencias de importancia y ya en el interior de una bacteria, son capaces de auto replicarse
y producir hasta cientos de copias de dicha secuencia.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 21/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Los plásmidos desde el punto de vista técnico pueden ser clasificados en vehículos de
clonación y vehículos de expresión, estos últimos contienen las secuencias necesarias para
expresar varios genes en células animales.
Actividad: Requisito para ingresar a práctica. Resolver en este cuadernillo cada una de las
preguntas del cuestionario de la práctica a la que corresponde. Las cuales se deben de
refutar con bibliografía sugerida.
Objetivo.
1. El alumno debe ser capaz de observar, identificar y clasificar bajo el Microscopio
Óptico Compuesto (MOC) los 23 pares de cromosomas del genoma humano.
3. METODOLOGÍA.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 22/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Materiales
MOC
Preparaciones de cromosomas
Aceite de Inmersión
Materiales Reactivos
Parrilla eléctrica
3.2 Procedimiento.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 23/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 24/73
01
21 06 2017 21 08 2017
4. Análisis de resultados.
Actividad: Realizar un análisis de los resultados obtenidos para cada uno de los
procedimientos, puede utilizar dibujos, imágenes, etc.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 25/73
01
21 06 2017 21 08 2017
6. Bibliografía consultada:
1. Describa cuales son los principales componentes de la cromatina y qué función tiene
cada uno de ellos.
https://www.ucm.es/data/cont/media/www/pag-56185/04-
El%20cromosoma%20eucari%C3%B3tico.pdf
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 26/73
01
21 06 2017 21 08 2017
RÚBRICA DE EVALUACIÓN
Desarrollo experimental Puntaje: 3.0 Puntaje: 2.0 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje:0.0
Máximo puntaje: 3.0
Cuestionario Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 2.0
Análisis de Resultados Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Habilidades
Calificación Final.
Firma:_____________________________________
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 27/73
01
21 06 2017 21 08 2017
PRÁCTICA 3.
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA POR CHOQUE TÉRMICO PARA
LA EXPRESIÓN DEL PLÁSMIDO +pGLO.
Introducción.
La transformación genética consiste en la incorporación de nuevo material
genético a una célula el cual puede provenir de cualquier organismo. Para la incorporación de
ADN en células bacterianas es requisito que el nuevo ADN se encuentre incorporado en
plásmido.
Tanto el gen que codifica para GFP como el gen araC se encuentran en el
plásmido pGLO, el cual además contiene un gen que codifica para la proteína beta-
lactamasa, que confiere resistencia a ampicilina. Así, únicamente las bacterias transformadas
pueden sobrevivir y crecer en medio que contiene ampicilina.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 28/73
01
21 06 2017 21 08 2017
2. OBJETIVO:
Que el alumno realice una transformación bacteriana, a fin de que comprenda de una mejor
manera los mecanismos moleculares en la transferencia de información genética entre las
bacterias.
3. METODOLOGÍA.
3.1 Materiales:
Materiales Reactivos
Micro pipetas 10 - 100µl, y 100 –
Medio LB/agar
1000lµ
Solución de transformación
Incubadora a 37° C
(CaCl2 50 mM, glicerol 15%
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 29/73
01
21 06 2017 21 08 2017
3.2.6 Después de remover los tubos del hielo, agregar 1.5 ml del LB líquido en
ambos tubos, incubar a 37°C por 30 minutos.
3.2.7 Marcar cuatro cajas de Petri con medio de cultivo LB solido en la parte
inferior.
a) LB/amp +pGLO
b) LB/amp/ara +pGLO
c) LB/amp - pGLO
d) LB - pGLO
3.2.8 Agitar los tubos golpeando con los dedos; inocular las cajas de Petri
como se indica:
a) LB/amp +pGLO ----Añadir 100µl del tubo +pGLO
b) LB/amp/ara +pGLO ----Añadir 100µl del tubo +pGLO
c) LB/amp -pGLO -----Añadir 100µl del tubo –pGLO
d) LB -pGLO -----Añadir 100µl del tubo –pGLO
3.2.9 Dispersar la suspensión bacteriana usando el asa microbiológica
esterilizada. Incubar por 24 horas a 37°C.
3.2.10 Observar las cajas de Petri inoculadas con luz blanca y con luz
ultravioleta.
4. Análisis de resultados.
Actividad: Realizar un análisis de los resultados obtenidos para cada uno de los
procedimientos, puede utilizar dibujos, imágenes, etc.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 30/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 31/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 32/73
01
21 06 2017 21 08 2017
4. ¿Cuál es la importancia clínica del hecho que las bacterias pueden generar conjugación y/o
transformación?
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 33/73
01
21 06 2017 21 08 2017
http://analesranf.com/index.php/aranf/article/view/1876/1850
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 34/73
01
21 06 2017 21 08 2017
RÚBRICA DE EVALUACIÓN
Desarrollo experimental Puntaje: 3.0 Puntaje: 2.0 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje:0.0
Máximo puntaje: 3.0
Cuestionario Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 2.0
Análisis de Resultados Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Habilidades
Calificación Final.
Firma:_____________________________________
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 35/73
01
21 06 2017 21 08 2017
PRÁCTICA 4.
OBTENCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE Y SU SEPARACIÓN
POR ELECTROFORESIS.
Objetivo.
El objetivo de esta práctica es que, aplicando un sistema de expresión comercial
para células procariontes, el alumno sea capaz de identificar con exactitud las partes que lo
componen y explicar para qué se requieren en la expresión de proteínas recombinantes.
Introducción.
En Biología Molecular es común estudiar la composición, estructura y, en lo
posible, la función de proteínas. Ahora es posible producir grandes cantidades de proteínas
seleccionadas usando la tecnología del ADN recombinante. En general, un ADN híbrido o
recombinante se prepara al insertar el gen que deseamos expresar en un vector y luego se
transfiere dentro de una célula hospedera (“host”) donde la proteína deseada es sintetizada.
Este procedimiento ha sido usado en la producción de cientos de proteínas con propósitos
científicos, médicos e industriales.
Proteína Uso
Las células bacterianas han sido ampliamente usadas como células hospederas
para la producción de proteínas recombinantes a gran escala. El gen clonado que contiene el
mensaje para la proteína deseada es incorporado dentro de un vector de expresión que tiene
todas las secuencias de control transcripcional y traduccional necesarias.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 36/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Si las señales apropiadas para la expresión del gen están presentes, es posible
sobre expresar la proteína deseada a una concentración que puede representar hasta el 40%
en peso de la proteína total de la bacteria. Sin embargo, esta sobreexpresión puede causar
dificultades en el crecimiento bacteriano, inestabilidad plasmídica o incluso, la proteína
extraña puede ser tóxica para la bacteria. Además, en ocasiones las células bacterianas
concentran las proteínas extrañas dentro de cuerpos de inclusión insolubles en donde las
proteínas están presentes en forma desnaturalizada y agregada. Muchos de estos problemas
pueden ser minimizados o eliminados al etiquetar (tagging) la proteína deseada con una
proteína de origen bacteriano, lo cual se logra al insertar dentro del vector un fragmento de
ADN que codifique una proteína bacteriana. Así, la bacteria puede reconocer a la proteína
extraña como propia (la etiqueta frecuentemente se agrega en el extremo N- terminal de la
proteína de interés). Estas proteínas modificadas son llamadas proteínas híbridas o de fusión.
Si es necesario, la etiqueta puede ser eliminada de la proteína deseada después de la
purificación. Otra forma de disminuir los problemas asociados a la expresión de proteínas
extrañas en las células bacterianas, es restringir al mínimo la expresión basal, es decir, utilizar
un sistema inducible de expresión proteica. Esto se puede lograr si la enzima encargada de la
transcripción del gen, la ARN polimerasa, reconoce al promotor del vector sólo en presencia
de un inductor, por ejemplo IPTG (isopropil- β-D-tiogalactopiranósido). La adición de IPTG al
cultivo en crecimiento induce la transcripción del ADN blanco bajo el control de promotores
derivados del promotor lac. Las etiquetas en las proteínas tienen otros usos, además del
mencionado previamente: pueden ser útiles para facilitar la purificación, para identificar a la
proteína de interés, para incrementar la probabilidad de actividad biológica por afectar la
solubilidad en el citoplasma o para exportar al periplasma. Varios vectores comerciales
contienen diferentes secuencias adyacentes al sitio de clonación que codifican péptidos
“etiqueta” y que pueden desarrollar varias de estas funciones cuando se fusionan con la
proteína de interés. La elección de los sitios de clonación depende de la combinación de
etiquetas deseadas y la localización de éstas en el extremo N-terminal, C- terminal o ambos,
de la proteína de interés. Ejemplos de estos sistemas de expresión para proteínas de fusión
son los vectores pGEX de la compañía GE Healthcare Life Sciences y el sistema pET de
NOVAGEN. En esta práctica utilizaremos un vector pGEX, que permite expresar, purificar y
detectar proteínas de fusión a glutatión S-transferasa (GST) producidas en E. coli. El gen gst
codifica para una proteína de 26 kDa, tiene un codón de inicio y un sitio de entrada ribosomal
y está bajo el control de un promotor que es inducible con 1 a 5 mM de IPTG. El plásmido
confiere resistencia a ampicilina y contiene un represor lacI. La proteína de fusión resultante
puede ser purificada por cromatografía de afinidad, usando una resina con glutatión.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 37/73
01
21 06 2017 21 08 2017
2. OBJETIVO:
2.1 el alumno debe comprender la importancia de la expresión génica, en la medicina,
mediante la obtención de una proteína recombinante.
3. METODOLOGÍA:
3.1 Materiales, reactivos y equipos:
Mechero de Bunsen
Tubos de 1.6 mL
Hielo/contenedor
4. Análisis de resultados.
Actividad: Realizar un análisis de los resultados obtenidos para cada uno de los
procedimientos, utilizando la estadística descriptiva para determinar: el promedio y la
desviación estándar de los valores obtenidos, además puede utilizar dibujos, imágenes, etc.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 39/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 40/73
01
21 06 2017 21 08 2017
6. Bibliografía consultada:
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 41/73
01
21 06 2017 21 08 2017
https://zaguan.unizar.es/record/75556/files/texto_completo.pdf
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 42/73
01
21 06 2017 21 08 2017
RÚBRICA DE EVALUACIÓN
Desarrollo experimental Puntaje: 3.0 Puntaje: 2.0 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje:0.0
Máximo puntaje: 3.0
Cuestionario Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 2.0
Análisis de Resultados Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Habilidades
Calificación Final.
Firma:_____________________________________
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 43/73
01
21 06 2017 21 08 2017
PRÁCTICA 5.
EXTRACCIÓN DE ADN TOTAL A PARTIR DE: CULTIVO
BACTERIANO Y SUERO.
Introducción.
Hay diferentes técnicas que permiten obtener ácidos nucleicos con alto grado de
pureza. Las más utilizadas suelen incluir una etapa de ultracentrifugación en gradientes de
CsCl (Cloruro de cesio) o una cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, muchas
aplicaciones de laboratorio no necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas
técnicas (laboriosas y/o caras) en los protocolos de purificación.
Se han descrito diversos métodos particulares a cada tipo de muestra. Por ejemplo, en
el caso particular de células bacterianas, se emplea típicamente la enzima lisozima, que
cataliza la degradación de la pared celular. Para facilitar a la solubilización de los
componentes celulares, y a la ruptura de membranas y complejos proteicos, la solución de
lisis contendrá un detergente iónico (dodecil sulfato de sodio, SDS). Este detergente dispersa
los componentes de las membranas y desnaturaliza las proteínas. La solución de lisis
contiene además el agente quelante de cationes divalentes EDTA. Esto impide la acción de
las ADNasas (dependientes de Mg++), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las
ribonucleasas.
La purificación de ácidos nucleicos, las moléculas de gran tamaño (como por ejemplo
las moléculas de ADN genómico presentes en los cromosomas, cuyo tamaño es del orden de
millones de pares de bases) es fragmentado mecánicamente en forma parcial, por lo que se
obtienen fragmentos de tamaño mucho menor (típicamente entre 20 y 200 kb). El grado de
fragmentación dependerá, obviamente, de los métodos utilizados para la homogeneización y
purificación. Los métodos más vigorosos por lo general permiten mayores rendimientos, al
maximizar el número de células lisadas, pero por la misma razón llevan a una mayor
fragmentación del ADN.
Extracción de proteínas y lípidos
Los ácidos nucleícos son muy solubles en agua debido al fuerte carácter hidrofílico de
sus grupos fosfato. Dentro de una mezcla de solventes no miscibles, uno acuoso y otro
orgánico no polar, los ácidos nucleícos tenderán a permanecer en la fase acuosa, en tanto
que los lípidos y gran parte de las proteínas desnaturalizadas se encontrarán en la fase
orgánica. En la preparación de ácidos nucleicos, los solventes que se usan más
frecuentemente para la extracción de proteínas y lípidos son el fenol y el cloroformo.
Precipitación de ácidos nucleicos
La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración. Se
basa en la simultánea neutralización de las cargas negativas (mediante el añadido de sales),
y deshidratación de la molécula (mediada por el agregado de alcoholes, típicamente etanol o
isopropanol), lo cual lleva a su precipitación. La precipitación es un fenómeno reversible
(mediante la disolución en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 44/73
01
21 06 2017 21 08 2017
3. METODOLOGÍA:
3.1 Materiales:
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 45/73
01
21 06 2017 21 08 2017
4. Análisis de resultados.
Actividad: Realizar un análisis de los resultados obtenidos para cada uno de los
procedimientos, utilizando la estadística descriptiva para determinar: el promedio y la
desviación estándar de los valores obtenidos, además puede utilizar dibujos, gráficos,
imágenes, etc.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 47/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 48/73
01
21 06 2017 21 08 2017
3. Describa cual es efecto de la reacción Fenton, sobre la estabilidad del ADN extraído.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 49/73
01
21 06 2017 21 08 2017
6. Mencione cuales son los factores que influyen en la estabilidad, integridad y calidad
del ADN extraído.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 50/73
01
21 06 2017 21 08 2017
RÚBRICA DE EVALUACIÓN
Desarrollo experimental Puntaje: 3.0 Puntaje: 2.0 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje:0.0
Máximo puntaje: 3.0
Cuestionario Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 2.0
Análisis de Resultados Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Habilidades
Calificación Final.
Firma:_____________________________________
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 51/73
01
21 06 2017 21 08 2017
PRÁCTICA 6.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) PARA LA
DETERMINACIÓN DE ADN BACTERIANO.
Introducción.
Para un Médico Cirujano Integral, el conocimiento y la capacitación para comprender y
elaborar técnicas que incluyan PCR y separación de ADN por electroforesis es de vital
importancia, debido a que las aplicaciones de esta técnica son innumerables y su aporte al
avance del conocimiento y manipulación del material genético es invaluable. Dentro de las
aplicaciones más importantes se pueden mencionar: los análisis forenses, identificación de
sospechosos con pequeñas muestras de sangre, semen o pelo, identificación de padres en
litigios de paternidad, en la antropología molecular, en la arqueología molecular, en
microbiología ambiental, en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, en el diagnóstico
prenatal de enfermedades genéticas, diagnóstico de cáncer, en técnicas de clonaje y
secuenciación de ADN genómico entre otros.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) fue descrita por
primera vez en 1985 por Kary B. Mullis. El objetivo y función de esta técnica es obtener
mediante amplificación in vitro cantidades “masivas” de ADN incluso a partir de muestras de
ADN muy pequeñas.
Para realizar la PCR más sencilla, se requiere conocer las secuencias que rodean la
región a amplificar, luego se producen oligonucleótidos complementarios a estas secuencias
mediante síntesis química automatizada y estos son utilizados como cebadores o iniciadores
(primers) en una reacción de polimerización cíclica catalizada por la ADN polimerasa.
En primer lugar el ADN que contiene la secuencia que se quiere amplificar se
desnaturaliza mediante calor y luego se alinea con los cebadores, los cuales se encuentran
presentes en exceso. A continuación, la ADN polimerasa realiza la extensión de la cadena de
ADN a partir de los extremos del cebador, incorporando desoxinucleótidos trifosfato que se
añaden a la reacción. Posteriormente se aplica un segundo ciclo de desnaturalización por
calor, alineado y extensión del cebador. Se utiliza una ADN polimerasa resistente a la
temperatura, la Taq polimerasa, procedente de una bacteria llamada Thermus aquaticus que
vive en aguas termales. Sin embargo esta polimerasa no presenta actividad 3´ exonucleasa
de corrección de pruebas, por lo que la síntesis es relativamente inexacta. Este ciclo se repite
unas 30 veces o más en un dispositivo de regulación automática de temperatura conocido
como termociclador. Después de 32 ciclos se producen alrededor de 1X 109 copias del ADN
molde original, o 2n-1, donde n es el número de ciclos.
Actividad: Requisito para ingresar a práctica. Resolver en el cuadernillo de biología
molecular y celular cada una de las preguntas del cuestionario de la práctica a la que
corresponde. Las cuales se deben de refutar con bibliografía sugerida.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 52/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Objetivo.
El alumno deberá comprender y aplicar los conceptos teóricos en los cuales se basa la
reacción en cadena de la polimerasa. Así como su importancia en el diagnóstico de diversas
enfermedades.
3. METODOLOGÍA:
3.1 Materiales y reactivos.
Materiales Reactivos
Micropipetas de 10 y 100 Iniciadores (para la detección de ADN bacteriano)
µl Sentido o forward 5´-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-
3´ (Tm, 59±4 °C)
Anti-sentido o reverse
5´-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3´ (Tm, 58±1 °C)
Puntas para micropipetas Agarosa
Tubos eppendorf PBS
Termociclador amortiguador de carga
Cámara de electroforesis Mezcla de reacción, con Taq Polimerasa
Microtubos para reacción Agua grado biología molecular
Transiluminador UV MgCl2 25 mM
dNTPs
TAE 50X (242g de Tris-Base + Ácido acético glacial 57.1 mL +
EDTA 0.25 mM pH 8.0 200 mL + H2O cbp 1L)
3.2 Desarrollo experimental.
Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)
3.2.1 Descongelar en refrigeración el ADN obtenido en la práctica de extracción de
ADN bacteriano.
3.2.2 Colocar en un microtubo de reacción para PCR la siguiente relación:
Reactivo
Volumen (µL)
Mezcla de reacción 12
MgCl2 1
Iniciador R (25pmol/L) 1
Extracto de ADN 4
H2O cbp 25
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 53/73
01
21 06 2017 21 08 2017
4. Análisis de resultados.
Actividad. Realizar un análisis de los resultados obtenidos para cada uno de los
procedimientos, utilizando la estadística descriptiva para determinar: el promedio y la
desviación estándar de los valores obtenidos, además puede utilizar: gráficos, dibujos,
imágenes, etc.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 54/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Bibliografía consultada:
Núm. Autor (es) Libro (nombre) Año Edición Editorial País
1
2
3
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 55/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 56/73
01
21 06 2017 21 08 2017
RÚBRICA DE EVALUACIÓN
Nombre y firma del alumno
Desarrollo experimental Puntaje: 3.0 Puntaje: 2.0 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje:0.0
Máximo puntaje: 3.0
Cuestionario Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 2.0
Análisis de Resultados Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Habilidades
_______________________________________________
_______________________________________________
_____________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_____________________________________________
Firma:_____________________________________
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 57/73
01
21 06 2017 21 08 2017
PRÁCTICA 7.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) PARA LA
DETERMINACIÓN DE ADN HUMANO EN UNA MUESTRA DE SUERO.
Materiales Reactivos
Micropipetas de 10 y Iniciadores (para la detección de ADN humano)
100 µl Sentido o forward RNAseP3F (5′-CCA AGT GTG AGG GCT GAA
AAG-3′)
Anti-sentido o reverse
RNAseP3R (5′-TGT TGT GGC TGA TGAACTATA AAA GG-3′)
Puntas para Agarosa
micropipetas
Tubos eppendorf PBS
Termociclador amortiguador de carga
Cámara de Mezcla de reacción, con Taq Polimerasa
electroforesis
Microtubos para Agua grado biología molecular
reacción
Transiluminador UV MgCl2 25 mM
dNTPs
TAE 50X (242g de Tris-Base + Ácido acético glacial 57.1 mL + EDTA
0.25 mM pH 8.0 200 mL + H2O cbp 1L)
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 58/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Mezcla de reacción 12
MgCl2 1
Iniciador R (25pmol/L) 1
Extracto de ADN 4
H2O cbp 25
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 59/73
01
21 06 2017 21 08 2017
4.2.12 Una vez corrido el gel, sacarlo de la cámara de electroforesis y con mucho
cuidado teñirlo con bromuro de etidio durante 5 min.
4.2.13 Sacar cuidadosamente el gel y observarlo en un transiluminador UV.
4. Análisis de resultados.
Actividad: Realizar un análisis de los resultados obtenidos para cada uno de los
procedimientos, utilizando la estadística descriptiva para determinar: el promedio y la
desviación estándar de los valores obtenidos, además puede utilizar dibujos, imágenes, etc.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 60/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 61/73
01
21 06 2017 21 08 2017
2. Investigue cuales son los principales marcadores genéticos para las siguientes
enfermedades:
Diabetes Mellitus: file:///C:/Windows/system32/config/systemprofile/Downloads/558-
Article%20Text-566-1-10-20180913.pdf
Hipertensión arterial: https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=457746536002
Cáncer de mama:
http://repositorio.puce.edu.ec/bitstream/handle/22000/12399/TESIS.pdf?sequence=1&is
Allowed=y
Cáncer de páncreas:
file:///C:/Windows/system32/config/systemprofile/Downloads/Dialnet-
DiagnosticoDeCancerDePancreasMedianteSecuenciacion-6041042.pdf
Cáncer de colón: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-
90152015000400002; https://www.tdx.cat/handle/10803/378353
Alzheimer:
https://ruidera.uclm.es/xmlui/bitstream/handle/10578/19352/TESIS%20Ati%C3%A9nzar
%20N%C3%BA%C3%B1ez.pdf?sequence=1
Parkinson:
https://repositorio.unican.es/xmlui/bitstream/handle/10902/8525/Tesis%20MIGA.pdf?seq
uence=1&isAllowed=y
Cardiopatía isquémica:
http://www.morfovirtual2018.sld.cu/index.php/morfovirtual/2018/paper/viewPaper/225/42
7
Obesidad crónica:
http://revista.ened.edu.mx/index.php/revistaconade/article/view/161/143
Insuficiencia renal crónica: https://core.ac.uk/download/pdf/83599218.pdf
Artritis reumatoide: file:///C:/Windows/system32/config/systemprofile/Downloads/Dialnet-
MarcadoresGeneticosDeEficaciaYToxicidadAMetotrexat-5241006.pdf
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 62/73
01
21 06 2017 21 08 2017
RÚBRICA DE EVALUACIÓN
Desarrollo experimental Puntaje: 3.0 Puntaje: 2.0 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje:0.0
Máximo puntaje: 3.0
Cuestionario Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 2.0
Análisis de Resultados Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Habilidades
Calificación Final.
Firma:_____________________________________
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 63/73
01
21 06 2017 21 08 2017
PRÁCTICA 8.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA CON
TRANSCRIPTASA INVERSA (RT-PCR) PARA LA DETERMINACIÓN
DE MATERIAL GENÉTICO VIRAL.
Introducción
El hecho de que las moléculas de ADN obtenidas al finalizar la reacción en
cadena correspondan efectivamente al fragmento de interés queda asegurado por la
intervención de los primers que definen los extremos "derecho" e "izquierdo" de ese
fragmento. Así, una vez que la reacción ha finalizado, el tamaño del fragmento multiplicado
puede determinarse sometiendo los productos de la reacción a una electroforesis en gel de
agarosa o poliacrilamida, es decir, a un proceso de separación por difusión bajo la acción de
un campo eléctrico.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 64/73
01
21 06 2017 21 08 2017
El cDNA se desnaturaliza a más de 90º (~94º), las dos hebras se separan. A 50 o 60º
los primers específicos se alinean con el sitio complementario en cada cadena. Los sitios de
unión a los primers deben estar separados 400 bases, pero generalmente se encuentran a
100 bases de distancia especialmente cuando se usa el PCR en tiempo real
Objetivo:
El alumno deberá desarrollar la técnica para la extracción de ARN viral, así como entender y
utilizar el procedimiento de la transcriptasa reversa, para la obtención de un cADN para el
diagnóstico de diversas enfermedades.
3. METODOLOGÍA
3.1 Materiales y reactivos
Materiales Reactivos
Micropipetas de 10 y Iniciadores (para la detección de ARN viral)
100 µl
Puntas para Agarosa
micropipetas
Tubos eppendorf PBS
Termociclador amortiguador de carga
Cámara de Mezcla de reacción, con Taq Polimerasa
electroforesis
Microtubos para Agua grado biología molecular
reacción
Transiluminador UV MgCl2 25 mM
dNTPs
TAE 50X (242g de Tris-Base + Ácido acético glacial 57.1 mL + EDTA
0.25 mM pH 8.0 200 mL + H2O cbp 1L)
Vórtex Kit de extracción de ARN viral QIAGEN (Camisas (tubo colector),
Columnas, Buffer concentrado AW-1, Buffer concentrado AW-2, Buffer
de lisis AVL, Acarreador, Buffer de elusión)
Ultramicrocentrífuga Etanol absoluto (100%) grado biología molecular.
Estuche para amplificación de RNA en un solo paso por RT-PCR,
SuperScript One -StepRT-PCR with Platinum Taq.
Equipo de desoxinucléotidos trifosfatados (dNTP), viales individuales
de cada uno (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Enzima Taq polimerasa. Caja con 1000 U
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 65/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 66/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 67/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 68/73
01
21 06 2017 21 08 2017
4. Análisis de resultados.
Actividad: Realizar un análisis de los resultados obtenidos para cada uno de los
procedimientos, utilizando la estadística descriptiva para determinar: el promedio y la
desviación estándar de los valores obtenidos, además puede utilizar gráficas, imágenes, etc.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 69/73
01
21 06 2017 21 08 2017
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 70/73
01
21 06 2017 21 08 2017
6. Bibliografía consultada:
Núm. Autor (es) Libro (nombre) Año Edición Editorial País
1
2
3
7. Cuestionario con orientación clínica.
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 71/73
01
21 06 2017 21 08 2017
RÚBRICA DE EVALUACIÓN
Desarrollo experimental Puntaje: 3.0 Puntaje: 2.0 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje:0.0
Máximo puntaje: 3.0
Cuestionario Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 2.0
Análisis de Resultados Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Habilidades
Calificación Final.
Firma:_____________________________________
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 72/73
01
21 06 2017 21 08 2017
BIBLIOGRAFIA.
Fuentes bibliográficas.
TIPO TITULO AUTOR EDITORIA AÑO
L
4 Meterial http://www.bionova.org.es/animbio/
didáctico http://www.ncbi.nlm.nih.gov
en línea http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/replicacion%20dna.html
4 Revistas Revista de Salud Pública de México Varios Varios Varios
con http://bvs.insp.mx/rsp/inicio/
acceso en Instituto Nacional de Medicina genómica
línea http://www.inmegen.gob.mx/es/investigac
ion/publicaciones-cientificas/articulos-
cientificos/?anio=2008&autor=0
Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular