LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

PRUEBA DE TINSION DE GRAM, CATALASAS Y COAGULASAS.

VINIS VIVIANA CUELLO BECERRA

MARTHA SUSANA CUETO HERNÁNDEZ
YANIA VALENTINA HOLGUÍN SAAVEDRA
MARÍA DE LOS ÁNGELES MARTINEZ QUINTERO
ALEJANDRO JAVIER MONTERO MONTERO
ANDREA FERNANDA OTERO ATENCIA
CAMILA ANDREA OTERO PAYARES
JHAIDER JHAIR VEGA OSORIO

DR. LEONAR ANTONIO ARROYO GAMERO

UNIVERSIDAD DEL SINÚ - SECCIONAL CARTAGENA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE MEDICINA
CARTAGENA-BOLÍVAR
2019
 INTRODUCCION.

Los cocos Gram positivos, excluyendo las enterobacterias, son los microorganismos más
frecuentemente aislados de muestras de pacientes y se han involucrado como agentes importantes
en procesos de enfermedades infecciosas desde el año 1836. Se encuentran ampliamente
distribuidos en la naturaleza y forman parte de la flora microbiana normal de la piel y las mucosas
Del hombre y de animales. Las infecciones en el hombre se producen por contacto directo con
individuos infectados o portadores sanos, o por penetración a través de piel y mucosas mediante
objetos cortopunzantes por heridas, trauma o procedimientos quirúrgicos o por la acción de toxinas
producidas por cepas de algunas especies.(6) Con el objetivo de identificar el agente etiológico
responsable del proceso infeccioso y para conocer las implicaciones patogénicas/patológicas, la
evolución clínica, y aplicar una terapia antimicrobiana eficaz, un pilar fundamental en la práctica
de la microbiología clínica lo constituye la asignación de especie a un aislamiento microbiano.
Dentro de la práctica rutinaria diaria, el laboratorio de microbiología aplica técnicas fenotípicas
que permiten lograr este objetivo. Sin embargo, muestran algunas limitaciones que se observan de
manera más evidente para algún tipo de microorganismo. Los métodos moleculares permiten
soslayar algunas de estas limitaciones, si bien su implementación no es universal. Este hecho se
debe a un coste más elevado y al grado de especialización que se requiere para su aplicación, por
lo que los métodos moleculares suelen estar centralizados en laboratorios o centros de referencia.
Recientemente los métodos basados en proteómica han irrumpido de manera importante en el
campo del diagnóstico microbiológico y sin duda va a tener un gran impacto en la organización
futura de los servicios de microbiología. Éste manuscrito revisa de manera concisa los aspectos
más reseñables de los tres métodos de identificación bacteriana arriba descritos que se usan en los
laboratorios de microbiología.(7)
 MÉTODOS Y TÉCNICAS DE TINCIÓN
TINCIONES SIMPLES.
Se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico. Se utilizan solamente para incrementar
el contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Se fija
el espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el
exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser observada.
TINCIONES DIFERENCIALES:
Se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La técnica de tinción diferencial consta
de dos etapas: una tinción simple seguida de una tinción de contraste. En la tinción de contraste se
utiliza otro colorante que tiñe (y por tanto, revela) las células no teñidas por el primer colorante.
Estas tinciones son muy utilizadas en microbiología.(8)
TINCIONES ESPECÍFICAS:
Se utilizan para incrementar el contraste en las células microbianas y revelan estructuras
particulares, entre las que se incluyen en los flagelos y las cápsulas.
Tinción adecuada
En su forma más simple, el verdadero proceso de tinción puede implicar la inmersión de la muestra
en la solución colorante, seguido del aclarado que es un lavado para eliminar el exceso de colorante
y la observación. Muchos tintes, sin embargo, requieren del uso de un mordiente. Cuando la
solución de colorante en exceso se elimina durante el aclarado, la tinción mordentada permanece.
TINCIÓN NEGATIVA:
Un método sencillo de tinción para bacterias, que además es un claro caso de cromofobia y que
por lo tanto funciona aun cuando los métodos de tinción positiva fallan, es la tinción negativa. Esto
puede ser conseguido simplemente extendiendo la muestra en un portaobjetos y aplicando
directamente sobre ella una gota de nigrosina o tinta china y cubriendo luego la muestra
humedecida con un cubreobjetos. Luego de esto, los microorganismos pueden ser observados
fácilmente por medio de microscopía en campo claro como inclusiones claras muy bien
contrastadas contra el medio oscuro que las rodea
Tinción indirecta:
Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un mordiente habitual
es el ácido tánico.
TINCIÓN DIRECTA:
Hablamos de tinción directa cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato, sin otro
tratamiento previo.
TINCIÓN GRAM:
La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio
bacteriológico. Su utilidad en la práctica de referencias a la morfología celular bacteriana (cocos,
bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM.(8)
1. Se tiñe el espécimen con el primer colorante, cristal violeta.
2. Se añade el mordiente, yodo.
3. Se aplica el agente decolorante, normalmente una solución de acetona o etanol. En este
momento, las bacterias Gram negativas pierden su tinción violeta, pero las Gram positivas
retienen el colorante.
4. Como colorante de contraste se añade safranina, que tiñe de rosa las bacterias Gram
negativas, previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram positivas les
proporciona un color violeta más intenso.
Una tinción ácido-alcohol resistente se realiza según los siguientes pasos:
1. Tinción primaria con fucsina básica, que tiñe todas las células de rojo.
2. Calentamiento suave de la preparación para facilitar la penetración del colorante en el
interior de la célula.
3. Decoloración con una solución de ácido clorhídrico en etanol. Este decolorante elimina la
fucsina de todas las células excepto de las micro bacterias, que la retienen debido a su
superficie cérea.
4. Coloración de contraste con azul de metileno. Se tiñen de azul todas las células previamente
decoloradas, lo que facilita la diferenciación entre las células de Mycobacterum, aún
teñidas de rojo, v las células restantes del espécimen.
TINCIÓN: RODAMINA-AURAMINA
Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los
fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color
amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso.(10)
El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecífica. Todos
los microorganismos ácido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen
con estos colorantes.
Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser
reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción con el
fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión. De esta forma, los resultados positivos
pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que además permiten la diferenciación
morfológica.
TINCIÓN: NARANJA DE ACRIDINA
El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o
desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia
puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado
como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está
muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleico, el germen viable se
inactivará poco tiempo después de la tinción.(10)
Colorantes:
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por
los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados
negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.
Azul de metileno: El azul de metileno se utiliza para teñir células animales, para hacer más
visibles sus núcleos. Es también utilizado para teñir los extendidos de sangre para ser utilizados
en citología y como colorante vital en el recuento de reticulocitos.
Azul Nilo: Tiñe los núcleos de color azul. También puede ser utilizado para teñir células vivas.
Cristal violeta: El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado, tiñe las paredes
celulares de color púrpura. El cristal violeta es un componente importante en la coloración de
Gram.
Eosina: La eosina se utiliza más frecuentemente como contra coloración de la hematoxilina,
impartiendo un color que va del rosado al rojo al material citoplasmático, membrana celular, y
algunas estructuras extracelulares. Además imparte un fuerte color rojo a los eritrocitos. La eosina
puede ser utilizada también en algunas variantes de la coloración de Gram, y en muchos otros
protocolos de tinción.
Safranina: La safranina es un colorante nuclear. Colorea los núcleos celulares de rojo, y se utiliza
principalmente como contra coloración. También puede ser utilizada para darle una coloración
amarilla al colágeno.
Verde de metilo: El verde de metilo se utiliza frecuentemente en microscopia de campo claro,
para teñir la cromatina de las células y facilitar así su visualización
PRUEBAS BIOQUÍMICAS, DIFERENCIADAS:
1) Pruebas que se utilizan en la identificación preliminar y con lectura inmediata como la catalasa
y oxidasa; 2) otras pruebas rápidas, con lectura en menos de 6h tal y como la hidrólisis del hipurato,
la β-galactosidasa (ONPG), las aminopeptidasas, la uresa y el indol; 3) pruebas lentas, con lectura
de 18 a 48h que incluirían la óxido-fermentación, reducción de nitratos, rojo de metilo, Voges-
Proskauer, Agar hierro de Kligler, fermentación de azúcares, hidrólisis de la esculina, coagulasa,
fenilalanina-desaminasa, DNasa, hidrólisis de la gelatina, decarboxilasas, lipasa, lecitinasa,
utilización de citratos, utilización de malonato, y prueba de CAMP entre las más frecuentes, y 4)
pruebas basadas en caracteres de resistencia a ciertas sustancias tal y como optoquina, bacitracina,
solubilidad en bilis, y crecimiento en caldo hipersalino.(9)
Destacar que existen en el mercado numerosos sistemas o equipos multipruebas con el fin de
conseguir una mayor rapidez en la identificación de algunas bacterias. Todos exigen unas
condiciones muy precisas de concentración del inóculo, de inoculación, de incubación y de lectura,
que si no se observan pueden dar lugar a importantes errores. Estos sistemas pueden ser manuales
y automatizados.
 OBJTIVO GENERAL.

Ejecutar de forma adecuada el frotis de bacterias directamente sobre la portaobjetos, llevando a

cabo la tinción con su correspondiente colorante, identificando de esta forma el tipo de bacterias
Gram positivas o Gram negativas al momento de la observación al microscopio.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

 Aprender a diferenciar entre microorganismos Gram positivos y Gram negativos,

basándose en sus características.
 Conocer la importancia de dicha tinción para llegar con la interpretación de bacterias
apoyándose en sus propiedades estructurales al aplicar la coloración de Gram.
 Conocer los distintos modelos de pared bacteriana para así lograr identificar con más
precisión el tipo de bacteria.
 Identificar diferencias entre las características presentes en cada una de ellas.
 Conocer los beneficios de dicha prueba en la utilidad clínica.
 MATERIALES Y REACTIVOS.
TINCIÓN DE GRAM.
TINCIÓN DE GRAM.
MATERIALES:
 Guantes estériles.
 Hemocultivo para toma de muestras.
 Placas porta y cubre objetos.
 Hisopos estériles.
 Asas microbiológicas
 Mechero de alcohol.
 Agua destilada.
 Microscopio (1)
REACTIVOS:
 Azul de metileno
 Safranina
 Iodo Gram
 Cristal violeta
 Alcohol cetona (1)
METODOLOGÍA.
1. Preparar la extensión del cultivo: En un portaobjetos limpio, libre de grasa, y con un asa
bacteriológica colocar una pequeña cantidad de la colonia bacteriana.
a) Muestra solida: colocar solución salina previamente a colocar la colonia, igual en muestra
semisólida.
b) Muestra liquida: colocar la colonia directamente.
2. Dejar secar al aire, luego fijar la preparación pasando la placa rápidamente por el mechero (2 ó
3 veces).
3. Agregar cristal violeta durante 20 a 30 segundos, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de
la pared bacteriana (Colorante primario), enjugar con agua destilada seguidamente.
4. Agregar yodo gram durante 40 a 60 segundos que sirve como mordiente (compuesto químico
intensificador del color) e impide la salida del cristal violeta por la formación de un complejo
cristal violeta-yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana. Enjuagar
con agua destilada seguidamente.
5. Agregar alcohol acetona y enjuagar con agua destilada inmediatamente (decoloración, disuelve
lípidos de la pared de Gram negativas). Esta mezcla de alcohol-acetona, deshidrata la pared
bacteriana y cierra los poros de la misma, también destruye la membrana externa de las bacterias
Gram negativas debido a que ésta es soluble a la acción de solventes orgánicos, como la mezcla
de alcoholacetona.
6. Agregar safranina durante 20 segundos, enjuagar con agua destilada seguidamente. La safranina
funciona como un colorante secundario o de contratinción y sirve para teñir las bacterias que no
pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo. (2)
7. Dejar secar al aire libre la muestra, cuando esté completamente seca observar en el microscopio
y evaluar los resultados.

PRUEBA DE CATALASA.
MATERIALES.
 Microorganismo problema procedente de un cultivo.
 Pipeta pasteur
 Asa de siembra desechables.
 Peróxido de hidrógeno de 100 volúmenes al 30%
 Mechero de alcohol.
 Lamina portaobjetos
 Guantes. (3)
METODOLOGIA.
1. Tomar un inóculo del microorganismo problema con un asa estéril de siembra desechable.
2. Depositar el inóculo realizando una impronta sobre una lámina portaobjetos con
movimientos circulares.
3. Añadir una gota de H2O2.
4. Visualizar alrededor de 2 a tres minutos si aparecen o no burbujas y catalogar al
microorganismo como catalasa positivo o negativo. (3)
 PRUEBA DE CUAGULASA EN PLACA.

MATERIALES.
MUESTRAS.
 Colonias de cocos grampositivos en racimos catalasa positiva crecidas en medio de cultivo
sólido. (4)
REACTIVOS Y MATERIALES
 Plasma de conejo
 Asas desechables
 Agua destilada estéril
 Porta objetos.
 Guantes.(4)
METODOLOGIA.
1. colocar una gota de agua destilada sobre una porta objetos.
2. Emulsionar suavemente la colonia en estudio en la gota de agua destilada hasta obtener
una suspensión cargada homogénea.
3. Agregar una gota de plasma de conejo reconstituido junto a la gota de la suspensión
bacteriana-
4. Mezclar bien con el asa e inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la
formación inmediata de un precipitado.
5. A los 20 o 30 minutos observar si la muestra presenta o no coagulación. (4)
CULTIVO MICROBIOLOGICO.
MATERIALES.
 Muestra: Microorganismo problema procedente de un cultivo.
 Caja de Petri.
 Asas desechables.
 Guantes estériles.
 Marcador.
 Incubadora.
 Microscopio. (5)
METODOLOGIA.
1. Ponerse los guantes estériles.
2. Tomar caja de Petri y con el marcador, marcar dicha caja para diferenciar la muestra de las
demás.
3. Abrir caja de Petri donde se encuentra el cultivo del microorganismo problema.
4. Abrir caja de Petri donde se realizara la práctica y con un asa desechable tomar una muestra
del microorganismo.
5. Inocular la muestra en la caja de Petri en la que se realizara el cultivo haciendo de 4-5
estrías simples muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja.
6. Girar la caja de Petri en un cuarto de vuelta y continuar realizando las mismas estrías hechas
en el primer cuadrante. Realizar este proceso hasta acabar con los dos cuadrantes restantes.
7. Al finalizar tapar la caja de Petri donde se encuentra la muestra e incubarla a 35°C por 24
a 48 horas.
8. Pasado el tiempo de incubación, observar muestra bajo el microscopio. (5)
 RESULTADOS

PRUEBA DE COAGULASA: En el Laboratorio se llevo acabo la determinación de la coagulasa

en la cual se debia esperar un tiempo de 4 horas; con el fin de obtener los resultados de la prueba.
Se pudo observar que pasado este tiempo no se formo ningun coagulo los que nos indica que el
microorganismo de la coagulasa es negativo.

PRUEBA DE CATALASA: En la determinación realizada en el laboratorio de microbiología

sobre la catalasa se estimulo un tiempo de 2 a 3 minutos para llevar a cabo este procedimiento y
así evaluar la presencia de burbujas lo que nos indicaría que la prueba seria positiva.

Al dar por terminado el procedimiento no se obtuvo la presencia de burbujas lo que nos indica
que esta prueba fue totalmente negativa.

PRUEBA DE TINCION DE GRAM : en el laboratirio para obtener los resultados de la tincion

de gram se hizo a travez de un hemocultivo donde se vio evidenciado el crecimiento de bacterias
gram positivas, debido a factores como lo son el ambiente debido a la humedad, los cambios de
temperatura y también es importante que la presión de oxigeno sea la adecuada.

Estas pruebas dieron como resultado un color amarillento en sus colonias, lo cual nos indicara que
la prueba positiva ; Dando así la presencia de una bacteria estrectocucos aeruos
 ANALISIS DEL RESULTADOS DE LAS PRUEBAS.

PRUEBA DE COAGULASA: En esta prueba podemos analizar la coagulasa, esta se utiliza para
poner en evidencia la presencia de la enzima coagulasa , la cual tiene la propiedad de coagular el
plasma. Esta prueba se realiza a los cocos Gram positivos, catalasa positivos, permitiendo
distinguir las cepas de Staphylococcus aureus del resto de los estafilococos, ya que él es el único
microorganismo de importancia clínica que la produce. En este sentido, los miembros de la Familia
Staphylococaceae que dan esta prueba negativa son a menudo denominados Staphylococcus
coagulasa negativos.

Staphylococcus coagulasa negativa (SCN) se encuentran entre los microorganismos más

frecuentemente. Sin embargo, su significado clínico en muchas situaciones es difícil de establecer,
pues pueden ser comensales inofensivos o patógenos invasores. El protagonismo de este grupo de
bacterias como patógeno ha ido en aumento y se los ha asociado con el progreso de la tecnología
médica. Han sido reportados como agentes etiológicos de bacteriemias relacionadas a catéteres,
peritonitis asociadas a contaminación del catéter, infecciones en válvulas, endocarditis de válvulas
protésicas y nativas, infecciones asociadas al empleo de otros dispositivos protésicos, abscesos
superficiales, infecciones en piel y tejidos blandos, infecciones oftalmológicas post-quirúrgicas e
infecciones urinaria.

PRUEBA DE CATALASA: Esta prueba aplicada en el laboratorio se hizo a través de un un

método rápido y fácil para la diferenciación de streptococcus y staphylococcus.

Todas las especies de streptococcus son catalasa negativa y staphylococcus son catalasa positiva.
basándonos en los resultados obtenidos pudimos observar que esta prueba dio positiva debido a la
gran presencia de burbujas que fueron evidentes al hacer la prueba.

staphylococcus son catalasa positiva cualquier enfermedad infecciosa es el resultado de la

interacción entre el microorganismo causal y el huésped; en las catalasas podría funcionar
inactivando algunos sistemas de ingestión de los PMN.(9)

PRUEBA DE TINCION DE GRAM: analizando los resultados obtenidos en el laboratorio,

Esta prueba dio como resultado un color amarillento en sus colonias, lo cual nos indicara que la
prueba positiva ; Dando así la presencia de una bacteria estreptococos aeruos.(8)

El estreptococo es un tipo de bacteria. Existen varios tipos. Dos de ellos causan la mayoría de
infecciones por estreptococo en las personas:
Infección en la garganta: Una garganta irritada y adolorida. Sus amígdalas pueden estar
hinchadas y tener manchas blancas.
Escarlatina: Una enfermedad que ocurre después de la faringitis estreptocócica. Provoca una
erupción roja en el cuerpo.
Impétigo: Una infección en la piel Síndrome del shock tóxico.
 CONCLUSIÓN
Se pudo aprender que existen muchos tipos de bacterias con morfologías muy parecidas, como en
el caso de los cocos gram (+), las cuales algunas pueden ser patógenas y vivir en nuestro
organismo, donde ya pudimos hacer las identificaciones para poder diferenciar los diferentes tipos
de cocos.
En definitiva muchas bacterias son patógenas y originan numerosas enfermedades en los seres
humanos. En el caso de las cocos gram positivos son la causa de muchos casos de infecciones, tal
vez, la enfermedad bacteriana por cocos gram positivos más frecuente sea la caries dental. La placa
dental, una biopelícula que se adhiere a los dientes, crea un medio idóneo para el crecimiento de
distintas bacterias. Estas fermentan (descomponen) el azúcar que consumimos y producen ácidos
que con el tiempo pueden disolver el esmalte y producir cavidades. La caries es un buen ejemplo
de cómo múltiples factores contribuyen a desencadenar una enfermedad bacteriana. El cuerpo
humano alberga las bacterias, la dieta proporciona los azúcares y las bacterias producen el ácido
que daña los dientes. Otro coco gram positivos es el que origina una enfermedad muy peligrosa en
nuestro medio que es la neumonía.
 BIBLIOGRAFÍA
1. GUIA DE PRÁCTICAS LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA. (2019). Retrieved 5
September 2019, from https://www.udla.edu.ec/laboratorios/wp-
content/uploads/2015/05/ENF303_MICROBIOLOGÍA.pdf
2. 2.Retrieved 5 September 2019, from http://www.telmeds.org/wp-
content/uploads/2016/11/Tincion-de-Gram.pdf
3. Rodríguez, F. (2019). Prueba de la catalasa - Blog de Laboratorio Clínico y Biomédico.
Retrieved 6 September 2019, from https://www.franrzmn.com/prueba-de-la-catalasa/
4. Procedimientos en Microbiología Clínica Recomendaciones de la Sociedad Española de
Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. (2013). Retrieved 6 September 2019,
from
https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/s
eimc-procedimientomicrobiologia37.pdf
5. Manual de practicas. (2019). Retrieved 6 September 2019, from
http://www.uamenlinea.uam.mx/materiales/licenciatura/diversos/AQUIAHUATL_RAM
OS_MARIA_DE_LOS_ANGELES_Manual_de_practicas_de.pdf
6. 6.https://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-microbiologia-clinica-28-
articulo-metodos-identificacion-bacteriana-el-laboratorio-s0213005x11001571#bib0005.
7. guía de prácticas laboratorio de microbiología. (2019). retrieved 5 September 2019, from
https://www.udla.edu.ec/laboratorios/wp-
content/uploads/2015/05/enf303_microbiología.pdf
8. retrieved 5 September 2019, from http://www.telmeds.org/wp-
content/uploads/2016/11/tincion-de-gram.pdf
9. rodríguez, f. (2019). prueba de la catalasa - blog de laboratorio clínico y biomédico.
retrieved 6 septiembre 2019, from https://www.franrzmn.com/prueba-de-la-catalasa/
10. procedimientos en microbiología clínica recomendaciones de la sociedad española de
enfermedades infecciosas y microbiología clínica. (2013). retrieved 6 september 2019,
from
https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/s
eimc-procedimientomicrobiologia37.pdf
11. manual de prácticas. (2019). retrieved 6 septiembre 2019, from
http://www.uamenlinea.uam.mx/materiales/licenciatura/diversos/aquiahuatl_ramos_mari
a_de_los_angeles_manual_de_practicas_de.pdf