Capítulo 5.

Vacuolas en protozoos y plantas con tinción de rojo neutro

Introducción

Las vacuolas son estructuras celulares constituidas por una membrana y un contenido
interno, están presentes en el citoplasma de las células eucariotas y son parte del
sistema de endomembranas.

Vacuolas vegetales.

Las vacuolas son orgánulos multifuncionales esenciales para la viabilidad de las

células vegetales, en las que cumplen funciones metabólicas importantes como son:
Almacenan proteínas, aminoácidos e iones; mantienen la homeostasis citoplasmática;
secuestran toxinas, pigmentos y metabolitos; proporcionan un óptimo compartimento
ácido para enzimas hidrolíticas; y generan turgencia para la expansión de células. La
vacuola vegetal ocupa el 90 -95% del volumen de las células de plantas, además,
maximiza tanto la relación de superficie /volumen del citoplasma y el área de superficie
del citoplasma en contacto con el medio ambiente.

La célula vegetal adulta encierra una voluminosa vacuola separada del medio que la
rodea por una membrana llamada tonoplasto. Ésta membrana se comporta como una
membrana semipermeable con respecto a numerosas sustancias disueltas (cloruro
sódico, sacarosa). El tonoplasto es selectivamente permeable e interviene
especialmente en el mantenimiento de la turgencia celular y el crecimiento. En su
interior se encuentra una sustancia fluida de composición variable (agua, azúcares,
proteínas, grasas, entre otros), denominado jugo vacuolar. Figura 1.

Figura 1. Vacuola vegetal. http://issuu.com/cipresdecartagena/docs/practicas_pau

La luz de las vacuolas vegetales es mucho más ácido (pH 3 a 6) que el citosol (pH
7,5). La acidez de las vacuolas es mantenida por una bomba de protones impulsada
por ATP de clase V y por una bomba de protones de hidrólisis de pirofosfato que es
exclusiva de los vegetales. Estas dos bombas, ubicadas en la membrana vacuolar,
transportan iones H+ hacia la luz vacuolar en contra de un gradiente de concentración.
La membrana vacuolar también contiene canales de iónicos de cloro y nitrato (Cl- y
NO3- ) que transportan estos aniones desde el citosol hacia el interior de la vacuola. La
entrada de estos aniones en contra de sus gradientes de concentración es impulsada
por el potencial positivo interno generado por las bombas de H +.

El funcionamiento combinado de estas bombas de protones y canales de aniones

producen un potencial eléctrico positivo interno de alrededor de 20mV a través de la
membrana vacuolar y también de un gradiente de pH sustancial. El gradiente
electroquímico de protones a través de la membrana vacuolar de los vegetales es
utilizado para impulsar la incorporación o impulsar iones (Na+, Ca2+) y moléculas
pequeñas (sacarosa) por diversos antiportadores, por ejemplo un antiportador
protones/sacarosa en la membrana vacuolar funciona para acumular sacarosa en las
vacuolas vegetales.

El movimiento de sacarosa hacia dentro es impulsado por el movimiento de H+ hacia

afuera, lo que es favorecido por su gradiente de concentración (luz vacuolar ˃citosol) y
por el potencial citosólico negativo a través de la membrana vacuolar. En resumen,
estas bombas generan un pH luminal bajo, al igual que un potencial eléctrico interno
positivo a través de la membrana vacuolar, debido al bombeo de iones H+ hacia
dentro. El potencial interno positivo impulsa el movimiento de Cl- y NO3- desde el
citosol a través de proteínas canal y los antiportadores de protones impulsados por el
gradiente de H+ acumulan Na+, Ca2+ y sacarosa dentro de la vacuola. Figura 2.

Figura 2. Concentración de iones (pH) y sacarosa por la vacuola vegetal (Lodish,

2005).

A diferencia de las células animales, las células vegetales, de algas, hongos y de

bacterias están rodeados por una pared celular rígida. Debido a la pared celular, el
flujo osmótico de ingreso de agua que tiene lugar cuando estas células están situadas
en una solución hipotónica conduce a un incremento de la presión intracelular, pero no
del volumen de la célula. En las células de las plantas, la concentración de soluto
(azúcares y sales) suele ser más alto en la vacuola que en el citoplasma, que a su vez
tiene una concentración de soluto más alta que la del espacio extracelular. La presión
osmótica, llamada presión de turgencia, generada por la entrada de agua en el
citoplasma y luego en la vacuola, empuja al citosol y a la membrana plasmática contra
la resistente pared celular. La elongación de la célula durante el crecimiento tiene lugar
por una pérdida localizada, inducida por hormonas, de una región de la pared celular,
seguida por un flujo de agua hacia adentro de la vacuola, lo que incrementa su
tamaño.

Vacuolas en eucariotas unicelulares

La mayoría de los organismos unicelulares son microscópicos; debido a su tamaño las

células requieren de una superficie celular lo suficientemente grande en relación con el
volumen, para garantizar el intercambio de material necesario para su existencia.
Muchos eucariotas unicelulares relativamente grandes reducen este problema porque
contienen vacuolas de varios tipos rodeadas por membranas que aumentan la
superficie celular efectiva.
Para los organismos que viven en agua dulce, su citoplasma es hipertónico con
relación a su medio, por lo que se produce entrada de agua. Algunos eucariotas
unicelulares dulceacuícolas, como el Paramecio, resuelven la cuestión de la
hipertonicidad con vacuolas contráctiles, que excretan el exceso de agua que el
organismo absorbe constantemente por ósmosis.

La principal función de la vacuola contráctil es la osmoregulación. A pesar de que la

mayoría de los protozoarios no tienen una pared celular rígida, muchos contienen una
vacuola contráctil que les permite evitar la lisis osmótica. La vacuola contráctil toma
agua del citoplasma y a diferencia de la vacuola de las plantas, descarga
periódicamente su contenido a través de la fusión con la membrana plasmática. De
esta manera, aunque el agua entra continuamente en la célula protozoaria por el flujo
osmótico, la vacuola contráctil evita que se acumule demasiada agua en la célula y la
dilate hasta el punto de explosión.

La vacuola alimenticia es otra de las vacuolas importantes presentes en el Paramecio

y en otros eucariotas unicelulares. Estos organismos engloban alimento sólido por
endocitosis formando una vacuola en la que digieren el alimento, luego, unas
vesículas más pequeñas que contienen el alimento digerido se desprenden de la
vacuola alimenticia e ingresan en el citoplasma. Estas diminutas vesículas presentan
una gran superficie de intercambio, a través de la cual los productos de la digestión
pueden ser absorbidos por el resto de la célula. Figura 3.

El Paramecio ingiere alimento a través de una estructura oral o citostoma, la

acidificación de las vacuolas alimenticias colaboran con la digestión, al ser
alimentados con células de levaduras teñidas, por ejemplo con rojo congo (indicador
de pH), se forma una vacuola alimenticia alrededor de las células de levadura, el
cambio de color muestra que la vacuola se volvió ácida (rojo congo vira a verde a pH
ácido), ello colabora en la digestión de las células de levadura, a medida que los
productos de la digestión se mueven hacia el citosol, el pH aumenta en la vacuola, el
colorante vuelve a verse rojo (rojo a pH neutro a alcalino). Figura 3 a. El fundamento
de la tinción de las vacuolas con rojo neutro es similar al rojo congo. Figura 3b.
Figura 3. Vacuolas en protozoos. a. dibujo de un protozoario con sus partes
http://fortanete.cjb.net/paramecio_esquema.gif b. Microfotografía de vacuolas en
Protozoario con rojo neutro (rojo a pH por debajo de 6.8 y amarillo a pH de 8.0).

Tinción de las vacuolas con Rojo Neutro.

El rojo neutro (NR), 3-amino-7-dimetilamino-2-methylphenazine, se usa como una

tinción vital porque penetra en las células viables, se acumula en los lisosomas de
animales, en vacuolas de plantas y en células de hongos, ya que puede penetrar
fácilmente las membranas celulares (membrana plasmática y tonoplasto) por difusión
pasiva en su forma no protonada.

La acumulación del rojo neutro ocurre por entrampamiento de la forma protonada del
colorante dentro del ambiente ácido, es decir, el NR es un colorante catiónico débil
que penetra fácilmente y se acumula intracelularmente (el pH lisosomal o vacuola es
menor que el pH citoplásmica), en sitios aniónicos de la matriz lisosomal. Así mismo,
el rojo neutro se une a cargas ácidas fijas, tales como polisacáridos ácidos dentro de
la matriz del lisosoma o vacuola (interacción iónica entre el NR protonado con cargas
negativas).

El rojo neutro es conocido por teñir diversos compuestos debido a su afinidad para
estructuras lipófilas, sustancias fenólicas. El NR es un indicador de pH (rojo a pH por
debajo de 6.8 y amarillo a pH 8.0) y tiñe vacuolas alimenticias recién formado de un
rojo brillante, pero a medida que el proceso de digestión avanza, estas vacuolas se
enfrentará a un color amarillento que indica un cambio a un pH alcalino como la
digestión se lleva a cabo.

Objetivos
Identificar la vacuola como estructura celular y relacionarla con su función.
Aplicar técnicas de tinción que permitan la observación de la vacuola.

Materiales
* Materiales que debe traer el estudiante. Laboratorio
* Portaobjetos Microscopio
* Cubreobjetos Agujas disección
* Cuchilla Cajas de Petri
*bulbo de cebolla (Allium cepa) Pipeta pauster , papel filtro
*Vaselina Rojo neutro 0.01% en tampón fosfato
0.08M (pH=7.2) Vacuola de protozoos
Rojo neutro al 1% en tampón fosfato
(pH=7.4) Vacuola Vegetal
Polvo de carmín
Solución tampón fosfato 0.08M (pH=7.2)
Acetato de cobre 3% o sulfato de cobre al
1% (inmovilización de los protozoos)
Solución de NaCl al 6%
Aceite de inmersión
Cultivo de protozoos ciliados

Observaciones y preguntas

1. Tinción vacuola vegetal con rojo neutro (se tiñe de color Rojo debajo de pH 6.8
y de color amarillo a pH de 8.0)

Figura 4. Metodología de la tinción de la vacuola vegetal con rojo neutro.

En una caja de petri coloque aproximadamente 2 mililitros de la solución rojo neutro

tampón fosfato (pH 7.4). Tome un fragmento de la epidermis interior del bulbo de la
cebolla y sumérjalo inmediatamente en la solución anterior, deje actuar durante cinco
minutos.
Haga el montaje de la epidermis en el portaobjetos y colóquele el cubreobjetos.
Realice observaciones en el microscopio óptico. (Figura 4).

¿A qué se debe la gran extensión de la coloración de la célula tras la tinción con rojo
neutro? ¿De qué color observa la vacuola? ¿Este color se debe a cuál propiedad
química de la vacuola?
¿El medio externo es hipotónico o hipertónico en relación al jugo vacuolar para que la
célula absorba agua y la acumule en la vacuola?

¿Observa la célula en fenómeno de turgencia o plasmólisis?

Sustituya la solución rojo neutro tampón fosfato, por una solución de NaCl al 6%
depositando con ayuda de una pipeta unas gotas de dicha solución en el borde del
cubreobjetos de la preparación anterior, y con ayuda de un papel filtro en el lado
opuesto retire por capilaridad la solución rojo neutro. La solución salina reemplaza el
colorante y esto se puede apreciar porque se aclara el líquido de la preparación.

Observe la preparación al microscopio óptico

¿Cómo observa las vacuolas?

¿Observa la célula en fenómeno de turgencia o plasmólisis?

¿En este caso el medio externo es hipotónico o hipertónico con relación al jugo
vacuolar, para qué la célula elimine agua?

¿Qué función cumplen el tampón fosfato y el cloruro de sodio sobre el jugo vacuolar?

2. Tinción vacuola de protozoos con rojo neutro y polvo carmín

Con una micropipeta transfiera una gota de muestra del cultivo de protozoos sobre el
portaobjetos. Adicione una gota de rojo neutro 0.01% en tampón fosfato 0.08M (pH
7.2) y mezcle las dos gotas suavemente girando el portaobjetos. Adicione una gota de
acetato de cobre al 3% o sulfato de cobre al 1%. Aplique vaselina a los cuatro
extremos del cubreobjetos y coloque el cubreobjetos sobre la gota de la muestra que
está en el portaobjetos. Presione suave el cubreobjetos.

Observe el citoplasma teñido de rosa pálido. Las vacuolas se tiñen diferencialmente

según el pH de su contenido: las vacuolas ácidas (rojo) y las básicas (amarillo).
Esquematice lo observado en el microscopio óptico.

Polvo de carmín
Coloque una gota del cultivo de protozoos en un portaobjetos, con una miniespatula
transfiera un poco de polvo de carmín sobre la gota del cultivo de protozoos. Ponga el
cubreobjetos. Observe la formación y circulación de vacuolas alimenticias.

¿Qué funciones tiene la vacuola pulsátil y las digestivas en los protozoos?

¿Qué le sucede al protozoario si no regula contenido de agua?

Realice un dibujo del protozoo e indique las partes que observó.

Qué función cumplen y en qué organismos se encuentran las vacuolas gaseosas,

contráctiles, alimenticias y de reserva?

¿Cuáles son las funciones de la vacuola en la célula animal, en la vegetal y en

organismos unicelulares?

¿Defina qué es una solución hipotónica, isotónica e hipertónica?

Bibliografia
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Plant Cell Vacuoles: An Introduction