APLICACION de NANODROP en Proteinas y Peptidos

NOTA DE APLICACIÓN
Usando el NanoDrop One para cuantificar

Proteínas y Péptidos a 205 nm
Resumen
Los investigadores en ciencias de la vida siempre han necesitado formas de cuantificar rápidamente diversas
biomoléculas (por ejemplo, proteínas y preparaciones de ácido nucleico) como una parte rutinaria de sus flujos de
trabajo. Esta información ayuda a tomar decisiones informadas antes de continuar con los experimentos posteriores. Hay
muchos métodos de cuantificación de proteínas para elegir, incluyendo enfoques gravimétricos y ensayos colorimétricos,
las mediciones directas de UV espectrofotométricas y análisis de aminoácidos. Todos estos métodos tienen sus puntos
fuertes y débiles. Las mediciones espectrofotométricas UV directas son una opción de amplio uso ya que son fáciles de
realizar, no requieren reactivos o normas, y consumen muy poca muestra. El NanoDrop One tiene aplicaciones pre-
programados (Figura 2a) para la cuantificación directa de proteínas utilizando medidas de absorbancia a 280 nm y 205
nm.
Este artículo describe específicamente cómo utilizar la aplicación Protein A205 para cuantificar muestras de proteínas.
El método de proteínas A205 tiene algunas ventajas sobre el método directo A280. Tales ventajas incluyen
menor variabilidad (porque los coeficientes de extinción A205 no se basan en la composición aminoacídica) y más
sensibilidad (debido a la alta absortividad molar de las proteínas a 205 nm).
1b
1a Enlace peptídico
Aminoácidos
aromáticos
Figura 1. A205 mide la absorción del enlace peptídico (1 a) mientras que A280 mide los anillos aromáticos del triptófano y la tirosina (1
b). Es decir el valor del coeficiente de absorción molar para A280 es directamente proporcional al número de Triptófanos y Tirosinas
en la secuencia de la proteína.
El esqueleto de enlaces peptídicos de una proteína absorbe luz en
la región ultravioleta profundo (190 nm-220 nm). Sin embargo,
algunas limitaciones técnicas del pasado impedían realizar
mediciones fiables a 205 nm, tales como el desempeño del
espectrofotómetro frente a la luz parásita, linealidad en el UV
profundo y tampones para estabilización de proteínas que
contienen componentes con absorción UV.
La tecnología de retención de la muestra patentada de NanoDrop One y la reducida interferencia
de la luz parásita, han simplificado cuantificación de pequeñas cantidades de proteína a través de
métodos A205. Este artículo describe varios métodos A205 que se pueden utilizar para
cuantificar muestras de proteínas y presentar los datos de desempeño para los diversos
métodos en el NanoDrop One.
Aplicación A205 en NanoDrop One
La aplicación A205 de NanoDrop One permite al usuario elegir entre tres opciones diferentes de
coeficientes de extinción en función de su aplicación (figura 2c):
• ε205 = método 31
• método Scopes
• Método personalizable ε205 1 mg/ml
2a
2b 2c
Figura 2. Capturas de pantalla de NanoDrop One. 2a. Distribución del menú de acceso a
determinaciones de proteínas en NanoDrop One. 2b. Icono de acceso al método A205. 2c. Métodos
disponibles para medición con A205. Método Scopes y Método 31.
Usando el NanoDrop One para cuantificar Proteínas y Péptidos a 205 nm

Método 31. Estudios previos mostraron que la mayoría de
las soluciones de proteínas en 1 mg/ml tienen coeficientes
de extinción (ε205 1 mg/ml) que van desde 30 a 35. El ε205
de 31 mg ml-1 cm-1 es un coeficiente de extinción de uso
frecuente para los péptidos que carecen de residuos de
triptófano (trp) y tirosina (Tyr).
El método Scopes da una ε205 más precisa, especialmente para las proteínas que contienen
una cantidad significativa de triptófano (Trp) y tirosina (Tyr). El aumento de la precisión de
este método tiene en cuenta las cantidades significativas de absorbancia a 205 nm aportado
por las cadenas aromáticas laterales. Este método utiliza el índice A280/A205 en su
ecuación para corregir la absorbancia debida a las cadenas laterales Trp y Tyr.
Recientemente, Anthis y Clore propusieron el uso de un cálculo ε205 específico de secuencia,
que puede ser adaptado para una amplia gama de proteínas y peptidos. Este método es
apropiado para las preparaciones de proteínas purificadas o péptidos cuyas secuencias de
aminoácidos se conozcan previamente.
Se realizaron preparaciones a base de Polimixina , un antibiótico y

detergente catiónico con esqueleto peptídico, en un tampón 0,01 %
Brij 35 y posteriormente fue medido en NanoDrop one y en
paralelo en el espectrofotómetro de UV-Vis Evolution 300. Para
asegurar la validez de las medidas tomadas con el Evolution 300,
las preparaciones Polimixina se diluyeron en el tampón 0,01 %
Brij. La dilución de muestras asegura que las mediciones
realizadas estuvieran dentro del rango lineal del detector. Las
mediciones se realizaron en una cubeta de cuarzo de 10 mm.
Tabla 1. Se probaron varias preparaciones de Polimyxina en los espectrofotómetros

NanoDrop One y Evolution 300. Se midieron 5 réplicas de cada solución en el NanoDrop
One. Las soluciones con absorbancia superiores a 1.0A fueron diluidos y medidos por
triplicados en el Evolution 3000 usando una cubeta de cuarzo de 10 mm.

Figura 3. Concentraciones de Polimixina calculadas usando el Evolution 300 y el NanoDrop One. La regresión lineal
muestra una buena correlación.
Para evaluar las diferencias entre los distintos coeficientes de extinción utilizados a
205 nm (es decir, Scopes y ε205 = método 31) se realizaron diversas preparaciones
de albúmina de suero bovino (BSA ) y lisozima. Estas preparaciones se midieron en el
NanoDrop One usando las opciones de medición Scopes y ε205 = método 31.
Tabla 2. Concentraciones de Polimixina calculadas usando el Evolution 300 y el NanoDrop One. La regresión lineal
muestra una buena correlación.

Conclusiones
Para evaluar el rendimiento del espectrofotómetro NanoDrop One a A205, se compararon los
valores de concentración de Polimixina obtenidos en NanoDrop One contra el espectrofotometro
de sobremesa Evolution 300, que tiene un excelente rendimiento para luz difusa. La tabla 1
muestra que el NanoDrop arroja resultados consistentes entre mediciones repetidas en
205 nm con una desviación estándar menor a 0.04A
Además, los resultados obtenidos con ambos instrumentos fueron

comparables (Figura 3). La comparación entre el diferentes métodos
A205 muestra que el número de residuos de triptófano tiene un gran
efecto sobre la resultados de concentración (Tabla 2). Esto se debe a
que el triptófano es el mayor contribuyente a la absorbancia A280, y
el método que utiliza Scopes se vale de la relación A280/A205 para
corregir la absorbancia de la cadena lateral aromática en A205.
Nuestros resultados muestran que la cuantificación A205 usando el
205 = método31 da resultados comparables cuando proteínas tienen
sólo unos pocos residuos de triptófano.
Una limitación del método A205 es que muchos de los tampones

comúnmente se usan tienen absorbancia a 205 nm. Antes de utilizar
esta técnica, se recomienda la comprobación del tampón de
estabilización de proteínas para verificar cualquier contribución a la
absorbancia a 205 nm entre sus componentes.
NanoDropTM One
Referencias
1. Anthis, NJ and Clore, GM 2013. Sequence-
specific determination of protein and peptide
concentrations by absorbance at 205 nm. Protein
Science 22:851-858.
2. Goldfarb, AR, Saidel, LJ, Mosovich E 1951. The
ultraviolet absorption spectra of proteins. Journal of
Biological Chemistry 193(1):397-404.
3. Scopes, RK 1974. Measurement of protein by
spectrophotometry a 205 nm. Analytical
Biochemistry
C/Artesanos, 7. 28660 Boadilla - Madrid (Spain). Tel. +34 917280810; Fax +34 917294454 .
www.controltecnica.com. Correo [email protected]

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