Trabajo Practico Cuantificacion de Proteinas CT Laiño

Química Biológica
Ingeniería Química
Informe de Laboratorio N° 2
Docente: Dra. Alicia Irene Cuesta
JTP: MY Ars OIM Yanina Reynoso
Alumno: CT Int Valeria Alejandra Laiño
12 de octubre de 2021
INFORME DE LABORATORIO Nro 02
1.TÍTULO: Cuantificación de proteínas.
2. AUTOR/ES:
a. CT Valeria Alejandra Laiño
3. FILIACIÓN: COMISIÓN 1A
4. RESUMEN
a. Lectura del enunciado del trabajo a realizar, lectura de las medidas de

seguridad del laboratorio y breve explicación del marco teórico en el que se
enmarca la práctica a efectuar.
b. Se esterilizó todo la zona de trabajo y material a ser empleado.
c. Se efectuó la rotulación correspondiente de los tubos de ensayo y
preparación de las soluciones requeridas para la práctica.
d. Se registraron los resultados obtenidos en cada medición realizada con el
espectrofotómetro.
e. Se analizó el objetivo propuesto del trabajo con los resultados obtenidos
experimentalmente.
1. INTRODUCCIÓN
Las proteínas son macromoléculas complejas que desempeñan múltiples

funciones de gran importancia. Son compuestos constituidos por aminoácidos
unidos por enlaces peptídicos. Son moléculas de elevado peso molecular. Por su
composición se dividen en simples y conjugadas, y se producen por hidrolisis de
aminoácidos y otros componentes orgánicos e inorgánicos. Existen miles de
proteínas en nuestro organismo que desempeñan funciones específicas, ya sean
estructurales, transporte, protección, etc.
a. OBJETIVO
1. Aplicar el método de Biuret para la determinación cuantitativa de una

proteína.
2. Construir una gráfica de calibración.
3. Analizar y comparar los datos resultantes.
b. FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA
Las proteínas y péptidos reaccionan con iones de cobre en solución alcalina,

formando un quelato color malva de configuración desconocida. La intensidad de
color es directamente proporcional a la concentración de proteínas presente en la
muestra. Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu 2+ y los
grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. El Cu 2+ se acompleja con
4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de
proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que
pocas sustancias interfieren.
La determinación cuantitativa de proteínas mediante el método de Biuret se basa
en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+y los grupos NH de
los enlaces peptídicos en medio básico. 1 Cu2+se acompleja con 4 NH. La
intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de
proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de
manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy
baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados
muy concentrados. Este método es sencillo y su sensibilidad está dentro de un
rango de concentración del orden de miligramos. Determinar la concentración de
proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando
se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se
quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el
diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos.
Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos
métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber
luz en el UV, b) para la formación
de derivados químicos, o
c) la capacidad que tienen las
proteínas de unir ciertos
colorantes.
Absorbancia: Se define como la cantidad de intensidad de luz que puede
absorber una muestra. Una absorbancia experimental que se aproxima mucho a la
absorbancia verdadera se obtiene con la ecuación:
A=I solvente I solucion
Transmitancia: Se define como la fracción de luz incidente, a una longitud de

onda especificada, que pasa a través de una determinada muestra. Generalmente
está dada porcentualmente. La siguiente imagen representa la expresión
matemática de la transmitancia:
Donde Io es la intensidad del rayo incidente, e I es la intensidad de la luz

proveniente de la muestra. La transmitancia se relaciona con la absorbancia como:
1
A=
T
Espectrofotometría: Es la medida de la cantidad de energía radiante absorbida

por las moléculas de una muestra en función de las longitudes de onda
específicas. Los métodos espectroscópicos se basan en la capacidad de las
sustancias de absorber o emitir radiación electromagnética, y tales métodos se
pueden emplear para determinar la concentración de un reactivo o producto
durante una reacción.
El espectrofotómetro detecta la cantidad de “luz” transmitida y/o absorbida a través
de la solución en la celda y la compara con la que se transmite o absorbe a través
de una solución de referencia o “blanco”.
Ley de Beer-Lambert: Es un modelo matemático que se utiliza para expresar de

qué modo un determinado material, en el caso de la experiencia en el laboratorio
una muestra, absorbe la luz. En otras palabras, introduce el concepto de
absorbancia (A) en una muestra.
2. DESARROLLO EXPERIMENTAL
a) Se procede a preparar las soluciones a ser utilizadas en el ensayo,

realizando las mediciones de la gelatina y solución proteica manteniendo
la relación de proporciones establecida en la práctica, mediante el uso
de una balanza de precisión y de pipetas graduadas.
b) Se preparan los tubos de ensayo previamente rotulados con las
soluciones y reactivos en las proporciones correspondientes haciendo
uso de la micropipeta de acuerdo con la siguiente tabla para construir la
curva de calibración:
St (20mg/ml) Agua Biuret (Reactivo)
Blanco 0 200 μl 2 ml
1 50 μl 150 μl 2 ml
2 100 μl 100 μl 2 ml
3 150 μl 50 μl 2 ml
4 200 μl 0 2 ml
Nota: la cantidad utilizada es 154 mg de solución proteica en 7,7 ml de H 2O

destilada (se mantuvo la proporción establecida).
Blanco ST Muestra
Reactivo Biuret 2 ml 2 ml 2 ml
Agua destilada 200 μl 180 μl -
Estándar (20mg/ml) - 20μl -
Muestra - - 200 μl
c) Se procede a preparar los 3 tubos de ensayos rotulados como muestra,

patrón y blanco añadiendo en cada uno:
d) Se mezclan
agitando cada tubo
de ensayo y se dejan
incubar los mismos
durante unos 10
minutos a
temperatura ambiente. (El color del complejo proteico es estable al

menos por 1 hora).
e) Se enciende y se calibra el espectrofotómetro con una longitud de onda
de 550 nm (se calibra a través de la perilla y realizando la medición del
blanco como para ser tomado de referencia).
f) Se realiza la medición de la transmitancia y la absorbancia por

espectrofotometría, obteniéndose las siguientes mediciones:
Medidas 1 2 3 4 5 PROMEDIO
Blanco 0 0 0 0 0 0
Tubo 1 0,19 0,17 0,17 0,16 0,16 0,17
Tubo 2 0,15 0,14 0,14 0,14 0,14 0,142
Tubo 3 0,11 0,9 0,9 0,9 0,8 0,722
Tubo 4 NO TOMA EL APARATO
Estándar 0,32 0,30 0,32 0,29 0,30 0,306
Muestra 0,11 0,9 0,10 0,10 0,9 0,422
Resultados:
[Proteínas totales] = Absorbancia de la muestra X [patrón] /Absorbancia del patrón
Concentración
T1 A1 T2 A2 T3 A3 T4 A4 T5 A5
ppm
Blanco 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 0,455 0,19 0,72 0,17 0,77 0,17 0,77 0,16 0,80 0,16 0,80
2 0,909 0,15 0,82 0,14 0,85 0,14 0,85 0,14 0,85 0,14 0,85
3 1,364 0,11 0,96 0,9 0,05 0,9 0,05 0,9 0,05 0,80 0,10
4 1,818 NO SE PUDO OBTENER RESULTADOS
St 0,183 0,32 0,49 0,3 0,52 0,32 0,49 0,29 0,54 0,30 0,52
Muestr
4,369 0,11 0,96 0,9 0,05 0,1 1,00 0,1 1,00 0,90 0,05
a
d) Con los datos obtenidos procedemos a realizar la curva de calibración a través

de sistemas informáticos (Excel) y a calcular la concentración de la muestra.
Cálculo de la concentración de la muestra:
y = 0,1755 x +0,3438 y = Absorbancia = 0,422

x= Concentración de la muestra
0,422−0,3448 mg
x= =0,440
0,1755 mL
3. CONCLUSIONES:
 La cuantificación de proteínas con Espectrofotometría es un método

que usa la luz ultravioleta y la espectroscopía visible para determinar
de manera rápida la concentración de proteínas.
 La reacción o prueba de BIURET es un método que detecta la
presencia de compuestos con dos o más enlaces peptídicos y, por
tanto, sirve para todas las proteínas y péptidos cortos.
 El reactivo del biuret (sulfato de cobre en una base fuerte) reacciona
con los enlaces del péptido y cambia el color cuando entra en
contacto con otra sustancia, tornándose VIOLETA. Mientras más
cantidad de proteína esté presente en la solución, más oscuro es el
color, como se pudo observar en la coloración de los tubos de
ensayos luego de dejarlos reposar en aquellos donde se encontraba
presente la solución proteica.
 La practica no fue muy satisfactoria por problemas con el aparato de
espectrofotómetro. Como puede observarse en los resultados
obtenidos, aplicando el método, la curva de calibración para la
cuantificación de la muestra a partir de los espectros de absorción,
no coincide con lo esperado. Se observa esto en la dispersión de los
puntos respecto de la línea de tendencia. Sin embargo, a través de la
herramienta de Excel se puede hallar la curva y despejar la
concentración de la muestra con un margen importante de error,
debido a problemas con el instrumental.
4. REFERENCIAS
a. Química Biológica Antonio Blanco. Editorial El Ateneo 8va edición.

b. Apuntes dados en la catedra.

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JTP: MY Ars OIM Yanina Reynoso

Alumno: CT Int Valeria Alejandra Laiño

1.TÍTULO: Cuantificación de proteínas.

a. CT Valeria Alejandra Laiño

a. Lectura del enunciado del trabajo a realizar, lectura de las medidas de

Las proteínas son macromoléculas complejas que desempeñan múltiples

1. Aplicar el método de Biuret para la determinación cuantitativa de una

Las proteínas y péptidos reaccionan con iones de cobre en solución alcalina,

A=I solvente I solucion

Transmitancia: Se define como la fracción de luz incidente, a una longitud de

Donde Io es la intensidad del rayo incidente, e I es la intensidad de la luz

Espectrofotometría: Es la medida de la cantidad de energía radiante absorbida

Ley de Beer-Lambert: Es un modelo matemático que se utiliza para expresar de

a) Se procede a preparar las soluciones a ser utilizadas en el ensayo,

St (20mg/ml) Agua Biuret (Reactivo)

Nota: la cantidad utilizada es 154 mg de solución proteica en 7,7 ml de H 2O

Agua destilada 200 μl 180 μl -

Estándar (20mg/ml) - 20μl -

c) Se procede a preparar los 3 tubos de ensayos rotulados como muestra,

temperatura ambiente. (El color del complejo proteico es estable al

f) Se realiza la medición de la transmitancia y la absorbancia por

[Proteínas totales] = Absorbancia de la muestra X [patrón] /Absorbancia del patrón

d) Con los datos obtenidos procedemos a realizar la curva de calibración a través

y = 0,1755 x +0,3438 y = Absorbancia = 0,422

 La cuantificación de proteínas con Espectrofotometría es un método

a. Química Biológica Antonio Blanco. Editorial El Ateneo 8va edición.

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