“Año de la lucha contra la corrupción y la impunidad”

UNIVERSIDAD NACIONAL
MAYOR DE SAN MARCOS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE ANÁLISIS
INSTRUMENTAL
FACULTAD: QUÍMICA E INGENIERÍA QUIMICA
EAP: INGENIERÍA QUÍMICA

1.- Curso: Laboratorio de Análisis Instrumental

2.- Horario:

 Viernes 1:00 – 5:00 p.m.

3.- Asignación:

Informe N° 1: Análisis de Espectrofotometría Ultravioleta

“Análisis de nitratos en aguas”

4.- Profesor: Mg. Quím. De Lama Carrillo, Gerardo

5.- Fecha de entrega: 27 de septiembre del 2019

6.- Integrantes:
Zavala Rojas, Jair 16070144

Raymundo Panduro, Androw Marcelo 17070122

Ciudad Universitaria, 27 de septiembre del 2019

 1. Fundamento del Método de Análisis

La espectrofotometría es un método analítico que utiliza los efectos de la

interacción de las radiaciones electromagnéticas con la materia (átomos y
moléculas) para medir la absorción o la transmisión de luz por las sustancias.

La espectrofotometría se refiere a los métodos, cuantitativos, de análisis químico

que utilizan la luz para medir la concentración de las sustancias químicas. Se
conocen como métodos espectrofotométricos y, según sea la radiación utilizada,
como espectrofotometría de absorción visible (colorimetría), ultravioleta,
infrarroja

En espectroscopia el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación

electromagnética, sino también a las formas UV e IR, que son invisibles. En
espectrofotometría de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV
cercano, de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm).
La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm.

Es una región de energía muy alta. Provoca daño al ojo humano así como
quemadura común. Los compuestos con dobles enlaces aislados, triples
enlaces, enlaces peptídicos, sistemas aromáticos, grupos carbonilos y otros
heteroátomos tienen su máxima absorbancia en la región UV, por lo que ésta es
muy importante para la determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos
orgánicos. Diversos factores -como pH, concentración de sal y el disolvente- que
alteran la carga de las moléculas, provocan desplazamientos de los espectros
UV.

La fuente de radiación ultravioleta es una lámpara de deuterio.

En la región visible apreciamos el color visible de una solución y que corresponde

a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que
absorbe es el complementario del color que transmite.

Por tanto, para realizar mediciones de absorción es necesario utilizar la longitud

de onda en la que absorbe luz la solución coloreada.

La fuente de radiación visible suele ser una lámpara de tungsteno y no

proporciona suficiente energía por debajo de 320 nm.
 2. Descripción de la técnica empleada

Un espectrofotómetro es un instrumento que tiene la capacidad de manejar un

haz de Radiación Electromagnética (REM), comúnmente denominado Luz,
separándolo en facilitar la identificación, calificación y cuantificación de su
energía. Su eficiencia, resolución, sensibilidad y rango espectral, dependerán de
las variables de diseño y de la selección de los componentes ópticos que lo
conforman.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida. El color

de las sustancias se debe a que estas absorben ciertas longitudes de onda de la
luz blanca que incide sobre ellas, y sólo vemos aquellas longitudes de onda que
no fueron absorbidas.

El espectrofotómetro mide la absorbancia de una muestra en los espectros de

luz ultravioleta y visible (200 a 850 nm). El largo de onda es determinado por un
prisma que descompone el rayo de luz de acuerdo al largo de onda escogido.
Luego la luz pasa por una hendidura que determina la intensidad del haz. Este
haz atraviesa la muestra y llega a un tubo fotográfico, donde es medido. La
cantidad de luz que atraviesa la muestra es el porcentaje (%) de transmitancia.
Podemos usar esta unidad o cambiarla a absorbancia usando la siguiente
ecuación.
%T = - Log Abs.

El espectrofotómetro nos puede dar ambos valores a la misma vez, ahorrando la

necesidad de hacer los cálculos. (Transmitancia= cantidad de luz que atraviesa
la mezcla).

Una característica del instrumento es la necesidad de “blanquear” el aparato

antes de cada lectura. Esto se hace colocando una cubeta con una solución
control que tenga todos los componentes de la reacción menos la sustancia que
va a ser medida en el instrumento y ajustando la lectura a cero absorbancia.

El propósito de esto es eliminar el registro de absorbancia (background) que

puedan presentar los demás componentes de la reacción a ese largo de onda
particular. Todas las moléculas presentan absorbancia porque todas interfieren
con el paso de la luz. Sólo que la absorbancia será óptima a un largo de onda de
luz específico para cada tipo de sustancia.
  Componentes de un espectrofotómetro

La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en unos

aparatos llamados espectrofotómetros. Aunque pueden variar en diseño, en
especial con la incorporación de ordenadores para el análisis de datos, todos los
espectrofotómetros constan de las siguientes partes:

1. Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno.

2. Un monocromador para la selección de radiaciones de una

determinada longitud de onda: filtros, prismas, redes de difracción.

3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas

o tubos) que contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o
plástico transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo
o sílice fundido, porque el vidrio no transmite la radiación UV.

4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales

luminosas en señales eléctricas.

5. Un registrador o sistema de lectura de datos.

 Utilidad.
Los espectrofotómetros son útiles debido a la relación de la intensidad del color
en una muestra y su relación a la cantidad de soluto dentro de la muestra. Por
ejemplo, si usted utiliza una solución del colorante rojo del alimento en agua, y
mida la cantidad de luz azul absorbida cuando pasa a través de la solución, una
fluctuación mensurable del voltaje puede ser inducida en una fotocélula en el
lado opuesto.

Si ahora la solución del tinte rojo es diluida por la adición del agua el color será
menos intenso. Así, hay una relación entre el voltaje y la cantidad de tinte en la
muestra.

El espectrofotómetro tiene la capacidad de proyectar un haz de luz

monocromática (de una longitud de onda particular) a través de una muestra y
medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al
experimentador realizar dos funciones:

Nos da información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra. Esto

podemos lograrlo midiendo la absorbancia (Abs) a distintos largos de onda (l) y
graficar estos valores en función del largo de onda, formando un espectrograma.
Como cada sustancia tiene unas propiedades espectrales únicas, distintas
sustancias producen distintos espectrogramas. Esto se debe a que cada
sustancia tiene un arreglo de átomos tridimensional particular que hace que cada
sustancia tenga características únicas.

 Tipos de Espectrometría

Hay tres grandes tipos de métodos espectro-métricos para identificar los

elementos presentes en la materia y determinar sus concentraciones: La
espectrometría óptica, la espectrometría de masas y la espectrometría de rayos
X.

En la espectrometría óptica, los elementos presentes en una muestra se

convierten en átomos o iones elementales en estado gaseoso por medio de un
proceso denominado atomización. De esta manera se mide la absorción
ultravioleta/visible, la emisión o la fluorescencia de las especies atómicas en el
vapor. En la espectrometría de masas atómica, las muestras también se
atomizan, sin embargo, en este caso, los átomos en estado gaseoso se
convierten en iones positivos (generalmente con una única carga) y se separan
en función de su relación masa-carga. Los datos cuantitativos se obtienen por el
recuento de los iones separados. En la espectrometría de rayos X, se necesita
atomizar, ya que, para la mayoría de los elementos, los espectros de rayos X
son independientes de cómo se encuentren dichos elementos combinados
químicamente en una muestra.

 Espectrometría de absorción molecular

La espectroscopia de absorción molecular se basa en la medida de la
transmitancia T o de la absorbancia A de disoluciones que se encuentran en
cubetas transparentes que tienen un camino óptico de b cm. Normalmente, la
concentración c de un analito absorbente está relacionada linealmente con la
absorbancia como representa la ecuación

𝑷𝟎
𝑨 = −𝒍𝒐𝒈𝑻 = 𝒍𝒐𝒈 = 𝜺𝒃𝒄
𝑷
Todas las variables de esta ecuación se definen en la Tabla 13-1. Esta ecuación
es una representación matemática de la ley de Beer

 Fundamentos de la absorción molecular

Transmitancia y Absorbancia

Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io

incide perpendicularmente sobre una disolución de un compuesto químico que
absorbe luz o cromóforo, el compuesto absorberá una parte de la radiación
incidente (Ia) y dejará pasar el resto (It), de forma que se cumple: Io = Ia + It
La transmitancia (T) de una sustancia en solución es la relación entre la
cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la
muestra, It, y la cantidad de luz que incidió sobre ella, Io, y se representa
normalmente en tanto por ciento:

% T = It/Io x 100

La transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad incidente

y transmitida al pasar por la muestra. La relación entre %T y la concentración no
es lineal, pero asume una relación logarítmica inversa.

La absorbancia (A) es un concepto más relacionado con la muestra puesto que

nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el
logaritmo de 1/T, en consecuencia:

A = log 1/T = -log T = -log It/ Io.

Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia
es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de
onda, y entonces A vale log 1 = 0.

La cantidad de luz absorbida dependerá de la distancia que atraviesa la luz a

través de la solución del cromóforo y de la concentración de éste.
  Ley de Lambert-Beer

Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud
de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución:

A = log I/Io = ε·c·l

La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración

a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también
depende de la distancia que recorre la luz por la solución a igual concentración,
cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se
encontrará-; y por último, depende de ε, una constante de proporcionalidad -
denominada coeficiente de extinción- que es específica de cada cromóforo.
Como A es adimensional, las dimensiones de ε dependen de las de c y l. La
segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) se
hace, siempre que sea posible, en M, con lo que las dimensiones de ε resultan
ser M-1·cm-1. Este coeficiente así expresado, en términos de unidades de
concentración molar (o un submúltiplo apropiado), se denomina coeficiente de
extinción molar (εM). Cuando, por desconocerse el peso molecular del soluto, la
concentración de la disolución se expresa en otras unidades distintas de M, por
ejemplo g·L-1, las dimensiones de ε resultan ser distintas, por ejemplo g-1·L·cm-
1, y al coeficiente así expresado se denomina coeficiente de extinción específico
(εs).

La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c

altos, ε varía con la concentración, debido a fenómenos de dispersión de la luz,
agregación de moléculas, cambios del medio, etc.
3. Descripción detallada de los instrumentos o aparatos
usados
La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en unos
aparatos llamados espectrofotómetros. Aunque pueden variar en diseño, en
especial con la incorporación de ordenadores para el análisis de datos, todos los
espectrofotómetros constan, según se indica en la figura, de:

1. Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno.

2. Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada
longitud de onda: filtros, prismas, redes de difracción.
3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o
tubos) que contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico
transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o sílice
fundido, porque el vidrio no transmite la radiación UV.
4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas
en señales eléctricas.
5. Un registrador o sistema de lectura de datos.

Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz

y longitud de onda a la que se va a realizar la medida. Hay espectrofotómetros
de un solo haz (con una sola celdilla para alojar la cubeta con la muestra) y de
doble haz (con dos celdillas para dos cubetas); en nuestro caso se trabajará con
los de un solo haz.

Se mide primero la absorbancia del disolvente (conocido como blanco) y al que

se le asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando, de forma que la
intensidad incidente y transmitida sean iguales (Io = It), y por tanto la absorbancia
es cero. A continuación se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee
la absorbancia de ésta.
Obtención de un espectro de absorción

El espectro de absorción es una representación gráfica que indica cantidad de

luz absorbida (ε) a diferentes valores de λ. A partir de una solución diluida de un
compuesto, cuya absorbancia máxima entra dentro del rango de medida del
espectrofotómetro, se verá el valor de absorbancia a diferentes longitudes de
onda frente a un blanco que contenga el disolvente de la solución de la muestra
a caracterizar. A partir del espectro de absorción se obtendrá el valor de λ al que
el compuesto presenta la mayor absorbancia (λmax). Dicho λ se utilizará a la
hora de hacer determinaciones cualitativas y cuantitativas del compuesto.
El espectro de absorción de un cromóforo depende, fundamentalmente, de la
estructura química de la molécula.

No obstante, hay una gran cantidad de factores que originan variaciones en los
valores de λmax y εM, entre los que se incluye el pH, la polaridad del solvente o
moléculas vecinas y la orientación de los cromóforos vecinos; y cada uno afecta
de forma particular. Por ejemplo, variaciones originadas por cambios de pH son
debidas al efecto de éste sobre la ionización del compuesto. A continuación se
muestran como ejemplo los espectros de absorción de HNTS (un reactivo
empleado para la determinación de especies oxidantes) y comprobándose que
por espectrometría se puede seguir el efecto que ejercen
 4. CALCULOS DETALLADOS, TABLA DE RESULTADOS
Y TRATAMIENTO ESTADISTICO

Tabla N°1 de datos

Estandar de trabajo Alicuota de SPI (ml) HCl 1 N (ml) Volumen final con H2O (ml) Concentracion (mg/L) Lectura de Abosrbancia
Bk 0 1 50 0 -0.002
St-1 1 1 50 0.1 0.071
St-2 2 1 50 0.2 0.135
St-3 3 1 50 0.3 0.234
St-4 4 1 50 0.4 0.301
St-5 5 1 50 0.5 0.393

Grafica N°1 : Obtenida en Laboratorio

Tabla N°2: Absorbancia vs Concentración

Concentracion (mg/L) Lectura de Abosrbancia

0 -0.002
0.1 0.071
0.2 0.135
0.3 0.234
0.4 0.301
0.5 0.393

Grafica N°2: Grafica obtenida en Excel

Absorbancia Vs Concentracion
0.45

0.4

0.35

0.3

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
-0.05

Aplicando Mininos Cuadrados

x y xy x2
0 -0.002 0 0
0.1 0.071 0.0071 0.01
0.2 0.135 0.027 0.04
0.3 0.234 0.0702 0.09
0.4 0.301 0.1204 0.16
0.5 0.393 0.1965 0.25
Obtendríamos la siguiente ecuación de la recta:

𝑨𝒃𝒔 = 𝒎𝑪𝒎 + 𝒃
Sabiendo que:

∑𝒙∑𝒚
∑ 𝒙𝒚 −
𝒎= 𝒏
(∑ 𝒙)𝟐
∑ 𝒙𝟐 −
𝒏
𝟏. 𝟔𝟗𝟖
𝟏. 𝟓 −
𝒎= 𝟔
𝟐. 𝟐𝟓
𝟎. 𝟓𝟓 −
𝟔

𝒎 = 𝟔. 𝟗𝟓𝟒𝟐𝟖

Y determinando b de la siguiente manera:

∑𝒚 ∑𝒙
𝒃= −𝒎
𝒏 𝒏
𝟏. 𝟏𝟑𝟐 𝟏. 𝟓
𝒃= − (𝟔. 𝟗𝟓𝟒𝟐𝟖)
𝟔 𝟔

𝒃 = −𝟏. 𝟓𝟒𝟗𝟗

Obteniendo como resultado final:

𝑨𝒃𝒔 = (𝟔. 𝟗𝟓𝟒𝟐𝟖)𝑪𝒎 − 𝟏. 𝟓𝟒𝟗𝟗

 Tabla N°3 : Muestras de aguas

Lectura de
Muestra de agua Alícuota de la muestra HCl 1N (ml) Concentración (mg/L) Absorbancia

Cielo 10 1 0.249 0.201

Vida 2 1 0.141 0.108

San Mateo 49 1 -0.21 -0.193

Alameda 2 1 0.298 0.243

Grafica N°3: Absorbancia Vs Concentración

Absorbancia vs Concentracion
0.3

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0
0.249 0.141 -0.21 0.298
-0.05

-0.1

-0.15

-0.2

-0.25
 5. DISCUSION DEL METODO EMPLEADO

En esta experiencia todas las soluciones que se utilizaron para la medición de

sus concentraciones eran diluidas. Esto se debe a que la ley de Lambert-Beer
tiene limitaciones, la que solo es posible para soluciones diluidas ya que a
mayor concentración las interacciones que se dan entre los iones del analito
afectan en la absorción.
El método espectrofotométrico ultravioleta, no es un método específico para la
determinación de ion nitrato en agua y debe ser utilizado con los recaudos
necesarios. Este método presenta la dificultad de no ser adecuado para el
estudio de aguas contaminadas, es decir sólo es válida su aplicación para
muestras de agua con bajo contenido en materia orgánica.
El método es de mucha utilidad cuando el agua a analizar no cuenta con
mucha materia orgánica aunque aun así puede usarse para monitoreo de NO 3
- para aguas que presentan materia orgánica constante. Sin embargo, para
tener resultados más factibles se pudo haber hecho una segunda medición a
275 nm ya que el NO 3 - no absorbe a esta longitud de onda mientras que la
materia orgánica sí; pudiendo corregir los valores obtenidos a 249.0 nm.
Algunas posibles interferencias que pudieron existir fueron eliminadas por
acidificación de HCl 1N, tales como los carbonatos e hidróxidos. Aun asi hubo
algunas otras interferencias, ya que la longitud de onda máxima que obtuvimos
que fue 249.0 nm no coincidió con el teórico que es 220 nm.
 6. DISCUSION DEL RESULTADOS OBTENIDOS

La longitud de onda obtenida fue de 249.0 nm mientras que la teórica es de

220 nm encontrando un error de 13.2% (exceso), lo cual es un valor no muy
cercano al teórico pero fue suficiente para trabajar la experiencia. Este valor se
debió a la falta de conocimiento para controlar el software UV-PROBE, ya que
es un software multifuncional con muchos comandos, e hicimos unas
modificaciones extras que no aparecían en nuestra guía de pasos, para
obtener un resultado coherente en nuestra longitud de onda ya que al
comienzo nos salía un valor muy alejado del teórico.
Para la realización de la curva de calibración de los 5 pares de datos que se
tenía de concentración y absorbancia de los patrones solo se consideraron 3
puntos ya que los otros 3 puntos distorsionan la tendencia lineal ideal que
debe tener, con los 3 puntos escogidos se obtiene un coeficiente de relación de
1.
En la determinación del contenido de Nitrato en las muestras de agua mineral
se obtuvo que la concentración de nitratos en agua VIDA es mucho mayor que
la concentración del agua CIELO, obteniendo estos valores gracias a las
absorbancia obtenidas por el espectrofotómetro UV.
 7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

CONCLUSIONES
- Si se trabaja directamente con la solución madre habría mucho error por
trabaja con solución intermedia que es una solución diluida a partir de la
solución madre.
- Para la curva de calibración de patrones es a partir de la dilución de la
solución intermedia, ya que el instrumento es sensible.
- El blanco se utiliza para corregir (restar) las absorbancias de las
interferencias.
- Se añade HCl 1N para las interferencias que haber en el agua como
carbonatos e hidróxidos.
- En este equipo solo se cambia el contenido de la celda que tiene la
muestra, la otra celda contiene el blanco, esto hace que los resultados
sean más precisos.
- La técnica utilizada es solamente para seleccionar muestras con bajo
contenido de materia orgánica
- Los resultados obtenidos de la concentración de NO3-, N- son por
debajo de lo permitido de 50 ppm según la OMS. Por tanto de esto se
concluyó que el “Agua Vida “y el “Agua Cielo” son aptas para el
consumo humano

RECOMENDACIONES
- Se recomienda enrasar adecuadamente las fiolas de las soluciones
preparadas, ya que un error en el enrase provoca un error significativo
en los resultados obtenidos.
- Las celdas de cuarzo deben ser sostenidas por la parte opaca y deben
ser secadas correctamente para poder colocarlas en el
espectrofotómetro.
- Las soluciones para el análisis deben ser diluidas y no muy
concentradas.
- No olvidarse de siempre leer el blanco antes de leer la muestra
problema para corregir los errores de absorción de las sustancias ajenas
al analito.
- Se recomienda agitar vigorosamente los patrones y las muestras antes
de cada lectura de absorbancia con el fin de que el equipo lea
correctamente el valor de absorbancia
 8. BIBLIOGRAFIA

http://es.medwow.com/med/spectrophotometer/shimadzu/uv-1700-
pharmaspec/364.model-spec
Skoog Holler Nieman. (2001). Principios de Análisis Instrumental. 5ta edición.
Editorial Mc Graw Hill, pp. 350-360
Rubinson K. & Rubinson J. (2001). Análisis instrumental. 1ra edición. Madrid:
Pearson Educación, pp. 300-302
Walton H. & Reyes J. (1983). Análisis Químico e Instrumental Moderno. 1ra
edición. España: Editorial Reverté, pp. 180-182