Vicerrectorado de

INVESTIGACIÓN

Facultad de
Oceanografía, Pesquería, Ciencias Alimentarias y
Acuicultura

ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE MACROALGAS

ANTÁRTICAS (Himantothallus grandifolius y Desmarestia
confervoides) FRENTE A CEPAS DE Yersinia ruckeri, AISLADAS DE
TRUCHA ARCO IRIS (Oncorhynchus mykiss)

Tesis para optar el título profesional de Ingeniero Pesquero Acuicultor

AUTOR (A)
Benites Guardia, Carmen Rosario
ASESOR (A)
Figueroa Vargas Machuca, Manuel Eduardo
JURADO
Zambrano Cabanillas, Abel Walter
Mogollón Ávila, Santos Valentín
Moreno Garro, Víctor

Lima – Perú
2020
 DEDICATORIA

Es mi anhelo como modesto gesto de agradecimiento, dedicarle este trabajo de

investigación a mis padres, Robert y Rosa, a quienes debo sacrificio, amor y dedicación.

A mis hermanos, por formar parte de mi vida y hacerla caóticamente hermosa. Dedico y

dedicaré cada logro alcanzado a ustedes por cada pequeña lección recibida que me han

ayudado a cumplir mis objetivos.

A mi alma mater, la Universidad Nacional Federico Villarreal, por ser la institución que

me abrió las puertas y ser la impulsora de muchos grandes profesionales.

2
 AGRADECIMIENTOS

Al M.V. Pablo Londoñe Bailon y a la Ing. Claudia Cecilia Sánchez Robinet, por

haberme brindado la oportunidad de realizar esta investigación, quienes con sus

conocimientos, enseñanzas y colaboración permitieron el desarrollo de este trabajo.

Gracias a ellos por su dedicación y orientación, por cada consejo brindado que me

permitió desarrollarme no solo académicamente, sino también como persona.

Al Ing. Manuel Figueroa y a mis maestros de la Universidad por haber compartido

conmigo sus conocimientos. Gracias a aquellos maestros que me ayudaron a crecer

personalmente y gracias a sus enseñanzas hoy puedo sentirme orgullosa de mi casa

de estudios.

Al Instituto Tecnológico de la Producción; a la Dra. Susana Sirvas, responsable del

Laboratorio de Biotecnología. Un agradecimiento especial a todo el equipo del

laboratorio de Biotecnología y de Fisicoquímica. Gracias a todo el equipo en general

de las diferentes áreas del ITP.

A la Dra. Nieves Sandoval Chaupe, Responsable de la Sección de Ictiopatología del

Laboratorio de Histología, Embriología y Patología Veterinaria de la Facultad de

Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, por facilitar

una cepa de Yersinia ruckeri para el desarrollo de la presente investigación.

3
 Este trabajo fue realizado en el marco del proyecto de investigación “Actividad

antimicrobiana, antiviral, antiinflamatoria y anti-quorum sensing de macroalgas y líquenes

provenientes de la Estación Machu Picchu (Isla Rey Jorge - Antártida) en la búsqueda de nuevos

compuestos bioactivos” realizado en el Laboratorio de Biotecnología del Instituto Tecnológico

de la Producción (ITP) y la Dirección de Asuntos Antárticos del Ministerio de Relaciones del

Ministerio de Relaciones Exteriores

4
 ÍNDICE GENERAL

DEDICATORIA………………………………………………………………………II

AGRADECIMIENTOS…………………………………………………………...…III

ÍNDICE GENERAL……………………………………………………………..……V

ÍNDICE DE TABLAS………………………………………………………………..IX

ÍNDICE DE FIGURAS……………………………………………………………… XI

RESUMEN…………………………………………..………………………………XIV

ABSTRACT…………………………………………………………………………..XV

ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................. 9

ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................. 11

I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 16

1.1. Descripción y formulación del problema ....................................................... 17

1.2. Antecedentes................................................................................................. 21

1.3. Objetivos ...................................................................................................... 25

1.3.1. Objetivo General.................................................................................... 25

1.3.2. Objetivos específicos ............................................................................. 25

1.4. Justificación e importancia ............................................................................ 25

1.5. Hipótesis ....................................................................................................... 28

1.5.1. Hipótesis nula ........................................................................................ 28

1.5.2. Hipótesis alternante................................................................................ 28

II. MARCO TEÓRICO .......................................................................................... 29

2.1. Bases teóricas sobre el tema de investigación ................................................ 29

5
 2.1.1. Las algas ....................................................................................................... 29

2.1.1.1. Características........................................................................................ 29

Nutrición .......................................................................................................... 29

Reproducción ................................................................................................... 29

Estructura general............................................................................................. 30

2.1.1.2. Clasificación .......................................................................................... 30

2.1.1.2.1. Algas pardas (Phaeophyta) .............................................................. 31

2.1.1.3. Compuestos bioactivos en algas ............................................................. 37

2.1.1.3.1. Metabolitos secundarios en algas .................................................... 37

2.1.2. Análisis Fitoquímico ..................................................................................... 42

2.1.3. Extracción..................................................................................................... 42

2.1.3.1. Técnicas de extracción ........................................................................... 43

2.1.3.1.1. Extracciones convencionales con disolventes .................................. 44

2.1.3.1.2. Extracción asistida por ultrasonido.................................................. 47

2.1.4. Trucha arco iris ............................................................................................. 47

2.1.4.1. Clasificación Taxonómica ...................................................................... 48

2.1.4.2. Características generales ........................................................................ 48

2.1.4.3. Cultivo de truchas en el Perú .................................................................. 48

2.1.4.4. Enfermedades más comunes en el cultivo de truchas .............................. 50

Enfermedad Entérica de la Boca Roja ............................................................... 52

2.1.5. Yersinia ruckeri ............................................................................................ 53

2.1.5.1. Transmisión ........................................................................................... 54

2.1.5.2. Prevención y control .............................................................................. 55

III. MÉTODO ........................................................................................................... 57

6
 3.1. Tipo de investigación .................................................................................... 57

3.2. Ámbito temporal y espacial ........................................................................... 57

3.3. Variables ...................................................................................................... 57

3.4. Muestra......................................................................................................... 57

3.5. Instrumentos ................................................................................................. 58

3.5.1. Materiales .............................................................................................. 58

3.5.2. Equipos.................................................................................................. 59

3.5.3. Medios de cultivo .................................................................................. 60

3.5.4. Reactivos ............................................................................................... 60

3.6. Procedimientos ............................................................................................. 61

3.6.1. Recolección y pre-tratamiento de muestras algales ................................. 61

3.6.2. Tratamiento primario de muestra algales ................................................ 62

3.6.3. Análisis fitoquímico preliminar .............................................................. 62

3.6.4. Obtención de extractos naturales ............................................................ 63

3.6.5. Solubilización de extractos..................................................................... 66

3.6.6. Material biológico .................................................................................. 66

3.6.6.1. Características morfológicas de Y. ruckeri .......................................... 66

3.6.6.2. Producción de cepas de trabajo ........................................................... 67

3.6.6.3. Identificación del biotipo de las cepas de Y. ruckeri ............................ 67

3.6.6.4. Evaluación de sensibilidad a antibióticos ............................................ 67

3.6.7. Evaluación antibacteriana ...................................................................... 69

3.6.7.1. Preparación de inóculo bacteriano ...................................................... 69

3.6.7.2. Microdilución en caldo ....................................................................... 69

3.7. Análisis de datos ........................................................................................... 70

7
IV. RESULTADOS .................................................................................................. 71

4.1. Análisis fitoquímico preliminar ..................................................................... 71

4.2. Obtención de extractos naturales ................................................................... 72

4.3. Solubilización de extractos............................................................................ 75

4.4. Obtención y preservación de muestras bacterianas ........................................ 77

4.4.1. Características culturales de cepas de Y. ruckeri, (N1)............................ 77

4.4.2. Características culturales de cepas de Y. ruckeri, (R3). ........................... 77

4.4.3. Identificación del biotipo de las cepas de Y. ruckeri ............................... 78

4.4.4. Evaluación de sensibilidad a antibióticos ............................................... 79

4.4.5. Evaluación antibacteriana ...................................................................... 80

V. DISCUSIÓN ....................................................................................................... 85

VI. CONCLUSIONES ............................................................................................. 89

VII. RECOMENDACIONES .................................................................................... 90

VIII. REFERENCIAS .......................................................................................... 91

IX. ANEXOS .......................................................................................................... 107

8
 ÍNDICE DE TABLAS

Tabla1.
Diferenciación de grupos taxonómicos (Basado en Van den Hoeck et al., 1995) ......... 31
Tabla 2.
Clasificación taxonómica de H. grandifolius ............................................................... 32
Tabla 3.
Clasificación taxonómica de D. confervoides .............................................................. 35
Tabla 4.
Técnicas de extracción de algas .................................................................................. 43
Tabla 5.
Clasificación taxonómica de la trucha arco iris .......................................................... 48
Tabla 6.
Enfermedades más comunes en trucha arco iris .......................................................... 51
Tabla 7.
Clasificación Taxonómica de la Y. ruckeri .................................................................. 53
Tabla 8.
Reportes de Yersinia ruckeri en el Perú ...................................................................... 56
Tabla 9.
Condiciones de trabajo en el proceso de extracción con diclorometano para ambas
matrices ...................................................................................................................... 64
Tabla 10.
Condiciones de trabajo en el proceso de extracción con acetona para ambas matrices65
Tabla11.
Condiciones de trabajo en el proceso de extracción con metanol para ambas matrices.
................................................................................................................................... 65
Tabla 12.
Resumen de las extracciones secuenciales para ambas macroalgas ............................ 65
Tabla13.
Metabolitos secundarios presentes en H. grandifolius (H) y D. confervoides (D) ........ 71
Tabla14.
Extractos y precipitados obtenidos. ............................................................................. 72

9
Tabla15.
Rendimiento de extracción con los tres solventes utilizados para H. grandifolius ........ 72
Tabla16.
Rendimiento de extracción con los tres solventes utilizados para D. confervoides ....... 74
Tabla17.
Solubilidad de extractos. ............................................................................................. 75
Tabla 18.
Concentración de los extractos solubilizados para evaluación antibacteriana. ........... 76
Tabla 19.
Inhibición de los discos de antibióticos contra las cepas evaluadas ............................ 79
Tabla 20.
Parámetros de lectura de halos de inhibición y su interpretación ................................ 80
Tabla 21.
Resultado de los ensayos de la actividad antibacteriana de los extractos crudos
obtenidos de las macroalgas ....................................................................................... 81
Tabla 22.
Resultados de los ensayos de la actividad antibacteriana de los extractos crudos
metanólicos ................................................................................................................. 82
Tabla 23.
Resultados del porcentaje de inhibición de los extractos metanólicos frente a Y. ruckeri
(Biotipo 2)................................................................................................................... 82
Tabla 24.
Resultados del porcentaje de inhibición de los extractos metanólicos frente a Y. ruckeri
(Biotipo 1)................................................................................................................... 83
Tabla 25.
Solventes utilizados en la prueba de solubilidad del extracto acetonido de H.
grandifolius............................................................................................................... 112

10
 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. De izquierda a derecha: Algas rojas (Rhodophytas); Algas verdes

(Chlorophytas) y Algas pardas (Phaeophytas). ............................................ 31

Figura 2. Morfología de las Phaeophytas. ................................................................... 32

Figura 3.Morfología de H. grandifolius ...................................................................... 33

Figura 4. Talo muy joven, de unos mm de largo, con crecimiento tricotálico. ............. 34

Figura 5. Crecimiento de tipo tricotálico, visible en etapas jóvenes. ............................ 34

Figura 6. Crecimiento de tipo tricotálico ..................................................................... 36

Figura 7. Morfología de Desmarestia confervoides ..................................................... 36

Figura 8. Eventos en los cuales, los metabolitos secundarios se inducen durante la

respuesta de defensa. ................................................................................... 38

Figura 9. Estructuras químicas de terpenoides ............................................................ 39

Figura 10. Estructura química del fenol ...................................................................... 40

Figura 11. Estructuras químicas algunos alcaloides (compuestos nitrogenados) .......... 40

Figura 12. Esquema idealizado de una operación de extracción líquido-líquido. ......... 44

Figura 13. Esquema de la extracción; antes de la extracción (izquierda) y después de la

extracción (derecha). ................................................................................... 45

Figura 14. Dispositivo de extracción Soxhlet .............................................................. 46

Figura 15. Equipos experimentales utilizados para la extracción por ultrasonido......... 47

Figura 16. Crecimiento de la producción de trucha en el Perú. .................................... 49

Figura 17. Producción de trucha en el Perú (mayor a 500 toneladas por año) .............. 49

Figura 18. Producción de trucha en el Perú (menor a 500 toneladas/año) .................... 50

Figura 19. Signos externos. Oscurecimiento de la piel (a); boca roja (b); distención

abdominal (c); secreciones (d); exoftalmia (e). ............................................ 53

11
Figura 20. Prueba de tinción de Gram para Y. ruckeri. Visto bajo Microscopio. ......... 54

Figura 21. Recolección de muestras de macroalgas. .................................................... 61

Figura 23. D. confervoides ......................................................................................... 62

Figura 22. H. grandifolius ........................................................................................... 62

Figura 24. Proceso de obtención de extractos.............................................................. 63

Figura 26. Concentración de la muestra en rotaevaporador ......................................... 64

Figura 25. Proceso de filtración del extracto en solución. ........................................... 64

Figura 27. Caracterización cultural de cepas bacterianas. ............................................ 67

Figura 28. Diagrama de la evaluación de sensibilidad antibiótica ................................ 68

Figura 30. Siembra por extensión. .............................................................................. 70

Figura 29. Evaluación antibacteriana .......................................................................... 70

Figura 31. Extractos metanólicos de H. grandifolius. MH1 (a), MH2 (b) y MH3 (c) ... 73

Figura 32. Extractos metanólicos de D. confervoides. MD1 y MD2 ............................ 74

Figura 33. Extractos solubles en DMSO. DH (a), DD (b) y AD (c). ............................ 75

Figura 34. Extractos solubles en agua. MH1(a), MH2(b), MH3(c), MD1(d) y MD2(e) 76

Figura 35. Y. ruckeri en TSA, cultivo de 48 h............................................................. 77

Figura 36. Y. ruckeri en TSA, cultivo de 48 h............................................................. 77

Figura 37. R3 en TSA, cultivo de 48 h ........................................................................ 77

Figura 38. R3 en TSA, cultivo de 48 h ....................................................................... 77

Figura 39. Prueba de biotipo para la cepa N1. ............................................................. 78

Figura 40. Prueba de biotipo para la cepa R3. ............................................................. 78

Figura 41. Halos de inhibición .................................................................................... 79

Figura 43. Microdilución en placa .............................................................................. 80

Figura 42. Siembra por extensión ............................................................................... 80

Figura 44. Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB) ................ 81

12
Figura 45.Actividad antibacteriana de los extractos metanólicos con la cepa N1 (Biotipo

2), Y. ruckeri. .............................................................................................. 83

Figura 46. Actividad antibacteriana de los extractos metanólicos con la cepa R3

(Biotipo 1), Y. ruckeri. ................................................................................ 84

Figura 47. Pruebas de solubilidad para el extracto acetónico de H. grandifolius con

diferentes solventes. .................................................................................. 111

13
 RESUMEN

En el presente estudio se evaluó la actividad antibacteriana de extractos crudos obtenidos

a partir de las macroalgas antárticas Himantothallus grandifolius y Desmarestia
confervoides, frente a cepas de Yersinia ruckeri. Se realizó un análisis fitoquímico
preliminar de ambas macroalgas para determinar la presencia de metabolitos secundarios
asociados a la actividad antibacteriana. Posteriormente se realizaron extracciones sucesivas
biodirigidas mediante la técnica de extracción asistida por ultrasonido y agitación en shaker
utilizando tres solventes orgánicos (diclorometano, acetona y metanol) a razón de 1:3
masa/volumen. Cada extracto se evaluó frente a dos cepas bacterianas de Y. ruckeri, de
distinto biotipo (1 y 2) mediante el método de microdilución en caldo para determinar la
concentración mínima inhibitoria (CMI), la concentración mínima bactericida (CMB) y el
porcentaje de inhibición. Se obtuvieron 9 extractos, de los cuales, los diclorometánicos (2)
y acetónicos (2) no presentan actividad antibacteriana frente a las cepas de Y. ruckeri a
diferencia de los extractos metanólicos (5) que sí demostraron actividad antibacteriana. Los
extractos metanólicos de H. grandifolius presentaron mayor actividad antibacteriana, HG1
y HG3 (CMI = 48 mg/ml – 93,8% de inhibición, CMB = 96 mg/ml) en contraste de los
extractos metanólicos de D. confervoides (MIC = 96mg/ml – 98% de inhibición). De tal
forma que, se concluye que los extractos metanólicos de las dos macroalgas evaluadas si
presentan actividad antibacteriana frente a cepas de Y. ruckeri, lo cual estaría asociado a la
presencia de metabolitos secundarios, tales como: Flavonoides, Taninos, Fenoles y/o
lactonas.

Palabras clave: Extracto crudo, Himantotallus grandifolius, Desmarestia

confervoides, Antártida, actividad antibacteriana, Yersinia ruckeri.

14
 ABSTRACT

In the present study, the antibacterial activity of crude extracts obtained from the Antarctic
macroalgae Himantothallus grandifolius and Desmarestia confervoides, against strains of
Yersinia ruckeri was evaluated. A preliminary phytochemical analysis of both macroalgae was
performed to determine the presence of secondary metabolites associated with antibacterial
activity. Subsequently, successive biodirected extractions were performed using the technique of
ultrasonic assisted extraction and shaking using three organic solvents (dichloromethane, acetone
and methanol) at a ratio of 1: 3 mass/volume. Each crude extract was evaluated against two
bacterial strains of Y. ruckeri, of different biotype (1 and 2) by the broth microdilution method to
determine the minimum inhibitory concentration (MIC), the minimum bactericidal concentration
(CMB) and the percentage of inhibition. Nine crude extracts were obtained, dichloromethane (2)
and acetonic (2) do not show antibacterial activity against Y. ruckeri strains, unlike methanolic
extracts (5) that did demonstrate antibacterial activity. The methanolic extracts of H. grandifolius
had higher antibacterial activity, HG1 and HG3 (MIC = 48 mg/ml – 93,8% inhibition, CMB = 96
mg/ml) in contrast to the methanolic extracts of D. confervoides (MIC = 96 mg/ml - 98%
inhibition). Thus, it is concluded that the methanolic extracts of the two macroalgae evaluated
present antibacterial activity against Y. ruckeri strains, which would be associated with the
presence of secondary metabolites, such as: Flavonoids, Tannins, Phenols and/or Lactones.

Keywords: Crude extract, Himantotallus grandifolius, Desmarestia confervoides, Antarctica,

antibacterial activity, Yersinia ruckeri.

15
I. INTRODUCCIÓN
La actividad acuícola en el Perú se distribuye a lo largo del territorio nacional,

siendo diversas las especies que se producen: langostinos (Litopenaeus spp),

concha de abanico (Argopecten purpuratus) trucha (Oncorhynchus mykiss),

tilapia (Oreochromis spp) y algunos peces amazónicos. Según el Ministerio de

Producción (PRODUCE, 2018), el cultivo de trucha arco iris (54,6 % de la

producción total) presenta una mayor producción a nivel nacional, sin embargo,

también es uno de los sectores que mayores problemas ha presentado debido a la

presencia de enfermedades bacterianas como es el caso de la enfermedad entérica

de la boca roja (ERM, por sus siglas en ingles).

Esta enfermedad ocasiona una infección sistémica de curso agudo a crónico que

afecta a la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) prácticamente en todas las

etapas de su cultivo (Tobback et al., 2007), y cuyo agente etiológico es la bacteria

Yersinia ruckeri, (Austin y Austin, 2007).

Dentro de los métodos que se emplean para controlar esta enfermedad, se incluyen

el uso de antibióticos, los que, según su naturaleza, pueden eliminarse rápidamente

o permanecer activos por tiempos prolongados (Barattini, 2012). Estos fármacos

principalmente son suministrados a través de alimentos medicados y su uso

indiscriminado o excesivo, ha originado el desarrollo de resistencia por parte de

las comunidades bacterianas, lo que genera que las bacterias sean cada vez más

difíciles de tratar, requiriendo antibióticos en mayor cantidad o más potentes.

Por otro lado, no es posible cuantificar o vigilar la cantidad ingerida de

antibióticos consumidos como residuos en los alimentos de origen animal, lo que

puede causar problemas directos para la salud pública, tales como la anemia

aplásica, que está asociada con el cloranfenicol (FAO, 2019). Del mismo modo,

16
 también se genera una alteración de la flora intestinal y como consecuencia una

disminución de bacterias que compiten con microorganismos patógenos,

aumentando así el riesgo de enfermedad (Doyle, 2006). Lozano y Arias (2008)

mencionan que los residuos de antibióticos (penicilina, sulfonamidas y

estreptomicina) en alimentos pueden desencadenar reacciones alérgicas, causar

hipersensibilidad. Se han presentado casos de personas sensibles a la penicilina

con reacciones alérgicas debido al consumo de leche o carne contaminada (Doyle,

2006). En tal sentido, según lo expuesto anteriormente, se plantea realizar una

búsqueda de alternativas más saludables como remplazo a los antibióticos

sintéticos.

1.1. Descripción y formulación del problema

En la actualidad la presencia de patógenos causantes de enfermedades bacterianas es

uno de los problemas con mayor importancia en el sector acuícola. Blanco et al.,

(2004) señalan que las enfermedades infecciosas son la principal causa de pérdidas

económicas en acuicultura debido a la mortalidad de los animales, los costos de los

tratamientos y el descenso de la producción. La Facultad de Veterinaria de la

Universidad Complutense (España, 2004) indica que las pérdidas económicas causada

por la mortalidad de los peces debido a enfermedades infecciosas se estiman en un 10

% y que, en algunos casos, estas enfermedades pueden causar pérdidas superiores al

90 %. La Enfermedad Entérica de la Boca Roja (ERM) es una importante infección

que afecta principalmente a salmónidos, ocasionando una infección sistémica de curso

agudo a crónico que afecta a la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) prácticamente

en todas las etapas de su cultivo (Tobback et al., 2007), cuyo agente etiológico es la

bacteria Yersinia ruckeri, (Austin y Austin, 2007).

Los métodos que se emplean para controlar esta bacteria, además de otros agentes

patógenos, en los sistemas de producción acuícola incluyen el uso de antibióticos, los

que, según su naturaleza, pueden eliminarse rápidamente o permanecer activos por

17
 tiempos prolongados (Barattini, 2012). Estos fármacos principalmente son

suministrados a través de alimentos medicados y su uso indiscriminado o excesivo, ha

originado el desarrollo de resistencia por parte de las comunidades bacterianas. El

número de los medicamentos empleados en el sector acuícola a nivel mundial es

reducido (304 medicamentos autorizados para acuicultura) y más de la mitad

corresponden a vacunas (51 %), seguido de los antibióticos que ocupan el segundo

puesto (29 %). Por otro lado, la trucha arco iris es la principal especie producida en la

acuicultura continental a nivel mundial (99 %) y es la segunda especie a la que se

destinan más medicamentos en la acuicultura (20 %) (AQUA, 2019).

Muchas enfermedades bacterianas graves, tales como la ERM, se están volviendo más

difíciles de tratar, debido a la constante exposición de antibióticos frente a

comunidades bacterianas lo que conlleva a la aparición de cepas resistentes, por lo

tanto, requieren antibióticos más potentes, lo cual se ha convertido en un problema de

interés global.

Algunos medicamentos se emplean con fines terapéuticos y profilácticos para tratar o

prevenir infecciones, en estos casos, los antibióticos deben ser obligatoriamente

suministrados bajo el control de un profesional (Torres y Zarazaga, 2002). Por otro

lado, los antibióticos también son empleados como promotores del crecimiento o

inmunopotenciadores, sin embargo, la Unión Europea decidió eliminar aquellos

antibióticos utilizados como promotores debido a la diseminación de cepas resistentes

de alto nivel, posteriormente otros países como Chile, Turquía, Corea del Sur y

Estados Unidos, también prohibieron su uso, aunque fueron ampliamente utilizados

en el pasado. No obstante, Brasil, México y otros países de América Latina se siguen

utilizando los antibióticos como promotores de crecimiento (Revista NutriNews,

España, 2018). En Cuba, se emplean antibióticos como suplemento dietético y se

considera una estrategia prometedora para disminuir las pérdidas económicas por

enfermedades (Pérez et al., 2014). En el Perú existen diversos antibióticos autorizados

18
 para su uso como tratamiento, sin embargo, no existe registro de estudios sobre su uso

como promotores de crecimiento.

Generalmente se suministran los antibióticos a los peces a través del alimento, por lo

que la absorción del fármaco depende en gran medida del tipo de antibiótico utilizado.

Algunos antibióticos como los fenicoles (cloranfenicol y tianfenicol) tienen un

porcentaje de absorción mayor al 90 %, por lo que, la cantidad excretada a través de

las heces es muy baja. En contraste, otros antibióticos como la oxitetraciclina, tienen

porcentajes de absorción muy bajos en el intestino del pez, lo que genera un aumento

de su presencia en el medio acuático (Barattini, 2012).

Los antibióticos excretados por el pez más el alimento medicado no consumido, son

vertidos directamente al agua y/o al fondo del estanque de cultivo y como es de

esperar, en estos ambientes acuáticos coexisten numerosas especies de bacterias, que

son constituyentes de la microflora natural del agua. La acumulación de antibióticos

en el sedimento podría causar cambios en la biodiversidad bacteriana, alterando la

composición y diversidad de las comunidades del suelo (Varela y Alfaro, 2018) y lo

que es más importante, afectan a bacterias que cumplen un rol importante en los ciclos

bioquímicos del suelo, como, por ejemplo, la fijación de nitrógeno, lo cual afecta de

manera indirecta a las plantas.

Por otro lado, no es posible cuantificar o vigilar la cantidad ingerida de antibióticos

consumidos como residuos en los alimentos de origen animal, lo que puede causar

problemas directos para la salud pública, tales como la anemia aplásica, que está

asociada con el cloranfenicol (FAO, 2019). Del mismo modo, también se genera una

alteración de la flora intestinal y como consecuencia una disminución de bacterias que

compiten con microorganismos patógenos, aumentando así el riesgo de enfermedad

(Doyle, 2006). Lozano y Arias (2008) mencionan que los residuos de antibióticos

(penicilina, sulfonamidas y estreptomicina) en alimentos pueden desencadenar

reacciones alérgicas, causar hipersensibilidad. Se han presentado casos de personas

19
 sensibles a la penicilina con reacciones alérgicas debido al consumo de leche o carne

contaminada (Doyle, 2006).

A nivel mundial se ha originado una controversia en la utilización de antibióticos, en

vista de los riesgos asociados con los efectos directos e indirectos en la salud humana

por el consumo tanto activo como pasivo, lo cual ha dado lugar a prohibiciones del

uso de algunos antibióticos en la producción de alimentos de origen animal y al

establecimiento de límites máximos de residuos (LMR). En nuestro país, sobre la base

de la Ley de Inocuidad de los Alimentos, se planteó la NTS N° 120-MINSA/DIGESA-

V.01 “Norma Sanitaria que establece los Límites Máximos de Residuos (LMR) de

medicamentos veterinarios en alimentos de consumo humano” (MINSA/DIGESA,

2016).

Por esta razón, se busca alternativas más saludables utilizando sustancias de origen

natural. Los ambientes marinos han pasado por muchas etapas de evolución lo cual ha

definido y seleccionado diversas estrategias de supervivencia, defensa, ataque,

adaptación y comunicación entre los organismos que habitan en ella (Fernández,

2015). Siendo el caso de las macroalgas, quienes han desarrollado diversos

mecanismos de defensa ante situaciones de estrés, defensa contra predadores e

infecciones originadas por virus, hongos y bacterias, por lo cual han desarrollado un

carácter de inhibición de crecimiento contra otros organismos debido a que producen

metabolitos secundarios, como protección y autodefensa (Piñol y Palazon, 1993).

En tal sentido, se plantea aprovechar la producción de compuestos bioactivos de

macroalgas antárticas, que por las condiciones extremas del hábitat producen

metabolitos secundarios asociados a la disminución de epifitos, inhibiendo a

organismos competidores y patógenos microbianos (Vlachos, 1997).

20
 Formulación del problema

¿Presentan actividad antibacteriana los extractos crudos de las macroalgas antárticas

(Himantothallus grandifolius y Desmarestia confervoides) frente a cepas de Y.

ruckeri, aisladas de trucha arco iris (O. mykiss)?

1.2. Antecedentes

Los primeros estudios acerca de compuestos con actividad antibacteriana en

macroalgas fueron descritos por Shirahama (1942), quien investigó que Cystophyllum

hakodatense tenía efecto sobre Lactobacilus bulgaris y Lactobacilus helveticus. Pratt

(1951), encontró que algunos extractos crudos de macroalgas marinas solubles en éter

inhibían el crecimiento de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomonas

aeuruginosa. De manera similar Bruce y Duff (1967), encontraron actividad

antibacteriana en dos extractos acetonicos de Isochrysis galbana.

De Lara et al., (1996) investigaron la actividad antibacteriana de macroalgas marinas:

Chaetomorpha antennina, Cladophoropsis robusta, Codium gíraffa, Enteromorpha

intestínalis, Halimeda discoidea, Ulva sp, Caulerpa sertularioides, Caulerpa

racemosa, Amphiroa beauvoisii, Amphiroa mexicana, Rhodymenia pacifica, Hypnea

spinella, Jania tenella, Chnoospora mínima, Sargassum liebmannii, Padina

durvillaei, Padína gymnospora y Padina crispata. El extracto acetónico de J. tenella

(Rhodophyta) presentó mayor actividad, con halos de inhibición de 22 mm ± 0,8

contra S. aureus y de 18 mm ± 1,6 contra Streptococcus pyogenes. Los extractos de

C. antennina y E. intestinalis (Chlorophyta), A. beauvoisii, A. mexicana y H. spinella

(Rhodophyta), C. mínima, S. liebmannii y P. durvillaei (Phaeophyta), presentaron una

moderada actividad antibacteriana, debido a que sus halos de inhibición fluctuaron

entre 12 mm y 14 mm. Los autores mencionan que, las bacterias Gram (+) fueron más

susceptibles lo que coincide con lo reportado por Pesando y Caram (1984), Padmini

et al. (1988) y Campos et al. (1988), quienes sugieren que la diferencia de sensibilidad

21
 entre las bacterias Gram (+) y las bacterias Gram (-), se debe a la naturaleza química

de los extractos, confirmando la existencia de sustancias de origen algal con actividad

biológica que nos muestra el potencial que tienen las algas para ser estudiado.

Ríos et al., (2009) en la Universidad de los Andes, en Venezuela investigaron la

actividad antibacteriana y antifúngica de extractos de las algas marinas: Acanthophora

sp. Bryothamnion triquetrum, Gracilaria sp., Gelidium sp., Caulerpa mexicana,

Caulerpa sp., Caulerpa spp., Codium decorticatum, Halimeda incrassata, Ulva sp. y

Sargassum sp. La actividad antibiótica de los extractos crudo se evaluó mediante la

aparición de halos de inhibición contra S. aureus, P. aeruginosa, K. pneumoniae, y E.

coli. De los 33 extractos ensayados sólo 17 presentaron actividad antibacteriana (5 con

etanol, 6 con diclorometano y 6 con hexano), resultando activos 14 frente a Gram (-)

y 4 contra Gram (+). Las algas que mostraron actividad antibacteriana fueron:

Acanthophora sp., B. triquetrum, Gracilaria sp., Gelidium sp., C. mexicana, Caulerpa

sp., Caulerpa spp., H. incrassata, Ulva sp., C. decorticatum, Sargassum sp.

En México, Molina (2011) evaluó la capacidad inhibitoria de siete especies de

microalgas: I. galbana, Navicula incerta, Nitzschia laevis, Navicula byskanterae, la

Cepa 2B, Nitzschia frustulum var. perminuta y la Cepa 5B contra las bacterias

patógenas Vibrio alginolyticus, Vibrio campbellii y Vibrio harveyi. Para evaluar la

capacidad inhibitoria de los cultivos de microalgas se realizaron conteos de bacterias

heterotróficas en medio ZoBell y bacterias que crecen en medio TCBS (BTCBS). Las

especies I. galbana CCMP, N. incerta, N. byskanterae y la cepa 2B fueron más

eficientes para inhibir el crecimiento de bacterias tipo Vibrio.

Silva et al. (2013) investigaron la actividad antibacteriana de los extractos etanolicos,

metanolicos, hexanicos y acetonicos de las macroalgas Padina gymnospora, Hypnea

musciformes, Ulva fasciata y Caulerpa prolifera. Donde se utilizó el método de

22
 difusión en disco para evaluar el efecto antimicrobiano de las algas contra cepas patrón

de Vibrio parahaemolyticus, E. coli, S. aureus y P. aeruginosa. Resultando que los

extractos etanolicos de P. gymnospora y H. musciformes inhibieron todas las cepas

evaluadas. El extracto metanolico de U. fasciata inhibio el crecimiento de Vibrio

navarrensis.

Marín (2013) estudió la actividad antibacteriana, antiviral y citotóxica de extractos y

productos naturales de Codium amplivesiculatum, Codium simulans, Codium

cuneatum y Codium fragile. Las bacterias analizadas fueron: S. aureus (ATCC-BAA-

42), E. coli (ATCC- BAA-196) S. pyogenes (ATCC-BAA-946), V. parahaemolyticus

(ATCC17802), V. alginolyticus (ATCC-17749) y V. harveyi (ATCC-14126). Reportó

que se obtuvieron 7 fracciones activas contra S. aureus, 9 contra S. pyogenes, 9 contra

V. parahaemolyticus, 6 contra V. alginolyticus y 12 contra V. harveyi. Ninguna de las

fracciones mostró actividad contra E. coli.

Cortés et al. (2014) investigaron la actividad antimicrobiana de un extracto

diclorometánico y etanólico del alga roja Ceramium rubrum contra Y. ruckeri. La

prueba de inhibición bacteriana se realizó mediante el método de difusión en agar. Los

autores reportan que el extracto etanólico y diclorometanico inhibieron el crecimiento

de Y. ruckeri, sin embargo, la inhibición antibacteriana más alta se logró con el

extracto diclorometanico (14,7 mm).

Troncoso et al. (2015) evaluaron la actividad antibacteriana de los extractos crudos de

las macroalgas: Gracilaria chilensis, Lessonia spicata, Durvillaea antarctica y

Macrocystis pyrifera, Ulva rigida y Ulva lactuca, contra dos bacterias utilizando el

método de discos de difusión. Las algas marinas G. chilensis y M. pyrifera presentaron

inhibición del crecimiento bacteriano de E. coli y P. aeruginosa. La investigación

23
 permitió identificar compuestos con capacidad antibacterianos del extracto de M.

pyrifera.

Magallanes et al. (2003) realizaron una investigación sobre la actividad antibacteriana

de extractos etanólicos de 12 especies de macroalgas marinas: Grateloupia doryphora,

Rhodymenia flabellifolia, Gracilariopsis lemaneiformis, Prionitis decipiens,

Ahnfeltiopsis durvillaei, Porphyra columbina, Petalonia fascia, Desmarestia sp,

Bryopsis plumosa, Cryptopleura sp., Ulva nematoidea y M. pyrifera. Enfrentaron a

cada extracto crudo contra cepas bacterianas perteneciente a los géneros

Staphylococcus, Enterococcus, Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Aeromonas y

Vibrio. Los resultados obtenidos indican que de 12 especies de algas ensayadas

solamente 5 (G. doryphora, A. durvillaei, P. decipiens, P. fascia y B. plumosa)

presentaron algún efecto antibacteriano. Finalmente, los autores de la investigación,

mencionan que P. fascia es la especie con mayor espectro de actividad antibacteriana.

Parhuayo (2015) estudió el efecto inhibitorio de la microalga I. galbana (Haptophyta)

sobre bacterias tipo Vibrio spp., en la investigación se usaron extractos microalgas

obtenidos con n-butanol y metanol (0,1 y 0,5 g de pellet) para el test de sensibilidad,

donde se registraron halos de inhibición más grandes con metanol (0,5 g de pellet).

Quispe (2017) identificó bacterias nativas aisladas del tracto intestinal de trucha arco

iris y evaluó la actividad antibacteriana de Lactobacillus sp. y Bacillus sp. frente a una

cepa de Y. ruckeri. Los resultados obtenidos demostraron el potencial probiótico de

las bacterias aisladas.

A la actualidad, a nivel mundial existen numerosos estudios sobre la capacidad

antibacteriana de algunas macroalgas (aproximadamente 2297 artículos, según el

buscador académico ScienceDirect). Si hablamos específicamente de algas pardas, el

número de estudios es menor (1398 artículos). Ahora, si nos centramos en algas

24
 antárticas la cantidad de estudios aproximado es más pequeña (96) haciendo referencia

a cepas clínicas. Si hablamos de patógenos en peces el número de estudios disminuye

(25). Finalmente, ninguno de estos estudios implicó la búsqueda de compuestos

bioactivos de las algas antárticas Himantotallus grandifolius y Desmarestia

confervoides, y su posterior evaluación frente a patógenos de trucha arco iris.

1.3. Objetivos

1.3.1. Objetivo General

Evaluar la actividad antibacteriana de los extractos obtenidos de macroalgas antárticas H.

grandifolius y D. confervoides, frente a Y. ruckeri, aislada de trucha arco iris (O. mykiss)

1.3.2. Objetivos específicos

Determinar la concentración mínima inhibitoria (MIC) de los extractos obtenidos frente

a cepas de Y. ruckeri.

Determinar la concentración mínima bactericida (MCB) de los extractos obtenidos frente

a cepas de Y. ruckeri.

1.4. Justificación e importancia

La enfermedad entérica de la boca roja (ERM) es más prevalente en trucha arco iris,

sin embargo, Austin y Austin (2007) reportaron brotes en poblaciones de otros

salmónidos como Salmo trutta (trucha marrón), Salvelinus fontinalis (salvelino o

trucha fontana), Oncorhynchus tshawytscha (salmón real) y Oncorhynchus kisutch

(salmón coho). La mortalidad del cultivo de trucha arco iris causada por Y. ruckeri, es

variable, pudiendo ocasionar pérdidas de 0,1 – 0,5 % por día y de 0,5 a más de 5 %

por semana (Meir, 1986). En Estados Unidos, Austin y Austin (2007) estimaron que

la pérdida acumulativa de trucha arco iris a causa de este agente patógeno es de 30 –

35 % de la población durante cada brote de la enfermedad.

La actividad acuícola en el Perú se distribuye a lo largo del territorio nacional, siendo

diversas las especies que se producen: langostinos (Litopenaeus spp), concha de

25
 abanico (Argopecten purpuratus) trucha (Oncorhynchus mykiss), tilapia

(Oreochromis spp) y algunos peces amazónicos. Según el PRODUCE (2018), el

cultivo de trucha arco iris (54,6 % de la producción total) presenta una mayor

producción a nivel nacional, siendo Puno y Junín, los departamentos de mayor

producción. Sin embargo, en el departamento de Junín, Y. ruckeri fue aislada y descrita

por primera vez (Bravo y Kojagura, 2004). Posteriormente este agente patógeno se

registró en otras regiones del país, asimismo se han realizado diversos estudios sobre

la prevalencia, la patogenicidad, la transmisión de la enfermedad (Sierralta, 2011;

Sirvas et al., 2011; Sandoval, 2012; Alvarado, 2012; Flores, 2013; Mamani, 2016;

Quispe, 2017) y sensibilidad antibiótica (Temoche et al., 2017).

Si bien, todos estos estudios han contribuido al conocimiento de esta enfermedad, lo

cual ha permitido emplear algunos medicamentos para su control (quinolonas,

tiamulinas, sulfonamidas, oxitetraciclina y eritromicina, y antisépticos) (Bullock,

2004), cabe mencionar que: a) existe una gran demanda de antibióticos para la

prevención y tratamiento de enfermedades, b) uso inadecuado y excesivo de

antibióticos en la industria acuícola causando una disminución en la eficacia del

fármaco y en la resistencia bacteriana (Barattini, 2012), por lo que es necesario

emplear nuevas vías de solución frente a esta cepa bacteriana.

La resistencia bacteriana en peces se ha reportado en todas las áreas de la acuicultura,

tanto en aguas continentales como ambientes marinos (Dixon, 1994) y las nuevas

investigaciones sugieren la utilización de compuestos naturales como alternativa a los

antibióticos sintéticos. Actualmente, diversos estudios sobre compuestos bioactivos se

enfocan en organismos marinos, los cuales son considerados una importante fuente de

sustancias con potencial bioactivo (Magallanes et al., 2003).

Las interrelaciones de las algas con los organismos que comparten su hábitat, en

especial sus depredadores, han permitido el desarrollo de mecanismos de defensa

morfológicos y químicos para su protección (Díaz, 2002). Los principales compuestos

26
 bioactivos producidos por las algas están formados por una amplia gama de

metabolitos secundarios, cada uno con una función específica dentro de su medio.

Estos metabolitos también están asociados a la disminución de epífitos, inhibiendo a

los organismos competidores y patógenos microbianos (Vlachos et al., 1997).

En la actualidad, diversos metabolitos secundarios, tales como péptidos,

sesquiterpenos, ergosteroles, alcaloides, compuestos halogenados, entre otros, han

sido aislados de macroalgas, esponjas, cnidarios, holoturias y tunicados con la

finalidad de aprovechar su actividad antimicrobiana (Trujillo et al., 2014). Dentro de

estos compuestos destacan los péptidos antimicrobianos (PAM), proteínas de bajo

peso molecular que se sintetizan principalmente en tejidos epiteliales regularmente

expuestos al ataque microbiano, los cuales constituyen un medio rápido para combatir

una amplia variedad de bacterias, hongos, virus e incluso protozoarios (Montaño et

al., 2002). Las algas proporcionan una excelente fuente de compuestos bioactivos

como carotenoides, polisacáridos, proteínas, lípidos, ácidos grasos, pigmentos,

vitaminas, polifenoles, entre otras sustancias (Borowitzka, 2003), además, las algas

marinas tienen grandes propiedades antioxidantes, antivirales, antiinflamatorias y

antiparasitarias (Pelegrin y Ortega, 2008).

En el caso de las algas pardas, por ejemplo, producen una amplia variedad de

metabolitos secundarios, los cuales incluyen terpenoides, oxilipinas, florotaninos e

hidrocarburos volátiles, así mismo, producen metabolitos mixtos de origen terpeno-

aromático (Vlachos et al., 1997). Varios de estos compuestos ofrecen un amplio

espectro de actividades farmacológicas tales como: citotóxica, antimicrobiana,

antioxidante y como inhibidores de diferentes enzimas (Echavarría et al., 2009). Por

otra parte, en la Antártida, las macroalgas, crecen en ambientes extremos debido a la

temperatura y los cambios climáticos que afectan directamente a los organismos que

habitan en ella, generando la presencia de metabolitos secundarios con acción

antibiótica, como una estrategia de defensa contra la herbivoría (consumidores de

27
 plantas) y de ataque en contra de bacterias y hongos bastante resistentes presentes en

el medio (De Lara y Álvarez, 1995).

Por lo antes expuesto, se evalua la actividad antibacteriana de macroalgas antárticas

contra cepas de bacterias de importancia acuícola, como: Y. ruckeri. Para lo cual se

han escogido las macroalgas antárticas de las especies H. grandifolius y D.

confervoides.

1.5. Hipótesis

1.5.1. Hipótesis nula

Los extractos de las macroalgas antárticas H. grandifolius y D. confervoides no presentan

actividad antibacteriana frente a cepas de Y. ruckeri, aisladas de trucha arco iris (O.

mykiss)

1.5.2. Hipótesis alternante

Los extractos de las macroalgas antárticas H. grandifolius y D. confervoides presentan

actividad antibacteriana frente a cepas de Y. ruckeri, aisladas de trucha arco iris (O.

mykiss).

28
II. MARCO TEÓRICO

2.1. Bases teóricas sobre el tema de investigación

2.1.1. Las algas

El término algas incluye a macroalgas y un grupo altamente diversificado de

microorganismos conocidos como microalgas (Barsanti y Gualtieri, 2005)

Las algas constituyen un grupo de vegetales muy heterogéneos y de amplia distribución,

encontrándose en agua dulce o salada, en el suelo, sobre rocas, corteza de los árboles e

incluso en la nieve (Lindorf et al., 1991; Pérez et al., 1998). Algunas especies viven en

simbiosis con hongos, constituyendo a los líquenes, mientras que otras son simbiontes de

animales como corales y esponjas (Peña et al., 2005).

2.1.1.1. Características

Nutrición

La mayoría de los grupos de algas se consideran fotoautótrofos, es decir, dependen

completamente de su aparato fotosintético para su metabolismo, así como, del uso de la

luz solar como fuente de energía y el dióxido de carbono (CO2) para producir

carbohidratos y trifosfatos de adenosina (Lindorf et al., 1991; Pérez et al., 1998).

Sin embargo, existen ciertas especies de algas que necesitan obtener su nutrición

exclusivamente de fuentes externas; es decir, que son heterótrofos (osmotrofia es la

absorción de las sustancias disueltas). Existen estrategias nutricionales de las algas en un

espectro que combina fotoautotrofia y heterotrofía, esta capacidad se conoce como

mixotrofía (Barsanti y Gualtieri, 2005).

Reproducción

Los métodos de reproducción pueden ser asexual por división de una sola célula o

fragmentación de una colonia, o sexual por producción de esporas móviles o por unión

de gametos (Barsanti y Gualtieri, 2005).

29
 Estructura general

Las algas muestran un amplio rango de formas de vida y de complejidad de estructuras,

carecen de auténticas hojas, tallos y raíces como las de las plantas. Las partes aplanadas

del talo (como hojas) de muchas algas se denominan frondes. El cuerpo en su conjunto

es conocido como talo independientemente. El agua y los nutrientes, que están en contacto

directo con todo el talo, son absorbidos directamente a través de la superficie sin

necesidad de raíces. También en contraste con las hojas y los tallos de las plantas, el estipe

y el rizoide generalmente carecen de tejidos especializados en el transporte de agua y

nutrientes (Castro y Huber, 2007).

2.1.1.2.Clasificación

Su diferencia de formas ha permitido clasificar a las algas en diferentes grupos, de

acuerdo a sus características estructurales como tipo de célula, reproducción, nutrición,

entre otros (Peña et al., 2005). Se pueden clasificar en tres amplios grupos basándose en

su pigmentación: pardas (Phaeophytas), verdes (Chlorophytas) y rojas (Rhodophytas)

(Figura 1). Las algas pardas suelen ser grandes, por ejemplo, el cochayuyo presenta una

longitud que varía desde los 20 m, las algas gruesas y correosas varían de 2 a 4 m mientras

que algunas especies de menor tamaño presentan de 30 a 60 cm. Las algas rojas suelen

ser tener un tamaño menor, con una longitud de unos pocos centímetros a un metro

aproximadamente, pero no siempre son rojas, ya que a veces son de color púrpura o

incluso un rojo pardo, pero los botánicos las clasifican como Rodofitáceas (Tabla 1). Las

algas verdes son también pequeñas y su longitud es parecida a la de las rojas. Las

macroalgas se distinguen de las microalgas (Cyanophyceae) debido a que estas últimas

tienen un tamaño microscópico, frecuentemente unicelular y suelen llamarse algas azules-

verdes las cuales florecen a veces y contaminan los ríos y cursos de agua (FAO, 2014).

30
 Figura 1. De izquierda a derecha: Algas rojas (Rhodophytas); Algas verdes (Chlorophytas) y

Algas pardas (Phaeophytas).

Fuente: AlgaeBase (2019). Recuperado de http://www.algaebase.org/

Tabla1.

Diferenciación de grupos taxonómicos (Basado en Van den Hoeck et al., 1995)

División Tipo de pigmento Reserva Pared celular

Chlorophytas Clorofila a,b y carotenos Almidos, similiar a Celulosa, algunso

plantas terrestres grupos sílice

Phaeophytas Clorofila a, c y fucoxantina Manitol, laminaria Celulosa, ácido

alginico

Rhodophytas Clorofila a,d y ficoeritrina, Almidón de Celulosa, pectinas

fucozantina, carotenos florideas (algunas CaCO3)

Fuente: Peña et al., (2005).

2.1.1.2.1. Algas pardas (Phaeophyta)

Constituyen un grupo importante conformado por aproximadamente 1500 especies (Van

den Hoeck, 1995). Las algas pardas predominan en aguas frías, particularmente en el

hemisferio norte. Se fijan al sustrato mediante rizoides formando auténticos bosques o

praderas como las de Laminariaen el Atlántico o Macrocystis en el Pacífico. Poseen

formas filamentosas que alcanzan hasta 50 metros o más, su pared celular contiene ácido

31
 algínico y sales sulfatadas. Estos compuestos dan resistencia y flexibilidad a las algas, ya

que forman geles en matriz intercelular, ayudándoles a resistir las tenciones provocadas

por las olas y corrientes (Cubas, 2008).

Figura 2. Morfología de las Phaeophytas.

Fuente: Google imágenes (2019). Recuperado de https://es.123rf.com/photo_35254795

2.1.1.2.2. Himantothallus grandifolius

Tabla 2.

Clasificación taxonómica de H. grandifolius

Familia Desmarestiaceae

Genero Himantotallus

Nombre científico Himantotallus grandifolius, Zinova, 1959

32
 Figura 3.Morfología de H. grandifolius

Fuente: FAO (1985)

Morfología: Talo formado por hojas grandes, verde oliva, lanceoladas, no divididas que

surgen de manera opuesta (joven) o irregular (vieja) de un estípite aplanado corto y fuerte

(a menudo retorcido en espiral) fijado al sustrato por un soporte (rizoide). Las cuchillas

se adelgazan gradualmente hacia el estípite en sus bases y mueren en sus extremos

distales.

Estructura y crecimiento: La estructura es de tipo uniaxial. Una sección transversal

muestra una médula distintiva con un eje central y un filamento longitudinal, una corteza

con varias filas de células parenquimatosas y un meristodermo superficial de células

pigmentadas y pequeñas.

33
 Figura 4. Talo muy joven, de unos mm de
largo, con crecimiento tricotálico.

Fuente: FAO (1985)

Figura 5. Crecimiento de tipo tricotálico, visible en etapas jóvenes.

Fuente: FAO (1985)
Tamaño: Es la más grande de las algas antárticas, su talo alcanza hasta 10 m de longitud,

con cuchillas más grandes conocidas de 8 m de largo y 1 m de ancho.

Distribución geográfica: Endémica de la región antártica. Se encuentra en la península

Antártica, en la costa de la reina María, la costa de Adelia, la tierra de Wilkes, la tierra de

Victoria y el sur de Georgia.

Ecología: Se encuentran como grupos aislados en la zona infralitoral hasta 30 m de

profundidad.

34
2.1.1.2.3. Desmarestia confervoides

Tabla 3.

Clasificación taxonómica de D. confervoides

Familia Desmarestiaceae

Genero Desmarestia

Desmarestia confervoides

Nombre científico Ramírez y Peters 1993.

Desmarestia viridis var. distans

Sinónimo (s) heterotípico (s): JD Hooker 1846

Desmarestia willii, Reinsch 1890

Morfología: Talo de tamaño mediano, blando y flácido, que surge de un sujetador

pequeño, compacto y cónico. Su eje principal se bifurca a 4 o 5 órdenes, con tipo de

bifurcación opuesta. Todas las partes del talo son cilíndricas o ligeramente comprimidas.

Estructura y crecimiento: Estructura de tipo uniaxial. La sección transversal muestra un

gran filamento axial central rodeado por una célula pequeña e hifa, una corteza de células

parenquimatosas y una capa superficial de células pigmentadas pequeñas. Crecimiento de

tipo tricotálico. Los meristemas intercalares de las frondas jóvenes dan lugar a

ramificaciones deciduas pequeñas y coloreadas en una dirección y al tejido

parenquimatoso de la fronda en la dirección opuesta.

35
 Figura 7. Crecimiento de tipo tricotálico
Fuente: FAO (1985)

Figura 6. Morfología de Desmarestia confervoides

Fuente: FAO (1985)

36
 Tamaño: Talo que alcanza hasta 1 m de largo, con eje principal de 0,5 cm de diámetro

que se mantiene firme hasta unos 10 cm de ancho.

Distribución geográfica: Tierra del fuego, Georgia del sur, Tierra de Victoria y

Malvinas, Príncipe Eduardo, Islas Crozet y Auckland.

Ecología: Encontrado en grupos densos en la parte superior de la zona infralitoral hasta

unos 5 m de profundidad.

2.1.1.3. Compuestos bioactivos en algas

Los organismos marinos son considerados una importante fuente de sustancias bioactivas.

En términos generales, los compuestos bioactivos son aquellas sustancias que influyen en

la actividad celular y en los mecanismos fisiológicos y con efectos beneficiosos para la

salud. Estas sustancias químicas se encuentran en pequeñas cantidades en las plantas y

ciertos alimentos (como frutas, verduras, nueces, aceites y granos integrales). Los

compuestos bioactivos cumplen funciones en el cuerpo que pueden promover la buena

salud (Instituto Nacional del Cáncer, 2019).

Los principales compuestos bioactivos producidos por las algas están formados por una

amplia gama de metabolitos secundarios, cada una con una función específica dentro de

su medio, atribuyéndole entre otras funciones, la defensa química contra herbívoros

marinos (Magallanes et al., 2003).

2.1.1.3.1. Metabolitos secundarios en algas

Los metabolitos secundarios son aquellos que no se encuentran involucrados

directamente en procesos primarios como son la fotosíntesis, división celular o

reproducción de las algas, más bien este tipo de compuestos se caracterizan por ser

subproductos de rutas metabólicas normales que se sintetizan dependiendo de

condiciones externas tales como ataques de patógenos, predadores, cambios térmicos o

lumínicos, deficiencias nutricionales o presencia de otros organismos, obteniendo así una

gran variedad de metabolitos como son polisacáridos, ácidos grasos poliinsaturados,

37
 florotaninos y otros compuestos fenólicos y pigmentos como los carotenoides y

flavonoides (García et al., 2013).

Los metabolitos secundarios tienen una implicación ecológica como defensa contra

herbívoros, virus, hongos, bacterias, como sustancias alelopáticas, fitoalexinas o

disuasorios nutritivos (Bourgaud et al., 2001). Otros tienen una función fisiológica, por

ejemplo, los alcaloides, las pectinas que pueden servir para el transporte de nitrógeno

tóxico y compuestos de almacenamiento, mientras los compuestos fenólicos como los

flavonoides realizan una función como protectores de rayos ultravioletas (Wink, 2007).

Además, son una fuente importante de principios activos de medicamentos y de valiosos

productos químicos (Goossens et al., 2003).

Figura 8. Eventos en los cuales, los metabolitos secundarios se inducen durante la respuesta
de defensa.

Fuente: Sepúlveda, G. et al., (2003).

38
 Particularmente en las algas marinas se han encontrado grupos de metabolitos como:

diterpenos, eicosanoides, lecitinas, esteroles y alcaloides (Ospina et al., 1997). Además,

las algas pueden sintetizar una gran variedad de compuestos químicos, entre los que

podemos citar compuestos nitrogenados y disterpenos en algas verdes, terpenos

halogenados en las algas rojas y metabolitos mixtos de origen terpeno aromático en las

algas pardas (Magallanes et al., 2003).

En general, los metabolitos secundarios han sido incluidos en tres principales categorías

según sus rutas biosintéticas: terpenos, compuestos fenólicos y compuestos nitrogenados

(Chinou, 2008). Los terpenos se forman por la polimerización de unidades de isoprenos

y esteroides (Sarin, 2005) y se dividen en seis grupos: monoterpenos, sesquiterpenos,

diterpenos, triterpenos, tetraterpenos y esteroles, dentro de los cuales se encuentran

carotenos, glicósidos cardiotónicos, taxol, entre otros (Shilpa et al., 2010). Entre los

compuestos fenólicos se incluyen los ácidos fenólicos, cumarinas, flavonoides y taninos.

Los compuestos nitrogenados son principalmente los alcaloides y glucósidos

cianogénicos. Los alcaloides son un diverso grupo de compuestos con cerca de 4 000

estructuras conocidas. Estos son fisiológicamente activos en humanos (cocaína, nicotina,

morfina) y por supuesto de gran interés en la industria farmacológica (Sajc et al., 2000)

Figura 9. Estructuras químicas de terpenoides

39
 Figura 11. Estructura Figura 10. Estructuras químicas algunos alcaloides (compuestos
química del fenol nitrogenados)

Fuente: Pérez, N. (2009). Fuente: Pérez, N. (2009).

Terpenos

Los terpenos se forman por la polimerización de unidades de isoprenos y esteroides

(Sarin, 2005) y se dividen en seis grupos: monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos,

triterpenos, tetraterpenos y esteroles, dentro de los cuales se encuentran carotenos,

glicósidos cardiotónicos, taxol, entre otros (Shilpa et al., 2010).

Se sintetizan a partir de metabolitos primarios por dos rutas: la del ácido mevalónico,

activa en el citosol, en la que tres moléculas de acetil-CoA se condensan para formar

ácido mevalónico que reacciona hasta formar isopentenil difosfato (IPP), o bien la ruta

del metileritritol fosfato (MEP) que funciona en cloroplastos y genera también IPP

(Avalos et al., 2009).

Los monoterpenos tales como el mentol, que es un antimicrobiano, el citronelal, que es

un repelente de insectos y las piretrinas que funcionan como venenos del sistema nervioso

de los insectos, son componentes químicos con actividad biológica potencial durante la

respuesta de defensa de las plantas que los producen (Sepúlveda et al., 2004). Las lactonas

sesquiterpénicas son metabolitos secundarios que tienen actividades biológicas como

antiinflamatoria, antitumoral, citotóxica, antibacterial, antimalaria y actividad

neurotóxica y alérgica (Ruiz y Suarez, 2015).

40
 Compuestos fenólicos

Entre los compuestos fenólicos se incluyen los ácidos fenólicos, cumarinas, flavonoides

y taninos. Las aplicaciones farmacéuticas de estos compuestos son considerables, se

refieren sus efectos como analgésicos, antibacterianos, antihepatotóxicos, antioxidantes,

antitumorales, inmunoestimulantes, entre otras (Gurib, 2006). Los compuestos

nitrogenados son principalmente los alcaloides y glucósidos cianogénicos.

Existen dos rutas básicas implicadas en la biosíntesis de compuestos fenólicos: la ruta del

ácido siquímico y la ruta del ácido malónico. La ruta del ácido malónico es una fuente

importante de fenoles en hongos y bacterias, pero es poco empleada en plantas superiores.

La ruta del ácido siquímico es responsable de la biosíntesis de la mayoría de los

compuestos fenólicos de plantas. A partir de eritrosa-4-P y de ácido fosfoenolpirúvico se

inicia una secuencia de reacciones que conduce a la síntesis de ácido siquímico y,

derivados de éste, aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) (Avalos,

2009).

Las flavonas son estructuras fenólicas que contienen un grupo carbonilo. Constituyen la

familia más amplia de fenoles naturales. Su actividad frente a los microorganismos

probablemente se debe a que forman complejos con las proteínas solubles y extracelulares

y con las células de la pared bacteriana (Mantilla y Sanabria, 2016). Del mismo modo,

los isoflavonoides actúan como fitoalexinas, las cuales pueden ser definidas como

compuestos antimicrobianos de pequeño peso moléculas o metabolitos de estrés

biológico. Pueden ser constitutivos o también ser inducidos por ataque biológico o

heridas. Los constituyentes varían entre las especies y el habitad y distribución de la

planta. Este tipo de flavonoides inhiben la germinación de esporas de hongos y causan

daño a los sistemas de membrana (Mantilla y Sanabria, 2016).

Por otro lado, los taninos son sustancias de origen polifenólica, solubles en agua, alcohol

y acetona. Se han descrito más de 30 taninos que pueden inhibir hongos y bacterias

(Mantilla y Sanabria, 2016).

41
 Alcaloides

Los alcaloides son un diverso grupo de compuestos con cerca de 4 000 estructuras

conocidas. Estos son fisiológicamente activos en humanos (cocaína, nicotina, morfina) y

por supuesto de gran interés en la industria farmacológica (Sajc et al., 2000).

Se sintetizan normalmente a partir de lisina, tirosina y triptófano, aunque algunos como

la nicotina y compuestos relacionados derivan de la ornitina (Avalos, 2009), también se

pueden derivar de purinas y del acetato de los policétido (Sepúlveda, 2004).

2.1.2. Análisis Fitoquímico

El análisis fitoquímico comprende el estudio de metabolitos secundarios presentes en

especies vegetales, los cuales pueden ser fenoles y polifenoles, quinonas, flavonas y

flavonoides, taninos, cumarinas, terpenoides y aceites esenciales, alcaloides, lectinas y

polipéptidos, glucósidos y saponinas (Prashant et al., 2011).

Existen distintos métodos cualitativos para la detección preliminar de los diferentes

metabolitos secundarios que pueden encontrarse en las plantas, basados en la extracción

de estos mediante solventes orgánicos de diferentes polaridades y aplicando pruebas de

coloración (Gutiérrez et al., 2008; Colina, 2016).

Respecto a las pruebas cualitativas, estas son realizadas para identificar la presencia de el

o los tipos de metabolitos secundarios que presentan las plantas, cabe mencionar la prueba

de espuma en el caso de saponinas, la reacción de los flavonoides con el reactivo de

Shinoda, la reacción de los taninos con gelatina-cloruro de sodio, entre otros (Colina,

2016).

2.1.3. Extracción

La separación de un compuesto por extracción se basa en la transferencia selectiva del

compuesto (mezcla sólida o líquida) con otras sustancias (generalmente disolvente

orgánico) hacia una fase líquida. El éxito de la técnica depende básicamente de la

42
 diferencia de solubilidad en el disolvente de extracción entre el compuesto deseado y los

otros compuestos presentes en la mezcla inicial.

A lo largo del tiempo los principales métodos usados para realizar extracciones de algas

son extracciones convencionales con disolventes como es el caso de la extracción con

equipo Soxhlet y por medio del método de hidrólisis tanto alcalina como ácida (Michalak

y Chojnacka, 2014).

2.1.3.1. Técnicas de extracción

Tabla 4.

Técnicas de extracción de algas

TÉCNICA DE EXTRACCIÓN EJEMPLOS

Extracción con agua Homogenización

Ebullición

Autoclavado

Extracciones convencionales con Extracción liquido-liquido

disolventes Extracción sólido-liquido

Extracción en equipo Soxhlet

Hidrólisis ácida y alcalina Hidrólisis ácida y alcalina

Nuevas técnicas de extracción Extracción de fluidos supercríticos

Extracción asistida por ultrasonido

Extracción por microondas

Extracción liquida presurizada

Fuente: Michalak y Chojnacka (2014)

Hay parámetros (temperatura, incidencia de la luz del sol, humedad, entre otros) que se

deben tomar en cuenta al momento de conseguir los extractos, ya que esto tiene un efecto

significativo en el tipo y efectividad del extracto, lo que implica que a través de una

correcta extracción no se pierda la funcionalidad biológica de los compuestos (Ruiz et al.,

2016).

43
2.1.3.1.1. Extracciones convencionales con disolventes

Son las extracciones tradicionales donde se incluye a la extracción Soxhlet, extracción

líquido-líquido y la extracción sólido-líquido. Estas extracciones se caracterizan por el

uso de solventes orgánicos de diversas polaridades (diclorometano, éter de petróleo,

hexano, acetona, metanol, etanol) (Suasnavas, 2017). La extracción con disolventes,

consiste en poner en contacto el material vegetal con un disolvente capaz de solubilizar

las sustancias activas. Los compuestos activos deben pasar del material vegetal al

disolvente de manera que se obtenga un extracto líquido (con los compuestos activos

disueltos) y el material vegetal sobrante.

Extracción liquido-liquido

Es un procedimiento muy utilizado para separar compuestos disueltos o suspendidos en

fases acuosas. El procedimiento consiste en agitar la fase acuosa con un disolvente

orgánico inmiscible en agua y dejar separar ambas fases. Los solutos presentes se

distribuyen entre la fase acuosa y la fase orgánica, de acuerdo con sus solubilidades

relativas (Bernal, 2013)

Figura 12. Esquema idealizado de una operación de extracción líquido-líquido.

Fuente: Google imágenes (2019). Recuperado de

https://sites.google.com/site/bioseparacionesfluidofluido/intruccion

Extracción sólido-liquido

Es una operación básica o unitaria mediante la cual se separan uno o varios constituyentes

solubles contenidos en un sólido inerte mediante la utilización de un disolvente adecuado.

44
 Los factores más importantes que influyen sobre la velocidad de extracción son:

 Tamaño de las partículas sólidas: Evidentemente cuanto más pequeñas sean,

mayor es la superficie interfacial y más corta la longitud de los poros. Por tanto,

mayor es la velocidad de transferencia. Sin embargo, tamaños excesivamente

pequeños pueden hacer que las partículas se apelmacen dificultando la

extracción.

 Tipo de disolvente: El disolvente debe ser lo más selectivo posible y se

recomienda de baja viscosidad.

 Temperatura: Un aumento de la temperatura favorece la solubilidad y

aumentan los coeficientes de transferencia de materia. El límite superior se fija

atendiendo a criterios de calidad del producto, criterios económicos y de

seguridad con respecto al disolvente.

 Agitación del disolvente-soluto: Favorece la transferencia por aumento de

coeficientes de transferencia de materia en la interfase. Además, se evita la

sedimentación y apelmazamiento de las partículas sólidas.

Figura 13. Esquema de la extracción; antes de la extracción (izquierda) y después de la

extracción (derecha).

Fuente: Google imágenes (2019). Recuperado de

https://sites.google.com/site/bioseparacionesfluidofluido/intruccion

La regeneración del disolvente consiste, generalmente, en un proceso de

evaporación/destilación, en el cual se elimina parte del disolvente y queda una solución

concentrada de extracto como producto.

45
 Extracción en equipo Soxhlet

La extracción Soxhlet es la técnica de separación sólido-líquido comúnmente usada para

la determinación del contenido graso en muestras de diferente naturaleza. De igual modo,

puede ser usada como técnica preparativa de muestra como paso previo al análisis

mediante otra técnica instrumental, por ejemplo, la extracción de ácidos grasos en

muestras de tocino para su posterior determinación mediante cromatografía de gases.

La extracción Soxhlet se fundamenta en las siguientes etapas: 1) colocación del solvente

en un balón. 2) ebullición del solvente que se evapora hacia un condensador a reflujo. 3)

el condensado cae sobre un recipiente que contiene un cartucho poroso con la muestra en

su interior. 4) ascenso del nivel del solvente cubriendo el cartucho hasta un punto en que

se produce el reflujo retornando el solvente con el material extraído al balón. 5) Se vuelve

a producir este proceso la cantidad de veces necesaria para que la muestra quede agotada.

Lo extraído se va concentrando en el balón del solvente (Núñez, 2008).

Figura 14. Dispositivo de extracción Soxhlet

Fuente: Universidad Peruana del Oriente (2004). Recuperado de

https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/TAQ/curso0405/TAQP5_0405.pdf

46
 2.1.3.1.2. Extracción asistida por ultrasonido

La extracción asistida por ultrasonido, utiliza sonidos de alta frecuencia, con el fin de

desprender el compuesto buscado del material vegetal. Las partículas sólidas y liquidas

vibran y se aceleran ante la acción ultrasónica, como resultado el soluto pasa rápidamente

de la fase sólida al solvente (Gao y Liu, 2005). Cuando se utilizan materiales secos el

proceso de ultrasonicación facilita la rehidratación del tejido mediante la aperturación de

los poros, lo cual a su vez incrementa el transporte de masa de los constituyentes solubles

por difusión y procesos osmóticos (Vinatoru, 2001).

Figura 15. Equipos experimentales utilizados para la extracción por ultrasonido.

Fuente: Azuola, y Vargas (2007).

2.1.4. Trucha arco iris

La trucha arcoíris es originaria de los ríos y lagos de Norte América, al oeste de las

Montañas Rocosas, sin embargo, este pez ha sido introducido en el mundo entero debido

a su uso en la pesca deportiva y a su suculenta carne (Revista NAT GEO, 2010).

La trucha fue la primera especie en el desarrollo de la acuicultura peruana. En el año 1982

se inició la truchicultura con la importación de 50 000 ovas embrionadas procedentes de

los Estados Unidos, las cuales fueron destinadas a un criadero particular de la Oroya

(Godoy, 2002).

47
2.1.4.1. Clasificación Taxonómica

Tabla 5.

Clasificación taxonómica de la trucha arco iris

Reino Animalia

Phylum Chordata

Clase Actinopterygii

Orden Salmoniformes

Familia Salmonidae

Genero Oncorhynchus

Especie Oncorhynchus mykiss

Nombre común trucha arcoíris

2.1.4.2. Características generales

Cuerpo de forma alargada, fusiforme. Presenta una coloración azul a verde oliva sobre

una banda rosada a lo largo de la línea lateral y plateada por debajo de ella. La parte del

lomo, los costados, la cabeza y las aletas están cubiertas con pequeños puntos negros

(FAO, 2019). La coloración de la piel varía de acuerdo al ambiente en que habita, la edad

y el estado de madurez sexual. La denominación de trucha arco iris se debe a la presencia

de una franja de colores de diferentes tonalidades, predominantemente rojiza, sobre la

línea lateral en ambos lados del cuerpo (Mendoza y Palomino, 2004).

2.1.4.3. Cultivo de truchas en el Perú

La actividad de crianza de truchas en el Perú, viene creciendo vertiginosamente,

principalmente a nivel intensivo, identificando 02 sistemas de cultivo: en ambientes

convencionales (estanques de concreto, mampostería de piedra, tierra y otros) y no

convencionales (jaulas flotantes). Este último sistema ha logrado un mayor desarrollo, en

la Región Puno que cuenta con el 98 % de unidades productivas en jaulas flotantes.

48
 Para el 2012, el aporte de las Regiones de Puno y Junín constituyeron alrededor del 88,4

% de la producción nacional de truchas (Puno 18 471,2 TM/Año - Junín 3 412,53

TM/Año) (FONDEPES, 2014). En los últimos 10 años la producción nacional de truchas

en Perú aumentó 678 % al pasar de 6 997 toneladas en el 2007 a 54 424 toneladas en el

2017, según estadísticas de la Oficina de Estudios Económicos del Ministerio de la

Producción (PRODUCE) (GESTIÓN, 2018). De acuerdo a las proyecciones del

PRODUCE para el 2021 se alcanzará una producción de 78 mil toneladas.

PRODUCCIÓN DE TRUCHA
60000
50000
TONELADAS

40000
30000
20000
10000
0
2001

2004

2007

2010

2013
2000

2002
2003

2005
2006

2008
2009

2011
2012

2014
2015
2016
2017
2018
AÑO

Figura 16. Crecimiento de la producción de trucha en el Perú.

Fuente: Anuario estadístico pesquero y acuícola (PRODUCE) y revista gestión (2018).

Figura 17. Producción de trucha en el Perú (mayor a 500 toneladas por año)

Fuente: Anuario estadístico pesquero y acuícola (PRODUCE)

49
 Fuente: Anuario estadístico pesquero y acuícola (PRODUCE)

Figura 18. Producción de trucha en el Perú (menor a 500 toneladas/año)

2.1.4.4. Enfermedades más comunes en el cultivo de truchas

Las principales enfermedades en las truchas se pueden clasificar en los siguientes grupos

(tabla 6):

 Enfermedades causadas por virus

 Enfermedades causadas por bacterias

 Enfermedades por hongos

 Enfermedades por parásitos internos o externos.

En los departamentos de mayor producción (Puno y Junín), se han reportado agentes

etiológicos bacterianos y virales (Mamani, 2016), siendo las enfermedades bacterianas

las más predominantes (MAG, 2011). Las enfermedades bacterianas más comunes son:

la enfermedad entérica de la boca roja, la enfermedad bacteriana del riñón, forunculosis,

piscirickettsias, enfermedad del agua fría y septicemia hemorrágica bacteriana

(FONDEPES, 2014).

50
 Tabla 6.

Enfermedades más comunes en trucha arco iris

Grupos Especificaciones

1 Virales SHV - Septicemia Hemorrágica Viral

NPI - Necrosis Pancreática Infecciosa

NHI - Necrosis Hematopoyetica Infecciosa

2 Bacterianas Enfermedad Bacteriana del Riñón

Enfermedad Entérica de la Boca Roja

Forunculosis

Piscirickettsias

Enfermedad del agua fría

Septicemia Hemorrágica Bacteriana

3 Micoticas Ictiofoniasis (sistémica)

Saprolegniasis (Externa)

Branquiomicosis (Externa)

4 Parasitarias Protozoos Externos: Ich, Trichodina, Ichthyobodo,

etc.

Protozoos Internos: Enfermedad del Torneo

Metazoos

Fuente: FONDEPES (2014)

51
 Enfermedad Entérica de la Boca Roja

El agente etiológico es Y. ruckeri, un microorganismo de la familia de las

enterobacteriaceae. Perjudica principalmente a salmónidos de todas las edades, tanto

alevines como adultos. La Enfermedad Entérica de la Boca Roja o Yersiniosis, es una

infección sistémica de curso agudo a crónico que afecta principalmente a la trucha arco

iris (O. mykiss).

La fuente de infección de la Yersiniosis es básicamente el agua, infectándose los animales

a través de las branquias o del tracto gastrointestinal (Blanco et al., 2004). Los signos más

comunes de la infección son aletargamiento, oscurecimiento del dorso, marcada

exoftalmia, hemorragias subcutáneas e inflamación en las mandíbulas, opérculos, paladar

y base de las aletas (Tebbit et al., 1981; Chía, 1997). La aparición de un brote sucede

normalmente cuando las condiciones de calidad del agua no son óptimas. Esto se debe a

la relación que existe entre las situaciones de estrés (cambios de temperatura, oxígeno

disuelto, pH, etc.) y el posterior mal desempeño del sistema inmune de los peces en

cultivo, provocando un aumento en las tasas de infección por causa de patógenos (Muñoz,

2015).

En alevines la enfermedad se presenta de forma aguda, ocasionando la muerte casi sin

síntomas. En adultos puede manifestar de forma leve (letargia, oscurecimiento), y

pudiendo evolucionar a la forma crónica: se percibe exoftalmia y lo más característico,

una congestión de los vasos de la zona oral, y hemorragias en la boca, que en algunos

casos también se pueden observar en el opérculo branquial (Blanco et al., 2004).

El diagnóstico de esta enfermedad se centra en el aislamiento de Y. ruckeri a partir de

riñón, intestino posterior y fecas, sin embargo, en algunos casos también es posible su

aislamiento del cerebro, hígado y bazo (Chía, 1997). En el Perú, Y. ruckeri, fue aislado

por primera vez en el departamento de Junín (Bravo y Kojagura, 2004) (Tabla 8)

52
 a

Figura 19. Signos externos. Oscurecimiento de la piel (a); boca roja (b); distención abdominal
(c); secreciones (d); exoftalmia (e).
Fuente: Sirvas et al. (2011)

2.1.5. Yersinia ruckeri

Y. ruckeri es una enterobacteria (tabla 7) Gram (-) (figura 20), posee forma de bacilo

ligeramente curvo de 0,5 – 0,8 μm de diámetro y entre 1,0 – 3,0 μm de longitud (Bastardo,

2012). Aproximadamente el 80 % de las cepas aisladas muestran movilidad, presentando

7 u 8 flagelos en disposición perítrica, que está asociado principalmente con la

temperatura de incubación, dejando de funcionar a temperaturas inferiores a 9 º C y están

ausentes a 35 º C (Davies y Frerichs, 1989).

Clasificación taxonómica

Tabla 7.

Clasificación Taxonómica de la Y. ruckeri

Dominio Bacteria

Phylum Proteobacteria

Orden Enterobacteriales

Género Yersinia

Especie Yersinia ruckeri

53
 Figura 20. Prueba de tinción de Gram para Y. ruckeri. Visto bajo
Microscopio.
Fuente: Elaboración propia

Esta bacteria crece tanto en condiciones aérobicas como anaeróbicas en cualquier medio

primario enriquecido, dentro de un rango de pH entre 6,5 a 7,7, en un tiempo que va desde

las 12 a 96 horas, en agar de soya tripticasa (TSA) las colonias crecen, normalmente con

un diámetro de 1 a 2 mm, redondas, lisas, ligeramente convexas y con bordes completos

(Concha, 1998), diversos autores mencionan que su temperatura optima de crecimiento

es de 22 a 28 °C. Las cepas de Y. ruckeri pueden ser divididos en 2 biotipos, biotipo 1 y

2, basados en su capacidad de fermentar el sorbitol, hidrólisis del Tween 20 y Tween 80,

y en la motilidad (Tobback, 2009). La hidrólisis enzimática del Tween 80 se produce por

acción de una lipasa, que da lugar a la liberación de ácido oleico y sorbitol polioxietilado.

2.1.5.1. Transmisión

La principal forma de transmisión de Y. ruckeri es por vía horizontal, de pez a pez a través

del agua, es decir que los peces sanos son expuestos a bacterias que han sido eliminadas

en heces por peces enfermos o portadores asintomáticos (Sierralta, 2011). En la mayoría

de los casos, la infección se da a causa de las condiciones de estrés, habiéndose observado

de manera experimental que los peces enfermos transmiten la bacteria Y. ruckeri a peces

54
 clínicamente sanos cuando la temperatura del agua es mayor a 25º C (Hunter et al., 1980).

Glen et al. (2004) realizaron un estudio donde mencionan que la transmisión de esta

infección, también se da por vía vertical, de las hembras a los huevos.

Las aves, peces, crustáceos silvestres y algunos mamíferos como la rata almizclera

Ondatra zibethicus (Austin y Austin, 2007), también pueden comportarse como vectores

potenciales de esta enfermedad, transmitiendo el agente infeccioso a truchas y salmones

cultivados en agua dulce o salobre (Willumsen, 1989).

2.1.5.2. Prevención y control

El control de esta enfermedad generalmente ha sido mediante tratamientos con

antibióticos, los cuales son suministrados, normalmente, mediante alimentos. Aunque en

algunos casos pueden ser diluidos en el medio de cultivo (Abbass, 2010); sin embargo,

esta práctica presenta consecuencias negativas sobre el ambiente acuático, y

posteriormente generan problemas a nivel global.

Entre los antibióticos más utilizados frente a Y. ruckeri, están la oxitetraciclina y la

sulfametazina, las cuales e han usado de forma individual o combinadas, sin embargo, se

han reportado casos donde este último tratamiento no fue efectivo para la Yersinionisis,

por el contrario, se generó resistencia ante estos antibióticos (López, 2012). Otras

combinaciones evaluadas se han dado utilizando oxitetraciclina y sulfametazina con

trimetoprim y sulfonamida, ácido oxolínico y flofenicol (Navais, 2003). Si bien el uso de

antibióticos puede contribuir al control de la enfermedad, la constante exposición a las

bacterias a estas sustancias puede motivar la generación de cepas resistentes.

55
 Tabla 8.

Reportes de Yersinia ruckeri en el Perú

Lugar Autor

Junín Bravo y Kojagura, 2004. Fernández, 2011. Sierralta, 2011. López, 2012.

Bueno, 2012. Mateo, 2017.

Puno Sandoval, et al, (2016). Mamani, 2016. Quispe, 2017.

Huancavelica Flores, 2013

Lima Sirvas et al., 2011.Temoche, 2017.

Ancash Mesías, et al., (2019)

Amazonas Castro, et al., (2017)

Fuente: Elaboración propia

56
III. MÉTODO

3.1. Tipo de investigación

El presente estudio reúne las condiciones de una investigación experimental, a razón de

que se evaluaron los efectos producidos por la acción de variables independientes

(extractos a partir de macroalgas) sobre variables dependientes (cepas de diferentes

biotipos de Y. ruckeri).

3.2. Ámbito temporal y espacial

El desarrollo del presente estudio de investigación se llevó a cabo en el marco del

proyecto de investigación “Actividad antimicrobiana, antiviral, antiinflamatoria y anti-

quorum sensing de macroalgas y líquenes provenientes de la Estación Machu Picchu

(Isla Rey Jorge - Antártida) en la búsqueda de nuevos compuestos bioactivos”, en el

laboratorio de Biotecnología de la Dirección de Investigación, Desarrollo, Innovación y

Transferencia Tecnológica (DIDITT) del Instituto Tecnológico de la Producción (ITP),

ubicado en la Carretera camino a Ventanilla KM 5,2 Callao, durante el periodo de

noviembre del 2018 hasta junio del 2019.

3.3. Variables

Variables independientes: extractos a evaluar, obtenidos a partir de las macroalgas.

Variables dependientes: cepas de Y. ruckeri (Biotipo 1 y 2)

3.4. Muestra

Las muestras de macroalgas antárticas utilizadas en esta investigación fueron

proporcionadas por la Dirección de Asuntos Antárticos del Ministerio de Relaciones

Exteriores durante la Expedición Científica Peruana (ANTAR XXIV - 2018), en

coordinación con el Instituto Tecnológico de la Producción.

57
3.5. Instrumentos

3.5.1. Materiales

 Asa de Kolle

 Agua destilada

 Balón de 1000 ml

 Baguetas de vidrio

 Cuchara

 Espátula Drigalsky

 Embudos de vidrio

 Frasco de vidrio (100, 250, 500, 1000 ml)

 Gradilla para tubos Falcón de 50 ml

 Guantes de látex talla “S”

 Guardapolvo

 Hisopos estériles

 Ligas

 Marcador

 Mascarilla

 Micropipeta 0.5 – 10 μl

 Micropipeta 2 – 20 μl

 Micropipeta 20 – 200 μl

 Micropipeta 100 – 1000 μl

 Microtubos Eppendorf de 0,5, 1,5 y 2,0 ml estériles

 Papel filtro

 Papel Kraft

 Papel toalla

 Papel mantequilla

 Parafilm (Laboratory Film

58
  Patrón de turbidez de 0,5 de Mc Farland

 Pipeta Multicanal 200 μl

 Placas Petri tamaño de 90 mm x 150 mm

 Placas de 96 pocillos

 Rack para microtubo

 Soporte universal

 Soporte de aros con nuez

 Tips sin filtro de 10 μl, 200 μl y 1000 μl estériles

 Tips con filtro de 10 μl, 200 μl y 1000 μl estériles

 Toca

 Tubos de ensayo 100 mm x 13 mm

 Tubos de ensayo con tapa rosca

 Tubos Falcón de 50 ml estériles

 Vaso de precipitados de 100 ml, 250 ml, 600 ml y 1000 ml

 Viales de vidrio de 5 ml

3.5.2. Equipos

 Agitador orbital (TermoScientific)

 Autoclave (Yamato SM 510)

 Balanza analítica, precisión 0,01 mg (Ohaus DV 2014 C),

 Balanza de humedad (Sartorius MA35)

 Campana extractora de gases (The Baker Company, Noys)

 Cabina Workstation (ESCO)

 Centrífuga refrigerada (Eppendorf 5804R)

 Congeladora (Frigidaire)

 Estufa de secado (Memmert, Elds)

 Incubadora (Binder)

 Incubadora (MMM group)

59
  Lector de placas (Bioteck PowerWave XS)

 Mechero Bunsen

 Microscopio (Olympus SC50)

 Molino de cuchillas (Retsch ZM 200)

 Licuadora – blender (Waring)

 Refrigeradora (Frigidaire)

 Rotaevaporador (Heidolph, modelo Laborata 4003)

 Selladora al vacío (Multivac C 100)

 Sonicador (Symphony VWR)

3.5.3. Medios de cultivo

 Agar tripticasa soya (TSA)

 Tryptic Soy Broth (TSB)

 Agar

3.5.4. Reactivos

 Aceite de inmersión

 Alcohol de 70°

 Glicerol

 Peptona

 Reactivos para gram (Cristal violeta, safranina, lugol, alcohol acetona)

 Cloruro de calcio (CaCl2)

 Tween 80

 Tween 20

 Solución salina al 0,85 %

 Dimetilsolfoxido (DMSO)

 Diclorometano (CH2Cl2)

 Acetona (C3H6O)

 Metanol (CH3OH).

60
  Discos antibióticos:

Sulphamethoxazole/ trimethoprim 19:1 (SXT)

Florfenicol 30 μg (FFC)

Oxytetracyclina 30 μg (OT)

Gentamicina 10 μg (GM)

Amoxycilina 10 μg (AM)

3.6. Procedimientos

3.6.1. Recolección y pre-tratamiento de muestras algales

Las muestras de macroalgas (D. confervoides y H. grandifolius) fueron recolectadas por

el Instituto Tecnológico de la Producción en los alrededores de la Estación Científica

Machu Picchu en la Isla Rey Jorge, Antártida, (62°05'27"S, 58°28'12"W) durante la

Expedición Científica Peruana (ANTAR XXIV) de enero a marzo del 2018. Las muestras

recolectadas fueron lavadas con agua destilada. Luego fueron secadas en una estufa a 40°

C, se realizó una premolienda y se empaquetaron al vació. Finalmente, las muestras

fueron trasladas al ITP.

Figura 21. Recolección de muestras de macroalgas.

Fuente: Proyecto ANTAR XXIV (2018)

61
 Figura 23. H. grandifolius
Fuente: Proyecto ANTAR XXIV (2018)

Figura 22. D. confervoides

Fuente: Proyecto ANTAR XXIV (2018)

3.6.2. Tratamiento primario de muestra algales

Las muestras secas (premolidas) se volvieron a moler en un molino de laboratorio a 16000

revoluciones por minuto (rpm). El material obtenido se pesó y almacenó al vacío en

congelación.

3.6.3. Análisis fitoquímico preliminar

Las muestras secas y molidas (25 g de cada matriz) se sometieron a extracción asistida

por ultrasonido con metanol (125 ml) en una relación de peso/volumen de 1:5. El extracto

fue filtrado y llevado a ensayo fitoquímico.

El rendimiento de extracción (η) para cada solvente se calculó de la siguiente manera:

(η%) = (solubilizado(obtenido)) /biomasa(proporcionada)) × 100.

62
 El solubilizado(obtenido) (en gramos de peso seco) es la cantidad de material extraído de

la biomasa con los diferentes solventes y la biomasa(proporcionada) es la cantidad de

biomasa (en gramos) utilizada para realizar la extracción (Álvarez y Félix, 2016).

Figura 24. Proceso de obtención de extractos

Fuente: Elaboración propia

En el anexo 3 se detallan las pruebas cualitativas, que fueron realizadas por el Centro de

Control Analítico (CCA) de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UNMSM.

3.6.4. Obtención de extractos naturales

Las algas secas y molidas se sometieron a extracciones sucesivas, utilizando tres

solventes orgánicos: Diclorometano (CH2CL2), Acetona (C3H6O) y Metanol

(CH3OH). Se utilizó 600 g de muestra molida y se trabajó con cada solvente en

una relación de 1:3, luego se llevó la muestra a extracción por ultrasonido durante

1 hora a temperatura promedio entre 20 – 25 ° C.

63
 Posteriormente se realizó la extracción por agitación durante dos horas a 240 rpm

(revoluciones por minuto). El extracto en solución obtenido se filtró y se

concentró en un rotaevaporador a baja temperatura y presión reducida.

Finalmente, el extracto obtenido se dejó en una campana extractora de gases para

la evaporación del solvente.

Figura 26. Proceso de filtración del extracto en Figura 25. Concentración de la muestra en
solución. rotaevaporador

Tabla 9.

Condiciones de trabajo en el proceso de extracción con diclorometano para ambas

matrices

Sonicación Agitación Recuperación Tiempo de

orbital de solvente cristalización

Tiempo Una hora Dos horas 1 hora (600 ml) Dos semanas

Presión - - 300 – 400 -

Temperatura 20 – 24 ° C Tem. Ambiente 30 ° C Tem. Ambiente

RPM - 240 - -

64
 Tabla 10.

Condiciones de trabajo en el proceso de extracción con acetona para ambas matrices

Sonicación Agitación Recuperación Tiempo de

orbital de solvente cristalización

Tiempo Una hora Dos horas 1 hora (300 ml) tres semanas

Presión - - 100 – 300 -

Temperatura 20 – 24 ° C Tem. Ambiente 30° C - 35 ° C Tem. Ambiente

RPM - 240 - -

Tabla11.

Condiciones de trabajo en el proceso de extracción con metanol para ambas matrices.

Sonicación Agitación Recuperación Tiempo de

orbital de solvente cristalización

Tiempo Una hora Dos horas 2 horas (300 ml) 2 meses

Presión - - 70 – 100 -

Temperatura 20 – 24 ° C Tem. Ambiente 30° C - 35 ° C 35° C

RPM - 240 - -

Tabla 12.

Resumen de las extracciones secuenciales para ambas macroalgas

N° de extracciones secuenciales

Solvente H. grandifolius D. confervoides

Diclorometano 5 6

Acetona 5 5

Metanol 9 9

65
3.6.5. Solubilización de extractos

Se pesaron 4 mg de los extractos obtenidos (diclorometánicos y acetónicos) y se

solubilizaron con 40 μl de Dimetilsulfóxido (DMSO) (figura 33), se agregaron 960 μl de

caldo TSB y se obtuvo una solución de trabajo de 4 mg/ml al 4 % de DMSO.

Los extractos metanólicos se solubilizaron en agua (figura 34) (160 mg de extracto más

800 μl de agua estéril), obteniéndose una solución de trabajo de 98 mg/ml. Sin embardo,

se observó pequeños precipitados en dos extractos por lo que se agitaron en vórtex durante

5 min y se centrifugó por 5 min a 13 000 rpm. Posteriormente se determinó la

concertación del extracto soluble, para lo cual se dispuso 50 μl en una balanza de

medición de humedad y se secó a 100 ° C durante 5 minutos. Finalmente se estimó la

concentración del extracto de la siguiente manera:

Fórmula utilizada:

% concentración = ((W muestra seca - W del plato) /W de la muestra) x 100

3.6.6. Material biológico

3.6.6.1. Características morfológicas de Y. ruckeri

Se trabajó con dos cepas bacterianas de Y. ruckeri, la cepa de código R3 pertenece a la

colección bacteriana del laboratorio de Biotecnología de la DIDITT del ITP y la de código

N1 fue cedida por la Sección de Ictiopatología del Laboratorio de Histología, Embriología

y Patología Veterinaria (Facultad de Medicina Veterinaria – UNMSM). Ambas cepas

fueron acondicionadas a temperatura ambiente y sembradas por agotamiento de estrías en

placas Petri con agar tripticasa de soya (TSA). Se incubaron a 22 ° C durante 48 h. Se

identificaron características morfológicas de forma, borde, superficie, elevación, luz

trasmitida, consistencia y color.

66
3.6.6.2. Producción de cepas de trabajo

A partir de un cultivo axénico de cada cepa bacteriana, se seleccionó 3 a 4 colonias de

igual tamaño y se volvió a reactivar en 50 ml de caldo de cultivo (TSB) colocándolo en

incubación sin agitación durante 24 horas a 22 °C. Seguidamente, cada tubo de cultivo se

centrifugó a 4000 rpm por 7 minutos y se retiró el sobrenadante obtenido, luego se

resuspendió el pellet con TSB al 15 % de glicerol y cada 1 ml de mezcla obtenido se

dispensó en microtubos, los cuales se almacenaron congelación a – 30 °C hasta la

realización del ensayo biológico.

Figura 27. Caracterización cultural de cepas bacterianas.

3.6.6.3. Identificación del biotipo de las cepas de Y. ruckeri

Las cepas de Y. ruckeri pueden clasificarse en 2 biotipos, biotipo 1 y 2, basados en su

capacidad de fermentar el sorbitol, hidrólisis del Tween 20 y Tween 80, como en su

motilidad (Tobback, 2009). La identificación del biotipo se realizó mediante la hidrólisis

del Tween 80 en medio sólido (Anexo 1). Se inoculó 10 µl de cultivo bacteriano overnight

de cada cepa bacteriana sobre el medio de cultivo y se incubaron durante 48 h a 22 °C.

3.6.6.4. Evaluación de sensibilidad a antibióticos

Se empleó el método de difusión en disco de Kirby-Bauer según el INS (2002), Las cepas

de Y. ruckeri fueron reactivadas en medio TSA e incubadas a 22 °C. A partir de un cultivo

67
 axénico de cada muestra, se retiró un inóculo y se realizó una suspensión bacteriana en

solución salina estéril al 0,85 % hasta obtener una turbidez del 0,5 de la escala de Mc

Farland (equivalente a 1x108 UFC, unidades formadoras de colonia). Posteriormente, las

muestras se hisoparon en medio TSA y se colocaron los discos de antibióticos con pinzas

estériles, ejerciendo una leve presión para que el disco pueda adherirse al medio de cultivo

(figura 28).

Los antibioticos evaluados fueron:

- Sulphamethoxazole/ trimethoprim 19:1 (SXT)

- Florfenicol 30 μg (FFC)

- Oxytetracyclina 30 μg (OT)

- Gentamicina 10 μg (GM)

- Amoxycilina 10 μg (AM)

Se consideró según el INS (2002), que la distancia entre discos debe ser como mínimo 25

mm, finalmente se incubó durante 24 horas a 22 °C.

Figura 28. Diagrama de la evaluación de sensibilidad antibiótica

Fuente: Elaboración propia

68
3.6.7. Evaluación antibacteriana

3.6.7.1. Preparación de inóculo bacteriano

Se reactivaron las cepas bacterianas en TSB y se dejó incubar a 22 °C por 24 horas.

Posteriormente se hizo la siembra en estrías por agotamiento en placas con TSA para su

verificación. Las cepas bacterianas utilizadas fueron R3 (biotipo 1) y N1 (biotipo 2).

A partir de un cultivo axénico de cada muestra, se retiró un inóculo y se realizó una

suspensión bacteriana en solución salina estéril al 0,85 % hasta obtener una turbidez del

0,5 de la escala de Mc Farland (equivalente a 1x108 UFC, unidades formadoras de

colonia). Luego, se realizó una dilución para obtener un inóculo bacteriano de 1x10 7 UFC

(Anexo 2).

3.6.7.2. Microdilución en caldo

Se empleó el método de microdilución en caldo en placas de 96 pocillos (figura 45). Se

utilizó caldo TSB como medio de cultivo. En las placas se colocaron las diluciones

seriadas de los extractos naturales y 10 µl del inoculo bacteriano.

Los extractos diclorometánicos y acetónicos que fueron solubles en DMSO se evaluaron

a partir de 2 mg/ml, debido que el DMSO no debe exceder del 2 % de volumen total. Los

extractos metanólicos que fueron solubles en agua, se evaluaron a partir de 96 mg/ml.

Las placas se incubaron a 22 °C durante 24 horas, luego a la longitud de onda de 600 nm

se midió la densidad óptica para determinar la CMI y el porcentaje de inhibición según

Banjara et al. (2007).

Para determinar la CMB, se realizó una siembra por extensión a partir de un pocillo al

azar (100 μl) por cada concentración evaluada (figura 44), se realizó una extensión

uniforme con una espátula Drigalski sobre la superficie del medio de cultivo (TSA), con

la finalidad de determinar a qué concentración el extracto presenta un efecto bactericida.

69
 Figura 30. Evaluación antibacteriana

Figura 29. Siembra por extensión.

3.7. Análisis de datos

Para el procesamiento de datos se utilizó el programa estadístico SPSS (Statistical

Package for the Social Sciences, con descripció IBM SPSS Statistics 21.0). Se utilizó la

prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis (de William Kruskal y W. Allen Wallis) para

determinar si existe o no diferencia significativa a un nivel de confianza del 95%. Para la

realización de gráficos de barra se empleó Excel 2016.

70
IV. RESULTADOS

4.1. Análisis fitoquímico preliminar

Según el analísis fitoquímico realizado para esta investigación se encontraron los

siguientes metabolitos secundarios en ambas macroalgas evaluadas, los cuales se detallan

en la tabla 13.

Tabla13.

Metabolitos secundarios presentes en H. grandifolius (H) y D. confervoides (D)

Metabolito Ensayo cualitatito Resultados

H D

Antocianinas Prueba cualitativa ++ +

Reacción de Dragendorff - -

Alcaloides Reacción de Mayer - -

Reacción de Wagner - -

Lactonas Reacción de Baljet ++ ++

Flavonoides Reacción de Shinoda + ++

Aminoácidos Reacción de Ninhindrina + -

Cardenólidos Reacción de Kedde + -

Esteroides Reacción de Liebermann-Burchard + +

Saponinas Reacción de espuma - -

Taninos Reacción de cloruro férrico ++ +

Triterpenos Reacción de Liebermann-Burchard + +

Azucares Reacción de Fehling - ++

reductores

Fenoles Reacción de cloruro férrico ++ +

(+++) Muy abundante. (++) Abundante. (+) Moderado. (+/-) Escaso. (-) Ausencia

71
4.2. Obtención de extractos naturales

A partir de la extracción secuencial con tres solventes diferentes se obtuvieron: 9 extractos

y 3 precipitados (Tabla 14).

Tabla14.

Extractos y precipitados obtenidos.

Especie

Solvente H. grandifolius D. confervoides

Diclorometano DH DD
Acetona AH AD
PH1 PD1
MH1 PD2
Metanol MH2 MD1
MH3 MD2
D: diclorometano, A: acetona, M: metanol, P: precipitado.

Los rendimientos de extracción para H. grandifolius se detallan en la tabla 15; para D.

confervoides en la tabla 16.

Tabla15.

Rendimiento de extracción con los tres solventes utilizados para H. grandifolius

H. grandifolius

Solubilizado Biomasa Rendimiento

(g) (g) (%)
Extracto diclorometánico 6,74 600 1,123

Extracto acetónico 34,77 600 5,795

PH1(*) 58,52 600 9,753

Extracto MH1 10,59 600 1,765

metanólico
MH2 37,9 600 6,3

MH3 21,32 600 3,41

* Precipitado que quedó retenido al momento de la filtración en la obtención de los

extractos.
72
 A partir de la extracción con metanol se obtuvieron 3 extractos (figura 31) y un

precipitado. Inicialmente, al finalizar las extracciones (7 extracciones secuenciales), se

filtró el extracto obtenido y se obtuvo un precipitado (PH1) que quedó en el papel filtro

y el extracto soluble se llevó a concentrar en un rotaevaporador.

El extracto concentrado se dejó durante 4 semanas en refrigeración. Transcurrido ese

tiempo se observó la formación de dos fases: fase 1 (primera formación de cristales, MH1)

en estado sólido y una fase 2 (sobrenadante) en estado líquido. Posteriormente, con la

finalidad de acelerar la evaporación del solvente por acción del calor, el sobrenadante se

colocó dentro de una estufa a 35 °C. Nuevamente se observaron dos fases y se separaron

al igual que en procedimiento anterior, de este modo se obtuvieron los segundos cristales

(MH2) más un segundo sobrenadante, del cual se formaron los terceros cristales (MH3).

Figura 31. Extractos metanólicos de H. grandifolius. MH1 (a), MH2 (b) y MH3 (c).

73
 Tabla16.

Rendimiento de extracción con los tres solventes utilizados para D. confervoides

D. confervoides
Solubilizado Biomasa Rendimiento
(g) (g) (%)
Extracto diclorometánico 24,17 600 4,03
Extracto acetónico 18,09 600 3,015
PD1* 22,74 600 3,79
Extracto PD2* 16,89 600 2,815
metanólico MD1 2040 600 3,4
MD2 42 600 7

* Precipitado que se formó en la obtención de extractos (no se evaluó su actividad

antibacteriana).

En la obtención de extractos metanólicos de D. confervoides se obtuvieron dos

precipitados, el primero (PD1) se formó al finalizar la séptima extracción (a partir de la

filtración del extracto concentrado) y el segundo (PD2) al finalizar el proceso de

extracción (9 extracciones secuenciales). En D. confervoides el proceso de formación de

cristales fue el mismo que en la H. grandifolius, con la diferencia que esta vez solo se

obtuvieron dos extractos metanólicos (MD1 y MD2) (figura 32). Al finalizar la obtención

de los extractos, estos fueron empacados al vacío y almacenados en congelación (-20 °C)

hasta su evaluación.

Figura 32. Extractos metanólicos de D. confervoides. MD1 y MD2

74
4.3. Solubilización de extractos

De los 9 extractos obtenidos, 5 de ellos presentaron solubilidad en agua (figura 34); 3 en

DMSO (figura 33) y 1 extracto más los precipitados formados no fueron solubles bajo

ningún sistema evaluado (tabla 17).

Tabla17.

Solubilidad de extractos.

Solubles en agua Solubles en DMSO No se lograron

solubilizar

MH1 DH AH

MH2 DD PH1

MH3 AD PD1

MD1 PD1

MD2

*El extracto AH, no es soluble bajo ningún sistema evaluado (figura 47). Se probó la

solubilidad con el mismo solvente de extracción, además de, otros solventes de polaridad

semejante (Anexo 4). De igual forma, los 3 precipitados obtenidos no se lograron

solubilizar, por lo que no se les consideró para realizar las evaluaciones antibacterianas.

Figura 33. Extractos solubles en DMSO. DH (a), DD (b)

y AD (c).

75
 Figura 34. Extractos solubles en agua. MH1(a), MH2(b), MH3(c), MD1(d) y MD2(e)

Los extractos que se lograron solubilizar fueron evaluados a concentraciones diferentes

dependiendo del tipo de sistema utilizado para su solubilización. Los extractos

diclorometánicos y acetónico se solubilizaron en DMSO y la concentración máxima

presente en la solución de trabajo de este solvente debe ser 2 mg/ml al 2 % de DMSO. En

contraste, los extractos metanólicos fueron solubles en agua y la concentración mayor

utilizada fue de 96 mg/ml (tabla 18).

Tabla 18.

Concentración de los extractos solubilizados para evaluación antibacteriana.

Extracto Concentración Concentración

de trabajo a evaluar

DH 4 mg/ml 2 mg/ml

MH1 96 mg/ml 96 mg/ml

MH2 98.04 mg/ml 96 mg/ml

DD 4 mg/ml 2 mg/ml

AD 4 mg/ml 2 mg/ml

MD1 98.08 mg/ml 96 mg/ml

MD2 98.4 mg/ml 96 mg/ml

76
4.4. Obtención y preservación de muestras bacterianas

4.4.1. Características culturales de cepas de Y. ruckeri, (N1)

Placa con medio base TSA Colonia en TSA Características en TSA

Yersinia ruckeri Yersinia ruckeri

Morfología Cepa
Tamaño 2,5 mm
Forma Circular
Borde Redondeado
Superficie Lisa
Elevación Plana
Luz Opaca
transmitida
Figura 35. Y. ruckeri en TSA, Figura 36. Y. ruckeri en TSA, Consistencia Blanda
cultivo de 48 h cultivo de 48 h Color Crema

4.4.2. Características culturales de cepas de Y. ruckeri, (R3).

Placa con medio base TSA Colonia en TSA Características en TSA

Cepa: R3 Cepa: R3

Morfología Cepa

Tamaño 3 mm
Forma Circular
Borde Redondeado
Superficie Lisa
Elevación convexo
Luz transmitida Opaca
Figura 37. R3 en TSA, cultivo Figura 38. R3 en TSA, cultivo
de 48 h Consistencia Blanda
de 48 h
Color Crema

77
4.4.3. Identificación del biotipo de las cepas de Y. ruckeri

Descripción de los biotipos

Para la determinación del biotipo se realizó las pruebas de hidrólisis enzimática del Tween

80 y motilidad en gota pendiente.

La cepa R3, presenta halos de precipitación (figura 40) lo cual indica que hidrolizó el

Tween 80 además presentó motilidad por lo que corresponde al biotipo 1. En contraste,

la cepa N1, no presenta halos de precipitación ni es motil por lo que corresponde al biotipo

2 (figura 41).

Figura 40. Prueba de biotipo para la Figura 39. Prueba de biotipo para la
cepa N1. cepa R3.

78
4.4.4. Evaluación de sensibilidad a antibióticos

Se realizó una evaluación de sensibilidad de las cepas de Y. ruckeri, N1 y R3 frente a 5

antibióticos (Tabla 19). Los resultados se interpretan de acuerdo la medición de la

formación de halos de inhibición (figura 42).

Tabla 19.

Inhibición de los discos de antibióticos contra las cepas evaluadas

Diámetro de inhibición (mm)

Disco de Antibiótico R3 N1

SXT 25 28
AM 10 28 35
GM 10 17 20
OT 37 42
FFC 37 40

Sulphamethoxazole/trimethoprim 19:1 (SXT), Florfenicol 30 μg (FFC),

Oxytetracyclina 30 μg (OT), Gentamicina 10 μg (GM) y Amoxycilina 10 μg (AM)

Figura 41. Halos de inhibición

79
 De acuerdo a los parámetros de lectura de halos de inhibición (Tabla 20) las cepas

evaluadas (N1 y R3) son consideradas como cepas muy sensibles, puesto que, presentan

halos de inhibición mayores a 17 mm.

Tabla 20.

Parámetros de lectura de halos de inhibición y su interpretación

Interpretación Abreviatura Halo de inhibición

Resistente R ≤ 7 mm

Sensibilidad media M ≤ 8 – 11 mm

Sensible S ≥ 12 – 16 mm

Muy sensible MS ≥ 17 mm

Fuente: CISIPA (2017). Basado en disposiciones internacionales del National

Committee for Clinical Laboratory Standards de USA (NCCLS)

4.4.5. Evaluación antibacteriana

Figura 43. Siembra por extensión Figura 42. Microdilución en placa

La CMI es la mínima concentración del extracto que, en un determinado período de

tiempo, fue capaz de inhibir el crecimiento de las cepas bacterianas evaluadas. Del mismo

modo, la CMB es la mínima concentración del extracto que, en un período de tiempo es

capaz de matar al 99,9 % crecimiento de las cepas bacterianas evaluadas (figura 45). Los

80
 extractos diclorometánicos y acetónicos, fueron evaluados a concentraciones seriadas (2,

1 y 0,5 mg/ml) y no presentaron actividad antibacteriana frente a ninguna cepa de Y.

ruckeri.

La CMI y CMB de los extractos evaluados frente a ambas cepas de Y. ruckeri (N1 y R3)

se muestran en la tabla 21.

Figura 44. Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB)

Fuente: Elaboración propia

Tabla 21.

Resultado de los ensayos de la actividad antibacteriana de los extractos crudos obtenidos

de las macroalgas
Especie Extracto N1 R3
Diclorometánico NP NP
Metanólico - 1 Actividad Actividad
Metanólico – 2 Actividad Actividad
Himantothallus Metanólico - 3 Actividad Actividad
grandiofolis
Diclorometánico NP NP
Acetónico NP NP
Desmarestia Metanólico - 1 Actividad Actividad
confervoides. Metanólico – 2 Actividad Actividad

NP: No presenta actividad antibacteriana - Actividad: Presenta actividad antibacteriana.

81
 Tabla 22.

Resultados de los ensayos de la actividad antibacteriana de los extractos crudos

metanólicos

R3 N1

Concentration (mg/ml)

96 48 24 96 48 24

MH1 CMB CMI - CMB CMI -

MH2 CMI - - CMI - -

MH3 CMB CMI - CMB CMI -

MD1 CMI - - CMI - -

MD2 CMI - - CMI - -

Se obtuvieron 9 extractos crudos, de los cuales únicamente 5 de ellos (obtenidos con

metanol) fueron activos frente a Y. ruckeri (Biotipo 1 y 2). Los extractos fueron evaluados

en concentraciones seriadas a partir de 96 mg/ml siendo la menor concentración 6 mg/ml

en cada pocillo. Los extractos de H. grandifolius fueron los más efectivos (96 mg/ml)

inhibiendo el 100 % del crecimiento bacteriano.

Tabla 23.

Resultados del porcentaje de inhibición de los extractos metanólicos frente a Y. ruckeri

(Biotipo 2)

Concentración del extracto evaluado

96 mg/ml 48 mg/ml 24 mg/ml 12 mg/ml 6 mg/ml

MH1 100 % 71,9 % 38,2 % 23 % 21,8 %

MH2 98,8 % 30,1 % 28,3 % 21,3 % 14,9 %

MH3 100 % 93,8 % 5,4 % 7,3 % 5,1 %

MD1 95 % 64,9 % 19,6 % 6,4 % 0%

MD2 98 % 22,5 % 15,1 % 6,4 % 5%

82
 Figura 45.Actividad antibacteriana de los extractos metanólicos con la cepa N1 (Biotipo 2), Y.
ruckeri.

Tabla 24.

Resultados del porcentaje de inhibición de los extractos metanólicos frente a Y. ruckeri

(Biotipo 1)

Concentración del extracto evaluado

96 mg/ml 48 mg/ml 24 mg/ml 12 mg/ml 6 mg/ml

mg/ml

M.H1 100 % 66,2 % 35,9 % 23 % 12,8 %

M.H2 98,5 % 43,8 % 29,1 % 20,2 % 14,2 %

M.H3 100 % 45,3 % 11,4 % 12,6 % 8,1 %

M.D1 92 % 26,1 % 1,1 % 0% 0%

M.D2 93 % 40,1 % 17,9 % 0% 0%

83
 Figura 46. Actividad antibacteriana de los extractos metanólicos con la cepa R3 (Biotipo 1), Y.
ruckeri.

84
 V. DISCUSIÓN

En el trabajo se demostró que los extractos crudos de las macroalgas antárticas H.

grandifolius y D. confervoides producen compuestos bioactivos con propiedad

antibacteriana frente a las cepas de Y. ruckeri (Biotipo 1 y 2). Actualmente no existen

estudios previos acerca de la capacidad antibacteriana de las macroalgas evaluadas, sin

embargo, existen investigaciones que demuestran la producción de diferentes tipos de

metabolitos secundarios con potencial antibacteriano en otras macroalgas frente a Y.

ruckeri.

En esta investigación se obtuvieron 9 extractos crudos (2 diclorometánicos, 2 acetónicos

y 5 metanólicos), de los cuales únicamente los extractos metanólicos presentaron

actividad antibacteriana frente a las cepas de Y. ruckeri. Este hallazgo es similar a lo

reportado por Bansemir et al. (2006), quienes examinaron la actividad antibacteriana de

extractos diclorometánicos, metanólicos y acuosos de las macroalgas cultivadas:

Asparagopsis armata, Falkenbergia rufolanosa, Gracilaria cornea y Halopitys incurvus

frente a Y. ruckeri. En este estudio los autores indicaron que el extracto diclorometánico,

en comparación al extracto metanólico fue el más efectivo frente a Y. ruckeri, lo cual es

similar a los resultados presentados por Cortés et al. (2014), quienes investigaron la

actividad antimicrobiana de un extracto diclorometánico y etanólico del alga roja

Ceramium rubrum contra Y. ruckeri. Aunque los autores reportaron que ambos extractos

evaluados, tanto etanólico, como diclorometánico inhibieron el crecimiento de Y. ruckeri,

se menciona que la actividad antibacteriana más alta se logró con el extracto

diclorometánico.

Si bien los autores antes mencionados reportan resultados positivos frente a Y. ruckeri, lo

cual es comparable con nuestros hallazgos, existe una diferencia con respecto a los

extractos de mayor efectividad. En ambos casos se utilizaron solventes de mayor y menor

polaridad (metanol y diclorometano), a pesar de ello, en nuestro estudio se encontró que

solamente el extracto metanólico presento actividad antibacteriana, mas no el extracto

85
 diclorometánico. Probablemente esta diferencia sea debido al tipo de macroalgas

utilizadas, pues los autores mencionados utilizaron algas rojas que posiblemente poseen

metabolitos secundarios solubles en diclorometano, en cambio en nuestro estudio se

trabajó con algas pardas, que aparentemente tienen metabolitos secundarios con

propiedad antibacteriana solubles en metanol, lo cual se confirmó mediante el análisis

fitoquímico, en el que se evidencia la presencia de compuestos fenólicos, flavonoides,

taninos y triterpenos.

Por otro lado, las pruebas de actividad antibacteriana se realizaron mediante el método de

difusión en agar, a diferencia de nuestro estudio donde se utilizó el método de

microdilución en caldo. Bansemir et al. (2006) trabajaron con discos de 2 mg y con ello

reportaron halos de inhibición de 15.3 mm, mientras que Cortés et al. (2014) trabajando

con discos de 1 mg encontraron halos de inhibición de 14 mm. Ambos autores consideran

que los extractos evaluados tienen un alto porcentaje de efectividad en relación al

antibiótico utilizado como control positivo (Oxytetracycline 20 μg/disc) que obtuvo halos

de inhibición de 14,5 mm de diámetro.

Por su parte, Martinez et al. (2002) evaluaron extractos metanólicos de macroalgas pardas

del caribe colombiano, donde reportaron que: Dictyota bartayresiana, Dictyota pulchella

y Padina boergesenii presentaron actividad antibacteriana frente a cepas Gram positivas

(S. aureus) y ninguna fue activa contra cepas Gram negativas (Escherichia coli), lo que

ya había sido mencionado por De Lara et al. (1995), quienes reportaron que las bacterias

Gram positivas (S. aureus) fueron más susceptibles a los extractos algales activos que las

bacterias Gram negativas (E. colí y Enterobacter sp). Del mismo modo, Algaser et al.

(2013) evaluaron extractos metanólicos de macroalgas pardas de las costas de Libia y

mencionan que las bacterias Gram (-) son más resistentes, confirmando lo reportado por

Castro (1997), quien estudió el efecto antibacteriano del alga parda Sargassum sinicola e

indicó que los extractos de S. sinicola únicamente inhibieron el crecimiento de Bacillus

subtils, recalcando que esta bacteria es una Gram (+).

86
 En contraste, Ríos, et al., (2009) evaluaron extractos de macroalgas de la zona tropical de

Venezuela, donde evaluaron macroalgas rojas, verdes y pardas. Los autores encontraron

extractos con alta actividad (+) antibacteriana contra cepas Gram (-) de P. aeruginosa y

Klebsiella pneumoniae en comparación a una baja (-) actividad antibacteriana en S.

aureus, Gram (+).

Cabe mencionar que las macroalgas utilizadas por estos autores fueron recolectadas en

regiones tropicales y sub tropicales (a diferencia de nuestro estudio), entonces la

diferencia de sensibilidad entre bacterias Gram (+) y Gram (-) sea probablemente a la

naturaleza química del extracto (Pesando y Caram, 1984). En ese mismo orden de ideas,

Castro (1997) hace referencia a que las macroalgas, indistintamente de pertenecer a la

misma familia, no presentan la misma actividad antibacteriana cuando han sido

recolectadas en distintos puntos geográficos, presumiblemente esto se deba a que existen

además otros factores que afectan las propiedades bioactivas de las algas, tales como la

estación del año en que fueron recolectadas, las variaciones climáticas de su medio natural

y del estado reproductivo del alga (Martínez et al., 2002).

Desde otro punto de vista, Vlachos, et al., (1996) consideran que la efectividad de algunos

extractos de algas dependerá en gran medida al solvente que se utilice y de las variables

aplicadas en el proceso. Soto y Rosales (2016), mencionan que el uso de etanol, metanol

y acetona, como solventes de extracción con mejores resultados. Sin embargo, Caprioti et

al. 2014, consideran que la efectividad y el rendimiento de los extractos dependerá de la

composición química de los compuestos a extraer, así como de factores como la

concentración del solvente, temperatura, tiempo de contacto, tamaño de partícula y

relación masa-solvente.

En nuestro estudio el extracto con mejor rendimiento y efectividad antibacteriana fue el

extracto metanólico (teniendo en cuenta que el método utilizado fue la extracción

convencional con solventes), lo cual es similar al hallazgo de Osuna, et al., (2016),

quienes evaluaron dos extractos utilizando dos solventes: acetona y metanol, donde

87
 mencionan que el extracto metanólico mostró un halo de inhibición mayor comparado

con el extracto de acetona, en cambio, De Lara, et al., (1995) encontraron una mejor

respuesta antibiótica en general utilizando acetona, en comparación a evaluaciones

efectuados con etanol u otro solvente de mayor polaridad (metanol) lo que ya había sido

mencionado por Rosell y Srivastava (1987).

García, et al., (2012) encontraron que extractos algales obtenidos con metanol poseían

alta actividad antibacteriana, en dicho estudio los autores hacen referencia a que los

compuestos responsables de la actividad antibacteriana fueron los compuestos fenólicos,

lo cual ya había sido reportado por Maximiliem et al., (1998), a su vez estos reportes

concuerdan con lo mencionado por Nylund et al., (2008) y Osuna, et al., (2016) quienes

señalan que la efectividad de los compuestos bioactivos de los extractos de algas

presumiblemente estén relacionados al contenido de compuestos fenolicos (ej. taninos,

flavonoides, terpenos futranona y algunos ácidos grasos). Estos estudios dan mayor

veracidad a nuestros resultados, puesto que, los metabolitos secundarios encontrados en

esta investigación son fenoles, flavonoides, triterpenos y taninos.

Por su parte, Gonzales del Val et al., (2001) afirman que estos metabolitos secundarios

presentan una mayor solubilidad en solventes orgánicos polares, por lo que recomienda

utilizar sistemas para la obtención de extractos de algas utilizando mezclas acuosas de

metanol y etanol.

88
VI. CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en esta investigación demuestran que los extractos obtenidos

(extractos metanólicos) de Himantotallus grandifolius y Desmarestia confervoides

producen compuestos bioactivos (especialmente grupos fenólicos), que tienen la

capacidad de inhibir el crecimiento de las cepas del Biotipo 1 y 2 de Yersinia ruckeri.

Utilizando el método de microdilución en caldo se demostró que los extractos evaluados

a concentraciones seriadas a partir de 48 mg/ml tienen un efecto inhibitorio en el

crecimiento de las cepas evaluadas, concluyendo que 48 mg/ml es la concentración

mínima inhibitoria (MCI).

En ese mismo orden de ideas se encontró y demostró que los extractos algales a

concentraciones de 96 mg/ml inhibe al 100% el crecimiento de las cepas bacterianas

evaluadas, por lo tanto, se concluye también que, esta es la concentración mínima

bactericida (MCB)

Los resultados obtenidos en esta investigación, en conjunto con previos estudios sobre la

búsqueda de nuevos compuestos bioactivos, demuestran que las macroalgas son una

fuente potencial de compuestos bioactivos con actividad antibacteriana que pueden ser

empleados en tratamientos de enfermedades bacterianas, además de, hongos, virus, y

otros patógenos.

89
VII. RECOMENDACIONES

Es necesario aislar e identificar químicamente las sustancias presentes en los extractos

crudos obtenidos en esta investigación, de esta manera poder medir y evaluar su actividad

con mayor precisión, para lo cual es importante buscar el principio activo de la actividad

a nivel de molécula y no de extracto.

Además, se recomienda seguir realizando estudios posteriores orientados a la búsqueda

de nuevos compuestos bioactivos de origen natural, ya que muchos organismos marinos

existentes aún no han sido estudiados.

90
VIII. REFERENCIAS

Alóz, J. (2014). Resistencia bacteriana a los antibióticos: una crisis global. Facultad de

Ciencias Biomédicas, Universidad Europea de Madrid, Villaviciosa de Odón,

Madrid, España.

Algaser, R., Whida, F., Abduelrhman, E., Gammoudi, F. y Azawai, S. 2013. Screening of

antibacterial activity in marine green, red and brown macroalgae from the western

coast of Libya. Natural Science, 5(1): 7-14

Alvarez, F., Korbee, N. y Figueroa, F. (2016). Analysis of antioxidant capacity and

bioactive compounds in marine macroalgal and lichenic extracts using different

solvents and evaluation methods. Department of Ecology and Geology, Faculty

of Sciences, International Campus of Excellence Andalucia Tech, University of

Málaga, 29071 Málaga, Spain.

Angulo, F. (2000). Agentes antimicrobianos en Acuicultura: impacto y potencial en la salud

pública. Enf Infec Microbiol 2000; 20 (6)

Austin, B. y Austin, D. (2007). Bacterial fish pathogens-diseases of farmed and wild fish.

Springer-Verlag, 2nd Edn., 188-226.

Ávalos, A. y Pérez, E. (2009). Metabolismo secundario de plantas. Departamento de

Biología Vegetal I (Fisiología Vegetal). Facultad de Biología. Universidad

Complutense. Madrid. Reduca (Biología). Serie Fisiología Vegetal. 2 (3): 119-

145, 2009 ISSN: 1989-3620.

91
 Azuola, R., y Vargas-Aguilar, P. (2007). Extracción de sustancias asistida por ultrasonido

(EUA). Revista Tecnología En Marcha, 20(4). Recuperado a partir de

https://revistas.tec.ac.cr/index.php/tec_marcha/article/view/449.

Bansemir, A., Blume, M., Schroder, S., y Lindequist, U. (2006). Selección de algas marinas

cultivadas para la actividad antibacteriana contra bacterias patógenas de

peces. Acuicultura, 252 , 79-84. doi: 10.1016 / j.aquaculture.2005.11.051

Barsanti, L. y GualtierI, P. (2005). Algae second edition anatomy, biochemistry, and

biotechnology. Instituto de Biosfísica, Pisa, Italia.

Barattini, P. (2012). Antibióticos en acuicultura. Boletín INIA Nº 223. ISSN 0717-4829.

Coyhaique, Chile, 2012.

Bernal, A. (2013). Extracción liquido-liquido. Química orgánica. Acceso disponible en:

http://riubu.ubu.es/bitstream/10259.3/62/3/20.3%20-

%20Extracci%C3%B3n%20l%C3%ADquido-l%C3%ADquido.pdf

Bernal, R. y Guzman, U. (1984). El antibiograma de Discos. Normalización de la Técnica

de KIRBY-BAUER. BlOMEDlCA Vol. 4, No. 3 y 4 – 1984. Universidad

Nacional de Colombia.

Borowitzka M. (2013). High-value products from microalgae—their development and

commercialisation. J. Appl. Phycol. 25: 743–756.

Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi S. y Gontier, E. (2001). Production of plant secondary

metabolites: a historical perspective. Plant Science 161:839-851

92
 Bravo, S. y Kojagura, V. (2004). First isolation of Yersinia ruckeri from rainbow trout

(Oncorhynchus mykiss) in Peru. Bull. Eur. Ass. Fish Pathol., 24(2) 2004, 104

Bruce, D. y Duff, D. (1967). The identification of two antibacterial products of the marine

planctonik alga Isochrysis galbana. Journal of Genetic Microbiology 48:293-298.

Bueno, H. (2012). Caracterización Fenotípica y Molecular de Cepas de Yersinia ruckeri

Aisladas de Oncorhynchus mykiss, del Centro Piscícola “El Ingenio” –

Huancayo. Memoria para optar al título profesional de Biólogo Microbiólogo y

Parasitólogo. Lima, Perú. Facultad de Ciencias Biológicas. E. A. P. de

Microbiología y Parasitología. U. Nacional Mayor de San Marcos. 75p

Bullock G, (2004). Enteric redmouth disease of salmonids. Fish Dis Leaflet 2004; 82:1-8.

Calderón, Ó., Visoso, S., De la Rosa, I., Acosta, J. y Jiménez, B. (2014). Efecto

antimicrobiano de tres tipos de algas marinas contra el E. faecalis. Centro de

Investigación y Estudios Avanzados en Odontología. Universidad Autónoma del

Estado de México.

Capriotti, A.L.; Cavaliere, C.; Crescenzi, C.; Foglia, P.; Nescatelli, R.; Samperi, R.; y

Lagana, A. (2014). Comparison of extraction methods for the identification and

quantification of polyphenols in virgin olive oil by ultra-HPLC-QToF mass

spectrometry. Wood Chemistry 158:392-400.

Carrion, A. y Garcia, C. (2010). Preparación de extractos vegetales: determinación de

eficiencia de metódica. Tesis previa a la obtención del título de Bioquímica y

Farmacéutica. Cuancua, Ecuador. 2010.

93
 Castro, P. y Huber, M. (2005). Biología Marina. (6ta edición). Madrid: McGraw-Hill

Interamericana; 2007. Pp. 108,109.

Castro, T., Peña, C. y E. Mateo. (2014). first report of viral diseases in rainbow trout

(Oncorhynchus mykiss) in Perú. The Biologist. 1: 67-75.

Chía, R. (1997). Efectividad de dos vacunas Nacionales para la prevención de la

Yersiniosis causada por la cepa atípica de Yersinia Ruckeri en Salmo Salar.

Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de

LICENCIADO EN MEDICINA VETERINARIA. Universidad Austral de Chile.

Chinou, I. (2008). Primary and secondary metabolites and their biological activity. En:

WaksmundzkaHajnos M, Sherma J, Kowalska T (Eds) Thin layer

chromatography in phytochemistry, pp. 59-76. CRS Press, Boca Raton

Colina, R. (2016). Análisis fitoquímico, determinación cualitativa y cuantitativa de

flavonoides y taninos, actividad antioxidante, antimicrobiana de las hojas de

“Muehlenbeckia hastulata (J.E.Sm) I.M. Johnst” de la zona de Yucay (Cusco).

TESIS Para optar el Título Profesional de Químico. Facultad de Química e

Ingeniería Química, UNMSM.

Concha, A. (1998). Caracterizacion bioquimica, electroforetica y sensibilidad antibiotica

de cepas de Yersinia ruckeri aisladas desde Salmon del Atlantico (Salmo salar).

[tesis de bachiller]. Universidad Austral Chile.

Cortés, Y., Hormazábal, E., Leal, H., Urzúa, A., Mutis, A., Parra, L. y Quiroz, A. (2014).

Novel antimicrobial activity of a dichloromethane extract obtained from red

94
 seaweed Ceramium rubrum (Hudson) (Rhodophyta: Florideophyceae) against

Yersinia ruckeri and Saprolegnia parasitica, agents that cause diseases in

salmonids. Electronic Journal of Biotechnology, 17(3), 126-

131. https://dx.doi.org/10.1016/j.ejbt.2014.04.005

Coy, C., Parra, J. y Cuca, L. (2014). Caracterización química del aceite esencial e

identificación preliminar de metabolitos secundarios en hojas de la especie

Raputia heptaphylla (rutaceae). DOI: 10.15765/e. v4i4.513.

Cubas, P. (2008). Phaeophyta (algas pardas). Acceso disponible en:

https://www.aulados.net/Botanica/Curso_Botanica/Algas_pardas/7_Phaeophyta

_texto.pdf

Davies, R. y Frerichs, G. (1989). Morphological and biochemical differences among

isolates of Yersinia ruckeri obtained from wide geographical areas. Journal of

Fish Diseases 4:357-365.

De Lara, G., Álvarez, S. y C. Lozano-Ramírez. (1996). Actividad antibacteriana de algas

marinas de Oaxaca, Pacífico Tropical Mexicano. Rev. Biol. Trop., 44(2):895-898.

Departamento de Hidrobiología, Universidad Autónoma Metropolitana-

Iztapalapa. Apartado 55-535. México, D. F. 09340. (Rec. 13-111-1995. Rev. 14-

VI-1995. Ac. 14-VIlI-1995).

Díaz, G. y Garzón, J. (2005). Estacionalidad en ensamblajes de algas en arrecifes de coral

con influencia de surgencias en el Caribe colombiano. Botanica Marina, 45 (3),

pp. 284-292. Consultado el 30 de mayo. 2019, desde doi: 10.1515 /

BOT.2002.028

95
 Dixon, B. (1994). Antibiotic resistance of bacterial fish pathogens. J World Aquacult

Soc;25:60-3. http://dx.doi.org/10.1111/j.1749-7345.1994.tb00805.x.

Domínguez, X. (1973). Métodos de investigación fitoquímica. México, D.F.: Limusa,

1973. 281 p.

Echavarría, B., Franco, A. y Martínez, A. (2009). Evaluación de la actividad antioxidante

y determinación del contenido de compuestos fenólicos en extractos de

macroalgas del caribe colombiano. Vitae, revista de la facultad de química

farmacéutica ISSN 0121-4004 Volumen 16 número 1, año 2009. Universidad de

Antioquia, Medellín, Colombia. págs. 126-131.

FAO, 1985. Species Identification Sheets. Fishing area, 48. 58, 88. For fishery purposes. P-

43. ISBN: 92/5/102357/3.

FAO, 2005-2019. Programa de información de especies acuáticas. Oncorhynchus mykiss.

Programa de información de especies acuáticas. Texto de Cowx, I.

G. In: Departamento de Pesca y Acuicultura de la FAO [en línea]. Roma.

Actualizado 15 June 2005. [Citado 30 May 2019].

Fernández, M., Hernández, I y Regueira S. (2019). Bioactivos marinos en el tratamiento

del cáncer. Revista Electrónica Dr. Zoilo E. Marinello Vidaurreta [revista en

Internet]. 2015 [citado 2019 Jun 11];40(7): [aprox. 0 p.]. Disponible

en: http://revzoilomarinello.sld.cu/index.php/zmv/article/view/46

FONDEPES (Fondo Nacional de Desarrollo Pesquero) (2014). Manual de Crianza de

Trucha en Ambientes Convencionales. Lima-Perú. 57p. Acceso disponible en:

https://www.fondepes.gob.pe/src/manuales/MANUAL_TRUCHA.pdf

96
 Forrt, A. (2007). Uso y abuso de Antibióticos en la Salmonicultura. Acceso: 11 febrero

2011], 13 pp. Documento 23. Disponible en:

http://oceana.org/sites/default/files/o/fileadmin/oceana/uploads/americadelsur/d

ocume ntos_2007/Uso_antibioticos_en_la_salmonic ultura.pdf

Gao, M. y Liu, C. (2005). Comparison techniques for the extraction of flavonoids from

cultures cells of Saussurea medusa Maxim. World journal of Microbiology &

Biotechnology. 21: 1461-1463

Garcia, A., Gutiérrez, L., Acedo, E., Burgos, A., López, M., Valdés, M. y Burboa-Zazueta,

M. (2013). Las algas y otros organismos marinos como fuente de moléculas

bioactivas. Revista Biotecnia, 15(1), 25–32.

Godoy, M. (2002). Truchicultura. 2° Edición. Perú: Editorial Perú, 247.

Gonzalez del Val, A., Platas, G., Basilo, A., Cabello, A., Gorrochategui, J., Suay, I.,

Vicente, F., Portillo, E., Jimenez del Rico, M., Garcia Reina, G. y Pelez, F. 2001.

Screening of antimicrobial activities in red, green and brown macroalgae from

Gran Canaria (Canary Islands, Spain). International Journal of Microbiology 4:

35-40

Goossens, A., Häkkinen S., Laakso, I., Seppänen T., Biondi, S., De Sutter, V., Lammertyn,

F., Nuutila, A. Söderlund, H., Zabeau, M., Inze, D. y Oksman-Caldentey, K.

(2003). A functional genomics approach toward the understanding of secondary

metabolism in plant cells. Proc Natl Acad Sci USA 100:8595-8600

97
 Gurib, A. (2006). Medicinal plants: Tradition of yesterday and drugs of tomorrow. Mol

Aspects Med 27:1-93.

Holt, R., Rohovec, J. y Fryer, J. (1993). Bacterial cold-water disease. In “bacterial disease

of fish” (Inglis, V., Roberts, RJ & Bromage, NR. Eds.). Blackwell Scientific

Publications, Oxford, UK. Pp.3-22.

Hunter, V., Knittel, M. y Fryer, J. (1980). Stress-induced transmission of Yersinia ruckeri

infection from carriers to recipient steelhead trout Salmo gairdneri Richardson.

Journal of Fish Diseases 6: 467-472.

INS. (2002). Manual de procedimientos para la prueba de sensibilidad antimicrobiana por

el método de Disco Difusión / Elaboración: Rosa Sacsaquispe Contreras y Jorge

Velásquez Pomar. -- Lima: Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud,

2002. ISBN 9972 - 857 - 18 – 2

Kumar, K. y R, Rengasamy. (2000). Evaluation of antibacterial potencial of seaweeds

occurring along the coast of Tamil Nadu, India against the plant pathogenic

bacterium xanthomonas oryzae p.v. oryzae (Ishiyama) Dye. Botanica Marina,

43: 409-415.

Lannan C., Bartholomew, J. y Fryer, J. (1999). Rickettsial and Chlamydial infections. Fish

disease and disorders Vol.3, 245-267

Leon, J., Avalos, R. y Ponce M. (2009). Flavobacterium psychrophilum y su patologia en

alevines de Onchorhynchus mykiss del Centro Piscicola El Ingenio, Huancayo.

Rev. Peru. Biol. 2009; 15(2): 117 – 124.

98
 Lindorf H., De Parisca, L. y Rodríguez P. (1991). Botánica. Ed. Biblioteca de la

Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela, pp. 584.

Magallanes, C. (2003). Potencial antibacteriano de extractos etanólicos de macroalgas

marinas de la costa central del Perú. Universidad Nacional Mayor de San

Marcos.

Magallanes, C., Córdova, C. y Orozco, R (2003). Actividad antibacteriana de extractos

etanólicos de macroalgas marinas de la costa central del Perú. s

http://sisbib.unmsm.edu.pe/BVRevistas/biologia/biologiaNEW.htm Rev. peru.

biol. 10(2): 125- 132 (2003) Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM.

Mamani, D. (2016). Evidencia de Piscirickettsia salmonis y Yersinia ruckeri en truchas

arcoíris (oncorhynchus mykiss) en cultivo de balsa jaula en el lago titicaca en el

distrito de Pomata departamento de Puno (Perú). Tesis para optar al Grado de

Magíster en Ciencias de la Acuicultura. Facultad de Ciencias Veterinarias y

Pecuarias, Universidad de Chile.

Mantilla, J. y Sanabria, A. (1985). Actividad antibacteriana de plantas superiores

colombianas. Revista Colombiana de Ciencias Químico-Farmacéuticas, 4(2),

25-33. Recuperado

de https://revistas.unal.edu.co/index.php/rccquifa/article/view/56644

Marín, A. (2013). Potencial bioactivo de algas del género Codium, recolectadas en baja

california sur, México. Tesis que para obtener el grado de doctorado en Ciencias

Marinas.

Maximilien, R., De Nys, R., Holmstrom, C., Gram, L., Givskov, M., Crass, K., Kjelleberg,

S. y Steinberg, P.D. 1998. Chemical mediation of bacterial surface colonisation

99
 by secondary metabolites from the red alga Delisea pulchra. Aquatic Microbial

Ecology 15(3): 233-246.

Medinilla, B. (1993). Manual de Laboratorio de Fitoquímica. Universidad de San Carlos

de Guatemala. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. Guatemala. pp 8-9.

Meir, W. (1986). Enteric redmouth disease: outbreak in rainbow trout in Switzerland. Dis.

Aquat. Org. 2: 81-82.

Mesías, F., Vargas, M., Cueva, A., Manchego, A. y Sandoval, N. (2019). Patogenicidad de

una cepa de Yersinia ruckeri de un brote de yersiniosis en truchas

arcoíris(Oncorhynchus mykiss) de Huaraz, Perú. Revista de Investigaciones

Veterinarias del Perú, 30(1), 387-

403. https://dx.doi.org/10.15381/rivep.v30i1.15695

Michalak, I. y Chojnacka, K. (2014). Algal extracts: Technology and advances.

Engineering in Life Sciences, 14(6), 581–591.

MINSA/DIGESA-V.01. 01 (2016). “Norma Sanitaria que establece los Límites Máximos

de Residuos (LMR) de medicamentos veterinarios en alimentos de consumo

humano” Lima, Perú.

Molina, C, (2011). Efecto inhibitorio de diferentes especies de microalgas sobre Vibrio

spp. Tesis para obtener el grado de Maestro en Ciencias. México.

Montaño, K. y Vargas, F. (2002). Péptidos antimicrobianos: un mecanismo de defensa

ancestral con mucho futuro. Interciencia, vol. 27, núm. 1, enero, 2002, pp. 21-27

Asociación Interciencia Caracas, Venezuela.

100
 Muñoz, J., Mardones, O., Chacoff, L. y Gesto, M. (2015). Estrés en peces: respuesta

fisiológica y sus implicaciones en el cultivo de salmónidos . Salmonexpert , (5),

55-57.

Núñez, C. (2008). Extracciones con equipo soxhlet. Acceso disponible en:

http://cenunez.com.ar/archivos/39-ExtraccinconequipoSoxhlet.pdf

Nylund, G.M., Cervin, G., Persson, F., Hermansson, M., Steinberg, P.D. y Pavia, H. 2008.

Seaweed defence against bacteria: a poly-brominated 2-heptanone from the red

alga Bonnemaisonia hamifera inhibits bacterial colonisation. Marine Ecology

Progress Series, 369: 39-50

Ospina A. (1997). Actividad antimicótica de dos especies de algas del pacífico colombiano.

1997. p. 5-12, 18-22, 27, 28, 39, 40

Panreac Química S.L.U. (2017). Versión 2: JMBJUL17. Leído en:

https://www.itwreagents.com/download_file/ce_ivd_instructions/CEIVD08/es/

CEIVD08_es.pdf

Peña, J., Palacios, M. y Ospina, N. (2005) Algas como indicadoras de contaminación. (1ª.

Ed.). Cali, Colombia. Universidad del Valle.

Perez, D. (1998). Resistencia bacteriana a antimicrobianos: su importancia en la toma de

decisiones en la práctica diaria. Hospital Universitario Clínica Puerta de Hierro.

Madrid. Vol. 22N. o 3-1998

101
 Pérez, N. y Jiménez, E. (2011). Producción de metabolitos secundarios de plantas

mediante el cultivo in vitro. Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad

Central ‘Marta Abreu’ de Las Villas.

Piñol, M. y Palazon, J. (1993). Metabolismo secundario en: ASCON-BIETO J, M.

TALON. Fisiología y Bioquímica vegetal, Madrid, España: McGraw – Hill-

Interamericana (1993) 582. P

Prashant, T., Bimlesh, K., Mandeep, K., Gurpreet, K. y Harleen, K. (2011). Phytochemical

Screening and Extraction: a Review. Internationale Pharmaceutica Sciencia. (1)

1: 98-106.

Pratt, R., Mautner, H., Gardner, M., Sha,Y. y Dufrenoy, J. (1951). Report on the antibiotic

activity of seaweed extracts. Journal of American Pharmacolgy Association.

Edición Científica 40: 575-579.

Quispe, W. (2017). Aislamiento de Lactobacillus sp. de “trucha arco iris” Oncorhynchus

mykiss con potencial probiótico frente a Yyersinia ruckeri en puno. Tesis

presentada para optar el título de licenciado en Biología en la Universidad

Nacional del altiplano - Puno Facultad de Ciencias Biológicas, Perú.

Revista National Geographic. (2010). Trucha arcoíris. Acceso disponible en:

https://www.nationalgeographic.es/animales/trucha-arcoiris

Ríos, N., Medina, G., Jiménez, J., Yánez, C., García, M., Di Bernardo, M. y Gualtieri, M.

(2009). Actividad antibacteriana y antifúngica de extractos de algas marinas

venezolanas. Rev. Perú. biol. 16(1): 097- 100 (agosto 2009) © Facultad de

Ciencias Biológicas UNMSM.

102
 Robledo, D., Freile, Y., Chan, M. y Ortega, B. (2008). Propiedades antileishmaniales de

extractos de algas marinas tropicales. Fitoterapia. 2008; 79 (5): 374 - 377.

Ruiz, E. y Suarez, M. (2015). Lactonas sesquiterpénicas. Diversidad estructural y sus

actividades biológicas.Revista CENIC. Ciencias Biológicas, 46 (1), 9-24.

Ruiz, I., Hurtado, M., Nieves, M., Manzano, M., Burgos, A., Lizardi, J. y Hernández, E.

(2016). Algas marinas: potencial fuente de compuestos contra el cáncer. Revista

Ciencia, 67(3), 1–9.

Russell, C. (1997). Salmonid Richettsial Septicemia. Disponible en:

http://hmsc.oregonstate.edu.

Rosell KG., Srivastava LM (1987) Ácidos grasos como sustancias antimicrobianas en algas

pardas. En: Ragan MA, Bird CJ (eds) Duodécimo Simposio Internacional de

Algas Marinas. Desarrollos en hidrobiología, vol. 41. Springer, Dordrecht

Sajc, L., Grubisic, D. y Vunjak-Novakovic G. (2000). Bioreactors for plant engineering:

an outlook for further research. Biochemical Engineering Journal 4:89-99

Sarin, R. (2005) Useful metabolites from plant tissue cultures. Biotechnology 4:79-93

Sepúlveda, J. y Porta, D. y Rocha, S. (2003). La Participación de los Metabolitos

Secundarios en la Defensa de las Plantas. Revista Mexicana de

Fitopatología, 21 (3), 355-363.

103
 Shilpa, K., Varun, K. y Lakshmi, BS. (2010). An alternate method of natural drug

production: Eliciting secondary metabolite production using plant cell culture. J

Plant Sci 5:222-247

Shirahama, K. (1942). On the unsaponifiable matter and phosphatides in marine algae fat.

Journal of the Faculty of Agriculture. Hokkaido University. 49:1-93.

Silva, G., Albuquerque, R. y Oliveira, J. (2013). Macroalgas marinas tropicales atlánticas

con actividad biológica contra vibrios virulentos y resistentes a antimicrobianos.

Lat. Am. J. Aquat. Res., 41(1): 183-188, 2013 Antibacterial activity of

macroalgae DOI: 103856/vol41-issue1-fulltext-17. Sea Sciences Institute,

Federal University of Ceará, Ceará, Brazil.

Soto, M. y Rosales, M. (2016). Efecto del solvente y de la relación masa/solvente, sobre

la extracción de compuestos fenólicos y la capacidad antioxidante de extractos de

corteza de Pinus durangensis y Quercus sideroxyla. Maderas. Ciencia y

tecnología, 18(4), 701-714. Epub 00 de de

2016.https://dx.doi.org/10.4067/S0718-221X2016005000061

Suasnavas, J. (2017). Evaluación de la actividad antibacteriana de extractos de 4 géneros

de microalgas originarias de la estación antártica ecuatoriana Pedro Vicente

Maldonado. Proyecto de investigación presentado como requisito previo para la

obtención del título de Bioquímica Clínica. UNIVERSIDAD CENTRAL DEL

ECUADOR. Quito, Ecuador.

Talavera, Z. (2008). Determinación de presencia de Renibacterium salmoninarum y

caracterización renal de lesiones histopatológicas presentes en truchas arcoíris

(Oncorhynchus mykiss) en crianza comercial. TESIS para optar el título

profesional de Médico Veterinario. Facultad de Medicina Veterinaria, UNMSM.

104
 Tobback, E., Decostere, A., Hermans, K., Haesebrouck, F., y Chiers, K. (2007). Yersinia

ruckeri infections in salmonid fish. J Fish Dis. 2007; 30: 257-268.

Torres, C. y Zarazaga, M. (2002). Antibióticos como promotores del crecimiento en

animales: ¿Vamos por el buen camino? Gaceta Sanitaria, 16(2), 109-112.

Recuperado en 25 de junio de 2019, de

http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0213-

91112002000200002&lng=es&tlng=es.

Troncoso, N., Saavedra, R., Olivares, A., Farías, J., Urrutia, H y Agurto, C. (2005).

Identificación de compuestos antibacterianos en macroalgas presentes en la

Región del Biobío, Chile. Revista de Biología Marina y Oceanografía Vol. 50,

S1: 199-204, abril 2015 DOI 10.4067/S0718-19572015000200007

Trujillo, L., Uribe, J., López, B. y López, D (2014). Actividad antibacteriana de extractos

crudos del crustáceo Austromegabalanus psittacus (Cirripedia: Balanidae).

Revista de Biología Marina y Oceanografía Vol. 49, Nº2: 385-392, agosto 2014

DOI10.4067/S0718-19572014000200018. Chile.

Vinatoru, M. (2001). An overview of the ultrasonically assisted extraction of bioactive

principles from herbs. Ultrasonics sonochemistry. N°. 8:303-313

Vlachos, V., Critchley, T. y Holi, A. (1997). Establishment of a protocol for testing

antimicrobial activity in southern African macroalgae. Cambridge, Gran Bretaña.

Microbios, 88: 115-123.

105
 Wink, M. (2007). Bioprospecting: The search for bioactive lead structures from nature.

En: Kayser O, Quax W (Eds) Medicinal plant biotechnology. From basic research

to industrial application, pp. 97-116. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA,

Weinheim

106
IX. ANEXOS

1. Preparación del medio de cultivo para determinar el Biotipo de las cepas:

Para 1 L de medio de cultivo:

Parte A

- Peptona, 10 g

- Cloruro de sodio (ClNa), 5 g

- Cloruro de calcio (CaCl2), 0, 1 g

- Agar, 15 g

Parte B

- Tween 80 a una concentración de 1 %.

Posteriormente, la parte A y B se esterilizaron en autoclave (121 °C durante 15 min),

posteriormente ambas partes se mezclaron y homogenizaron, y finalmente se obtuvo

el medio de cultivo.

2. Fórmula utilizada para realizar las diluciones:

C1V1=C2V2

Donde:

C1= Concentración inicial (solución stock)

V1=Volumen inicial (solución stock)

C2=Concentración final (solución final)

V2=Volumen final (solución final)

3. Metodología para la determinación del análisis fitoquímico

107
  Reacción de Dragendorff

El reactivo de Dragendorff se prepara mezclando 8 g de nitrato de bismuto

pentahidratado en 20 ml de ácido nítrico al 30 % con una solución de 27.2 g de

yoduro de potasio en 50 ml de agua. Se deja en reposo por 24 horas, se decanta y

se afora a 100 ml. La presencia de alcaloides se detecta por la formación de un

precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona este reactivo a una solución ácida

de alcaloides (Coy, et al., 2014).

 Reacción de Mayer

El reactivo Mayer se emplea para la caracterización no específica de alcaloides

La mayoría de los alcaloides reaccionan dando un precipitado blanco o amarillo

claro, amorfo o cristalino. El precipitado es (una sal compleja) puede disolverse

posteriormente en un solvente menos polar para su identificación. El reactivo

Mayer se basa en la acidez de los alcaloides en su forma de sales (Clorhidratos)

debido a que en medios básicos el reactivo Mayer no precipita. A 1 ml de extracto

ácido agregar unas gotas de reactivo de Mayer. Observar formación de

precipitado blanco (Coy, et al., 2014)

 Reacción de Wagner

Se disuelven 1.27 g de yodo (resublimado) y 2 g de yoduro de potasio en 20 ml

de agua. La solución se afora a 100 ml con agua destilada. La mayoría de las

soluciones aciduladas de alcaloides forman precipitados floculentos color marrón

(Domínguez, 1973)

 Reacción de Baljet

Se utiliza dos soluciones que se mezclan en iguales volúmenes antes de usarse.

Solución A: se coloca 1 g de ácido pícrico en 100 ml de etanol. Solución B: se

agregan 10 g de NaOH en 100 ml de agua. Para la prueba se agregan 100 μl de la

108
 muestra y 3 a 4 gotas del reactivo, siendo la prueba positiva si adquiere una

coloración naranja o rojo oscuro (Domínguez, 1973)

 Reacción de Shinoda

10 g de la muestra disuelta en etanol se trata con limaduras de magnesio, se le

aplica calor (60° C) y después unas gotas de HCL concentrado por las paredes.

Se considera positiva con la aparición de colores naranja, rojo, rosa, rosa-azul a

violeta (Domínguez, 1973)

 Reacción de Ninhindrina

El grupo alfa-amino de los aminoácidos forma complejos coloreados con la

ninhidrina: violeta azuloso en la mayoría de los aminoácidos cuyo grupo amino

es primario, amarillo para la prolina e hidroxiprolina y café para la asparagina

que tiene un grupo amido en la cadena lateral. Esta reacción también identifica

los grupos alfa-amino libres presentes en péptidos y proteínas (Universidad Jorge

Tadeo Lozano, Laboratorio de química orgánica).

 Reacción de Kedde

Solución A: ácido 3.5 dinitrobenzoico al 2 % en metanol. Solución B: KOH al

5.7 % en agua. Se mezclan cantidades iguales de las soluciones A y B del reactivo

y se añade una punta de espátula de la muestra a ensayar. Los cardenólidos y sus

agliconas dan color azulado, rosa hasta violeta (Universidad Nacional de la

Patagonia San Juan Bosco, 2010).

 Reacción de Liebermann-Burchard

Se disuelve una pequeña cantidad de muestra (1.5 mg) en cloroformo para añadir

el reactivo que se prepara agregando una gota de ácido sulfúrico en una mezcla

de 1 ml de anhídrido acético con 1 ml de cloroformo; la aparición de cualquier

color en el lapso de 1 hora determina que la prueba es positiva (Domínguez, 1973)

 Reacción de espuma

109
 Al agitar una solución acuosa de una muestra que sea o contenga saponinas, en

una probeta por 15 segundos, se forma una espuma estable como la obtenida al

agitar una solución acuosa de un jabón. Esta es una prueba presuntiva de

saponinas, ya que existen otras sustancias que también pueden formar espuma

(Medinilla, 1993).

 Reacción de cloruro férrico

Cloruro férrico (FeCl3). Cloruro de hierro (III) como catalizador de reacciones

de alquilación de benceno. La “prueba del cloruro férrico” es una prueba

colorimétrica tradicional para fenoles, que usa una disolución al 1 % de cloruro

de hierro (III) que ha sido neutralizada con hidróxido sódico hasta que se forme

un leve precipitado de FeO (OH). La sustancia orgánica se disuelve en agua,

metanol o etanol, luego se añade la disolución neutra de cloruro: se forma un

complejo coloreado transitorio o permanente (normalmente púrpura, verde o

azul) indica la presencia de un fenol. Permite reconocer la presencia de

compuestos fenólicos y/o taninos, determina tanto fenoles como taninos. A 0.2

mL de extracto etanólico agregar 1 gota de solución de cloruro férrico al 0.1 %

(Coy, et al., 2014).

 Desarrollo de una coloración rojo-vino, compuestos fenólicos en general.

 Desarrollo de una coloración verde intensa, taninos del tipo pirocatecólicos.

 Desarrollo de una coloración azul, taninos del tipo pirogalol, derivados del ácido

gálico.

 Reacción de Fehling

La prueba de Fehling se utiliza para la detección de sustancias reductoras,

particularmente azúcares reductores. Se basa en el poder reductor del grupo

carbonilo de un aldehído que pasa a ácido reduciendo la sal cúprica de cobre (II),

en medio alcalino, a óxido de cobre (I). Éste forma un precipitado de color rojo.

Un aspecto importante de esta reacción es que la forma aldehído puede detectarse

110
 fácilmente, aunque exista en muy pequeña cantidad. Si un azúcar reduce el licor

de Fehling a óxido de cobre (I) rojo, se dice que es un azúcar reductor (Panreac

Química S.L.U.)

El reactivo de fehling es una mezcla entre 2 soluciones acuosas

- Sulfato cúprico cristalizado, 35 g; agua destilada, hasta 1.000 ml.

- Sal de Seignette (tartrato mixto de potasio y sodio), 173 g; solución de hidróxido

de sodio al 40%, 3 g; agua, hasta 500 ml.

Ambas se guardan separadas hasta el momento de su uso para evitar la

precipitación del hidróxido de cobre (II).

4. Sistemas evaluados (tabla 25) para la Solubilización del extracto acetónico de H.

grandifolius (figura 47).

Figura 47. Pruebas de solubilidad para el extracto acetónico de H. grandifolius con diferentes
solventes.

111
 Tabla 25.

Solventes utilizados en la prueba de solubilidad del extracto acetonido de H.

grandifolius.

N° Sistema Solvente utilizado

evaluado

1 Agua

2 DMSO

3 Tween 20

4 Metanol

5 Acetato de etilo

6 Acetona

7 Acetona + acetato de etilo

8 Acetona + metanol

9 Acetona + metanol + diclorometano

10 Diclorometano

11 Metanol + diclorometano

112