Southern Blot

SOUTHERN BLOT
Una transferencia Southern es un método de laboratorio utilizado para

detectar moléculas de ADN específicas entre muchas otras moléculas de
ADN. La técnica lleva el nombre de su inventor, Edward Southern. Como
procedimiento de laboratorio, las transferencias Southern pueden usarse para
analizar el ADN total de un organismo, también conocido como su genoma,
para identificar una secuencia específica de interés.
El primer paso en una transferencia Southern es preparar la mezcla de ADN

rompiéndola en pequeños fragmentos usando una proteína llamada enzima
de restricción. La mezcla de fragmentos de ADN se separa según el tamaño
mediante una técnica llamada electroforesis en gel. Después de la
separación, las piezas de ADN de doble cadena se desnaturalizan, o se
separan, en cadenas individuales dentro del gel. A continuación, el ADN se
transfiere del gel a una membrana de transferencia. Aunque este paso es lo
que le da a la técnica el nombre de "Southern blotting", el término se usa
típicamente para describir todo el procedimiento.
Una vez que se completa la transferencia, la membrana lleva todas las

bandas originalmente en el gel. Luego, la membrana se trata con una
pequeña pieza de ADN o ARN llamada sonda, que ha sido diseñada para
tener una secuencia que sea complementaria a una secuencia de ADN
particular en la muestra; Esto permite que la sonda hibridice o se una a un
fragmento de ADN específico en la membrana. Además, la sonda tiene una
etiqueta, que generalmente es un átomo radiactivo o un tinte
fluorescente. Por lo tanto, después de la hibridación, la sonda permite
detectar el fragmento de ADN de interés entre los muchos fragmentos de
ADN diferentes en la membrana. [ CITATION WOR14 \l 2058 ]
ESQUEMA DE TODO EL PROCESO
1. ELECTROFORESIS DEL GEL DE AGAROSA
a) Preparar el gel Preparar un gel de agarosa al 0,8% para la electroforesis de las

muestras lista para ser sembradas. Utilizar un gel de 7x7 cm o 7x10 cm. Se necesitan 6
pocillos con una capacidad de 40 µl.
b) Antes de la siembra de las muestras En un baño calentar un vaso a 65ºC para calentar
las muestras que contienen el ADN antes de su siembra. A 65ºC las agregaciones no
específicas que se pueden generar por los extremos cohesivos generados por los
enzimas de restricción son eliminadas. Calentar las muestras A-E a 65ºC durante 2
minutos. Permitir enfriar las muestras otros 2 minutos.
c) Sembrar las muestras Sembrar las muestras A-E en pocillos consecutivos. La cantidad
de muestra a siembra debe ser de 35-38 µl.
d) Correr el gel Después de la siembra, configurar la fuente de electroforesis al voltaje
requerido. Una vez terminada la electroforesis proceder con el análisis de Soutern Blot. La
electroforesis debería pararse cuando el colorante naranja de carga haya migrado
aproximadamente 4,5 cm desde el pocillo de siembra del gel de agarosa.
2. ANÁLISIS DE SOUTHERN BLOT

Durante este proceso se transferirán los fragmentos de ADN desde el gel de
agarosa a la membrana de nylon. Después de la trasferencia, la membrana será
incubada durante un periodo corto de tiempo para fijar el ADN a la membrana.
Para evitar reactivos TOXICOS, y especialmente los radioactivos, que son
utilizados en el Southern, en este experimento se utilizará un sistema de detección
no isotópico especialmente diseñado para su uso escolar.
a) Despurinización/Desnaturalización Después de la electroforesis, el gel es
secuencialmente tratado con HCl y NaoH. El HCl introduce sitios apurínicos en el
ADN lo cual produce uniones fosfodiester e introduce “nicks” en el ADN de doble
cadena. El tratamiento con NaOH rompe los puentes de hidrógeno entre las
bases. El secuencial tratamiento ácido/base resulta en la formación de pequeños
fragmentos que facilita la trasferencia de los fragmentos de ADN en la membrana
de nylon.
1. Después de la electroforesis colocar el gel de agarosa en una cubeta con 100
ml de 0,25 N HCl. Incubar a temperatura ambiente durante 8 minutos (no
sobrepasar este tiempo). El gel debe estar completamente cubierto con la solución
y agitar periódicamente. Eliminar con cuidado la solución, que no se podrá
reutilizar. Lavar el gel con diversos cambios de 100 ml de agua destilada.
2. Colocar el gel durante 15 minutos en la solución de Desnaturalización del ADN
(0,5 M NaOH/0,6 M NaCl). El gel debe estar completamente cubierto con la
solución y agitar periódicamente. Eliminar la solución.
3. Utilizar otros 100 ml de Solución de Desnaturalización e incubar otros 15
minutos. Conservar está solución para el punto 6. b) Configurar la transferencia
del Southern Blot
4. Colocar unas hojas de papel de plástico, de aluminio o papel “whatman” en una
superficie plana del laboratorio. Sacar el gel e invirtiendo el gel (los pocillos hacia
abajo), colocar la superficie lisa de forma que quede en contacto con la membrana
de transferencia.
5. Utilizando siempre guantes, con pinzas y tijeras ajustar la membrana de nylon al
tamaño del gel. Aquellas zonas de la membrana tocadas sin guantes dejarán
residuos de aceite y no permitirán unir el ADN durante la transferencia. Muchos
guantes contienen polvo lo que aumentará el “background” en la membrana,
colocarse los guantes y lavarse con agua para eliminar el polvo.
6. Recoja con mucho cuidado la membrana por los extremos con 2 pinzas y
ligeramente doblada en el centro y lentamente humedecer (desde la mitad hacia
afuera) con la solución de Desnaturalización del punto 4.
7. Liberar la membrana y sumergir suavemente durante 5 minutos en la solución
de Desnaturalización. Utilizando unas pinzas sacar la membrana saturada de la
Solución de Desnaturalización y colocarla encima del gel de agarosa. Es MUY
IMPORTANTE que entre los diferentes elementos del dispositivo no queden
burbujas de aire.
8. Recorte el papel de filtro de blotting del mismo tamaño del gel y la membrana de
nylon. Colocar el papel de filtro encima de la membrana. Cuidadosamente, colocar
un montón de papel absorbente 4-5 cm de grosor encima del filtro de “blotting”.
Colocar una bandeja o placa de cristal y colocar por ejemplo un vaso de 400 ml
vacío como peso.
9. Permitir que la transferencia progrese durante 4 horas o toda la noche.
10. Eliminar la placa de vidrio, vaso y papeles absorbentes.
11. Con guantes enjuagados y pinzas voltear el conjunto (gel-nylon-papel de filtro)
de forma que descanse sobre el papel de filtro.
12. Utilizando un rotulador dibujar los 6 pocillos de muestra y rastrear sus
posiciones en la membrana de nylon
13. Utilizando pinzas retirar el gel de la membrana. El gel puede ser descartado y
se observará que está deshidratado
14. Poner la membrana encima de un montón de papel seco con el ADN hacía
arriba (el lado que estuvo en contacto con el gel).
15. Marcar la membrana por el lado del ADN con el nº de grupo o nombre
16. Para unos resultados óptimos, secar y fijar el ADN completamente a la
membrana. Para ello colocar la membrana entre dos hojas de papel de filtro y
colocar a 80ºC durante 30 minutos.
Bibliografía
SOUTHERN BLOT. (s.f.). Obtenido de https://bioted.es/protocolos/SOUTHERN-BLOT-

ANALISIS.pdf
WORLD LIBRARY OF SCIENCE. (2014). Obtenido de A Global Community for Science
Education: https://www.nature.com/wls/definition/southern-blot-289/

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