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¿Qué es el Northern Blot?...2

Material y protocolo ………. 4

Aplicaciones ……………….. 6

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¿Qué es el Northern Blot?

Fue una de las primeras técnicas que permitió el análisis cualitativo y cuantitativo de
la expresión génica a nivel de ARN. Nombrado en honor al Southern Blot (utilizado
para detectar ADN) y al Western Blot (para detectar proteínas),
conseguimos detectar moléculas de ARN a partir de un tejido o tipo celular concreto
de cualquier organismo, además se considera fundamental para los estudios de
expresión génica en células eucariotas, permite la desnaturalización rompiendo los
enlaces de hidrógeno mediante la aplicación de formaldehído, al contrario que en el
Southern Blot ( mediante una endonucleasa de restricción).
Antes de explicar el procedimiento, es necesario saber por qué se desea medir un
ARNm, ya sea por determinar qué tejidos expresan un gen concreto, como determinar
los factores que regulan la expresión de un gen dado, ya sea por causas hormonales
como nutricionales.
La técnica de Northern Blot implica la separación de moléculas de ARN por tamaño
mediante electroforesis en gel y se detecta en una membrana utilizando una sonda
de hibridación con una secuencia de bases complementaria a toda o parte de la
secuencia del ARNm diana.
Existen tres técnicas para medir un ARNm, aunque la primera y la más utilizada es
Northern Blot, un segundo método en el ensayo de protección de ARNasa, ya que
ofrece una mayor sensibilidad y el tercero utiliza la reacción en cadena de la
polimerasa con transcriptasa inversa, ofreciendo aún mayor sensibilidad que la
técnica de Northern Blot y puede ser incluso útil para medir niveles muy bajos de un
ARNm en un tejido. El Northern Blot ha sido históricamente utilizado para validar y
complementar datos generados por otras técnicas de análisis de ARN, como la PCR
cuantitativa en tiempo real (qPCR) y el secuenciamiento de ARN (RNA-seq).
Se han publicado diferentes protocolos basados en el diseño y el marcaje de la sonda
denominado LED (tres metodologías) que modifican tres aspectos fundamentales
que consisten principalmente en reemplazar las sondas de oligonucleótidos de ADN
por sondas que contienen ácidos nucleicos bloqueados o no accesibles
El pretratamiento de las muestras supone un paso importante para garantizar la
integridad y la calidad del ARN, lo que a su vez afecta la calidad y la interpretación de
los resultados . Algunas consideraciones importantes para el pretratamiento incluyen:
El primer paso es extraer el ARN de las muestras biológicas. Este proceso
generalmente supone la ruptura de las células para liberar el ARN y luego la
purificación del ARN para eliminar contaminantes como lípidos, proteínas etc. Es
crucial preservar la integridad del ARN. El ARN puede ser susceptible a la
degradación por ribonucleasas presentes en el medio ambiente o dentro de las
células. Por lo tanto, se utilizan técnicas y reactivos para minimizar la degradación del
ARN, como la adición de agentes desnaturalizantes como el fenol/cloroformo y la
inhibición de ribonucleasas con sustancias químicas como el dietilpirocarbonato Es
importante realizar un tratamiento con DNasa, las cuales degradan el probable ADN
contenido para asegurar la máxima pureza. Después de la extracción y el
pretratamiento, es importante cuantificar el ARN para asegurarse de que se utilice
una cantidad adecuada en el experimento de Northern Blot. Además, algunas veces
se normaliza la cantidad de ARN entre diferentes muestras para garantizar que sean

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válidas. Durante el proceso de pretratamiento, también se evita la exposición a
temperaturas extremadamente altas o bajas, así como la contaminación con
nucleasas u otros contaminantes que puedan degradar el ARN.

En el Northern Blot la membrana es una parte esencial. Después de que se ha

separado el ARN mediante electroforesis en gel, es posteriormente transferido a la
membrana de nitrocelulosa o nylon, esta membrana actúa reteniendo el ARN y
permitiendo la detección específica mediante la hibridación con sonda. Podemos
diferenciar dos tipos de membranas: membranas de nitrocelulosa y membranas de
nylon, aunque existe una preferencia a la membrana de nylon debido su alta afinidad
hacia las moléculas de ácido nucleico.

Las membranas de nitrocelulosa tienen una alta capacidad de unión a los ácidos
nucleicos debido a que tienen porosidades finas que facilitan el proceso. Para su uso,
requieren un tratamiento previo para activar la unión de los ácidos nucleicos,
realizándose mediante inmersión en soluciones alcalinas. Sus láminas son frágiles,
rompiéndose con facilidad durante su manipulación, por ello requiere un cuidado
especial. Al contrario, las membranas de nylon tienen un material más resistente en
comparación con las membranas de nitrocelulosa, además no requieren un
tratamiento previo, por ello el proceso es más simple y rápido, son incluso más
uniformes en la retención de ácidos nucleicos adquiriendo una capacidad de unión
constante en toda la membrana y debido a su durabilidad también pueden ser
reutilizables. Las membranas de nylon suelen ser más caras.

Su elección dependerá de factores como la sensibilidad que se requiere, así como las
preferencias del laboratorio. Como recomendaciones a su uso, siempre deben
usarse guantes, utilizando unas pinzas o con máximo cuidado por los bordes.

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Material
1. agarosa
2. formaldehido
3. 20X MAE
4. equipo de electroforesis
5. 20X SSPE (contiene 3,0 M de NaCl, 0,2 M de NaH2PO4 y 0,02 M de EDTA con
un pH de 7,4.)
6. tinte de carga
7. papel de filtro
8. membrana de nylon
9. formamida
10. transiluminador de luz ultravioleta
11. centrifugadoras
12. tubos de centrifugado
13. micropipetas
14. DNTPs para hibridar

Protocolo
1. extracción y purificación del RNA
2. se realiza una electroforesis para separar los fragmentos de ARN según su
tamaño. El gel de agarosa debe estar disuelto en buffer MOPS para asegurar la
estabilidad, y el formaldehído evita estructuras secundarias. la mezcla de
formaldehido, formamida y buffer MOPS ayuda a las condiciones
desnaturalizantes. Se añade colorante de carga para poder visualizar las
cadenas de RNA. La manipulación de este debe de ser rápida para evitar su
degradación. Se tiñe el gel con bromuro de tibio que se cala en las bases
nitrogenadas para su detección en una foto documentador que usa luz UV, en
esto se puede observar la presencia y la calidad del RNA.
3. Se prepara un papel filtro tipo Whatman 3 mm, se coloca sobre un soporte que
filtra el buffer de transparencia. una vez este papel está totalmente mojado, se
coloca más papel de filtro para eliminar las burbujas de aire, tras eso se coloca
el gel de agarosa y después se coloca una membrana de nylon, al cual por
capilaridad se les unirá el RNA, pero no le atravesará. Se añade más papel filtro
encima de la membrana, luego se le pone film transparente para asegurar su
transferencia y se aplica peso encima de este. se deja reposar por 12/24h.
para asegurarse que las bandas se han transferido correctamente a la
membrana, se vuelve a teñir el gel de agarosa y se revela otra vez en la foto
documentador. Se retira la membrana y se sumerge en tampón SSC 6X y se
coloca en el transiluminador, esta membrana también absorbe el colorante
de carga.

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4. Antes de proceder con la hibridación se pre-híbrida la membrana con un buffer
de Prehibridacion. Esta se lleva a incubar de 2 a 4 h de 45ºC a 65ºC, esto
prepara la membrana para la hibridación.
Después se desecha el buffer de Prehibridacion y se le añade un buffer de
hibridación sumado a la sonda y se deja incubar de 12h a toda la noche. Se
desecha el buffer de hibridación y se lava con tampón de lavado y se incuba 3
veces durante 30 min a 52ºC, para eliminar los mis match. Se coloca la
membrana de nylon y se coloca sobre una película fotográfica y se tapara con
casete y se lleva a una temperatura de -70ºC para evitar la radiación de la
sonda usada (en caso de que la sonda usada haya sido radiactiva)para que las
bandas pasen por completo a la película y se tengan los resultados para ser
visualizados. El resultado serán bandas oscuras en la película de rayos X.

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Aplicaciones del Northern Blot

Las aplicaciones del Northern-Blot, las podemos organizar en 2 grupos:

• Investigación:

Se utilizará para la supervisión de la expresión génica y el procesamiento de los diferentes

tipos de ARN.
Los patrones de expresión obtenidos nos ayudan a conocer las funciones de los genes. Las
sondas de ARN pueden darnos una idea de su tamaño, sugerir ajuste alternativo, o motivos
repetidos en la secuencia.

• El Northern-Blot permite observar un patrón particular de expresión genética entre de

tejidos, órganos, infecciones causadas por patógenos y durante el curso del
tratamiento de esas infecciones.
• La variación en el tamaño del producto de un gen puede además indicarnos
deleciones o errores en el proceso de transcripción.
• Alterando la sonda podemos conocer la secuencia e incluso determinar qué región
del ARN ha sido dañada.

• Clínico:

Se utilizará para los diagnósticos del cáncer y algunas enfermedades o saber la existencia de
un gen extraño en nuestro organismo.
Nos mostrará la sobreexpresión de oncogenes y la desregulación de genes oncosupresores
en células cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales.

• La transferencia Northern se utiliza como herramienta para los estudios de expresión

génica relacionados con la sobreexpresión de genes que causan cáncer y la
expresión génica durante el rechazo de trasplantes.
• La transferencia Northern se ha utilizado como una herramienta molecular para el
diagnóstico de enfermedades como la enfermedad de Crohn gracias a que tiene
naturaleza autoinmune.

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