Universidad de San Carlos de Guatemala Facultad de Agronomía Instituto de Investigaciones Agronómicas
Universidad de San Carlos de Guatemala Facultad de Agronomía Instituto de Investigaciones Agronómicas
Universidad de San Carlos de Guatemala Facultad de Agronomía Instituto de Investigaciones Agronómicas
FACULTAD DE AGRONOMÍA
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES AGRONÓMICAS
TESIS
POR
INGENIERO AGRONÓMO
EN
EN EL GRADO ACADÉMICO DE
LICENCIADO
RECTOR MAGNÍFICO
Distinguidos miembros:
De conformidad con las normas establecidas por la Ley Orgánica de la Universidad de San
Carlos de Guatemala, tengo el honor de someter a vuestra consideración el trabajo de tesis
titulado:
Atentamente,
A:
DIOS Fuente eterna de sabiduría, que me ha dado la vida, la
paciencia necesaria, y las herramientas para que cumpla
otro de mis objetivos.
MIS AMIGOS Y William Capriel, Jorge Mendoza, Henry Aj, Victor Suyén, Ana
COMPAÑEROS DE Melgar, Silvia García, Mauricio Rosales, Alfredo Cabrera,
TRABAJO Carlos Bolaños, Julio Peña, Arturo Salas, Gustavo Jacinto,
Alfonso Vásquez, Pedro Ampuria, Miriam de la Roca,
Rolando Aragón, Felipe Esquequé, Elsita Vásquez y en
especial a Esperanza de León.
Como recuerdo de las experiencias compartidas y muestra
de sincera amistad.
iv
A:
GUATEMALA
FACULTAD DE AGRONOMÍA.
AGRADECIMIENTOS
Quiero expresar mis agradecimientos a las personas que colaboraron de alguna y/o otra
manera, en el desarrollo de la presente investigación:
A:
MIS ASESORES
Fernando Hernández, Estuardo Catalán, Rony G., Venancio R., Ing. Agr. Werner
Ovalle y al Ing. Ovidio Pérez.
CONTENIDO
ÍNDICE PÁGINA
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 7. Análisis de varianza para la variable número de brotes, a los 15 días después
de la siembra {(con datos transformados, Y’ = √ (Y+1), CENGICAÑA 2003..... 50
Cuadro 9. Resumen de la prueba de Tukey (α=0.05), según el factor nivel de BAP, para
la variable número de brotes................................................................................ 52
Cuadro 10. Análisis de varianza para la variable longitud de brotes, a los 15 días después
de la siembra {(con datos transformados, Y’ = Log (Y+1)}, CENGICAÑA 2003.. 53
Cuadro 11. Resumen de la prueba de Tukey (α=0.05), según la interacción variedad x BAP
para la variable longitud de brotes....................................................................... 54
Cuadro 12. Análisis de varianza para la variable número de hojas, a los 15 días después
de la siembra {(con datos transformados, Y’ = √ (Y+1)}, CENGICAÑA 2003..... 57
Cuadro 13. Resumen de la prueba de Tukey (α=0.05), según la interacción variedad x BAP
para la variable número de hojas......................................................................... 58
ix
Cuadro 14. Análisis de varianza para la variable número de brotes, a los 30 días después
de la siembra {(con datos transformados, Y’ = √ (Y+1)}, CENGICAÑA 2003... 61
Cuadro 16. Análisis de varianza para la variable longitud de brotes, a los 30 días después
de la siembra {(con datos transformados, Y’ = Log (Y+1)}, CENGICAÑA 2003.. 65
Cuadro 18. Análisis de varianza para la variable número de hojas, a los 30 días después
de la siembra {(con datos transformados, Y’ = √ (Y+1)}, CENGICAÑA 2003..... 69
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 11. Número de hojas por brotes de tres variedades de caña de azúcar CP 722086,
SP 792233 y PR 872080 a los 15 y 30 días después de la siembra,
CENGICAÑA, 2003............................................................................................... 79
APÉNDICE
Cuadro. 21. A Reactivos e insumos utilizados para la realización del cultivo in vitro
de tres variedades de caña de azúcar....................................................... 88
xi
GLOSARIO DE ABREVIATURAS
RESUMEN
Se utilizó el medio de cultivo descrito por Murashige y Skoog (1962), como agente inductor la 6-
bencilaminopurina, es un regulador del crecimiento catalogado dentro del grupo de las citocininas,
considerada en varios estudios por ser un compuesto muy activo en la proliferación de brotes en
diversas especies vegetales. Se evaluó con 5 niveles a 0.15, 0.30, 0.45, 0.60 y 0.75 mg/l más un
testigo éste sin la aplicación de BAP. Cada tratamiento dentro del medio de cultivo fue
suplementado con 0.01 mg/l de ácido indolacético como auxina, 0.1 mg/l de cinetina y 150 mg/l de
xiv
ácido cítrico como antioxidante. El tipo de explante utilizado consistió en el ápice meristemático de
cada una de las variedades de caña de azúcar.
Se observó que la variedad PR 872080, presentó el mayor número de brotes a los 15 y 30 días
después de la siembra con 10.04 y 17.92 brotes por explante. Fue la que presentó la mayor
longitud de brotes, pero en la producción de hojas se determinó intermedia con 4.06 y 4.50
hojas/brote. La variedad SP 792233 con 5.49 y 13.93 brotes/explante fue intermedia, a la vez fue
la que presentó un tamaño de brote de 1.37 y 1.65 cm siendo el más pequeño de todo el estudio al
igual que en el número de hojas con 3.98 a 4.46. Con una menor respuesta en el número de
brotes la variedad CP 722086 con 5.83 y 9.79 pero intermedia en la longitud con 1.56 y 2.17
cm/brote, y con el mayor número de hojas diferenciadas del resto de variedades con 4.19 a 4.78
hojas/brote.
El nivel 0.75 mg/l de BAP, presentó el mayor número de brotes/explante a los 15 y 30 días con
8.95 y 20.43, pero a la vez con la aplicación de BAP en el medio de cultivo existió una disminución
en la longitud y en la diferenciación de hojas. El testigo (0.00 mg/l de BAP), fue constante 4.55 y
4.60 brotes/explante y con la mayor longitud en las tres variedades de caña.
1
1. INTRODUCCIÓN
Previo a lo anterior, se hizo necesario evaluar una metodología que permitió la propagación
adecuada de las tres variedades de caña de azúcar con el uso de dicha técnica de cultivo de
tejidos. En el presente trabajo, se evaluó el efecto que produce la 6-Bencilaminopurina en la
proliferación de brotes, en cinco niveles más un testigo en la variedad CP 722086, SP 792233 y
PR 872080, para lo cual se empleó un diseño estadístico completamente al azar, con seis
tratamientos y 10 repeticiones analizándose cada variedad por separado a los 15 y 30 días
después de la siembra.
Este estudio se realizó en las instalaciones del laboratorio de Cultivo de Tejidos del Centro
Guatemalteco de Investigación y Capacitación de la Caña de Azúcar (CENGICAÑA), ubicado en la
finca Camantulul, Santa Lucia Cotzumalguapa.
3
3. MARCO TEÓRICO
De acuerdo con Orozco, et al. (1995) (25), en Guatemala, la caña de azúcar se propaga
tradicionalmente por medio de esquejes, en paquetes de 110 yemas para 10 metros lineales; con
una tasa de multiplicación de 1:10. Actualmente está en práctica el uso de plántulas provenientes
de yemas extraídas, que de acuerdo con Viveros y Cassalett (1994) (46), reportan una proporción
de 1:140 como tasa de multiplicación. Esta tasa es baja si se pretende obtener suficiente semilla
de variedades promisorias para establecer pruebas de molienda (14). La multiplicación por el
método tradicional es relativamente bajo, además presenta riesgos de incremento de
enfermedades trasmitidas por medios mecánicos. Otro aspecto son las enfermedades
sistemáticas que están latentes frecuentemente en el material vegetal, por lo que al transportar
semillas-estacas infectadas, de un país a otro, pueden éstas ser llevadas a diferentes partes del
mundo, como lo es el intercambio de germoplasma vegetal.
usando propagación masiva por cultivo de tejidos. Comparado con los métodos convencionales,
donde si la semilla estaca posee tres a cuatro yemas y cada yema produce un tallo con
aproximadamente nueve yemas cada uno de estos producen aproximadamente 32 yemas a los
nueve meses.
Reino: Plantae
Subreino: Embryobionta
División: Magnoliophyta
Clase: Liliopsidae
Subclase: Commelinidae
Orden: Cyperales
Familia: Poaceae
Subfamilia: Chloridoidae
Género: Saccharum
Especie: S. officinarum (10).
A. Morfología
Orozco, et al. (25), menciona que Blackburn (1985), cita a Barber (1918) y Jeswiet (1925),
como los pioneros en la morfología de la caña de azúcar, luego en 1939, Artshcwager propuso el
primer descriptor botánico que en 1948, fue mejorado tomando encuenta las características
vegetativas de formas silvestres de Saccharum. Finalmente Artshcwager y Brandes en 1958, lo
completaron con estudios acerca del origen características y descripciones de clones
representativos de Saccharum officinarum.
7
a. El tallo
El tallo también conocido como una caña o culmo, está formado por los entrenudos que se
encuentran separados por los nudos. La expresión de las características del tallo depende de los
factores genéticos ambientales y la interacción de ambos. La capacidad de macollamiento y el
hábito de crecimiento del tallo dependen principalmente de factores genéticos (25).
i. Entrenudo
El diámetro, color, forma y longitud del entrenudo son características varietales, que
también pueden ser influenciados particularmente por la luz y disponibilidad de nitrógeno
(Purseglove, 1972) (33). El color del entrenudo el cual varia en su expresión y penetrancia;
genéticamente es debido a la presencia en antocianinas rojas y azules en células epidermales y
clorofila verde en tejidos más profundos. Cuando ambos están ausentes el color es amarillo. Este
carácter también puede ser modificado por efectos de la luz. Según Amaya, et. al. (1995) (2), la
longitud del entrenudo es influenciada en gran medida por las condiciones edafoclimáticas y por el
manejo agronómico. Blackburn (1985), citado por Purseglove, 1972 (33), indica que la longitud y
diámetro del entrenudo son afectados principalmente por los factores nutricionales, temperatura y
disponibilidad de agua. Por esta razón el tallo podría mostrar entrenudos cortos y delgados en el
tercio medio reflejando crecimiento retardado durante una época seca.
ii. Nudo
El nudo es la base de la vaina y lámina foliar en el cual se desarrollan además las yemas y
hojas, esta constituido por él anillo de crecimiento la banda de raíces, la cicatriz foliar, el nudo en
sí, la yema y el anillo ceroso. La banda o anillo ceroso es una capa que se observa en la parte
inferior del nudo sobre el entrenudo; su intensidad es un carácter varietal (33).
De las partes del tallo, a la yema se le asigna la mayor importancia por ser el origen de
nuevas plantas. Las partes más importantes de las yemas son las alas que se localizan a los lados
o en la parte superior, el poro germinativo el ápice en la parte superior el cual es una prolongación
de la estructura de la yema. La parte visible de la yema es una escama que en algunos clones
esta cubierta totalmente de pelos en otros solamente en las alas y pocas son libre de pelos.
Según Orozco, et al. (25), Jeswiet (1916), citado por Moore (1987), con base en esta
8
La presencia ocasional de más de una yema en el nudo se reporta como una anormalidad
fisiológica. Las características como forma, tamaño, color y vellosidad de la yema pueden no diferir
dentro de una misma variedad. Se describen 8 diferentes modalidades en la forma de la yema las
cuales fueron agrupadas por Skinner (1972), en 3 formas: redonda, ovalada y puntuda. De
acuerdo con Artschwager y Brandes (1958), citado por Orozco, et al. (25), las formas ovaladas son
las más comunes, la localización de la yema y el desarrollo alcanzado por el ápice a nivel del anillo
de crecimiento es también un carácter clonal.
b. La hoja
i. Lámina foliar
Las hojas están adheridas al tallo a través de la base de los nudos, alternamente en forma
dística al tallo, se reporta que el tamaño y forma de crecimiento de las hojas en la planta varían
considerablemente. La longitud y el ancho de lámina foliar dependen de las variedades; por lo que
se sugiere el ancho de la lámina foliar o la tasa del ancho y largo como un carácter más estable.
Por otro lado el crecimiento de las hojas esta determinado por el tamaño de la hoja en sí y la
dureza de la nervadura central. El color de las hojas es un carácter clonal que puede variar entre
verde claro a oscuro y es menos frecuente encontrar variedades con colores púrpura o verde
púrpura (25).
ii. Cuello
De acuerdo con Artschwager (1951), citado por Orozco., et al. (25), el cuello es la unión de
la lámina foliar y la vaina en sus extremos, y se encarga del movimiento de la lámina foliar. La
superficie exterior esta formada por dos áreas generalmente triangulares que difieren de la lámina
foliar en el color y estructura interna. Como regla la forma del cuello es un carácter clonal, aunque
pueden ocurrir variaciones en un mismo tallo y entre los dos cuellos de una misma hoja. Las
formas reconocidas del cuello son rectangulares deltoide y ligular.
9
iii. Vaina
La pubescencia o afate, generalmente mayor en la vaina, de la hoja que en la lámina foliar
al nivel de la lígula, es un carácter efectivo en la diferenciación clonal. La presencia de afate sobre
la superficie de la vaina en cantidad y longitud puede diferir conforme a la variedad. La lámina
foliar envejece juntamente con la vaina, como característica varietal estos pueden o no adherirse
al tallo, también se reporta que la intensidad con que se adhieren las vainas al tallo difiere con las
variedades (25).
3.1.2 Micropropagación
Cuando se considera que la mayoría de las plantas que se propagan mediante el cultivo
aséptico, se originan generalmente en pequeños esquejes, se puede apreciar rápidamente que no
hay nada fundamentalmente nuevo acerca de la multiplicación de las plantas por medio del cultivo
de tejidos (16). La micropropagación, originalmente se definió como “Cualquier procedimiento
aséptico que comprenda la manipulación, en las plantas, órganos, tejidos o células que produzcan
poblaciones de plántulas y que permitan el desvío tanto del proceso sexual normal como de la
propagación vegetativa no aséptica que se practica convencionalmente (16).
Las aplicaciones del cultivo de tejidos son numerosas y diferentes. Las posibilidades en
agricultura podrían resumirse en los siguientes aspectos: Propagación de plantas, obtención de
plantas libres de patógenos, mejoramiento genético de los cultivos y conservación e intercambio
de germoplasma (24).
En esta etapa es cuando se inoculan los explantes al medio de cultivo artificial, los cuales
pueden provocar la proliferación de microorganismos en donde pueden crecer y desarrollarse,
compitiendo con el cultivo, y a la vez destruyendo al explante, es por eso que es necesario que
todos los explantes deben estar debidamente limpios y desinfectados.
B. Multiplicación
En ésta etapa sucede la formación de nuevas células por división, o por aumento en
tamaño, está influenciada por las condiciones in vitro y la ganancia en peso seco da como
resultado la diferenciación de novo. También existe la capacidad del cultivo y de los medios
inductores para que puedan ser divididos y transferidos a nuevos medios de cultivos para seguir la
secuencia de su multiplicación (24).
C. Enraizamiento y transplante
Esta consiste en el endurecimiento del cultivo para que pueda adaptarse a las condiciones
fuera del laboratorio, para que sé de esta etapa, se debe trasladar el cultivo a otro medio
reduciendo en un 50% las sales inorgánicas como a la vez realizar cambios en el balance
hormonal, es decir, disminuir las citocininas y aumentar las auxinas, esto con la finalidad de que
exista una mayor proliferación de raíces para el sostenimiento de la planta. El período de
endurecimiento o aclimatación en la cual la planta deberá colocarse en condiciones normales para
su desarrollo total. Para lograr ésta fase se deberá lavar la planta y eliminar los restos del medio
de cultivo que pudiera quedar en las raíces y luego sembrarlas en suelo estéril, cubriéndolas con
bolsas plásticas a las cuales se le abrirán agujeros para aclimatarlas poco a poco a su nuevo
hábitat.
11
A. Medio de Cultivo
a. Agua
Los medios de cultivo de tejidos están constituidos en su mayor parte por agua; por lo tanto,
es necesario utilizar agua de intercambio iónico o agua destilada, ya que el agua natural incluye
algunas sustancias que pueden causar influencia negativa para el crecimiento de las plantas “in
vitro” (41).
b. Componentes Inorgánicos
Los componentes inorgánicos son importantes para el crecimiento de las plantas. Si
escasean estos elementos, aparecen los síntomas característicos correspondientes a la
deficiencia de cada elemento (41).
Nitrógeno
El nitrógeno es componente de aminoácidos (proteínas), vitaminas y ácidos nucleicos.
Mientras la planta está en crecimiento activo, necesita gran cantidad de nitrógeno. Este se
encuentra en forma de NH4NO3 y KNO3, y en cantidad adecuada según la especie de planta.
Existen varias influencias del nitrógeno, en concentraciones altas, promueve el
enraizamiento, mientras que, en concentraciones bajas, promueve el desarrollo de callo. Dos
fenómenos semejantes son causados mediante la función de NH4+ (36).
Fósforo
El fósforo es uno de los elementos necesarios para el metabolismo de las plantas.
Principalmente, es utilizado para sintetizar ATP como fuente de energía. Dentro de los medios de
cultivo, las plantas lo absorben en forma de PO4 3-.
Potasio
Existe relación entre el potasio iónico y la diferenciación de órganos.
Calcio
El Calcio es componente de la pared celular.
Magnesio
El magnesio es un componente importante de la molécula de clorofila.
12
Hierro
Para los vegetales, el hierro es importante, debido a que es un componente de la clorofila.
Normalmente se da en forma de quelato (Fe-EDTA) en los medios de cultivo, ya que en otra forma
se precipitaría (41).
Microelementos
Se adicionan manganeso (Mn), cobre (Cu), zinc (Zn), molibdeno (Mo) y boro (B) a los
medios de cultivo como microelementos.
c. Componentes Orgánicos
Vitaminas
Según la especie de planta, así se adiciona tiamina (vitamina B1), pyridoxina (vitamina B6)
y ácido nicotínico, generalmente para el cultivo de la caña de azúcar es indispensable agregar la
tiamina al medio de cultivo (29, 31,40).
Mio-inositol
Se sabe que el agua de coco incluye componentes que promueven la producción de células
u órganos, y la diferenciación de las mismas. El mio-inositol es uno de estos componentes.
Aminoácidos
Acerca de la función de los aminoácidos, se sabe que estos promueven la producción y
diferenciación de células y tejidos. Sin embargo, algunas veces pueden ocurrir inhibiciones en el
crecimiento de las vitroplantas cuando se adiciona uno solo al medio de cultivo. En tal caso, se
deben incluir combinaciones de varias clases para que actúen conjuntamente.
d. Componentes naturales
Los más utilizados son la pulpa de plátano, agua de coco, emulsión de pescado, jugo de
naranja, extracto de malta, hidrolizado proteico (caseína), jugo de tomate, extracto de levadura,
etc. En varios casos, éstos compuestos inducen diferenciación y la producción de células y tejidos
eficazmente. Sin embargo, debido a que son componentes muy complejos, no son productos
estables ni homogéneos, es mejor evitar su uso, sobre todo en trabajos de investigación (41,45).
13
e. Otros componentes
Fuente de Carbono
Originalmente, las plantas pueden producir azúcar como fuente de energía a través de la
fotosíntesis. Sin embargo, las vitroplantas casi no realizan fotosíntesis debido a la baja intensidad
de luz en la que se desarrollan y aunque lo hagan producirán muy poco azúcar. A causa de esto,
es necesario adicionar cierta cantidad de azúcar como fuente de energía. Por lo general esta
cantidad varia entre 1 y 3% de sucrosa o glucosa que se agrega al medio de cultivo.
Agar
Como un gelificante del medio de cultivo, el agar se utiliza más que otros agentes. Sin
embargo, no se puede usar uno corriente como se ofrece en el mercado, ya que este es impuro y
puede inhibir el crecimiento de las vitroplantas. Por consiguiente, se debe utilizar uno con alto
grado de pureza. Normalmente, se adiciona entre 0.6 a 1% al medio de cultivo.
Phytagel
Es un gelificante que se aplica en porcentajes bajos que el agar, su precio en el mercado es
elevado, pero de mayor pureza.
i. Contaminación
La contaminación provoca cuantiosas pérdidas en la micropropagación masiva y hace
ineficiente económicamente algunos procesos. La contaminación en cultivo de tejidos puede
originarse de dos fuentes:
Contaminación por microorganismos: Los contaminantes patógenos pueden ser externos o
internos. Los primeros llamados exógenos, se encuentran en todas partes. Las esporas de estos
organismos se mueven en las corrientes de aire, sobre partículas de polvo. Los microorganismos
internos, sistémicos o endógenos, son los que se encuentran en el interior del tejido del explante,
ya sea en espacios intercelulares o intracelulares.
Dentro de los microorganismos que se describen como contaminantes del cultivo de tejidos,
se incluyen virus, bacterias, hongos (16, 23, 41). Sandoval, 1987, citado por López Morales (18),
menciona que para obtener buenos resultados en la micropropagación, recomienda mantener
controlada la contaminación en un rango de 10-20%.
3.1.2.4 Oxidación
Pocasangre, 1993, citado por López Morales (18), refiere que el color café característico de
la oxidación, llamado ennegrecimiento del explante, se debe a que las enzimas monofeloxidasa
(tirasinada y la polifenol oxidasa (catecoloxidasa) oxidan los fenoles dando como resultado
quinonas.
El fenómeno de la oxidación se observa normalmente en explantes viejos después de
cultivarlos durante un tiempo largo, formándose materia orgánica alrededor del explante y el medio
15
de cultivo se torna café oscuro. Algunas especies tienen una tendencia de oxidación desde el
inicio del cultivo, ocurriendo necrosis o inhibición del crecimiento. La toxicidad por oxidación se
cree que ocurre a través del algún complejo químico de fenol orgánico metabólico (15, 23).
Sandoval, 1987, citado por López Morales (18), indica que las principales fuentes de
oxidación son el tipo de material que se utilice, ya que incluso dentro de una misma especie
existen distintos grados de oxidación, y otra, es una defectuosa Desinfestación superficial del
material que es transferido al laboratorio.
A. Antioxidantes
Muller L. & A. Krikorian (1985), citados por Cambara (6), indican que los antioxidantes son
sustancias que se usan durante la preparación de los explantes o que se adicionan al medio para
evitar o reducir la oxidación de ciertos compuesto, especialmente derivados de fenoles ó
polifenoles, que pueden afectar el desarrollo de los explantes.
Lee, citado por López Morales (18), hace las siguientes propuestas para impedir el
ennegrecimiento de los explantes:
• Utilizar Polivinilpirrolidona (PVP).
• Modificando el potencial redox, a través de agentes reductores o con menor disponibilidad de
oxígeno.
• Inactivando las enzimas fenolasas.
• El control más efectivo, son los subcultivos frecuentes y la eliminación de tejidos que se
encuentran casi muertos y por lo general se localizan en la base de los brotes.
Ken Okabe (23), sugiere los siguientes pasos para evitar el fenómeno de la oxidación:
en alcohol etílico, sin embargo, algunas veces inhibe el crecimiento. Además no se disuelve en el
medio y no es común en el mercado. Generalmente se aplica en el rango de 0.1 a 1%.
Según Cambara (6), se puede utilizar otros antioxidantes para prevenir la oxidación:
Acido cítrico: Es un ácido trícarboxilico muy común en plantas, especialmente frutos; es usado
como antioxidante en la preparación de explantes y medios, es una de los compuestos claves del
ciclo de Krebs (Ciclo de los ácidos).
Reactivo de Cleland: Es utilizado para retardar la oxidación, especialmente de grupos _SH:
reduce disulfidos cuantitativamente, es sinónimo de Citiotreitol o DTT.
Ovalle, 1996 (29), afirma que es posible utilizar antioxidantes químicos pero no todos son
efectivos, por ejemplo, el ácido ascórbico es conveniente utilizarlo por períodos cortos, porque
muy rápidamente se vuelve un oxidante fuerte; o sumergir los explantes en soluciones de cisteina
HCl.
hasta que se obtenga alguno que no este contaminado. Se puede modificar la forma de
Desinfestación para que mejore la tasa de sobrevivencia como agregar:
Alcohol al 70% (30 segundos) más hipoclorito de sodio al 1% (10 minutos) ó hipoclorito de sodio al
3% más Tween 20 (5 minutos) y finalmente se enjuaga tres veces con agua esterilizada durante 5
minutos cada vez, ó
Alcohol al 70% (30 segundos) más 25 ppm de PCNB (Pentacloronitrobenceno) más 500 ppm de
penicilina G (30 minutos) luego hipoclorito de sodio al 3% más Tween 20 (5 minutos), y pro último
enjuague tres veces con agua esterilizada (5 minutos cada vez).
Alcohol al 70% (30 segundos) hipoclorito de sodio al 1%* Tween 20 (10 minutos) se enjuagua con
agua esterilizada (tres veces, cinco minutos) más la solución para descontaminación (30 minutos),
18
se agrega 1 ml en la superficie del medio conjuntamente con el tejido, cultivándose 10 días bajo
oscuridad.
Perea (1988) (30), reporta que los factores físicos de los laboratorios deben tener en
cuenta: la temperatura y la luz. El grado higrométrico del aire no tiene mucha importancia puesto
que las plantas cultivadas en medio cerrado “in vitro” se encuentran en una atmósfera
naturalmente saturada. El cuarto de cultivo debe ser climatizado con temperatura estable y con
estantes sobre los cuales se coloca los cultivos que deberán ser sometidos a fotoperíodos para un
buen desarrollo.
A. Temperatura: la caña de azúcar por ser una planta tropical se establece entre un rango de
25-30°C. Para el cultivo in vitro, es necesario programar la temperatura de acuerdo con los
períodos de luz y oscuridad o constante. De igual manera se debe establecer la temperatura con
las exigencias de la planta, climas cálidos o fríos.
Otro de los factores interesantes, es la temperatura mantenida en los recipientes cerrados, la cual
es superior a la del cuarto climatizado con luz.
morfogenéticos. Selbert (1978) considera que sobre callos de tabaco las radiaciones azules y
violetas inducen la formación de brotes mientras que las radiaciones rojas inducen la rizogénesis.
Generalmente las fuentes de luz utilizadas consisten en tubos fluorescentes caracterizados por
sus curvas de emisión espectral.
Se reconoce actualmente que la mayor parte de la actividad fisiológica de las plantas, está
regulada por un complejo de sustancias químicas llamadas hormonas (13). Este término fue
acuñado por los especialistas en fisiología animal y a partir de allí han surgido confusiones
considerables en cuanto a la terminología de las sustancias de crecimiento (45).
Los reguladores de las plantas se definen como compuestos orgánicos, que en pequeñas
20
cantidades, fomentan, inhiben o modifican de alguna manera cualquier proceso fisiológico vegetal.
Las hormonas de las plantas o fitohormonas, son reguladores producidos por las mismas plantas,
que en bajas concentraciones, regulan los procesos fisiológicos de aquellas y por lo general se
desplazan de un lugar de producción a un sitio de acción (45).
Las hormonas del crecimiento se definen como “sustancias que siendo producidas en una
parte de un organismo son transferidas a otra y en ésta influencian un proceso fisiológico
específico”.
En realidad es muy difícil definir el término hormona vegetal con toda precisión. Muchas
sustancias del tipo hormonal pueden actuar en su lugar de síntesis, actúan al parecer de modo no
específico o actúan a nivel genético como inductores o represores. A menudo se prefiere el
término fitorregulador, refiriéndose a compuestos naturales o sintéticos que inducen respuestas en
el crecimiento, desarrollo o metabolismo (5).
Para Hartman (16) las auxinas y citocininas son las más importantes para regular el
crecimiento y la morfogénesis en el tejido de las plantas y en el cultivo de órganos, para ellas,
reguladores sintéticos han sido descubiertos con una actividad biológica que iguala o excede la de
las sustancias de crecimiento equivalentes. No hay alternativas químicas para las giberelinas
naturales, las cuales son extraídas de hongos cultivados y se utilizan como reguladores exógenos.
Para Bidwell (5), las hormonas son por definición, compuestos orgánicos sintetizados por
las plantas superiores, que influyen sobre el crecimiento y desarrollo, que actúan generalmente en
áreas diferentes a donde son producidas y se encuentran presentes y activas en muy pequeñas
cantidades.
El término hormona ha sido reservado para ciertos compuestos naturales que ocurren en
las plantas como reguladores del crecimiento. Aunque el ácido naftalenacético (ANA), el ácido 2,4-
Diclorofenoxiacetico (2,4-D) y la Kinetina son reguladores del crecimiento las cuales no son
considerados como hormonas.
3.1.3.1 Auxina
Thiman (39), define a las auxinas como sustancias orgánicas que promueven el crecimiento
(aumento en volumen), a lo largo de eje longitudinal, en concentraciones aproximadas de 10-3
21
Molar. Todos los compuestos que tienen actividad auxínica poseen hidrógeno y oxígeno en
proporciones y disposiciones diferentes y algunos de ellos contienen, además, nitrógeno y cloro;
tienen estructuras simples, pero la mayoría son complejos (47).
Las auxinas son sustancias que participan en la elongación y división celular. Las
concentraciones recomendadas son de 0.1 a 10 mg/l. Dentro de las auxinas más utilizadas están
el ácido indolacético (AIA), el ácido indolbutiríco (AIB), el ácido naftalenacético (ANA) y el 2,4
diclorofenoxiacético (2,4-D), siendo el AIA una auxina natural (13,18).
Se debe distinguir claramente entre el efecto de las auxinas sobre la formación de las raíces
y su efecto sobre el alargamiento radicular. En general las concentraciones requeridas para el
primero de éstos procesos son mucho mayores que para el segundo.
Un efecto importante de la auxina, que también implica división de células, es el de
provocar la iniciación de raíces laterales y adventicias en la raíz y en el brote. Este efecto tiende a
correlacionar el grado de ramificación del sistema radical con el grado de desarrollo de yemas de
brote. Más aún, debido al transporte polar hacia abajo, la auxina tiende a acumularse justamente
arriba de cualquier sitio dañado en el tallo o en el sistema radical. Esta acumulación estimula la
iniciación de raíces adventicias en el lugar dañado, con lo que promueve la regeneración de las
raíces perdidas y aumenta las probabilidades de supervivencia de las partes aéreas de una planta
después que haya sufrido una lesión abajo o al nivel del suelo (13).
Uno de los mejores estimuladores del enraizamiento es la auxina AIB, tiene una actividad
auxínica débil y los sistemas de enzimas destructores de auxinas, la destruyen en forma
relativamente lenta. Un producto químico persistente resulta muy eficaz como estimulante de las
raíces. Debido a que el AIB se desplaza muy poco, se retiene cerca del sitio de aplicación. Los
reguladores del crecimiento que se desplazan con facilidad pueden causar efectos indeseables de
22
El AIB y el ANA resultan más efectivos en la inducción del enraizamiento que el AIA. El AIA
es muy inestable en las plantas y se descompone rápidamente en soluciones no esterilizadas, aun
cuando permanece activo en soluciones estériles durante varios meses. Los rayos fuertes del sol
pueden destruir en 15 minutos una solución de 10 ppm de AIA. Las amidas de AIB y ANA son
también agentes muy efectivos del enraizamiento. La forma amida del AIB es menos tóxica que el
ANA y por tanto, puede utilizarse con mayor seguridad. El AIB produce un sistema de raíces
fuertes y fibrosas, mientras que los ácidos fenoxiacéticos a menudo producen un sistema de
raíces atrofiado y maltoso, compuesto de raíces dobladas y gruesas. Las sustancias promotoras
del enraizamiento son a menudo más eficaces cuando se utilizan en combinación (45).
Las auxinas mas frecuentemente incorporadas a los medios para inducir enraizamiento son
AIA (0.05-10 mg/l), ANA (0.05-1 mg/l), ó AIB (0.5-3 mg/l). Estos componentes pueden algunas
veces ser tratados como alternativas, pero frecuentemente la formación de raíz es mucho mejor
con una que con otra. El ANA por ejemplo, es superior al AIA y AIB para el enraizamiento de
brotes de Olivo (17).
3.1.3.2 Citocinina
A. Concepto de Citocinina
Las citocininas son potentes factores del crecimiento para la diferenciación y son sustancias
que regulan la división celular (4). Haberlandt (1913) encontró que los tejidos floemáticos difundían
una o unas sustancias capaces de inducir la división celular de tejido parenquimatoso de patata.
Skoog observó que en segmentos de tallo de Nicotiana spp., que incluía corteza, vasos y médula
no crecían en un medio simple y necesitaba añadirle una auxina para que hubiera alargamiento y
proliferación de la médula, por otra parte, si se colocaba esta aislada y añadía auxina se
observaba alargamiento de las células sin división de las mismas, pero cuando la médula se ponía
en contacto con el tejido vascular, podía observarse de nuevo división celular (4).
23
El primer compuesto con las propiedades de la citocinina que se logró identificar fue la
cinetina, aunque fue aislada a partir del DNA del esperma del arenque, ya que no se encuentra en
forma natural en las plantas (4). La cual es considerada la primera citocinina que se descubrió y
aislada por Skoog en Winscon. El DNA fue purificado en estado cristalino, una sustancia activa
que fue identificada como 6-(furfurilamino)-purina y que se conoce con el nombre de Kinetina (9,
4,15).
Miller (1961) aisló una sustancia a partir de granos inmaduros de maíz que demostró poseer
alta actividad sobre el proceso de división celular y que denominó como zeatina. Al año siguiente
describió que se trataba de un derivado de la adenina N6 substituido (9).
La semejanza entre la estructuras de zeatina y Kinetina, así como de otras sustancia con
actividad sobre la división celular, que se encuentra sin modificar en la naturaleza, tales como 6-
(metilamino)-purina, 6-(dimetilamino)-purina o 6-(β² -isopentenilamino)-purina, ha hecho que todos
estos compuestos se agrupen en una nueva categoría hormonal que recibe el nombre genético de
citocininas (13).
¾ Kinetina 6-furfurilaminopurina.
¾ BAP 6-bencilaminopurina o
¾ BA benciladenina.
24
¾ PBA 6-(bencilamino)-9-(2-tetrahydropyranyl)-9H-purina o
¾ SD 8339 N-benzyl-9-(2-tetrahydropyranyl)-adenina.
a. Bencilaminopurina
N CH2
N N
N
N
Las citocininas son producidas en las raíces, se sintetizan principalmente en los ápices
radiculares y son transportados por el xilema al tallo y resto de la planta, aunque también se
conducen a través del floema, este transporte puede ser de tanto de órgano a órgano como de
raíz a tallo o viceversa (4, 9).
25
D. Mecanismo de acción
Según Evans, et al. (1983), citado por Roca, (34), considera que el modo de acción de las
citocininas es a través de la síntesis de proteínas específicas para el desencadenamiento de la
mitosis. Dentro de la misma la Kinetina ha recibido mucha atención como una sustancia
estimuladora de la división celular, no se ha demostrado que esté presente como un compuesto
natural y generalmente se reconoce como un artefacto.
Las citocininas son, típicamente las hormonas de la división celular activando el proceso
directamente (como efecto de la activación metabólica), a comparación de las otras hormonas que
lo hacen de forma indirecta. Además determinan la dominancia apical en interacción con las
auxinas. Los fenómenos estimulados con las citocininas son característicos de las plantas y tejidos
jóvenes, por lo que parecen ser “factores de juvenilidad”, por lo que la deficiencia provoca
senescencia.
F. Interacción auxina-citocinina
AUXINA CITOCININA
EFECTO DE AUXINA + CITOCININA
ALTO BAJO
Formación de raíces.
Iniciación de callos en monocotiledóneas.
En caña de azúcar se han realizado varios trabajos de mejoramiento genético con la técnica
del cultivo in vitro y esta especie es ideal para este objetivo; pero a medida que se aumentan los
subcultivos, se pierden cromosomas los cuales de 82 en promedio en la R0, descienden a 30 en la
R8; la R2 es recomendado como la mejor para la regeneración (31).
Estudios en los cuales se evalúa la variabilidad producida por los cultivos es un poco
contradictoria (31). Feldemann (1984) analizó de 10 a 16 sistemas enzimáticos en plantas
obtenidas de callos de 13 variedades concluyendo que la caña de azúcar es una planta estable en
los cultivos in vitro, los cambios producidos se deben al rejuvenecimiento y a la sanidad de las
plantas regeneradas.
Se ha encontrado que la inestabilidad en los cultivos in vitro esta influenciado por los
genotipos y las auxinas, como también señalan que se deben de seleccionar los genotipos que se
sometan a esta técnica según la estabilidad de su cariotipo (31).
Nickell, (1961), citado por Hurtado (17), inicio en Hawaii los primeros trabajos de
investigación, con esta especie, utilizando la metodología de cultivo de tejidos; ésta técnica
actualmente complementa al sistema tradicional de selección; permite manipular genéticamente
los materiales aptos para seleccionar, a partir de poblaciones celulares con el propósito de obtener
cultivares con características fenotipicas deseables.
Los primeros cultivos asépticos de caña de azúcar se elaboraron con el medio White al
que se le agregó agua de coco y ácido 2,4-diclorofenoxiacético (19). En 1964 Nickell desarrolló la
técnica del cultivo de tejidos en la caña de azúcar obteniendo masas callosas a partir de trozos de
parénquima (44).
28
De acuerdo a lo expuesto por A. Dookum, et al. (14), el cultivo in vitro de la caña de azúcar
ha ganado importancia en muchos países productores de este cultivo, a la vez esta siendo
adoptado para la micropropagación de esta especie como una de sus técnicas más importantes.
Hendre (1983), citado por Cambara, (6), indica que en la India se ha demostrado que es
posible producir alrededor de 260,000 plantas provenientes de un solo meristemo apical en un
período de 4 meses y aproximadamente 200,000 plantulas podrían ser enraizadas a partir de ese
explante en dos meses más. Este número podría ser suficiente para plantar 10 hectáreas de
prueba en el campo.
En Hawaii, Comstock (1988), ha reportado que alrededor de 20,000 plantulas podrían ser
multiplicadas semanalmente a partir de plantas regeneradas de puntas de brotes conteniendo el
meristema apical (14).
3.1.4.1 Micropropagación
En base a lo expuesto por Dookun, et al. (1995) (14), el medio más utilizado para las etapas
metodológicas de iniciación, brotación y regeneración, consiste en las sales de Murashige &
Skoog (1962) con ligeras modificaciones en macroelementos, vitaminas y fitohormonas también
con algunas mejoras actuales como: el uso de medio líquido para la etapa de iniciación más un
antioxidante para reducir la fenolización, como Polivinilpyrrolidone (PVP) o ácido cítrico, a la vez
mencionada Lee (1987) y Nagai (1988) citados por Nand L. (22), el carbón activado se puede
agregar al medio sólido en la etapa de iniciación. El pH del medio debe estar comprendido entre
5.6-5.8; la esterilización se ejecuta a 110°C por un espacio de tiempo de 15 minutos a 15
libras/pulgadas² equivalente a 1.2 atmósferas/cm² de presión.
De acuerdo con Muller, citado por Cambara, (6), él término cultivo de tejidos es usado
frecuentemente como generalización para describir cualquier tipo de cultivo aséptico de células,
tejidos, órganos, protoplastos, etc. Manteniendo los explantes por más de un día en un medio
artificial.
30
B. Cultivo de Células
Barba y Nickel (1969), (6), demostraron que la producción de plantas de caña de azúcar
procedentes de cultivo de tejidos es posible. Se puede decir que las técnicas abarcan la formación
de callo y la posterior diferenciación de tejidos.
Según Artschwager, (1925), citado por Pérez Ponce, (31), para el cultivo de la caña de
azúcar se emplea cualquier parte de la planta: el meristema subapical, desde el primero hasta el
octavo internudo, las hojas jóvenes aún enrolladas, la inflorescencia antes de emerger, los
meristemas apicales del tallo y de la raíz, y el parénquima medular. La inflorescencia sin emerger
es la mejor, por su alta capacidad de regeneración, la cual no es recomendada en mejoramiento
por su baja variabilidad.
Es recomendable las hojas jóvenes tomadas de tallos jóvenes que tengan un rápido y
vigoroso crecimiento, Los meristemas subapicales no son recomendables por que se contaminan
y por que sufren fenolización. Explantes de la hoja -1 extraídos asépticamente son los más
adecuados para un rápido crecimiento de los callos (31).
31
Alexander en 1973, citado por Méndez Salas, (19), señaló que existían diferencias en la
capacidad regenerativa de los callos, mismas que atribuyó a variaciones, en el número
cromosómico de las células de la caña de azúcar.
Medio de cultivo: Según Pérez Ponce, (31), la formación de callos en la caña de azúcar es
relativamente fácil. Se han empleado los siguientes medios de cultivo con buenos resultados:
Heinz y Mee (1969), Murashige y Skoog (1962), White (1963), Heinz et al. (1977) y Liu (1983).
Para la formación del callo, el 2,4-diclorofenoxiacético es la única auxina que debe de
manejarse, según la variedad, y la dosis administrada oscila entre 2 y 5 mg/litro (31).
A. Inducción de enraizamiento
las coordenadas 14°19’30’’ latitud norte y longitud 91°03’ 03’’ Oeste, a una altura sobre el nivel del
mar de 280 metros (IGM 1985) (8).
300 msnm
ESTRATO ALTO
DEPARTAMENTO DE ESCUINTLA
100 msnm
ESTRATO MEDIO
)
CENGICAÑA
ESTRATO BAJO
MAPA
ZONA DE LADE
CAÑERA ZONA
GUATEMALA
CA ÑERA DE GU ATEMALA
SIN ESCALA
OCEÁNO PACÍFICO
La variedad Canal Point. 722086 tiene tallos de color amarillo verdoso, posee vigor y es de
buen cierre de calle. Su crecimiento es erecto y no posee afate. Es suave para el corte y además
desbajera bien. Tiene muy buen retoño, es resistente al carbón y tolerante al mosaico. En lo que
respecta a su madurez es altamente floreadora (más del 90%) lo que implica que es una variedad
temprana.
Posee nudo obconoidal, anillo de crecimiento prominente y yemas de forma redonda con
poro germinativo central (forma de globo). La lígula al nivel del último cuello es de forma creciente
con centro ancho. Esta variedad se reconoce a cierta distancia durante la etapa de su crecimiento
por un color verde claro rojizo presente sobre la vaina de las hojas.
Esta variedad a la edad de 9 meses se distingue por su follaje abundante cuyas hojas
superiores se muestran en forma de espada, un grupo intermedio es decumbente y las hojas
bajeras caídas. La floración es nula, los tallos crecen erectos y muestran un regular deshoje
natural. La forma del entrenudo es cilíndrico ligeramente en zig-zag con abundante cera en la
banda cerosa y a lo largo del entrenudo. El canal de la yema es casi superficial que abarca 1/4 del
mismo.
La vaina de la variedad PR 872080, es verde claro con poca cera sin presencia de afate. En
la lámina foliar de las aurículas es lanceolada larga y la otra transicional ascendente, ambas se
localizan siempre sobre el mismo lado. El último cuello visible es verde claro cuya superficie es lisa
y velluda en el borde, la lígula de su patrón es creciente lineal (25, 27).
35
4. OBJETIVOS
4.1.1 Establecer un método para la obtención de brotes de caña de azúcar in vitro de las
variedades CP 722086, SP 792233 y PR 872080.
5. HIPÓTESIS
5.1 Existe por lo menos un nivel de 6-Bencilaminopurina que induzca a la mayor proliferación
de brotes, para cada una de las variedades en la fase de multiplicación.
5.2 Al menos un nivel de 6-Bencilaminopurina induce a la mayor longitud de brotes, para cada
una de las variedades de caña de azúcar.
5.3 Existe por lo menos un nivel de 6-Bencilaminopurina que induzca mayor diferenciación de
hojas por brote para cada variedad.
37
6. METODOLOGÍA
6.2 Material vegetal, equipo, cristalería, reactivos, insumos y medio de cultivo usados
para la realización del estudio
Para la elaboración de las soluciones concentradas los componentes del medio de cultivo
MS, se agruparon de la siguiente forma: Macroelementos, microelementos, quelatos de hierro,
vitaminas y reguladores del crecimiento. Se utilizó agua destilada-esterilizada, los recipientes de
vidrio color ambar fueron esterilizados a calor seco los cuales se emplearon para guardar dichas
soluciones. La finalidad de agrupar los ingredientes en forma de soluciones concentradas es que
permite reducir pasos en la preparación del medio de cultivo y evitar precipitación de algunos
reactivos. Los volúmenes a preparar dependieron de las concentraciones de las soluciones las
cuales fueron a 10X, 100X, 1000X y 5000X.
Para la preparación de cada una de las soluciones concentradas del MS y reguladores del
crecimiento, se procedió de la siguiente manera (cuadro 1): se realizó con la mayor asepsia
posible, a los recipientes de solución (beaker) se les agregó agua destilada-esterilizada a un tercio
de su capacidad, para luego agregar los diferentes componentes previamente pesados los cuales
se mantuvieron en constante agitación.
Para el caso de la solución de hierro (solución 6), fue necesario calentar (40°C) cada
reactivo por separado en un beaker de 250 ml de capacidad con 50 ml de agua destilada-
esterilizada, para luego realizar la mezcla y aforar a 200 ml. La mayoría de los componentes de los
medios básicos son solubles en agua, los reguladores del crecimiento se diluyen en pequeños
volúmenes de bases como NaOH, KOH, ácidos como el HCl y alcohol etílico. Cada solución se
almacenó en recipientes identificados en la refrigeradora a una temperatura de 2-5°C (1, 20, 31).
Para la homogenización de los agregados fue necesario el uso de una barra magnética y
una estufa-agitador. Se ajustó el pH a 5.7-5.8 con NaOH y HCl al 1.0 y 0.1N, luego se agregó agar
como gelificante a 0.8%, seguidamente se disolvió dentro del medio para lo cual fue necesario el
uso de un microondas.
El medio de cultivo se distribuyó en tubos de ensayo de 150X25 mm, con 15 ml del mismo.
Se utilizó medios líquidos y sólidos, para el caso del primero fue necesario el uso de puentes de
papel filtro que sirvió de soporte al explante (15). Para la esterilización, ésta consistió en el uso de
autoclave durante 20 minutos, a una presión de 1.05 kg/cm² y a una temperatura de 121 °C.
40
Los medios de cultivo empleados para esta etapa, las sales de MS no variaron en lo
absoluto al igual que la sucrosa y el pH, la única variante fue la disminución de la auxina (AIA) y la
cinetina, el uso del GA3 no fue necesario (cuadro 2), la aplicación de ácido cítrico como
antioxidante fue imprescindible, seguidamente se aplicó los niveles de BAP para su evaluación
(Cuadro 3). El medio de cultivo fue líquido, el cual se depositó en recipientes de vidrio de 200 ml
de capacidad, aproximadamente 25 ml de medio.
41
Cuadro 3. Reguladores del crecimiento y niveles de BAP aplicados al medio de cultivo en las
tres variedades de caña de azúcar.
6.3.1 FASE I
En esta fase se realizó una serie de pruebas preliminares, con la finalidad de prevenir la
oxidación, la contaminación por microorganismos y sobrevivencia de los explantes: una de ellas
consistió en evaluar antibióticos y antioxidantes previo al establecimiento de los explantes al
cultivo de tejidos, utilizándose la metodología descrita por Cruz (12), para lo cual se utilizó la
combinación de ácido cítrico (0.4%) y ácido ascórbico (0.2%) como antioxidantes y Sulfato de
estreptomicina y oxitetraciclina (Agrimicyn WP 16.5%) a 0.15%, methyl-1-(butylcarbamoyl)-2-
benzimidazolecarbamato (Benomyl WP 50%) a 0.1% y cloranfenicol sulfato a 500 ppm como
antibióticos (0.4/0.2/0.15/0.1/500).
Para el control del oscurecimiento oxidativo en explantes de las tres variedades de caña de
azúcar se evaluó el efecto de antioxidantes, según estudios realizados por Cruz (12), utilizándose
el ácido cítrico en el medio de cultivo a 150 mg/l previo a la evaluación realizada con l-cisteína (10
42
Luego el material se introdujo a una solución de alcohol etílico al 70% durante 2 minutos.
Los cogollos se transfirieron a una solución de hipoclorito de sodio al 2% durante 5 minutos, a esta
solución se le agregó 2 gotas de Polyoxyethylenesorbitan monolaurate (tween 20) y luego se agitó
con una pinza esterilizada para uniformizar el proceso de desinfestación, este reactivo actúa como
surfactante para que el proceso sea más eficiente (1, 20).
recipientes esterilizados para tal actividad dentro de la cámara de flujo laminar. Luego el material
vegetal se introdujo en una solución de ácido cítrico a 100 ppm, esterilizado.
Utilizando cajas de petri esterilizadas, pinzas y bisturíes y con 3-5 ml de ácido cítrico a 150
ppm, se procedió a la disección del explante para lo cual se eliminó las envolturas más profundas
que recubre y protegen al ápice meristemático, luego se procedió a la extracción del explante
(ápice meristemático) con dos primordios foliares, el cual consistió de un tamaño de 3-5 mm.
6.3.1.4 Siembra
Para la fase I, los explantes se sembraron en medio MS sólido, la colocación de los mismos
fue de forma invertida, es decir con la parte de crecimiento (ápice) sumergida en el medio de
cultivo. Se utilizaron tubos de ensayo de 150X25 mm, con 15 ml de medio. El tamaño del explante
fue de 3-5 mm, con dos primordios foliares (31). Luego se transfirieron los cultivos al cuarto de
incubación, se colocaron a 26±2 °C y en total oscuridad por un período de 8 días.
En un lapso de tiempo los explantes produjeron brotes para lo cual fue necesario la
transferencia y división de macollas a nuevos medios. Se procedió a multiplicar los explantes de
las variedades de caña SP 792233, PR 872080 y CP 722086, con la finalidad de obtener un brote
de un tamaño de 3 cm de longitud y un grosor de 2-3 mm, para lo cual se requirió 800 a 900
cultivos y de 150 a 180 días.
6.3.2 FASE II
En dicha fase se evaluó el efecto de los niveles de BAP, el tipo de explante proveniente de
la fase I, fue seleccionado e inoculado en los diferentes niveles del regulador de crecimiento, con
44
la finalidad de encontrar la respuesta de acuerdo a las variables en estudio, dicha fase consistió de
un brote como explante y 30 días en incubación.
6.3.2.1 Siembra
Para la inoculación de los explantes en esta fase, se utilizó el medio descrito en la Cuadro 2
con sus respectivos niveles de BAP, más la aplicación de ácido naftalenacético a 0.01 mg/l como
auxina y una citocinina (cinetina a 0.1 mg/l), a la vez se utilizó el antioxidante ácido cítrico a razón
de 150 ppm en cada uno de ellos (12).
Los cultivos fueron transferidos al cuarto de incubación, el cual con una temperatura de 26
±2°C y luz de gas neón color blanca controlada de 1000 lux aproximadamente, fotoperíodo de 16
horas de luz y 8 de oscuridad, proporcionó las condiciones adecuados para la evaluación del
BAP, durante 180 días y 30 días más que duro esta segunda fase para hacer un total de 210 días
que duraron las dos fase de la micropropagación y la investigación respectiva de las variedades de
caña de azúcar CP 722086, SP 792233 y PR 872080.
Donde:
Yijk = Variable de respuesta en la ijk-ésima unidad experimental.
µ = Efecto de la media general.
Ai = Efecto del i-ésima variedad.
Bj = Efecto de la j-ésimo nivel de BAP.
ABij = Efecto de la interacción de la i-ésima variedad, j-ésimo nivel de BAP.
Eijk = Error experimental asociado a la ijk-ésima unidad experimental.
45
FACTORES NIVELES
A1 A2 A3
A Variedades
CP 722086 SP 792233 PR 872080
B1 B2 B3 B4 B5 B6
B BAP (mg/l)
0.00 0.15 0.30 0.45 0.60 0.75
TRATAMIENTOS
Descripción
# Código
Variedad X mg/l BAP
1 A1B1 CP 722086 X 0.00
2 A1B2 CP 722086 X 0.15
3 A1B3 CP 722086 X 0.30
4 A1B4 CP 722086 X 0.45
5 A1B5 CP 722086 X 0.60
6 A1B6 CP 722086 X 0.75
7 A2B1 SP 792233 X 0.00
8 A2B2 SP 792233 X 0.15
9 A2B3 SP 792233 X 0.30
10 A2B4 SP 792233 X 0.45
11 A2B5 SP 792233 X 0.60
12 A2B6 SP 792233 X 0.75
13 A3B1 PR 872080 X 0.00
14 A3B2 PR 872080 X 0.15
15 A3B3 PR 872080 X 0.30
16 A3B4 PR 872080 X 0.45
17 A3B5 PR 872080 X 0.60
18 A3B6 PR 872080 X 0.75
El total de unidades experimentales fue de 180 unidades, producto de las 3 variedades (CP
722086, SP 792233 y PR 872080), 5 niveles de BAP, más 1 testigo (0.00 mg/l de BAP) y 10
repeticiones.
Para determinar la respuesta de los explantes a los diferentes niveles del regulador del
crecimiento BAP, se registró el número de brotes adventicios inducidos por explante, a los 15 y 30
días de realizada la siembra. Para la toma de datos fue necesario extraer la macolla (conjuntos de
brotes) de los recipientes de vidrio para cuantificarlos.
Para establecer los cambios en el crecimiento de los brotes se registró la longitud de los
mismos, ésta se tomó de la base al ápice de cada brote reportándose en cm. La variable se
registró a los 15 y 30 días después de la siembra. Extraída la macolla de los recipientes se
procedió a separar cada brote para medir su longitud utilizándose una regla graduada en cm.
Para determinar la dinámica del crecimiento de los brotes se realizó el conteo del número
de hojas de los mismos por separado. Para la toma de datos ésta se realizó a los 15 y 30 días de
realizada la siembra.
Para una adecuada interpretación de la información al realizar los ANDEVA, se verificó los
supuestos de la normalidad de los errores experimentales, la independencia de error y la
homogeneidad de varianzas. Para el caso de la normalidad se utilizó la prueba de Shapiro & Wilk
(normalidad de residuos), el cual es un método gráfico en donde se ploteó RES*PRES en el
programa estadístico SAS (Statistical Análisis System) y para la independencia de error, no se
efectuó prueba alguna debido a que la aleatorización al momento de manejar el experimento se
realizó de manera correcta.
Se determinó que los datos analizados no cumplieron con algunas de las suposiciones
(distribución asimétrica, correlación positiva entre las medias y las varianzas de los tratamientos),
por tal razón se procedió a la transformación de los datos originales de las variables como se
describe en el cuadro 6. El uso de esta medida correctiva fue para validar el ANDEVA e
incrementar la precisión para poder medir las diferencias entre las medias de los tratamientos y de
tal manera se generó conclusiones y recomendaciones más reales.
Cuadro 6. Tipo de transformación empleada en las variables de estudio en las tres variedades
de caña de azúcar, a los 15 y 30 días después de la siembra.
A los datos trasformados se les realizó el análisis de varianza para cada variable de
respuesta, y una prueba de Tukey al 5% de significancia aquí los datos de las medias fueron
reconvertidas a la escala original, para determinar el mejor tratamiento. La utilidad de las
separación de medias, fue para seleccionar el o los tratamientos que dieron significancia al
análisis de varianza en base a la comparación de las medias de los tratamientos. Para dicho
ensayo, se necesitaba una severidad alta por tal razón la prueba de Tukey al 5%, detectó
deferencias entre medias altas, para declarar diferencias significativas entre los tratamientos.
48
7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Esta investigación se realizó en dos fases: la primera consistió en una etapa inicial o el
establecimiento de explantes, y la etapa de multiplicación en donde se evaluó el efecto de la 6-
bencilaminopurina, en las tres variedades de caña de azúcar siendo estas: CP 722086, PR
872080 y SP 792233.
officinarum menciona que dicho cultivo es recalcitrante al establecimiento in vitro. Por otra parte
CENGICAÑA, menciona específicamente que la CP 722086 y PR 872080 no se han podido
propagar, debido a la presencia de oxidación que provoca prematuramente la muerte del explante,
dificultando su reproducción clonal a nivel de cultivo de tejidos.
La variedad que presentó mayor oxidación fue SP 792233, la CP 722086 con una oxidación
intermedia y la PR 872080 en menor porcentaje, por tal razón el uso de antioxidantes fue de suma
importancia, tanto en la fase de iniciación como en la fase de multiplicación, resultando el mejor
tratamiento para este caso el ácido cítrico a 150 mg/l para ambas variedades de caña de azúcar.
Lo anterior coincide con lo reportado por Cruz, (11), quien indica que el ácido cítrico a una
concentración de 150 ppm redujo considerablemente el efecto de la oxidación en las variedades
PR 872080, CP 722086 y SP 792233 siendo ésta última la de mayor oxidación al cultivo in vitro.
En esta fase, se utilizó como explante brotes provenientes de la fase inicial, los cuales se
seleccionaron de una manera estándar en cuanto a tamaño y vigorosidad para la realización de la
evaluación de los tratamientos de 6-bencilaminopurina, esto en base a las variables de estudio en
las tres variedades.
Cabe mencionar que para la evaluación de las dosificaciones de BAP, fue necesario incluir
en el medio de cultivo (MS) ácido cítrico a una concentración de 150 mg/l, más una auxina (ácido
indolacético a 0.01 mg/l), suplementado con cinetina a razón de 0.1 mg/l. Pérez Ponce, (31),
mencionan que al suplementar en el medio de cultivo una auxina y cinetina con BAP existe un
efecto de sinergismo en la cual la estimulación de la brotación se incrementa; al respecto
coinciden Shurkla (36) y Suavaire (38) en donde indican que la combinación de cinetina y BAP son
importantes para la multiplicación de brotes y la incorporación de AIA al medio de cultivo produce
mayor longitud de los mismos en el cultivo de la caña.
Cuadro 7. Análisis de varianza para la variable número de brotes, a los 15 días después
de la siembra {(con datos transformados, Y’ = √ (Y+1), CENGICAÑA 2003.
C.V. = 22.50%
Media número de
Variedad Agrupación de Tukey al 5% *
brotes
PR 872080 10.04 A
CP 722086 5.83 B
SP 792233 5.49 B
* No existe diferencia significativa en medias con la misma letra.
La variedad con el mayor número de brotes para los diferentes niveles de BAP, después de
los 15 días de la siembra fue la PR 872080, por tal razón se considera que la respuesta a la
aplicación de BAP al medio de cultivo produce un efecto inductor de brotes considerablemente alto
en las condiciones in vitro, sin descartar las variedades CP 722086 y SP 792233 en las cuales
dicho efecto inductor fue igual estadísticamente, pero menor en relación a la primera variedad. La
característica de la CP 722086, se evidencia en la baja proliferación y recalcitrante al cultivo in
vitro por efectos de la alta producción de compuestos fenólicos en la etapa de multiplicación. La
SP 792233 produjo un tamaño de brote sumamente pequeño por lo que poco se diferenciaron,
dificultando hasta cierto punto su cuantificación (Figura 4).
6 5 4 3 2 1
Figura 4. Efecto de los tratamientos de BAP en el número de brotes, en la variedad SP 792233 y característica
de tamaño de sus brotes, a los 15 días después de la siembra. CENGICAÑA, 2003. (1 = 0.00, 2 = 0.15,
3 = 0.30, 4 = 0.45, 5 = 0.60 y 6 = 0.75 mg/l de BAP)
52
De acuerdo a la prueba de Tukey al 5% (Cuadro 9), para el factor nivel de BAP, el nivel con
0.75 mg/l, presentó el mayor número de brotes. Estadísticamente los niveles 0.45, 0.30, 0.60 y
0.15 mg/l de BAP produjeron similar cantidad de brotes en las variedades de caña de azúcar en
estudio.
Cuadro 9. Resumen de la prueba de Tukey (α=0.05), según el factor nivel de BAP, para la
variable número de brotes.
Por otra parte el nivel que presentó la menor media en la brotación fue el tratamiento 0.00
mg/l siendo el testigo, sin aplicación de BAP al medio de cultivo, por tal razón no se observó
estimulación a la inducción de brotes en los explantes para el cultivo in vitro de la caña de azúcar,
como lo demuestra la media de 4.55 brotes.
El análisis de varianza para la variable de respuesta longitud de brotes (Cuadro 10), mostró
diferencia significativa para los factores: variedad, BAP y la interacción variedad x BAP. El
coeficiente de variación fue el 10.05%, el cual indica que el manejo del experimento para esta
variable fue adecuado.
53
Cuadro 10. Análisis de varianza para la variable longitud de brotes, a los 15 días después
de la siembra {(con datos transformados, Y’ = Log (Y+1)}, CENGICAÑA 2003.
C.V. = 10.05%
* Diferencia significativa (5%)
Cuadro 11. Resumen de la prueba de Tukey (α=0.05), según la interacción variedad x BAP
para la variable longitud de brotes.
En relación a los tratamientos evaluados 0.15, 0.30 y 0.75 mg/l de BAP, estadísticamente
son considerados intermedios para el caso de la longitud de los brotes. Con la aplicación del
regulador BAP y al elevar los niveles existe una disminución en la longitud de brotes, como se
evidencia en los niveles anteriormente descritos. Por tal razón, la longitud es afectada
55
negativamente por las citocininas, por que al existir mayor formación de brotes la longitud es
menor, como se evidencia en el nivel con 0.75 mg/l de BAP.
6 5 4 3 2 1
Figura 5. Efecto de los tratamientos de BAP en la longitud de los brotes, en la variedad PR 872080, a los 15
días después de la siembra. CENGICAÑA, 2003. (1 = 0.00, 2 = 0.15, 3 = 0.30, 4 = 0.45, 5 = 0.60 y 6 =
0.75 mg/l de BAP)
ii. Variedad SP 792233, según la interacción variedad x BAP a los 15 días después de la
siembra, en tres variedades de caña de azúcar
Se considera al tratamiento con un nivel de 0.45 mg/l de BAP, el cual se determinó como el
de menor respuesta a esta variable, y en base a su media de 1.20, siendo la más baja en el
experimento.
56
iii. Variedad CP 722086, según la interacción variedad x BAP a los 15 días después de la
siembra, en tres variedades de caña de azúcar
Podemos observar que el nivel 0.00 mg/l de BAP, con una media estadística de 1.91 la
longitud de brotes fue mayor, esto comparado con el nivel con una dosis de 0.75 mg/l de BAP en
el cual se evidencia la disminución de dicha variable.
Podemos observar que para las tres variedades de caña de azúcar: PR 872080, CP 722086 y SP
792233 el número de hojas fue constante en un rango de 4.07 a 5.02 hojas por brote.
Cuadro 12. Análisis de varianza para la variable número de hojas, a los 15 días después de
la siembra {(con datos transformados, Y’ = √(Y+1)}, CENGICAÑA 2003.
C.V. = 4.10%
Por medio de la prueba de Tukey (Cuadro 13), se agrupó a las variedades PR 872080, SP
792233 y CP 722086 en base al número de hojas, éstas a los 15 días después de la siembra, las
cuales presentaron diferencia en los niveles del regulador de crecimiento BAP. En el primero, el
tratamiento en donde la variedad PR 872080 en el testigo (0.00 mg/l de BAP) produjo 5.02
hojas/brote.
Según la prueba de Tukey al 5% (Cuadro 13), ésta variedad en el tratamiento 0.00 mg/l,
produjo mayor número de hojas, según indica la media 5.02 hojas/brote, cuyo valor es el más alto
58
del resto de tratamiento evaluados, por tal razón ese mismo nivel, es considerado hasta cierto
punto como el de mayor diferenciación de hojas para esta variable. Caso contrario, se indica con
el tratamiento en donde el nivel con 0.75 mg/l de BAP, siendo la concentración más alta indujo
menor número de hojas, y a la vez se fundamenta con la media 4.07 hojas/brote. Por tal razón al
existir mayor concentración BAP en el medio de cultivo, la diferenciación de hojas se reduce y por
lo tanto la cantidad de las mismas.
Cuadro 13. Resumen de la prueba de Tukey (α=0.05), según la interacción variedad x BAP
para la variable número de hojas.
Los tratamientos 0.15, 0.30, 0.45 y 0.60 mg/l de BAP, con las medias 4.90, 4.58, 4.26 y
4.16 hojas/brote, se consideran iguales en cuanto a la cantidad de hojas formadas.
Estadísticamente estos tratamientos producen un número de hojas de una magnitud intermedia
para dicha variedad, en la fase de multiplicación o evaluación de los tratamientos de BAP, a los 15
días después de la siembra.
59
ii. Variedad SP 792233, según la interacción variedad x BAP, para la variable número de
hojas a los 15 días después de la siembra, en tres variedades de caña de azúcar
Al analizar el tratamiento de 0.15 mg/l de BAP el cual fue alto en número de hojas 4.73
hojas/brote según la media, al compararlo con el tratamiento de 0.75 mg/l de BAP el cual produjo
4.19 hojas/brote, siendo para este caso el de menor diferenciación para dicha variable. De lo
anterior se deduce que al elevar los niveles de BAP, se induce a un incremento de brotes, que por
lo tanto la diferenciación de hojas se reduce, tal como lo indicó el análisis estadístico.
iii. Variedad CP 722086, según la interacción variedad x BAP a los 15 días después de la
siembra, en tres variedades de caña de azúcar
Para el caso de la variedad de caña de azúcar CP 722086, los tratamientos evaluados 0.75,
0.45, 0.60, 0.00, 0.30 y 0.15 mg/l de BAP, estadísticamente son iguales, y a la vez de intermedia
producción en cuanto al número de hojas en el experimento, a los 15 días después de la siembra,
según lo indicó la prueba de medias de Tukey con 5% de significancia (Cuadro 13).
Podemos indicar que el tratamiento 0.75 mg/l de BAP, es el que tiene la media más alta con
4.94 hojas/brote para dicha variedad de caña de azúcar, y por lo tanto el nivel de BAP más alto.
Por tal razón el incremento del regulador de crecimiento BAP en el medio de cultivo, indujo a una
mayor producción de hojas para esta variedad, contrario, a los tratamientos evaluados para dicha
60
variable en las variedades PR 872080 y SP 792233, en donde los niveles elevados produjeron
menor número de hojas/brote, lo cual se debió a la poca diferenciación de hojas en los brotes.
Para un caso muy particular, como es la variedad CP 722086, al existir más proliferación de
brotes, el número de hojas tiende a incrementar, por lo tanto los niveles de bencilaminopurina
como el 0.75, 0.45 y 0.60 mg/l de BAP, producen mayor división celular en el explante y por ende
la inducción de la brotación es estimulada, es decir que al existir más brotes se incrementa el
número de hojas por unidad experimental, lo cual se confirma con las medias estadísticas 4.94,
4.91 y 4.86 hojas/brote del presente experimento.
7.2.2.1 Variable Número de Brotes, a los 30 días después de la siembra en tres variedades
de caña de azúcar
Para el caso de esta variable, después de los 30 días de realizada la siembra, los
resultados obtenidos en el análisis de varianza, se puede observar que existe diferencia
significativa para los factores: variedad y BAP, al igual que la interacción variedad x BAP, debido a
61
que el Pr>F=0.0031 es menor al 5% de significancia (Cuadro 14), por lo que se procedió a realizar
la prueba de Tukey (Cuadro 15) a la interacción variedad x BAP, siendo para éste caso el factor
de interés.
Con lo referente al coeficiente de variación que fue 22.96%, se puede indicar que la
variable número de brotes presentó heterogeneidad como era de esperarse en cada uno de sus
valores de las tres variedades de caña de azúcar, el rango para ésta variable va de 4.32 a 24.90
brotes, a los 30 días después de la siembra.
Cuadro 14. Análisis de varianza para la variable número de brotes, a los 30 días después
de la siembra {(con datos transformados, Y’ = √ (Y+1)}, CENGICAÑA 2003.
C.V. = 22.96%
* Diferencias significativas (5%)
estadísticamente significativa con lo que respecta al número de brotes, aquí las tres variedades de
caña de azúcar SP 792233, PR 872080 y CP 722086 estadisticamente tienen en mismo efecto en
algunos de los niveles de BAP aplicados al medio de cultivo.
Por último los tratamientos SP 792233x0.00 mg/l y CP 722086x0.00 mg/l de BAP que
presentaron las menores medias y por lo consiguiente la menor cantidad de brotes, lo cual se
debe a que son los tratamientos sin aplicación alguna de BAP en el medio de cultivo.
Cuadro 15. Resumen de la prueba de Tukey (α=0.05), según la interacción variedad x BAP,
para la variable número de brotes, a los 30 días después de la siembra.
De acuerdo al análisis realizado (Cuadro 15), los tratamientos 0.75 mg/l y 0.60 mg/l de BAP
con una media de 23.70 y 23.20 brotes por explantes indican que son los mejores, por lo tanto,
63
con fines de propagación in vitro se puede utilizar cualquiera de los dos. Tienen igual efecto para
dicha variedad, pero económicamente el tratamiento 0.60 mg/l de BAP se considera adecuado
para la micropropagación.
Para el caso de los tratamientos 0.30 mg/l, 0.45 mg/l, 0.15 mg/l y 0.00 mg/l de BAP, con las
medias 19.90, 19.30, 16.40, 5.00 brotes/explante, produjeron una cantidad similar de brotes por
explante, pero bajo con respeto a uno de los mejores tratamientos (0.60 mg/l de BAP).
ii. Variedad SP 792233, según la interacción variedad x BAP para la variable número de
brotes, a los 30 días después de la siembra
Por medio de la prueba de Tukey (Cuadro 15), el tratamiento con el nivel de 0.75 mg/l de
BAP fue el que produjo mayor número de brotes por explante y constituye el mejor. Dicha prueba
mostró diferencia en los diferentes niveles de BAP con respecto a ésta variable en la variedad SP
792233 a los 30 días de realizada la siembra. Se observa que el mejor tratamiento se obtuvo con
una media de 24.90 brotes/explante en el nivel 0.75 mg/l, con 20.50 brotes/explante más que el
testigo, éste sin la aplicación de BAP al medio de cultivo el cual se considera como el de menor
inducción a la brotación.
iii. Variedad CP 722086, según la interacción variedad x BAP para la variable número de
brotes, a los 30 días después de la siembra
Con lo que respecta a esta variedad, la proliferación de brotes fue intermedia sobre la base
de ésta segunda etapa, a pesar de duplicar el tiempo de permanencia en el medio de cultivo (30
días en total), y fue baja con respecto a las variedades PR 872080 y SP 792233, como a la vez
comparando el efecto del mismo tratamiento de BAP a una concentración de 0.75 mg/l, en donde
éstas variedades indujeron el doble de brotación que la CP 722086 lo cual se evidencia en las
medias que aparecen en el cuadro 15.
3 2 1
4
5
6
Figura 6. Efecto de los tratamientos de BAP en la variedad CP 722086, se observa la brotación, la longitud de
los brotes y las hojas diferenciadas, a los 30 días después de la siembra, CENGICAÑA, 2003. (1=
0.00 mg/l, 2 = 0.15 mg/l, 3 = 0.30 mg/l, 4 = 0.45 mg/l, 5 = 0.60 mg/l y 6 = 0.75 mg/l de BAP)
65
Analizando los tratamientos de dicha variedad el nivel 0.75 mg/l, fue el que más indujo a la
brotación con una media de 12.70 brotes/explante y el menor para éste caso el nivel 0.15 mg/l,
pero dichos tratamientos son considerados iguales agrupadamente en cuanto a esta variable
(Cuadro 15). Con respecto al tratamiento 0.00 mg/l de BAP, fue el menos adecuado en la
inducción de brotes con una media de 4.32, la cual es la más baja de todo el experimento.
Cuadro 16. Análisis de varianza para la variable longitud de brotes, a los 30 días después
de la siembra {(con datos transformados, Y’ = Log (Y+1)}, CENGICAÑA 2003.
C.V. = 9.06%
* Diferencia significativa (5%)
Por medio de la prueba de Tukey al 5% aplicada a los datos, se puede observar que la
misma nos agrupa en tres distintos grupos de longitudes, siendo el tratamiento 0.00 mg/l de BAP
con la mayor longitud de brotes de las tres variedades de caña en estudio, los cuales
corresponden a las variedades PR 872080 y CP 722086. En ambas variedades los tratamientos
testigo sin la aplicación de BAP, estadísticamente tienen una media de 4.36 y 3.12 cms/brote.
En lo referente a esta variable (Cuadro 17), se indica que el tratamiento 0.00 mg/l, sin la
aplicación del regulador de crecimiento BAP, produjo una de las medias más altas, 4.36 cm/brote
de todo el experimento a los 30 días después de la siembra, mientras que con longitudes
intermedias los tratamientos 0.15 mg/l, 0.30 mg/l, 0.45 mg/l, 0.60 mg/l y 0.75 mg/l de BAP y las
medias 2.50, 2.35, 2.35, 2.17 y 2.11 cm/brote las cuales nos indican la forma proporcional y
descendente de la longitud de los brotes de la variedad PR 872080, en este caso se hace notorio
el efecto de los niveles de BAP en dicha variable.
67
El efecto de los niveles de BAP en la PR 872080, fue notorio, es decir que la misma es muy
sensible a los cambios de nivel de BAP, de todo el experimento. Presentó con 0.75 mg/l de BAP
una de las medias más altas en la producción de brotes y disminuyendo en el tratamiento testigo,
lo anterior confirma que el testigo sin la aplicación de BAP produjo mayor diferenciación de hojas y
que al existir BAP en el medio de cultivo esta disminuye debido a la proliferación de brotes, ya
que a mayor brotación menor diferenciación de hojas.
ii. Variedad SP 792233, según la interacción variedad x BAP, para la variable longitud
de brotes, a los 30 días después de la siembra
Dicha variedad presenta una tendencia definida a disminuir la longitud en los tratamientos
0.45 mg/l, 0.60 mg/l y 0.75 mg/l de BAP, los cuales presentan las medias de 1.10, 0.92 y 0.90
cm/brote. Es relevante mencionar el efecto que produce el BAP en la longitud de brotes, debido a
que los niveles más altos de regulador disminuye la longitud. Podemos indicar que la
característica que presentó esta variedad en el transcurso del estudio fue de producir brotes
sumamente pequeños, delgados y aglomerados, lo cual se evidenció en la mayor proliferación de
brotes del resto de variedades y como también de producir una longitud no adecuada para la
etapa de enraizamiento (figura 4).
La longitud de brotes, es una variable que no presenta relevancia dentro del estudio en la
fase de multiplicación, ya que se puede mejorar en las siguientes fases de subcultivo, esto se
logra reduciendo el nivel de BAP a manera de disminuir la inducción multiplicativa y de tal manera
obtener mayor desarrollo de los brotes.
iii. Variedad CP 722086, según la interacción variedad x BAP, para la variable longitud
de brotes, a los 30 días después de la siembra
La prueba de Tukey realizada a los datos obtenidos de la variedad CP 722086 (Cuadro 17),
agrupa los resultados en dos los cuales estadísticamente difieren entre sí. En el primer
agrupamiento se determinó que el tratamiento sin la aplicación del BAP presentó la media más
alta la cual fue de 3.12 cm/brote, a los 30 días después de la siembra. Como era de esperarse, sin
la aplicación del regulador de crecimiento, la longitud de los escasos brotes fue alta, y como una
segunda agrupación se concentran los tratamientos 0.15 mg/l, 0.60 mg/l, 0.45 mg/l, 0.75 mg/l y
0.30 mg/l de BAP, los cuales se ubican entre una intermedia longitud, según lo indican las medias
2.21, 2.05, 1.97, 1.83 y 1.82 cm/brote, en dichos tratamientos existió la disminución del largo de
los brotes en todo el experimento, por tal razón cuando los niveles de BAP fueron altos existió un
incremento en la brotación, pero se redujo la longitud.
Con fines de una multiplicación masiva esta variable es poco relevante, lo que interesa es
una mayor brotación ya que se incrementaría la tasa de multiplicación para dicha variedad de
caña de azúcar y esto se logra con altos niveles de BAP en el medio de cultivo. En la presente
investigación se evidenció la escasa respuesta que presentó dicha variedad a los tratamientos con
BAP en la proliferación de brotes. Para la longitud de brotes en el tratamiento testigo se obtuvo un
69
tipo de brote sumamente vigoroso, alto y adecuado para la etapa de enraizamiento y posterior
aclimatación, con estas características se garantiza la sobrevivencia en invernadero.
7.2.2.3 Variable número de hojas, a los 30 días después de la siembra en tres variedades
de caña de azúcar
Cuadro 18. Análisis de varianza para la variable número de hojas, a los 30 días después de
la siembra {(con datos transformados, Y’ = √ (Y+1)}, CENGICAÑA 2003.
C.V. = 3.51%
* Diferencia significativa (5%)
NS No significativo (> 5%)
El coeficiente de variación que presentó esta variable a los 30 días después de la siembra
fue 3.51%, estadísticamente indica homogeneidad en los datos obtenidos por lo que se considera
un manejo adecuado del estudio, además podemos decir que para la variable número de hojas en
las tres variedades de caña de azúcar fue constante en un rango de 3.60 a 4.60 hojas por brote.
A. Variable número de hojas según la interacción variedad x BAP, a los 30 días después
de la siembra en tres variedades de caña de azúcar
Con el uso de la prueba de Tukey y como lo indica el cuadro 19, se determinó para la
variable número de hojas de cada una de las variedades de caña de azúcar, el mayor número de
70
vemos una respuesta adecuada para dividir las macollas y a la vez incrementar la tasa de
multiplicación en dicha variedad de caña de azúcar.
Cuadro 19. Resumen de la prueba de Tukey (α=0.05), según la interacción variedad x BAP
para la variable número de hojas, a los 30 días después de la siembra.
ii. Variedad SP 792233, según la interacción variedad x BAP, para la variable número de
hojas, a los 30 días después de la siembra
A nivel intermedio y sin diferenciación alguna los tratamientos 0.15 mg/l, 0.45 mg/l, 0.30
mg/l y 0.60 mg/l de BAP, con las medias de 3.96, 3.92, 3.92 y 3.86 cm/brote, estadísticamente
72
tienen igual cantidad de hojas por brote, pero menor al nivel con 0.75 mg/l de BAP y mayor al
testigo.
Al analizar el comportamiento de dicha variedad en el nivel de BAP más alto 0.75 mg/l,
indujo a un mayor número de brotes al igual que el número de hojas en todo el experimento, pero
en la longitud de brotes se redujo considerablemente, siendo el que menor respuesta obtuvo.
Podemos observar que esta variedad tiene una característica de brotes sumamente particular,
produce brotes delgados, frágiles y en cantidad pero definidos en cuanto a hojas y tallos.
iii. Variedad CP 722086, según la interacción variedad x BAP, para la variable número de
hojas, a los 30 días después de la siembra
En una segunda agrupación se ubican los tratamientos 0.60 mg/l, 0.00 mg/l, 0.30 mg/l, 0.15
mg/l y 0.75 mg/l de BAP, los cuales estadísticamente tienen igual cantidad de hojas por brote,
pero el tratamiento con 0.75 mg/l, siendo el más alto redujo la diferenciación de hojas, el cual
presenta una media de 4.12 hojas/brote en relación al tratamiento 0.45 mg/l que presentó la media
más alta de 4.30 hojas/brote.
7.2.3 Análisis de variables en función del tiempo de tres variedades de caña de azúcar
Se observa en la figura 7, que la variedad CP 722086 produjo 5.83 brotes como promedio
por explante a los 15 días después de la siembra, pero 15 días más existió un leve incremento de
3.96 brotes/explante, es relevante mencionar que la brotación para dicha variedad se incrementa
mientras más tiempo permanece el explante en el medio de cultivo, pero se presenta el
inconveniente de agotamiento del medio de cultivo, el cual se debe a la competencia por el mismo
y el espacio, como a la vez por la liberación de compuestos fenólicos que afectan de tal manera la
brotación que incide en la estimulación e inducción de brotes como se muestra en la figura 6. Con
9.79 brotes por explante, a los 30 días, la CP 722086 produjo la brotación más baja de las tres
variedades en el presente estudio.
13.93
15
Promedio de Brotes
12
9.79 10.04
9
5.83 5.49
6
0
CP 722086 SP 792233 PR 872080
VARIEDADES
15 días 30 días
Figura 7. Promedio de brotes a los 15 y 30 días después de la siembra, en tres variedades de caña de
azúcar, CENGICAÑA, 2003.
74
Con 5.49 brotes promedio por explante a los 15 días después de la siembra y 13.93 brotes
a los 30 días, la variedad de caña de azúcar SP 792233, produjo un incremento de 8.44 brotes
promedio en un lapso de 15 días, por tal razón ésta variedad se considera la de mayor producción
de brotes en el tiempo de permanencia en el medio de cultivo. Pero sin embargo, y como se
muestra en la figura 7, existe una producción intermedia de brotes a los 30 días, pero a los 15
días, la misma fue baja, con respecto a las dos variedades en estudio.
En la variedad PR 872080, la brotación fue de 10.04 brotes promedio por explante a los 15
días de realizada la siembra, para luego cuantificar 17.92 brotes promedio por explante sembrado
a los 30 días. Con esta cantidad de brotes producidos se considera a dicha variedad como
adecuada para la adaptación y multiplicación al cultivo in vitro. Como se observa en la figura 5, en
la cual la calidad de los brotes y en donde la oxidación de los mismos es nula la cual la hacen
satisfactoria para la tasa de multiplicación y posteriores fases de la micropropagación.
En la figura 7, puede observarse el comportamiento que tuvo cada uno de los niveles de
BAP para esta variable, destacándose el nivel con una dosis de 0.75 mg/l, el cual presentó la
mayor inducción a brotación en las tres variedades de caña de azúcar, a los 15 y 30 días después
de la siembra. Con un promedio de 8.95 y 20.43 brotes/explante en los dos períodos, el nivel 0.75
mg/l de BAP se considera el mejor tratamiento para la fase de multiplicación de la caña de azúcar.
Cada 15 días se dio un incremento de 11.48 brotes/explante como promedio, el cual fue el
más alto del resto de tratamientos evaluados (Figura 8).
Los niveles con 0.30 y 0.60 mg/l de BAP, estadísticamente no difieren en el número de
brotes al igual que con 0.45 mg/l, pero podemos observar en la figura 8 que el nivel con 0.60 mg/l,
disminuyó el número de brotes, esto a los 15 días después de realizada la siembra. Sin embargo,
a los 30 días incrementó la brotación a 18.33, en base a esto podemos indicar que a más tiempo
75
20.43
20 18.33
Promedio de brotes
15.75
15 13.01
11.17
10
brotación (figura 9) en los diferentes niveles de BAP, aunado a la vez a la característica que
presenta dicha variedad en los brotes los cuales son de tamaño pequeño y delgados (figura 4).
3.0
2.64
2.5
2.42
2.17
Longitud (cm)
2.0
1.65
1.56
1.5
1.37
1.0
0.5
0.0
C P 722086 SP 792233 P R 872080
VARIEDADES
15 días 30 días
Figura 9. Longitud de brotes de tres variedades de caña de azúcar CP 722086, SP 792233 y PR 872880 a
los 15 y 30 días después de la siembra, CENGICAÑA, 2003.
La variedad CP 722086 a los 15 días presentó una longitud de 1.56 cm/brotes siendo la
menor de todo el experimento, pero a los 30 días después de realizada la siembra los brotes
alcanzaron una longitud de 2.17 cm, la cual estadísticamente se considera como la segunda mejor
variedad en cuanto a longitud de brotes de todo el estudio.
En la figura 10, se observa el efecto de los niveles de BAP en la variable longitud de brotes
en tres variedades de caña de azúcar, en donde el tratamiento testigo sin BAP (0.00 mg/l) a los 15
como a los 30 días de realizada la siembra, presentó la mayor longitud de brotes (2.37 y 3.19
77
3.50 3 .1 9
3.00
Longitud de brotes (cm)
2 .3 7
2.50
2 .0 2 2 .0 0
1 .8 8 1 .8 1
2.00 1 .7 9 1 .7 4 1 .7 9 1 .7 1 1 .6 8 1 .6 1
1.50
1.00
0.50
0.00
0.00 0.15 0.3 0.45 0.6 0.75
Figura 10. Efecto de la bencilaminopurina en la longitud de brotes en tres variedades de caña de azúcar a
los 15 y 30 días después de la siembra, CENGICAÑA, 2003.
Algo de resaltar en el tratamiento con 0.60 mg/l de BAP, este produjo similar longitud de
brotes que el de 0.30 mg/l de BAP, lo cual se debe a que dicho nivel redujo su efecto en la
brotación a los 15 días después de realizada la siembra ya que al existir mayor brotes la longitud
de los mismos disminuyó. En base a lo anterior, se puede decir que la longitud de brotes esta
relacionado en la cantidad de brotes que se obtenga de cada variedad de caña de azúcar.
4.78
5.0 4.46 4.50
4.19 4.06
4.5 3.98
Número Hojas/brote
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
CP 722086 SP 792233 P R 872080
VARIEDADES
15 días 30 días
Figura 11. Número de hojas por brote de tres variedades de caña de azúcar CP 722086, SP 792233 y PR
872880 a los 15 y 30 días después de la siembra, CENGICAÑA, 2003.
En la figura 12, se observa el efecto de los diferentes niveles de BAP y el testigo en las tres
variedades de caña de azúcar. En donde el tratamiento testigo sin regulador de crecimiento tiene
un promedio de 4.64 hojas/brote al igual que nivel con 0.30 mg/l de BAP.
El nivel con 0.15 mg/l produjo el mayor número de hojas del resto de tratamientos con 4.75
hojas/brote. Los niveles con 0.45, 0.60 y 0.75 mg/l de BAP muestran una tendencia a la
disminución del número de hojas/brote. Siendo éste último, con un promedio de 4.40 hojas/brote el
de menor respuesta a los 15 días después de la siembra.
80
4.8 4.75
4.64 4.64
4.58
4.6
4.46
Número hojas/brote
4.40
4.4
4.19
4.2 4.11
4.04 4.04 4.06
4.01
4.0
3.8
3.6
0.00 0.15 0.30 0.45 0.60 0.75
Figura 12. Efecto de la bencilaminopurina en el número de hojas por brotes en tres variedades de caña de
azúcar a los 15 y 30 días después de la siembra.
El nivel, sin regulador de crecimiento BAP (testigo) y con 0.15 mg/l de BAP, produjeron
similar numero de hojas con 4.04 hojas/brote, ambos en la inducción de brotes se consideran de
respuesta baja, los cuales para fines de multiplicación masiva no son adecuados.
81
8. CONCLUSIONES
2. El uso de ácido indolacético a 0.01 mg/l como auxina y cinetina a 0.1 mg/l combinados con
la 6-bencilaminopurina, provocan un efecto de sinergismo que estimulan la brotación en las
variedades de caña de azúcar estudiadas, además para evitar el ennegrecimiento de los
explantes el uso de ácido cítrico a 150 ppm como antioxidante en las fase de iniciación y
multiplicación se hace necesario.
5. El nivel 0.75 mg/l de BAP, presentó el promedio más alto a los 15 y 30 días después de la
siembra, con 8.95 y 20.43 brotes/explante, comparado con el nivel 0.00 mg/l el promedio
fue constante 4.55 y 4.60 brotes/explante en los dos períodos del estudio en las tres
variedades de caña.
7. La longitud de brotes esta relacionada con la brotación que presentan las variedades. El
nivel 0.00 mg/l de BAP siendo el testigo que presentó la mayor longitud con 2.37 y 3.19
cm/brote a los 15 y 30 días respectivamente, mientras que con la aplicación de BAP en el
medio de cultivo existió una disminución en la longitud, pero la brotación se incrementó.
8. La variedad CP 722086 con un promedio de 4.19 a 4.78 hojas/brote fue la que presentó el
mayor número de hojas diferenciadas, como una segunda mejor producción de hojas la PR
872080 con 4.06 y 4.50 hojas/brote y la SP 792233 con 4.46 a 3.98 hojas/brote siendo la
que presentó el menor número de hojas a los 15 y 30 días después de la siembra.
9. A los 15 días después de la siembra se diferenció el mayor número de hojas en cada nivel
de BAP, pero conforme la concentración se incrementó el número de hojas/brote se redujo.
El nivel 0.15 mg/l BAP produjo la mayor diferenciación de hojas con 4.75 hojas/brote, pero a
los 30 días la misma fue menor, además el nivel con 0.60 mg/l BAP con 4.01 hojas/brote fue
el que produjo la menor diferenciación.
83
9. RECOMENDACIONES
1. Suplementar al medio de cultivo ácido indolacético a 0.01 y cinetina a 0.1 mg/l con 6-
bencilaminopurina más ácido cítrico a razón de 150 ppm como antioxidante, para se
induzca a un mayor efecto en la brotación y control en la oxidación de los explantes
2. Utilizar 0.75 mg/l de BAP en la variedad PR 872080 para obtener un proceso satisfactorio
de una multiplicación masiva.
5. Se sugiere continuar con investigaciones sobre posibles efectos adversos que pueda
causar el uso del BAP al final de cada subcultivo, en las tres variedades de caña de azúcar,
en particular si se emplean niveles de 6-bencilaminopurina altos a los evaluados en el
presente estudio.
84
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88
11. APÉNDICE
Cuadro. 21. A Reactivos e insumos utilizados para la realización del cultivo in vitro de tres
variedades de caña de azúcar.
Reactivos Otros
9 CaCl2 ⋅ 2H20 9 NaMoO4 ⋅ 2H2O 9 Jabón neutral.
9 KNO3 9 Myo-inositol 9 Polyoxyethyenesorbitan monolaurate
9 NH4NO3 9 Ácido indolacético (Tween 20).
9 KH2PO4 9 6-Bencilaminopurina 9 Hipoclorito de sodio.
9 MgSO4 ⋅ 7H2O 9 Cinetina 9 Etanol al 70% y 95%.
9 KI 9 Ácido nicotínico 9 Agua desmineralizada-destilada.