Bioquimica Practica 7

PRÁCTICA 7
“HIPERBILlRRUBINEMIAS”
RELACION DE EXPERIMENTOS:
 Determinación de la bilirrubina directa e indirecta en el suero sanguíneo. Método

Malloy Evelyn modificado
 Identificación de los pigmentos biliares en la orina. Reacción de Gmelin.
INTRODUCCION
La bilirrubina es un producto derivado del metabolismo de la hemoglobina. El grupo
heme se transforma en biliverdina y está en bilirrubina a la cual se le llama "no conjugada"
o indirecta. Al pasar por el hígado esta bilirrubina se conjuga con ácido glucurónido
transformándose en bilirrubina "conjugada" o directa.
El hígado segrega esta bilirrubina directa a través de las vías biliares hacia el intestino, al
metabolizarse por la flora intestinal se convierte en urobilinas que dan el color marrón a las
heces. Parte de estas urobilinas se reabsorben y pueden aparecer en la orina en forma de
urobilinógeno.
Cuando se eleva la bilirrubina, la piel y los tejidos toman un color amarillo que se llama
ictericia.
Se denomina hiperbilirruinemias a las enfermedades que curan con aumento en la
concentración de la bilirrubina en el suero sanguíneo, este aumento puede ser a predominio
de la bilirrubina no conjugada en cuyo caso se hablara de hiperbilirrubinemia a
predominio indirecto, mientras que la elevación de la bilirrubina conjugada determina
una hiperbilirrubinemia predominio directo.
Sin embargo resulta más apropiado agrupar las hiperbilirrubinemias en atención al
mecanismo de su producción y desde ese punto de vista se describen 4 categorías.
I. Hiperbilirrubinemias por sobreproducción de bilirrubina

Il. Hiperbilirrubinemias por menor captación hepática de bilirrubina
III. Hiperbilirrubinemias por alteración en la conjugación hepática de la bilirrubina
IV. Hiperbilirrubinemias por alteraciones en la excreción de bilirrubina
EXPERIMENTO 1:
DETERMINACION DE LA BILIRRUBINA DIRECTA E INDIRECTA EN SUERO
Objetivos:
1. Determinar las bilirrubinas en el suero de un paciente con ictericia

2. Determinar las bilirrubinas en el suero de un sujeto aparentemente normal
3. Comparar el resultado obtenido en ambas determinaciones
METODO DE MALLOY EVELYN MODIFICADO
FUNDAMENTO
La bilirrubina directa fue originalmente descrita por 'Van den Bergh y Miller como la
porción de la bilirrubina en suero que reaccionó con el re activo diazo en ausencia de un
acelerador. El método utiliza la reacción de Van der BergLa bilirrubina reacciona con el
ácido sulfanílico diazotado, formando un producto colorido. El diazoreagente reacciona con
el carbono central de la bilirrubina, formando 2 moléculas Azobilirrubina. La bilirrubina
directa reacciona en medio acuoso, en tanto la bilirrubina indirecta reacciona en presencia
de un solvente apolar, en este método es el metanol; el metanol también disuelve a la
bilirrubina soluble, por lo tanto, el resultado corresponde a la concentración de bilirrubina
total. Una modificación del pH del medio, puede alterar la determinación de productos de
la
reacción.
MUESTRA:
Suero o plasma, de preferencia suero para evitar la precipitación de proteínas por la adición
de reactivo.
INTER(ERENTES:
• Hemólisis: Dan resultados falsamente bajos

 Luz: La bilirrubina es fotosensible; la muestra debe ser mantenida siempre alejada de
la luz y en ambiente refrigerado (2 a goC). La sensibilidad es mayor a la luz ultravioleta.
 Turbidez:Afecta la lectura espectrofotométrica.
VALORES DE REFERENCIA:
 Bilirrubina Directa: Hasta 0,4 mg/dl

 Bilirrubina Indirecta: Hasta 0,6 mg/dl
 Bilirrubina Total: Hasta 1,0 mg/dl
PROCEDINJIENTO:
En 4 tubos de prueba prepare los siguientes sistemas:
SISTEMAS BO BT
1 1I III IV
Suero diluido 1/10 2 2 2 2
Agua destilada 2.5 2.5
Metanol 2.5 2.5
Reactivo de Ehrlich 0.5 0.5
Reactivo Blanco 0.5 0.5
l. Mezclar completa y cuidadosamente pues de ello depende que la reacción se

complete.
2. Dejar en reposo 20 minutos.
3. El complejo coloreado es medido a 540 nm o filtro verde
Preparación del estándar:

Con anterioridad se preparó el estándar conteniendo 2 mI dé una solución de bilirrubina
0,005 mg/ ml, se añadió 2.5 mI de metanol y 0,5 mI del re activo de Ehrlich, se midió la
absorbancia en las condiciones señaladas para el suero, obteniendose la lectura de: 0,224.
Estimar el factor de calibración porcentual
Absorbancia del estándar:
Concentración del estándar:
Factor de calibración Fc % = Cst/Abs. (corrigiendo al volumen de
suero empleado en los sistemas)

INTERPRETACION DE DATOS:
TCTERÍCIA PRÉ-HEPÁTICA:
Geralmente hemolítica, está asociada a defectos genéticos de captación - Síndrome

de Gilbert - o de conjugación - Síndrome de Crigler-Najjar - de B. Indirecta. Hay
aumento da B. Indirecta
No hay colúria
En recién nacidos, la intensa ictericia puede elevar el depósito de B.l. en los
tejidos nerviosos, en un cuadro llamado "Kernicterus", de pronóstico reservado.
ICTERÍCIA PÓST-HEPÁTICA:
Geralmente obstructiva (colestasis).

Ocurre también en los defectos genéticos de secreción de B. Conjugada - Síndromes
de Dubin-Johnson y de Rotor.
Aumenta a B. Direta
Puede haber coluria.
ICTERÍCIA HEPÁTICA:
Hay un aumento general de bilirrubinas, con un patrón definido para BD y

Bl. La colúria depende de fracciones más aumentadas
Ocurre por ejemplo en las hepatitis virales
EXPRESION DE RESULTADOS
B. DIRECTA B. TOTAL
Abs Abs Con Abs Abs Con
Bruta Net cmg Bruta Net cmg
I II a III IV a
Paciente A 0,052 0,034 0,430 0,046

.
Paciente B 0,194 0,058 0,292 0,052
Paciente C
Paciente D
Paciente E
Señalar en la tabla con N (Normal), A (Aumentada), D (Disminuida), e indicar el probable
diagnóstico.
BD BI BT DIAGNOSTICO
Paciente A
Paciente B
Paciente C
Paciente D
Paciente E
Paciente F -
Eliminar esto
EXPERIMENTO 2
IDENTIFICACION DE PIGMENTOS BILLARES EN LA ORINA
Objetivos:
1. Realizar la reacción de Grnelin en una orina colérica

2. Realizar la reacción de Grnelin en una orina normal y comparar el resultado obtenido
con el correspondiente a la orina' colúrica.
MÉTODO: REACCIÓN DE GMELIN
 Identificar la presencia de bilirrubina en la orina utilizando la acción

oxidante del ácido nítrico concentrado conteniendo trazas de ácido nitroso.
Procedimiento:
1. En un tubo de prueba medir 2 mI de orina

2. Con una pipeta hacer llegar hasta el fondo del tubo, aprox. 1 mI de ácido nítrico-
nitroso, tratando que se formen dos capas
3. Observar los cambios de coloración que ocurren entre ambas capas
4. Hacer la reacción utilizando la orina patológica y la orina normal.
INTERROGANTES
1.- En las siguientes patologías, ¿Cuál es la falla?
• Síndrome de Crigler –Naijar tipo I
El síndrome de Crigler-Najjar de tipo 1 (SCN1) es la forma más grave del SCN, un

trastorno hereditario de la conjugación de la bilirrubinahepática, caracterizado
por una grave hiperbilirrubinemia neonatal no conjugada debida a la completa
ausencia de bilirrubina glucuronosiltransferasa (GT) hepática.
• Síndrome de Crigler –Naijar tipo II
El síndrome de Crigler-Najjar de tipo 2 (SCN2) es un trastorno hereditario del

metabolismo de la bilirrubina caracterizado por una hiperbilirrubinemia no
conjugada debido a la actividad reducida de la bilirrubina
glucuronosiltransferasa (GT) hepática. El SCN2 es una forma más leve de SCN
que el SCN1 .
• Síndrome de Gilbert
El síndrome de Gilbert es una enfermedad hepática frecuente e inofensiva en la

cual el hígado no procesa la bilirrubina de manera adecuada. La bilirrubina se
produce por la descomposición de los glóbulos rojos.
Si se padece de síndrome de Gilbert (también conocido como «disfunción
hepática constitucional» e «ictericia no hemolítica hereditaria») se nace con
esta enfermedad como resultado de una mutación genética hereditaria. Es
posible que no se sepa si se tiene esta afección hasta que se descubre por
accidente, por ejemplo, cuando en un análisis de sangre se observan niveles
elevados de bilirrubina. El síndrome de Gilbert no requiere tratamiento. El
único indicio de la enfermedad de Gilbert es que la piel y la parte blanca de los
ojos, a veces, adquieren un tinte amarillento (ictericia), debido a un leve
aumento en los niveles de bilirrubina en la sangre.
• Síndrome de Dubin –Johnson
El Síndrome de Dubin-Johnson (SDJ) es un trastorno genético poco común. Para

heredar la afección, un niño tiene que recibir una copia del gen defectuoso de ambos
padres.
El síndrome interfiere con la capacidad del cuerpo de transportar desde el hígado un

químico llamado bilirrubina. La bilirrubina se produce cuando el hígado descompone
glóbulos rojos desgastados. Normalmente, la bilirrubina se moviliza a través de la bilis
producida por el hígado hasta los conductos biliares, pasando por la vesícula, hasta el
aparato digestivo. Cuando la bilirrubina no se procesa de manera apropiada, se
acumula en el torrente sanguíneo. Causando que la piel y la esclerótica de los ojos se
tornen de color amarillo. A esto se le llama ictericia. Los niveles muy altos de
bilirrubina pueden causar daño al cerebro y a otros órganos.
• Síndrome de Rotor
El síndrome de Rotor es una enfermedad rara, relativamente benigna, heredada de

manera autosómica y recesiva, de etiología desconocida. Tiene muchos elementos
similares con el síndrome de Dubin-Johnson, con la excepción de que las células del
hígado no resultan pigmentadas. El síntoma principal es la ictericia por razón del fallo
en el procesamiento y almacenamiento de bilirrubina, generalmente sin prurito
(picazón).
Característicamente, la sangre del paciente tiene concentraciones elevadas de

bilirrubina, predominantemente de la fracción conjugada, causando una
hiperbilirrubinemia.
2.- Definir los siguientes términos:
• Acolia
La acolia es un término que indica una ausencia de la secreción de la bilis por el
hígado, que a su vez puede ser un síntoma de un dolor severo en la célula
hepática. La ausencia de bilirrubina en el organismo provoca que las heces sean
blancas, es a esto que normalmente se le llama acolia.
• Coluria
En su definición básica, coluria es la orina de color oscuro.La orina de color

oscuro llamado coluria es la excreción del exceso de bilirrubina por vía urinaria.
Cabe destacar que el que la orina tenga un color oscuro no necesariamente
indicaría que esto sea a causa de la coluria o bilirrubina, la orina puede obtener
color oscuro a causa de otras sustancias como hemoglobina u otras sustancias.
La coluria indica un aumento de la bilirrubina, para identificar la coluria se debe

hacer un análisis de la orina, normalmente cuando existe coluria es un claro
indicante de hepatitis aguda.
• Kernicterus
El kernícterus, ictericia nuclear o encefalopatía neonatal bilirrubínica es una

complicación neurológica grave causada por la elevación de los niveles
normales de bilirrubina en la sangre del neonato. Se debe a la acción directa de
la bilirrubina indirecta libre sobre el sistema nervioso central, inhibiendo varios
procesos bioquímicos muy importantes, como la fosforilación oxidativa de
las mitocondrias y la síntesis proteica.
• Ictericia
La ictericia es la coloración amarillenta de la piel y mucosas debida a un
aumento de la bilirrubina (valores normales de 0,3 a 1 mg/dl) que se acumula
en los tejidos, sobre todo aquellos con mayor número de fibras elásticas
(paladar, conjuntiva).
Se hace clínicamente evidente cuando la bilirrubina es mayor de 2.5 mg/dl. Este
aumento puede ser a expensas de la fracción no conjugada o "indirecta" de la
bilirrubina (BI); ésta es liposoluble y no se filtra por el riñón, por lo que no
aparece coluria. Cuando el aumento es a expensas de la bilirrubina conjugada o
"directa" (BD), al ser ésta hidrosoluble, se filtra por el riñón, apareciendo
coluria. Puede haber aumentos de ambas fracciones y se habla entonces de
hiperbilirrubinemia mixta. La bilirrubina no conjugada es la relacionada con la
ictericia pre hepática y no hay coluria ni acolia, mientras que la bilirrubina
conjugada está relacionada con la ictericia hepática y pos hepática.
• Urobilinógeno
El urobilinogeno es un producto incoloro, con estructura tetra pirrol, que se

produce por acción de las bacterias de la flora intestinal sobre la bilirrubina que
proviene de la excreción biliar en el tracto digestivo. Es parcialmente absorbido
por el sistema vascular portal, pasando al hígado donde es procesado los
hepatocitos siendo excretado de nuevo en la bilis. En condiciones normales,
solo una pequeña parte del urobilinogeno es eliminado por vía renal (<1 mg/24
horas).

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PRÁCTICA 7

 Determinación de la bilirrubina directa e indirecta en el suero sanguíneo. Método

I. Hiperbilirrubinemias por sobreproducción de bilirrubina

DETERMINACION DE LA BILIRRUBINA DIRECTA E INDIRECTA EN SUERO

1. Determinar las bilirrubinas en el suero de un paciente con ictericia

METODO DE MALLOY EVELYN MODIFICADO

• Hemólisis: Dan resultados falsamente bajos

 Bilirrubina Directa: Hasta 0,4 mg/dl

En 4 tubos de prueba prepare los siguientes sistemas:

l. Mezclar completa y cuidadosamente pues de ello depende que la reacción se

Preparación del estándar:

Absorbancia del estándar:

Concentración del estándar:

Factor de calibración Fc % = Cst/Abs. (corrigiendo al volumen de

suero empleado en los sistemas)

Geralmente hemolítica, está asociada a defectos genéticos de captación - Síndrome

Geralmente obstructiva (colestasis).

Hay un aumento general de bilirrubinas, con un patrón definido para BD y

Paciente A 0,052 0,034 0,430 0,046

IDENTIFICACION DE PIGMENTOS BILLARES EN LA ORINA

1. Realizar la reacción de Grnelin en una orina colérica

MÉTODO: REACCIÓN DE GMELIN

 Identificar la presencia de bilirrubina en la orina utilizando la acción

1. En un tubo de prueba medir 2 mI de orina

1.- En las siguientes patologías, ¿Cuál es la falla?

• Síndrome de Crigler –Naijar tipo I

El síndrome de Crigler-Najjar de tipo 1 (SCN1) es la forma más grave del SCN, un

El síndrome de Crigler-Najjar de tipo 2 (SCN2) es un trastorno hereditario del

El síndrome de Gilbert es una enfermedad hepática frecuente e inofensiva en la

El Síndrome de Dubin-Johnson (SDJ) es un trastorno genético poco común. Para

El síndrome interfiere con la capacidad del cuerpo de transportar desde el hígado un

El síndrome de Rotor es una enfermedad rara, relativamente benigna, heredada de

Característicamente, la sangre del paciente tiene concentraciones elevadas de

2.- Definir los siguientes términos:

En su definición básica, coluria es la orina de color oscuro.La orina de color

La coluria indica un aumento de la bilirrubina, para identificar la coluria se debe

El kernícterus, ictericia nuclear o encefalopatía neonatal bilirrubínica es una

El urobilinogeno es un producto incoloro, con estructura tetra pirrol, que se

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