Informe 5 Bioquimica

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA MESA
FACULTAD DE CIENCIAS N° 5
DEPARTAMENTO ACADEMICO DE QUIMICA
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA N° 5
ESPECTRO DE ABSORCIÓN – DETERMINACIÓN DE

(LAMBDA) ÓPTIMO
Integrantes:
1. Fernández Chugucaña, Stefany

2. Morrión De Paz, Leydi Laura
3. Osorio Díaz, Julissa
4. Sebastian Cuellar, Evelyn
Grupo: F* Lunes – 2:00 pm
Fecha de la práctica: 2 de octubre del
2017 Fecha de entrega de informe: 9 de octubre
del 2017
2017-II
I. INTRODUCCIÓN
La mayoría de los problemas analíticos reales comienzan con una
compleja mezcla a partir de la cual es necesario aislar, identificar y
cuantificar uno o más componentes de la misma. Se pueden plantear
las siguientes cuestiones: de carácter cualitativo (¿de qué componente
se trata?), y otra de carácter cuantitativo (¿cuánto hay de ese
componente?).
Para ello, se puede utilizar el método instrumental de análisis, como
es la espectrofotometría para medir la absorción
de radiación ultravioleta y visible que interactúa con la materia
(átomos y moléculas), la misma es considerada una técnica cualitativa
y cuantitativa basándose en la medición del color o de la longitud de
onda (Davis, J. et al., 1975).
La espectrofotometría es una técnica analítica que permite determinar
la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las
moléculas que absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez
que la cantidad de luz absorbida dependen de forma lineal de la
concentración. Además es usada para identificar compuestos por su
espectro de absorción y conocer la concentración de un material o
sustancia, esto último permite determinar enzimas y proteínas incluso
ácidos nucleicos (Sierra, I. et al., 2010).
En esta técnica se emplea un espectrofotómetro, que es un equipo
de laboratorio que mide la cantidad de luz que pasa por medio de una
longitud de onda específica. La cantidad de luz absorbida por un
medio es proporcional a la concentración del soluto presente, es
entonces así que la concentración de un soluto colorido en solución
puede ser determinada en el laboratorio mediante la medición de su
absorción de luz a una longitud de onda específica. Las muestras se
utilizan en estado líquido y se colocan en el compartimiento de las
muestras de celdas transparentes de diferentes tamaños y materiales.
(Díaz.et al .2009)
En esta práctica se hallarán espectros de absorción con el fin de
determinar la longitud de onda donde la muestra presenta la máxima
absorción, y tras realizar las correspondientes rectas de calibrado se
cuantificarán las concentraciones de distintas soluciones diluidas.
II. RESULTADOS
Experiencia N°1: Determinación del Espectro de Absorción de una
solución coloreada.
Cuadro N°1: Espectro de absorción de azul de bromofenol (ABF)
nm 520 nm 560 nm 580nm 600 nm 620nm
T% 83.56 62.09 47.53 48.42 83.56
A 0.078 0.207 0.323 0.315 0.078
Fuente: Elaboración propia
ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE ABF
0.35
0.3
Absorbancia
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
500520540560580600620640
Nanómetros
Longitud de onda de
máxima absorbancia:
0.315 nm.
Gráfico 1: Espectro de absorción de azul de bromofenol
Cuadro N°2: Espectro de absorción de naranja de metilo (NM)

nm 400 nm 420 nm 440 nm 460 nm 480 nm
T% 67.92 59.70 54.45 50.82 53.21
A 0.168 0.224 0.264 0.294 0.274
ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE NM
0.35
0.3
Absorbancia
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
Longitud de onda de
380400 420440460 480 500 máxima absorbancia:
Nanómetros
0.294 nm.
Gráfico 2: Espectro de absorción de naranja de
metilo.
Experiencia N°2: Preparación de una curva de calibración con los
colorantes azul de bromofenol y naranja de metilo.
Cuadro N°3: Curva de calibración de azul de bromofenol:
Tubo N° Blanco T1 T2 T3 T4 T5
Sol. Trabajo 0 2 4 6 8 10
(mL)
H2O destilada 10 8 6 4 2 0
(mL)
Absorbancia 0.066 0.131 0.201 0.264 0.322
Concentración
8x10-4 1.6x10-3 2.4x10-3 3.2x10-3 4x10-3
(mg/mL)
mg % 0.08 0.16 0.24 0.32 0.4
ug/mL 8x10 1.6x10 2.4x10 3.2x103
2 3 3
4x103
mg/L o ppm 0.8 1.6 2.4 3.2 0.042
CURVA DE CALIBRACION DE ABF

0.35
0.3
Absorbancia
0.25
0.2
0.15
0.1
y = 0.0645x + 0.0033
0.05
0 1 2 3 4 5 6
0 Tubos de trabajo
Gráfico 3: Curva de calibración de azul de bromofenol
Coeficiente de extinción molar: 0.0645

Cuadro N°4: Curva de calibración de naranja de metilo:
Tubo N° Blanco T1 T2 T3 T4 T5
Sol. Trabajo 0 2 4 6 8 10
(mL)
H2O destilada 10 8 6 4 2 0
(mL)
Absorbancia 0.063 0.120 0.178 0.236 0.294
Concentración
8x10-4 1.6x10-3 2.4x10-3 3.2x10-3 4x10-3
(mg/mL)
mg % 0.08 0.16 0.24 0.32 0.4
ug/mL 8x10 1.6x10 2.4x10 3.2x103
2 3 3
4x103
mg/L o ppm 0.8 1.6 2.4 3.2 0.042
CURVA DE CALIBRACIÓN DE NM
0.35
0.3
Absorbancia
0.25
0.2
0.15
0.1 y = 0.058x + 0.004

0.05
0
0 1 2 3 4 5 6
Tubos de trabajo
Gráfico 4: Curva de calibración de naranja de metilo
Coeficiente de extinción molar: 0.058

III. DISCUSIONES
Según Skoog, D. & West,D. (1986): “Un fotómetro es un

instrumento sencillo, que consta de un foco luminoso, cubetas un
detector fotoeléctrico, conteniendo también filtros adecuados para
limitar la radiación procedente del foco. En general, los métodos
fotométricos se utilizan solo en la región visible del espectro”.
En la práctica realizada se utilizó un fotómetro para la determinación de
la concentración de una sustancia coloreada desconocida, para
ellos utilizamos las herramientas mencionadas por el autor, la cual
se debe manejar con cuidado para no alterar los resultados de la
sustancia a analizar.
Quesada, S. (2007) nos menciona: “El procedimiento experimental para

el análisis cuantitativo utilizando la ley de Lambert Beer implica la
preparación de una recta de calibrado que permita relacionar el valor
de la absorbancia del analito que queremos determinar con su
concentración. En primer lugar se selecciona la longitud de onda más
adecuada para realizar las medidas que corresponderá al máximo de
absorbancia”.
Como lo mención el autor, antes de medir la absorbancia a
diferentes concentraciones, tuvimos que calcular la longitud de onda
optima en la cual la absorbancia es máxima para una determinada
concentración, este proceso se repitió varias veces a diversas
longitudes de onda hasta observar el mayor mayor.
Davis, J. et al. (1975) nos dice: “El método de análisis cuantitativo

denominado espectrofotometría se basa en la capacidad de las
sustancias de absorber luz, a una longitud de onda determinada, en
proporción directa a la cantidad de materia presente”.
En la experiencia realizada logramos corroborar lo que indica el
autor, la absorbancia en su longitud de onda optimo, es directamente
proporcional a la concentración de sustancia presente, así a mayor
concentración obtuvimos mayores valores de absorbancia.
Según Quesada, S. (2007): “Dado que el coeficiente de extinción molar
(a), es una constante para cada sustancia, el diámetro de la
cubeta (l), es también fijo, la absorbancia depende directamente de la
concentración de la sustancia. Esto se conoce como ley de Lambert
Beer”.
Como lo indica Quesada, los valores del ancho de la cubeta (1cm) y
el coeficiente de extinción molar, se mantuvieron constantes en las
diversas mediciones de absorbancia que se realizaron, dejando como
única variable a la concentración de la solución a analizar.
Sierra, I. et al. (2010) nos comenta: “Si se diluye sucesivamente una

sustancia coloreada y, a cada dilución se mide el valor de la
absorbancia a una longitud de onda óptima, al representar
gráficamente estos valores se obtiene una curva de calibración de
la sustancia. A partir de la curva de calibración es posible conocer
la concentración de una muestra”.
La sustancia a analizar fue diluida a diversas concentraciones
diferentes de manera gradual, en la cual corroboramos que a mayor
concentración, mayor absorbancia de la sustancia, esto nos permitió
realizar nuestra curva de calibración tanto para el azul de bromofenol
como para el naranja de metilo.
En el experimento de lectura del espectro de absorción para

soluciones coloreadas, se obtuvieron datos que corresponden
debidamente a cada rango de longitud de onda óptima de cada color
indicado por la teoría.
En la prueba de control precisión y exactitud fotométrica, los datos

arrojados por el instrumento están dentro de los límites de
aceptabilidad, puesto que al hacer los cálculos se confirma una
inexactitud de -0.98 % y el
% inexactitud aceptado es de +-3 %. El instrumento tiene exactitud.
Al calcular la impresión del instrumento obtenemos un coeficiente
de variación menor de 1.5 % el cual fue de 0.17%, podremos decir
entonces que el instrumento presenta precisión.
IV. CONCLUSIONES
 Se concluye que para la determinación de las concentraciones de

una sustancia es necesario determinar la constante de absorción
de dicho compuesto que nos indica en cuanto aumenta la
absorción variando las medidas de longitud de onda.
 La absorbancia es la capacidad que tienen algunas sustancias

para absorber la radiación electromagnética, se pudo observar
que la concentración y la longitud de onda a la cual se aplique
un rayo, puede alcanzar un punto máximo de absorción.
 La absorbancia y el coeficiente de extinción molar tiene una

relación directamente proporcional, a mayor coeficiente mayor
absorbancia; también pudimos observar de manera experimental
la Ley de Beer que nos indicó que a mayor concentración de
sustancia, mayor absorbancia, y al realizar los gráficos
observamos su relación lineal.
 Se comprobó la eficacia de los métodos espectrométricos

para determinar la concentración de sustancias coloreadas
desconocidas, siempre y cuando se conozca la constante de
absorción de dicho compuesto.
 El espectro de absorción, nos indica la variación de absorbancia

en función de diferentes longitudes de onda, en la práctica nos
dio diferentes resultados los cuales iban aumentando hasta llegar
a un punto máximo, en el cual una vez llegado empezó a
descender, por medio de este cambio concluimos que habíamos
llegado al pico más alto de la curva, es decir a la longitud de
onda de máxima absorción de la sustancia a identificar.
V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Davis, J. et al. (1975). Manual de Laboratorio. España: Reverté.
Díaz. N.A et al. (2009). Espectrofotometría: Aspectos de absorción

y cuantificación colorimétrica de biomoléculas.
Quesada, S. (2007). Manual de Experimentos de Laboratorio
para Bioquímica. San José, Costa Rica: Editorial Universidad a
Distancia.
Skoog, D. & West,D. (1986). Introducción a la Química

Analítica. Barcelona, España: Reverté.
Sierra, I. et al. (2010). Análisis Instrumental. España: Reverté.

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ESPECTRO DE ABSORCIÓN – DETERMINACIÓN DE

1. Fernández Chugucaña, Stefany

Grupo: F* Lunes – 2:00 pm

Fecha de la práctica: 2 de octubre del

2017 Fecha de entrega de informe: 9 de octubre

Gráfico 1: Espectro de absorción de azul de bromofenol

Cuadro N°2: Espectro de absorción de naranja de metilo (NM)

CURVA DE CALIBRACION DE ABF

Gráfico 3: Curva de calibración de azul de bromofenol

Coeficiente de extinción molar: 0.0645

0.1 y = 0.058x + 0.004

Gráfico 4: Curva de calibración de naranja de metilo

Coeficiente de extinción molar: 0.058

Según Skoog, D. & West,D. (1986): “Un fotómetro es un

Quesada, S. (2007) nos menciona: “El procedimiento experimental para

Davis, J. et al. (1975) nos dice: “El método de análisis cuantitativo

Sierra, I. et al. (2010) nos comenta: “Si se diluye sucesivamente una

En el experimento de lectura del espectro de absorción para

En la prueba de control precisión y exactitud fotométrica, los datos

 Se concluye que para la determinación de las concentraciones de

 La absorbancia es la capacidad que tienen algunas sustancias

 La absorbancia y el coeficiente de extinción molar tiene una

 Se comprobó la eficacia de los métodos espectrométricos

 El espectro de absorción, nos indica la variación de absorbancia

Davis, J. et al. (1975). Manual de Laboratorio. España: Reverté.

Díaz. N.A et al. (2009). Espectrofotometría: Aspectos de absorción

Skoog, D. & West,D. (1986). Introducción a la Química

Sierra, I. et al. (2010). Análisis Instrumental. España: Reverté.

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