7.

1: RECOGIDA Y CONSERVACIÓN

RESPONSABILIDADESDEL LABORATORIO

El laboratorio es el responsable la obtención de muestras correctas y óptimas a pesar de que muchas veces el proceso
real de la recogida esté a cargo personas que no formen parte del personal del laboratorio. En el caso en el que se esté
tratando al paciente en un hospital, podrá recoger la muestra un enfermero a la cabecera de la cama. El profesional
sanitario podrá recoger la muestra en un entorno clínico.

El laboratorio puede ayudar a garantizar la obtención de buenas muestras facilitando información de recogida al
personal sanitario en el centro de recogida, asegurándose de que se dispone de los recipientes y suministros de
recogida oportunos, definiendo un buen sistema de etiquetado y comprobando todas las muestras minuciosamente en
el momento de llegada al laboratorio.

SOLICITUD DE ANALISIS
El primer paso del proceso de obtención de la muestra es la
solicitud de análisis. El laboratorio debe facilitar una hoja de
petición de análisis que especifique toda la información necesaria
para una adecuada gestión y notificación adecuadas.

La información esencial que debe contener la hoja de petición es:

 la identificación del paciente;
 los análisis solicitados;
 la fecha y hora de la recogida de la muestra;
 el origen de la muestra, cuando proceda;
 los datos clínicos, cuando esté
Indicado;
 la información de contacto del profesional sanitario que solicita el análisis.

En el ámbito de los estudios epidemiológicos, la recogida de muestras debe acompañarse de un formulario que incluya
el nombre del paciente, un número de identificación único, los datos demográficos y el estado de salud del paciente.
La información complementaria es necesaria para ayudar a identificar la fuente de una infección y encontrar los
posibles contactos.

REQUISITOS DE LA RECOGIDA Y CONSERVACION DE LA MUESTRA

La recogida y conservación de la muestra variará según el análisis y el tipo de muestra que se recoja. El laboratorio
debe definir atentamente un proceso de recogida de muestras para todos los análisis que realice. Cuando se preparen
las instrucciones, deberán considerarse los siguientes elementos.
 Preparación del paciente: algunos análisis requieren que el paciente esté en ayunas. También podrá haber
requisitos especiales de horarios para análisis como en los análisis de glucemia, las concentraciones de fármacos o
los análisis hormonales.
 Identificación del paciente: la persona que recoja la muestra debe identificar al paciente de forma exacta. Con
este fin, podrá interrogarse al paciente o al familiar que le acompañe o usarse una pulsera identificativa u otro
dispositivo.
 Tipo de muestra necesaria: los análisis de sangre pueden requerir suero, plasma o sangre completa. En otras
pruebas quizá se necesite orina o saliva. Los análisis microbiológicos utilizan varios tipos de muestras, así que es
necesario contar con información específica sobre lo que hace falta.

 TUBOS Y CONTENEDORES
Dependiendo de las determinaciones analíticas solicitadas la muestra se recogerá en diferentes tubos y contenedores:

- TUBOS DE SANGRE

1. Tubo sin aditivos: Utilizados para la obtención de suero (pruebas de Bioquímica, serología, metabolismo del hierro...);
no llevan anticoagulante aunque sí contienen (no obligatoriamente) activadores, que facilitan la retracción del coágulo, y
gel separador, que facilita la separación de suero y coágulo tras la centrifugación. Con ella se obtiene el suero, tras dejar
reposar la sangre recién extraída al menos 10 minutos a temperatura ambiente para que se forme el coágulo y
centrifugar. Existen varios tamaños: pequeño de 5 ml, grande de 10 ml y microtubos de 0,8 ml.
2. Tubo EDTA: Contiene como anticoagulante el EDTA K3 (sal tripotásica del ácido etilén-diamino-tetraacético). Es el
tubo utilizado para la hematimetría (hemogramas), Banco de Sangre y otras pruebas. Con ella se obtiene sangre total
anticoagulada. Existen varios tamaños: pequeño de 3 ml, grande de 10 ml y microtubos de 1 ml.

3. Tubo Heparina de Litio: Contiene como anticoagulante la Heparina de Litio. Se utiliza para realizar determinaciones
bioquímicas y algunas técnicas especiales. Con ella se obtiene sangre total anticoagulada.

4. Tubo Citrato (para coagulación): Contienen como anticoagulante citrato trisódico. El citrato viene en una cantidad
prefijada para mezclarse con un volumen fijo de sangre; la exacta proporción de sangre y anticoagulante es crucial en la
realización de las pruebas de coagulación, ya que si no es la adecuada, los resultados se alteran. Con ella se obtiene el
plasma, tras centrifugación de la sangre anticoagulada. Existen varios tamaños: de 5 ml y de 1,8 ml.

5. Tubo Citrato (para VSG): Contiene también como anticoagulante citrato trisódico, aunque la concentración es distinta
que en el citrato de coagulación. Se utiliza exclusivamente para la determinación de la Velocidad de Sedimentación
Globular. Con ella se obtiene sangre total anticoagulada.

 Tipo de recipiente: el recipiente para la muestra suele ser muy importante, puesto que afectará al volumen y a
los aditivos necesarios como anticoagulantes y conservantes. Si el recipiente no controla el volumen, como por
ejemplo con los tubos Vacutainer®, se deberá especificar claramente. Algunas muestras para microbiología
requerirán de medios de transporte específicos para conservar los microorganismos.
 Etiquetado de la muestra: en las instrucciones de recogida, será necesario explicar detalladamente todos los
requisitos de etiquetado de la muestra en el momento de la recogida.
 Manipulación especial: algunas muestras podrán necesitar una manipulación especial, como refrigerarlas de
manera inmediata, protegerlas de la luz o entregarlas rápidamente al laboratorio. Deberá explicarse cualquier
precaución de seguridad importante.

ETIQUETADO DE MUESTRA
Cada muestra se deberá etiquetar claramente con:
 el nombre y los apellidos del paciente;
 el número de identificador único, que podría ser un número del hospital o un número que le asigne el
laboratorio;
 el análisis que se ha solicitado;
 la hora y fecha de recogida;
 las iniciales de la persona que recoge la muestra.

RESULTADOS DE LOS ERRORES DE LA RECOGIDA

La adecuada recogida de muestras es un elemento importante para las buenas prácticas de laboratorio. La recogida
incorrecta de muestras puede dar lugar a malos resultados como:
 retrasos en la notificación de los resultados analíticos
 repetición innecesaria de la extracción/el análisis
 menor satisfacción del cliente
 mayores costes
 diagnóstico o tratamiento incorrecto
 lesión
 muerte

CONSERVACIÓN Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS

Las muestras acompañadas de las correspondientes solicitudes, deben remitirse a la Unidad de Recepción de Muestras por
los distintos sistemas habilitados dependiendo de:

- Su Procedencia: Atención Primaria, Unidades de Extracción y Recogida de Muestras ubicadas en los distintos
Hospitales y Plantas de Hospitalización

- el Laboratorio de destino: Urgencias, Laboratorios Programados.

El sistema de envío de muestras por tubo neumático es un procedimiento rápido y de probada eficacia. Salvo escasas
excepciones (frascos de Hemocultivo...), no daña las muestras ni produce interferencias en la posterior medición de
magnitudes bioquímicas, hematológicas o en la realización de gasometrías.

Las muestras deberían permanecer el mínimo tiempo posible en el control de enfermería antes de ser enviada por tubo
neumático al laboratorio. El tiempo óptimo entre la extracción de la sangre y su recepción en el laboratorio debería ser
inferior a una hora. Estos retrasos en la recepción de los resultados son la causa más importante de prolongación indebida
del tiempo de respuesta del Laboratorio de Urgencias, y contribuye notablemente a la demora en los Laboratorios
Programados y pueden ser causa de alteraciones en determinadas magnitudes bioquímicas y hematológicas. Por ejemplo,
la concentración de glucosa puede disminuir hasta un 10% en una muestra de sangre almacenada durante dos horas a
temperatura ambiente; un frotis de sangre periférica requiere ser realizado dentro de las tres primeras horas desde la
extracción para que los leucocitos conserven bien su morfología; la Velocidad de Sedimentación Globular comienza a
variar a partir de las 4 horas de extracción, etc.

En el transporte de muestras se debe tener siempre en cuenta, que cualquier tipo de espécimen representa un riesgo
biológico. Para el transporte de las muestras de diagnóstico, el paquete a transportar tiene que cumplir una serie de
requisitos en relación al etiquetado o su señalización. Para el transporte por vía terrestre, tienen que aplicarse los requisitos
exigidos por el acuerdo ADR (2009).

De forma general, el sistema de embalaje/envasado que deberá utilizarse para todas las sustancias infecciosas, es el
sistema básico de embalaje/envasado triple P650 que comprende las tres capas siguientes:

• Recipiente primario. Un recipiente impermeable y estanco que contiene la muestra. El recipiente se envuelve en material
absorbente suficiente para absorber todo el fluido en caso de rotura.

• Embalaje/envase secundario. Un segundo embalaje/envase estanco, impermeable y duradero que encierra y protege el
recipiente o recipientes primarios. Se pueden colocar varios recipientes primarios envueltos en un embalaje/envase
secundario, pero se deberá usar suficiente material absorbente para absorber todo el fluido en caso de rotura.

• Embalaje/envase exterior. Los embalajes/envases secundarios se colocan en embalajes/envases exteriores de expedición

con un material amortiguador adecuado. Los embalajes/envases exteriores protegen el contenido de los elementos
exteriores, como daños físicos, mientras el bulto se encuentra en tránsito. Ninguna de las caras del embalaje/envase
exterior tendrá dimensiones inferiores a 10 × 10 cm.

Normalmente, cada embalaje/envase preparado para su expedición deberá estar correctamente marcado y etiquetado e ir
acompañado de los documentos de envío pertinentes. Para mas información consultar las “Directrices para el envío de
especímenes a los laboratorios clínicos para el diagnóstico biológico”.

7.2 PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LA SANGRE

Las propiedades físico-químicas de la sangre son:

 Velocidad de sedimentación globular.

 Viscosidad sanguínea.

 Osmolalidad plasmática.

Velocidad de sedimentación globular (VSG)

La VSG se define como la velocidad a la que sedimenta la fracción forme, en especial los hematíes, de una muestra
sanguínea anticoagulada.

Este proceso se puede visualizar con mucha facilidad. Basta con tener una muestra de sangre anticoagulada en una
gradilla, en posición vertical. Pasado un tiempo podremos apreciar como la fracción forme de la sangre, representada
mayoritariamente por los hematíes, comienza a sedimentar en el fondo del tubo.
Como iremos viendo, la velocidad de sedimentación globular no se calcula con tubos de ensayo o tubos de centrífuga. Se
calcula haciendo uso de unas columnas especialmente diseñadas para tal fin. Estas columnas nos permiten medir los
milímetros que ha descendido la fracción forme sanguínea transcurrido un determinado tiempo.

Etapas de la VSG

El proceso de sedimentación globular ocurre en tres etapas diferentes:

 Hemaglutinación: En esta fase los hematíes comienzan a aglutinarse entre sí. Y lo hacen formando agregados
en forma de pilas de moneda, también llamados rouleaux. El tamaño de estos agregados vendrá determinado por
el potencial zeta existente entre los hematíes.
Se denomina potencial zeta a la energía de repulsión existente entre los hematíes debido a la presencia de cargas
negativas en su superficie. Esta energía de repulsión mantiene separados a los hematíes.

La intensidad del potencial zeta puede variar con la concentración de las proteínas plasmáticas. La albúmina, proteína
con mayor presencia en el plasma sanguíneo, aumenta el potencial zeta. En cambio, el fibrinógeno y las globulinas lo
disminuyen. En condiciones normales se establece un equilibrio propio de valores normales de la VSG.
Si el potencial zeta disminuye, los hematíes tienden a formar agregados de mayor tamaño que descienden y
sedimentan más rápido. Si esto ocurre la velocidad de sedimentación globular aumenta.

 Sedimentación de los agregados: En esta fase los agregados hemáticos se desplazan hacia el fondo del tubo.
Durante este periodo, el descenso de los agregados ocurre de forma constante.
 Acumulación: En esta fase los hematíes se concentran en el fondo del tubo en forma de sedimento.

Valores normales de la VSG

La velocidad de sedimentación globular se expresa en los milímetros que ha descendido la columna de células durante un
periodo de tiempo. Actualmente el periodo de tiempo empleado es de una hora. Los valores de referencia de mi
laboratorio de estudios son de 2-7 mm para hombres y de 3-10 mm para mujeres.

Procedimientos de medición de la VSG

Existen diversos procedimientos para determinar la velocidad de sedimentación globular:

 Técnicas manuales: El método de las pipetas de Westergren es el más antiguo y el de referencia sobre el que
han evolucionado las demás técnicas manuales. Esta evolución ha ido mejorando la limpieza y seguridad a la
hora de manipular la muestra. También ha disminuido la cantidad de muestra necesaria para realizar la técnica.
Un ejemplo de esta evolución sería el método Eritrosed.

Causas de error en los métodos manuales de VSG

 Técnicas automáticas: Gracias a estas técnicas ha disminuido la manipulación de las muestras. También el
tiempo de ejecución. Y han aumentado el número de muestras que pueden procesarse a la vez. Además, se han
automatizado siguiendo el método de Westergren, compatibilizando los valores. Los sistemas automáticos más
 conocidos son Vesmatic, Sediscan y Sedimatic.
 Técnicas micrométricas: Este tipo de técnicas se emplean cuando la extracción de sangre venosa es dificultosa.
Como puede ser en el caso de lactantes, ancianos y gente obesa. En estos casos se utilizan las técnicas
de Chattas y/o Hellige-Vollmer.

Se efectúa una punción capilar en talón o en dedo y se llena el tubo por capilaridad. Ese tubo se lleva después a
un soporte especial que lo mantendrá en vertical. Pasada una hora, el resultado se compara con unas tablas que
relacionan el espacio en milímetros con el tiempo para poder valorar el resultado. Los valores de referencia son
de 8-10 mm/h en lactantes y de 6-8 mm/h en adultos y niños.
VSG aumentada
La velocidad de sedimentación globular se encuentra aumentada en condiciones fisiológicas como el embarazo y el
envejecimiento. En el tercer mes de embarazo la VSG es cuando más sube. Un mes después del parto vuelve a la
normalidad.
También se encuentra elevada en procesos patológicos. Cuando se producen alteraciones de las proteínas plasmáticas tales
como infecciones agudas, procesos inflamatorios crónicos, neoplasias, gammapatías monoclonales y en procesos
inflamatorios en los que aumenten los reactantes de fase aguda como el fibrinógeno, la alfa1-antitripsina, la alfa1-
antiglobulina o la haptoglobina.También aumentan en alteraciones hemáticas, como en anemias intensas o con hematíes
de mayor tamaño (macrocitosis).

VSG disminuida
La VSG no se encuentra disminuida en ningún proceso fisiológico, pero sí en diversos procesos patológicos como
la insuficiencia cardiaca congestiva.
También se encuentra disminuida cuando se producen alternaciones de las proteínas plasmáticas tales como la
disminución de fibrinógeno plasmático, ya sea a causa de necrosis hepática o a causa de una coagulación intravascular
diseminada (CIVD).

Propiedades físico-químicas de la sangre: Viscosidad sanguínea

La viscosidad de la sangre es una medida de su resistencia a las deformaciones graduales producidas por las diversas
tensiones a las que es sometida. En condiciones fisiológicas, el factor que más influye en la viscosidad sanguínea es el
hematocrito. También aumentará la viscosidad si aumentan en número el resto de componentes de la fracción forme de la
sangre. Si aumentan los leucocitos (por ejemplo, en una Leucemia Mieloide Crónica) o las plaquetas (por ejemplo, en una
Trombocitemia Esencial) la viscosidad sanguínea aumentará.
La viscosidad de la sangre también aumenta si lo hace la viscosidad plasmática. Ésta depende, sobre todo, de la
concentración de fibrinógeno y de globulinas, proteínas plasmáticas capaces de disminuir el potencial zeta existente entre
los hematíes.
Si aumentan el fibrinógeno y/o las globulinas disminuyen el potencial zeta. Por ende aumenta la VSG y también lo hace la
viscosidad plasmática, aumentando finalmente la viscosidad sanguínea. Este es el motivo por el que la viscosidad
plasmática presenta el mismo valor diagnóstico que la VSG. Los valores medios están comprendidos entre 1.64 y 1.84
mPas/s (milipascales/segundo).
La consecuencia de un aumento de la viscosidad es la dificultad que presenta la sangre a la hora de circular por los vasos
sanguíneos. Y si existe dificultad de circulación existirá hipo-oxigenación.

Propiedades físico-químicas de la sangre: Osmolalidad plasmática

La Osmolalidad es una forma de expresar la concentración de partículas de una disolución. Dicha concentración genera
una presión osmótica cuando se interpone una membrana semipermeable entre dos compartimentos.
La diferente concentración de sustancias a uno y otro lado de la membrana determinan el paso de agua hacia uno u otro
lado. La Osmolalidad plasmática normal tiene un rango de valor normal de 275-300 mOsmol/kg de agua, y depende de la
concentración del ión sodio, Na+ (con sus aniones acompañantes cloro, Cl–, y bicarbonato, CO3H–), de la glucosa y de la
urea.
La Osmolalidad está regulada por dos hormonas: antidiurética (ADH, también llamada vasopresina) y aldosterona. Si la
Osmolalidad es alta el cuerpo generará ADH para retener líquido y no perder agua a través de la orina. Si la concentración
es baja, el cuerpo generará aldosterona, que reabsorberá sodio para aumentar la Osmolalidad.

Osmolalidad plasmática aumentada

La Osmolalidad plasmática está aumentada en determinados procesos patológicos:

 Diabetes insípida: Por déficit de ADH. Hay poliuria, es decir, se orina muchísimo. Debido a este hecho se
pierde mucha agua y la concentración plasmática aumenta.

 Coma hiperosmolar de la diabetes mellitus: Complicación aguda de la diabetes mellitus. Esta enfermedad
está denominada la enfermedad de las 3P (Poliuria, Polidipsia y Polifagia). La Osmolalidad plasmática aumenta
debido a la alta glucemia y a la perdida de agua a través del riñón. Otra característica es la presencia de
glucosuria.
 Deshidratación: Puede acontecer a causa de diarreas, vómitos o fiebre.

Osmolalidad plasmática disminuida

La Osmolalidad plasmática está disminuida en determinados procesos patológicos:

 Insuficiencia cardiaca congestiva.

 Síndrome nefrótico: Existe oliguria o anuria. Debido a la imposibilidad de eliminar agua a través de la orina, la
concentración plasmática disminuirá.

7.3 DETERMINACIÓN DE LA SUPERVIVENCIA ERITROCITARIA. RESISTENCIA OSMÓTICA

ERITROCITARIA.

Procedimiento de determinación del volumen eritrocitario

El cromato (51 Cr) de sodio debe emplearse sin diluir. El procedimiento descrito es para marcar los eritrocitos del propio
paciente. El siguiente método describe el uso de 25 ml de sangre.

Con experiencia, el procedimiento puede ajustarse para reducir a la mitad el volumen de sangre que se usa el paso 2.

1. Extraer 25 ml de sangre del paciente con una jeringa heparinizada. Depositar 5 ml en un tubo de recuento, añadir una
pequeña cantidad de saponina en polvo y mezclar para hemolizar las células.

Esta muestra (muestra 1) se utiliza para medir la radiación de fondo.

2. Colocar el resto de la muestra de sangre (20 ml) en un frasco estéril que contenga 4 ml de solución ACD estándar.

3. Mezclar la sangre y la solución ACD, añadir despacio 0,74-1,11 MBq (20-30 μCi) de cromato 51Cr) de sodio,
mezclando suavemente de forma continua. Añadir 3,7 MBq (100μCi) si se está midiendo al mismo tiempo la
supervivencia eritrocitaria; ver más adelante.

4. Dejar 30 minutos a temperatura ambiente.

5. Añadir 50 mg de ácido ascórbico (en forma de solución inyectable estéril) para reducir el cromato libre a su estado
trivalente.

6. Añadir 40 ml de solución salina isotónica estéril para lavar. Invertir suavemente 10-12 veces.

7. Centrifugar a no más de 1.000 rpm durante 5 a 10 minutos.

8. Retirar y desechar el líquido sobrenadante y reconstituir hasta 20 ml con solución salina isotónica estéril.

9. Diluir una alícuota de 1 ml de células marcadas resuspendidas hasta 1.000 ml con agua destilada o solución salina con
saponina (para hemolizar las células). Medir una alícuota de 5 ml de esta solución para que sirva de referencia (muestra
2).
10. Inyectar por vía intravenosa una alícuota de los eritrocitos marcados y resuspendidos sin diluir con la cantidad de
radiactividad necesaria (véase posología en sección 4.2.). El volumen (V) de esta alícuota se determina con exactitud
pesando la jeringa y la aguja antes y después de la inyección.

11. Esperar 10 minutos para que las células marcadas se distribuyan por el sistema vascular. Aumentar este tiempo a 30-
40 minutos en caso de policitemia y esplenomegalia.

12. Extraer sin estasis con una jeringa heparinizada una muestra de 8 ml de sangre del brazo opuesto al utilizado para la
inyección de las células marcadas. Transferir 5 ml de la misma a un tubo de recuento y añadir una pequeña cantidad de
saponina en polvo para hemolizar las células (muestra 3).

13. Usar el resto de los 8 ml para obtener valores de hematocrito duplicados (H).

14. Contar la radiactividad (cpm) de las muestras 1-3, así como la del vial vacío (muestra 4) para determinar la radiación
de fondo.

15. Calcular el volumen eritrocitario total con la fórmula:

R=1000 (S--B) xV xH xF

(P—A) x 100
Donde R = volumen total de eritrocitos (ml)
A = cpm de la muestra 1 (radiación de fondo del paciente)
S = cpm de la muestra 2 (referencia)
P = cpm de la muestra 3 (muestra posterior a la inyección)
B = cpm de la muestra 4 (radiación de fondo ambiental)
V = volumen (ml) de inyección en el paso 10
H = hematocrito (porcentaje)
F = factor de corrección (alrededor de 0,96) para corregir el hematocrito en función del plasma atrapado con los
eritrocitos. No se requieren factores de corrección si se utiliza un micro hematocrito.

16. Calcular, en caso necesario, el volumen de sangre total aproximado (T) a partir de la fórmula:

T= R x 100

H x F x 0,91

Procedimiento para determinar el tiempo de supervivencia de los eritrocitos

Si se está midiendo al mismo tiempo el volumen eritrocitario, seguir las etapas 1-5 del procedimiento descrito
anteriormente con estas variaciones:

i. si el recuento leucocitario excede de 25.000/ml, centrifugar la mezcla de sangre y solución ACD, separar el plasma,
retirar la capa leucocitaria y añadir el plasma.
ii. añadir 3,7 MBq (100 μCi) de cromato (51 Cr) de sodio en la fase 3.
iii. dividir la suspensión de células marcadas al final del paso 5.

Si sólo se está determinando el tiempo de supervivencia de los eritrocitos, seguir el procedimiento de los pasos 2-5
anteriores, pero mezclar 10 ml de sangre del paciente con 2 ml de solución ACD y añadir 1,48- 1,85 MBq (40-50 μCi) de
cromato ( 51 Cr) de sodio. No hay fase de lavado. Después de añadir el ácido ascórbico en el paso 5, dejar reposar durante
3 minutos y proseguir como sigue:

6. Inyectar por vía intravenosa el volumen necesario de la mezcla de sangre marcada con la cantidad de radiactividad
necesaria (véase posología en sección 4.2.)".
7. A los 10 minutos, tomar una muestra de sangre de 7-10 ml con una jeringa heparinizada de una vena distinta de la
usada para la inyección. (Si se sospecha que la mezcla no será completa en 10 minutos, tomarla a los 60 minutos.)

8. Centrifugar 2 ml de esta muestra y determinar la radiactividad plasmática.

9. Tomar otra muestra a las 24 horas, tres muestras entre los días 2 y 7, y posteriormente al menos 2 muestras por semana
durante el estudio.

10. Medir la hemoglobina (g/100 ml) con el método del hemiglobincianuro o el PCV sobre una parte de cada muestra.

11. Añadir una pequeña cantidad de saponina a cada muestra, mezclar bien para hemolizar y pipetear 1-3 ml en un tubo de
recuento. Guardar las muestras a 2-4 °C.

12. El último día del estudio, contar la radiactividad de cada muestra, de la muestra de plasma tomada a los 10 minutos (o
a los 60 minutos) y de un tubo vacío para poder sustraer la radiación de fondo. Los valores obtenidos se expresan como
cpm/ml de eritrocitos.

13. Corregir las cifras de cpm en función de la desintegración física y representar gráficamente los datos conforme a las
instrucciones de las páginas 383-384 del documento del International Committee report on Radioisotope Red Cell Studies.
En ellas se incluyen un análisis detallado de los datos de supervivencia eritrocitaria y una tabla con la supervivencia media
del Cr y los factores de corrección. El tiempo que tarda la mitad del radio marcado en abandonar la circulación (T 1/2 o T
50 del Cr) se ha utilizado habitualmente como índice único. Sin embargo, el informe del Comité Internacional resalta que
el T 50 del Cr no tiene una relación simple con la vida media de los eritrocitos, que es el parámetro necesario en la
práctica clínica.

Resistencia osmótica eritrocitaria.

En el eritrocito normal, las características de su membrana le brindan una abundante superficie en relación con su
volumen, mientras que, en el esferocito, esta relación superficie/volumen está disminuida. Cuando un eritrocito normal se
suspende en una solución isotónica, conserva su forma y tamaño y no ocurre destrucción, ya que el balance de entrada y
salida de agua es nulo. Si la solución es hipotónica, el agua penetra en el eritrocito para diluir su concentración de sales y
equilibrar su presión osmótica con la del medio, lo que lleva a un aumento progresivo de volumen del hematíe hasta que
su capacidad se agota, adopta la forma esférica y se rompe y libera hemoglobina al medio. La prueba de FOE se realiza
suspendiendo los hematíes en soluciones de ClNa gradualmente más hipotónicas. Las células que ya tienen una relación
superficie/volumen disminuida, como los esferocitos o estomatocitos, alcanzan la forma esférica límite con menor ingreso
de agua en concentraciones de ClNa mayores que las células normales, y se presenta, entonces, lo que se denomina una
fragilidad osmótica aumentada. Por el contrario, cuando la relación superficie/volumen está aumentada (por ejemplo,
dianocitos), los eritrocitos son más resistentes que los normales y solo se lisan en soluciones muy hipotónicas y presentan
así una fragilidad osmótica disminuida. En el corto tiempo de incubación de la prueba, no se produce intercambio de
cationes y solo hay movimiento de agua; por lo tanto, la hiperactividad de la bomba de sodio de los esferocitos no
interviene en el mecanismo de hemólisis y no influye en el resultado de la determinación. Si la prueba se realiza con
sangre recién extraída (prueba de FOE inmediata), será positiva solo en un 75% de pacientes con ESH.43, 68 Para evitar
este elevado porcentaje de falsos negativos, se debe siempre realizar la prueba de FOE diferida. Al dejar la sangre
incubando 24 horas a 37 °C, se genera déficit de glucosa, y las condiciones de estrés metabólico conducen a la pérdida de
membrana de la población esferocítica, lo que aumenta su fragilidad. Como este proceso tiene muy escaso efecto sobre los
eritrocitos normales, así se enfatiza la diferencia entre ambas poblaciones. Por este método, también se pone en evidencia
la población esferocítica de los pacientes con recuentos reticulocitarios elevados, cuya curva de FOE no incubada puede
ser normal debido a que los meticulositos presentan una fragilidad osmótica inferior a la normal y pueden, entonces,
compensar los resultados. Los parámetros para tener en cuenta para evaluar los resultados de una prueba de FOE son los
siguientes:

• Desplazamiento: La curva está desplazada hacia la derecha (concentraciones mayores de ClNa) respecto a la normal
cuando la FOE está aumentada (esferocitos) o hacia la izquierda cuando está disminuida (talasemias, ferropenia).

• Fragilidad corpuscular media: Es la concentración de ClNa a la cual se produce un 50% de hemólisis. El valor obtenido
es más elevado cuanto más osmóticamente frágil es la población eritrocitaria. Las patologías con eritrocitos
osmóticamente resistentes (por ejemplo, talasemias) presentan valores disminuidos.
 • Hemólisis incipiente: Es la concentración de ClNa a la cual visualmente se detecta que comienza la hemólisis; es mayor
cuanto más osmóticamente frágil es la población eritrocitaria.

Prueba de autohemólisis: Si se dejan eritrocitos normales incubando a 37 °C durante 48 horas, se produce cierto grado de
hemólisis espontánea, no mayor de 2,5%. Los esferocitos presentan hiperactividad de la bomba de Na+ y una glucólisis.

7.4 HEMOGRAMA. MÉTODOS DE RECUENTO CELULAR SANGUÍNEO.

AUTOANALIZADORES.
Histogramas de distribución de volumen. Índices eritrocitarios. Amplitud de distribución eritrocitaria. Recuento de
meticulositos. Valores de referencia e interpretación de alteraciones cualitativas y cuantitativas. Pruebas realizadas para la
orientación etiológica de las anemias.
HEMOGRAMA
Las células sanguíneas producidas en la médula ósea pasan a la circulación periférica para cumplir su función. La sangre
periférica constituye el objeto del hemograma, análisis que reúne las mediciones, en valores absolutos y porcentuales y
agrega el aspecto morfológico de las tres poblaciones celulares, leucocitos, eritrocitos y plaquetas. La mayor parte de las
alteraciones que encontramos en el hemograma no corresponden a enfermedades que tengan origen en la médula ósea,
siendo consecuencia de modificaciones patológicas de diferente naturaleza.
Valores normales o rangos de referencia
Existen múltiples publicaciones con valores de referencia para cada una de las poblaciones celulares del hemograma. Los
rangos de referencia deben ser establecidos por cada laboratorio de acuerdo a su propia población normal, considerando
sexo y edad. Tabla 1 (4, 5).
Índices eritrocitarios:
Los índices eritrocitarios establecidos por Wintrobe en los años 30 indican con precisión cuánto mide un eritrocito
promedio, en volumen, peso y concentración de hemoglobina (6, 7).
VCM (Volumen Corpuscular Medio) Hematocrito x10/Recuento eritrocitos, se expresa en femtolitros (10-15 Fl) y
corresponde al promedio del volumen de cada eritrocito. Permite identificar macrocitosis, microcitosis o normocitosis en
la muestra. El VCM es un parámetro estable en el tiempo (si el laboratorio recibe muestra de control de un paciente que
presenta variación no explicada en su VCM, existe sospecha de confusión de muestra). HCM (Hemoglobina Corpuscular
Media) Hemoglobina x10/ Recuento eritrocitos, se expresa en picogramos (10-12 g), representa la carga media de
hemoglobina de cada eritrocito. Permite identificar normo e hipocromía.

CHCM (Concentración de Hemoglobina Corpuscular Media) Hemoglobina x100/Hematocrito, se expresa en porcentaje,

representa la concentración media de hemoglobina de cada eritrocito. Los recuentos celulares y hemoglobina pueden ser
medidos en forma directa por los autoanalizadores utilizando diferentes métodos como impedancia, difracción de luz,
láser y otros, y sus sistemas de cálculo integrado permiten obtener los índices eritrocitarios en forma automática (8).

RETICULOCITOS

El recuento de reticulocitos mide la producción de glóbulos rojos. Los

reticulocitos corresponden a los glóbulos rojos jóvenes con RNA
residual. El RNA tiene afinidad por los colorantes básicos de la tinción
May Grunwald Giemsa, utilizada para la evaluación del frotis al
microscopio, es esta afinidad la que da a los reticulocitos el
característico color gris azulado que se denomina policromatofilia. El
recuento no automatizado de reticulocitos se realiza en un frotis teñido
con tinción de Azul Cresil brillante. El recuento automático de
reticulocitos basado en citometría de flujo con colorantes específicos
que se enlazan al RNA, es entregado por los autoanalizadores como
recuento absoluto y porcentaje y ha sido incorporado en muchos
laboratorios por su menor variabilidad inter observador y por disminuir
el tiempo de informe del hemograma. El recuento de reticulocitos
aumentado o disminuido, permite clasificar a las anemias en
regenerativas y arregenerativas (recuento absoluto menor a
50.000/mm3), constituyendo otra herramienta de gran utilidad para
orientar el diagnóstico de anemia. Se observa recuento disminuido o
ausencia de reticulocitos en anemias por falla medular (aplasia,
infiltración), y recuento de reticulocitos elevados asociado a las
anemias secundarias a destrucción periférica (hemólisis).

ANEMIA
Se define por la concentración de hemoglobina, que debe ser menor a la establecida como normal para la edad y sexo del
paciente. El hematocrito es un parámetro calculado por los equipos automatizados por lo que no se utiliza en la definición
de anemia. El recuento eritrocitario no se correlaciona con la cantidad de hemoglobina, pues depende del tamaño
eritrocitario.

Anemia Microcítica

Hallazgo de anemia con presencia de eritrocitos de tamaño inferior a lo normal (VCM disminuido), generalmente
asociada a hipocromía (HCM, CHCM disminuidas). La causa más frecuente en nuestro medio de anemia Microcítica
hipocrómica es la ferropenia, cuya confirmación la entregará la historia clínica del paciente y el estudio de Fe (cinética de
Fe y ferritina). Figura 1.

La presencia de un rasgo talasémico (Talasemia menor) también se presenta habitualmente en el hemograma como anemia
Microcítica hipocrómica, en este caso el VCM es habitualmente cercano a 60fl y los hallazgos morfológicos en la
observación del frotis sanguíneo al microscopio orientan al diagnóstico: se pueden apreciar diferentes formas de
eritrocitos con células en diana o targets cells y presencia de punteado basófilo grueso. Los reticulocitos están elevados
por hemólisis, visualizándose al frotis como policromatofilia. El diagnóstico de certeza de esta condición se realiza por
electroforesis de hemoglobina. El índice de Mentzer (VCM/Recuento de eritrocitos) era usado antiguamente como
orientación diagnóstica para diferenciar estas dos condiciones. Un índice de Mentzer menor a 13 es sugerente de
Talasemia y si es mayor a 13 sugerente de ferropenia. En la actualidad este índice ha sido en parte reemplazado por un
nuevo parámetro entregado automáticamente por algunos contadores hematológicos de última generación: razón
%microcitosis %hipocromía, donde una ratio > 0.9% sugiere Talasemia (18, 19). La presencia de anemia Microcítica (con
frecuencia hipocroma), puede verse también en las etapas más avanzadas de las denominadas enfermedades inflamatorias
crónicas, en las cuales el fierro se distribuye en forma anómala por citosinas propias de estos procesos (TNF alfa,
interleucinas), siendo desplazado al sistema mononuclear fagocítico en lugar de ser utilizado en la hematopoyesis. La
hepcidina juega también un rol relevante en la disponibilidad del Fe. El cuadro clínico del paciente asociado al estudio de
fierro (TIBC normal o disminuida con ferritina normal o elevada) debe orientar a lo que habitualmente se denomina como
anemia de las enfermedades crónicas (9, 10).

Anemia Macrocítica

Hallazgo de hemoglobina bajo el rango normal con presencia de eritrocitos de tamaño mayor a lo normal (VCM elevado).
Con mayor frecuencia es provocada por déficits en vitamina B12 o ácido fólico que son esenciales para la síntesis de
DNA y reproducción celular, afectando a los eritrocitos, pero también a las otras poblaciones celulares. Los síndromes
mielodisplásicos suelen presentarse con anemia macrocítica porque generan eritropoyesis ineficaz, anemia que está
acompañada generalmente de citopenias y alteraciones morfológicas en las otras series. Otras causas de anemia
macrocítica son las anemias secundarias a hepatopatías crónicas, pacientes gastrectomizados, tratamientos con fármacos
que afectan el metabolismo del ácido fólico y anemias regenerativas como es el caso de anemias hemolíticas que
presentan aumento de glóbulos rojos jóvenes (reticulocitos) que tienen un volumen más alto que los eritrocitos maduros.

Anemia Normocítica Normocrómica

Se observa disminución de la hemoglobina y hematocrito, sin alteración de los índices eritrocitarios. Puede originarse por
diversas causas, algunas hematológicas como hipoplasia y aplasia medular (11), o etapas iniciales de anemia por sangrado
(previo a la producción de ferropenia) y también causas no hematológicas como la anemia de insuficiencia renal crónica
por déficit de eritropoyetina. La anemia secundaria a cuadros inflamatorios crónicos en sus etapas iniciales también puede
presentarse con normocitosis y normocromía.
7.5 AISLAMIENTO DE LINFOCITOS TOTALES Y SEPARACIÓN DE LINFOCITOS T Y B.
El medio de separación para purificar linfocitos sanguíneos consiste en una mezcla de dos componentes. El ficoll 400 es
un polímero sintético de sacarosa y epiclorhidrina, de 400.000 daltons, soluble en agua. Por otra parte, el diatrizoato de
sodio (que ha sustituido al metrizoato de la fórmula original de Bøyum) es un compuesto que, al ser mezclado con el
ficoll, forma soluciones de baja viscosidad y alta densidad. La función del diatrizoato es proveer la densidad óptima para
la separación y a la vez la osmolaridad adecuada para mantener la viabilidad de las células. Además, el ficoll causa la
aglutinación de los eritrocitos, lo cual facilita aún más su sedimentación. Es recomendable que el medio de separación se
mantenga en envases protegidos de la luz, debido a la fotosensibilidad del diatrizoato. La mezcla de ficoll-diatrizoato está
disponible comercialmente, estéril y lista para su uso, por una variedad de fabricantes (ejs. Ficoll-Paque®, Lymphoprep®,
etc.). También puede prepararse esta mezcla a partir de sus dos componentes, ajustando la densidad final a 1,077 ± 0,001
g/ml

Factores que afectan el procedimiento

La cantidad de sangre a procesar debe guardar proporción con el volumen y la altura del medio de separación. Al
aumentar la altura del estrato de sangre con respecto a la altura del medio, se aumenta la contaminación con eritrocitos en
la interfase. Por esto, el diámetro del tubo es un factor importante para establecer el volumen de sangre óptimo para
fraccionar. Para aumentar el tamaño de la muestra, es preferible aumentar el diámetro del tubo, tratando de no variar la
altura de las capas de medio y de sangre. El rendimiento y la pureza de los linfocitos dependen en gran parte de la
eficiencia en la remoción de los eritrocitos. Cuando estos son aglutinados por el ficoll, algunos linfocitos son atrapados
dentro de los grumos, y por lo tanto se pierden. Este fenómeno se reduce diluyendo la sangre 1:2 antes de fraccionarla,
usando una solución salina balanceada, con el fin de mejorar el rendimiento final de los linfocitos.
Procedimiento
1.Colocar 3 ml de F-D (ficoll-diatrizoato) en un tubo de 10-15 ml.
2.Diluir 2 ml de sangre (anticoagulada1 o desfibrinada) con 2 ml de solución salina balanceada (SSB) o con solución
salina amortiguada con fosfatos (PBS) pH 7,2.
3.Estratificar cuidadosamente 4 ml de la sangre diluída sobre el F-D (¡no mezclar!).
4.Centrifugar a 400 xg durante 20 min, a temperatura ambiente, en un rotor de ángulo libre.
5.Con cuidado de no mezclar las capas, sacar el tubo de la centrífuga y aspirar el plasma (capa superior) con una pipeta,
delicadamente, dejando intacto el anillo blanquecino de células mononucleares en la interfase.
6.Aspirar el anillo de células mononucleares, sin recoger demasiado2 plasma, ni F-D. Depositar las células en un tubo
limpio.
7.Lavar las células agregando ~8-10 ml de SSB y resuspendiendo suavemente con una pipeta. Recuerde que está
trabajando con células vivas que son sensibles a fuerzas mecánicas, así como a la osmolaridad y todos los componentes de
la solución en que se encuentran suspendidas. 8.Centrifugar a 100 xg por 5 min. Botar el sobrenadante mediante la
inversión rápida del tubo (las células se quedan adheridas al fondo, formando un botón) y repetir el lavado.
9.Después del segundo lavado, los linfocitos pueden ser resuspendidos suavemente en el medio apropiado que se va a
utilizar para cada propósito.

10.Para comprobar el porcentaje de viabilidad celular, mezclar partes iguales de la suspensión de células y de azul tripán,
por ejemplo 100 μl + 100 μl, y cargar una cámara de recuento (Figs. 1.3 y 1.4). Observar inmediatamente al microscopio y
contar las células viables (claras), distinguiéndolas de las dañadas (azules). Calcular la concentración de células en la
suspensión original, tomando en cuenta cualquier dilución realizada previamente al recuento.
Figura 1.3: Hemocitómetro o cámara de recuento celular (versión Neubauer). El retículo o cuadrícula está formado por 9
áreas iguales, de 1 mm2 cada una. La profundidad de la cámara (espacio que queda entre la superficie de la cuadrícula y el
cubreobjetos) es de 0,1 mm. El número de células contadas en 1 mm2 , multiplicado por 10 (altura), proporciona el
número de células por mm3 (1 mm3 = 1 μl). Los leucocitos pueden contarse en los cuadrantes externos de 1 mm2 (de
4x4).

Figura 1.4: Vista de un hemocitómetro con su cubreobjetos especial (izquierda) y forma de llenar la cámara por un borde,
con una micropipeta, tocando la muesca o cuña lateral por debajo del cubreobjetos (derecha).
Figura 1.5: Convención para contar las células que quedan en los bordes de las áreas. Las células que tocan los bordes
superior e izquierdo se cuentan, mientras que se excluyen las células que tocan los bordes inferior y derecho. El diagrama
representa como círculos oscuros aquellas células que se contarían, y como círculos más claros las que no.

Separación de linfocitos T

Las diferentes poblaciones y subpoblaciones de linfocitos no son distinguibles morfológicamente. Para identificarlas, se
requieren métodos de laboratorio que detectan, por lo general, proteínas de membrana que utilizamos como "marcadores"
de dichas poblaciones. Alrededor de 1970 se encontró que los linfocitos T humanos poseen la propiedad de unirse
espontáneamente a los eritrocitos de carnero in vitro, formando agrupaciones llamadas rosetas E (Brain et al., 1970; Lay et
al., 1971) (Fig.2.1). Esta propiedad ha sido útil para desarrollar una técnica sencilla y de bajo costo para la cuantificación
de los linfocitos T. El fenómeno de formación de rosetas se debe a que los linfocitos T humanos poseen en su superficie
un receptor que media la unión (fortuita) con los eritrocitos de carnero. Inicialmente, este receptor fue denominado
"antígeno T11", cuando se generaron las primeras series de anticuerpos monoclonales contra marcadores de los linfocitos
T humanos. Posteriormente, cuando se introdujo el uso de la nomenclatura de "grupos de diferenciación" (CD, clusters of
differentiation), se cambió su nombre a CD2. Esta es una glicoproteína de membrana de 50 kDa, presente en todos los
linfocitos T humanos maduros, cuya función natural (que obviamente no puede ser la de unirse a eritrocitos de carnero) es
la interacción con una glicoproteína de 40-70 kDa, denominada LFA-3 (leukocyte function antigen) o CD58, presente en
la superficie de diversos tipos celulares. Los eritrocitos de carnero poseen una molécula análoga al LFA-3 humano en su
superficie. El receptor CD2 posiblemente cumple una función en la estabilización de las interacciones celulares durante la
adhesión y la activación de los linfocitos T. El CD2 puede activar a las células T por medio de una vía diferente de la que
utiliza el complejo TCR/CD3 (receptor para antígeno) (Hale y Haynes, 1992).

Procedimiento

1.Obtener linfocitos de sangre periférica (heparinizada) por el método del ficoll-diatrizoato

(Capítulo 1) y ajustar la suspensión a 5x106 cél/ml en SSB (solución salina balanceada).

2.Lavar eritrocitos (E) de carnero (mantenidos en anticoagulante de Alsever1) 4 veces con

solución salina al 0,85% y resuspenderlos finalmente en SSB, al 0,5% v/v (por ejemplo: 0,1 ml de E empacados en 20 ml
de SSB).
3.Mezclar en un tubo de 12x75 mm (preferiblemente de plástico y con tapa) 0,1 ml de E y 0,1 ml de linfocitos. Agregar 20
μl de suero fetal bovino (previamente inactivado por calorpor 30 min a 56°C).
4.Centrifugar a 50 xg durante 5 min y luego colocar en refrigeración (4-8°C) durante 90 min, sin causar disturbios en el
botón de células.
5.Inmediatamente antes de examinar la muestra, agregar 100 μl de azul tripán.1 la estabilidad de los eritrocitos de carnero
en Alsever (para esta prueba) es de 3-4 semanas. La suspensión de trabajo se prepara para cada día y se descarta.
6.Resuspender suavemente las células, inclinando el tubo hasta una posición casi horizontal y rotándolo lentamente por
20-30 seg. Con una pipeta Pasteur sin bulbo, transferir por capilaridad una gota de la suspensión a una cámara de recuento
celular.
7.Contar 100 linfocitos con el objetivo de 40x y anotar como "rosetas" aquellos linfocitos que posean 3 o más eritrocitos
adheridos. No deben contarse las células permeables al azul tripán (dañadas), ni los monocitos (estos se pueden "marcar",
agregando desde el inicio partículas de látex de 1 μm, las cuales van a ser fagocitadas).
8.Calcular el porcentaje de linfocitos T (%T o % células E+), así como su número absoluto(T/µl o células E+/µl) con base
en los datos del hemograma de la muestra (número de leucocitos totales y fórmula leucocitaria diferencial).
• Ejemplo del cálculo de la cifra absoluta de linfocitos T:

recuento de leucocitos = 8000/μl

% de linfocitos = 30%
% de células E+ = 55%
cifra absoluta de T = 8000 x 0,3 x 0,55 = 1.320 cél.T/μl

Figura 2.1: Microfotografía (al fresco) de una roseta E formada por un linfocito T humano, rodeado de numerosos
eritrocitos de carnero (izquierda). Note la célula contigua que no se unió a los eritrocitos, y que por lo tanto se cuenta
como "no-T". A la derecha se muestra una roseta fijada y teñida (en una preparación de citocentrífuga).

Figura 2.2: A la izquierda se muestra una vista microscópica en bajo poder (objetivo 10x) de la mezcla de linfocitos y
eritrocitos de carnero, en donde las flechas señalan dos rosetas. A la derecha se observa en mayor detalle (objetivo 40x) la
formación de dos rosetas.

Separación de linfocitos B
Se aislaron linfocitos a partir de sangre periférica, utilizando el método de Middleditch et al. (10). A 10 ml. de sangre
venosa heparinizada se agregaron 14 ml. de solución tamponada de fosfatos (PBS) pH 7.4. Ocho ml. de la anterior
solución se añadierón sobre 3 ml. de Ficoll tipo F-P (No. F 8628, Sigma Co., St. Louis Mo., EUA) y se centrifugaron
durante 30 minutos a 400 r.p.m. La interfase opaca resultante, que contiene los linfocitos se separó con pipeta Pasteur y se
trató con 10 ml. de cloruro de amonio 0.87%, durante 5 minutos, con el objeto de lisar los glóbulos rojos contaminantes.
Posteriormente la solución se centrifugó a 250 r.p.m. durante 10 minutos. El precipitado obtenido se lavó y centrifugó por
3 veces con 5 ml. de PBS. Finalmente el precipitado se suspendió en 0,2 ml. de PBS y se colocó en gota gruesa sobre
láminas portaobjetos, dejándolas secar a temperatura ambiente. Previa realización de la reacción inmunológica, las
láminas se fijaron en metanol absoluto durante 30 minutos.

Identificación Inniunocitoquímica de Linfocitos B:

En la reacción de inmunofluorescencia indirecta (11) se utilizaron los siguientes antisueros consecutivamente: suero de
conejo anti-inmunoglobulinas humanas A, G y M, fracciones Fab (Miles Yeda Ltd., Israel) y suero de cabra anti-IgG de
conejo, conjugado a fluoresceína (Calbiochem-Behring Corp. La Jolla Ca. EUA). Las láminas se montaron en glicerol y
se estudiaron por microscopía de fluorescencia. La reacción de inmunoperoxidasa indirecta (12) se realizó según
procedimiento descrito por Escovar et al. (13) utilizando los siguientes antisueros: suero de conejo anti-inmunoglobulinas
humanas A, G y M, fracciones Fab (Miles Yeda Ltd.) y suero de cabra anti-IgG de conejo, conjugado a peroxidasa
(Cappel Lab, Pa. EUA). La reacción cromógena se desarrolló con 3.3'diaminobenzidina y H 2 02 al 0.1%. Las láminas
fueron contrastadas con hematoxilina de Harris, montadas en Entallan y leídas por microscopía de luz.

7.6 INDUCCIÓN DE DREPANOCITOS

La drepanocitosis o anemia de células falciformes se debe a la producción de una hemoglobina mutante (Hb S), que es el
resultado del reemplazo de la adenina por la timina en el codón del DNA (GTG en lugar de GAG) que codifica el ácido
glutámico, en la posición 6 de la cadena β de la globina, lo que da lugar a que este aminoácido se sustituya por valina.
Dicho cambio hace posible que la Hb S se polimerice con facilidad. El gen de la drepanocitosis representa una ventaja
genética: protege al portador heterocigoto de sufrir el cuadro de paludismo endémico causado por Plasmodium
falciparum, aunque, por otro lado, contribuye a la muerte prematura de los individuos homocigotos, lo cual ejemplifica el
polimorfismo balanceado

La prueba de drepanocitos es un análisis de sangre que se realiza para detectar el rasgo drepanocítico o la anemia
drepanocítica. La anemia drepanocítica es una enfermedad sanguínea hereditaria que hace que los glóbulos rojos sean
deformes (falciformes). Los glóbulos rojos se deforman porque contienen un tipo anormal de hemoglobina, llamada
hemoglobina S, en vez de contener hemoglobina normal, llamada hemoglobina A

Los drepanocitos son destruidos por el cuerpo más rápido que las células sanguíneas normales. Esto causa anemia.
Además, los drepanocitos pueden quedar atrapados en los vasos sanguíneos y reducir o bloquear el flujo de sangre. Esto
puede dañar órganos, músculos y huesos, y puede provocar afecciones potencialmente mortales.

La mejor manera de detectar el rasgo drepanocítico o la anemia drepanocítica es analizar la sangre con un método llamado
cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC, por sus siglas en inglés). Esta prueba identifica qué tipo de
hemoglobina está presente. Para confirmar los resultados de la HPLC, puede hacerse una prueba genética.

Una persona hereda dos grupos de genes (un grupo de cada uno de los padres). Por consiguiente, una persona puede tener:

Dos grupos de genes que producen la hemoglobina normal (hemoglobina A). Estas personas tienen glóbulos rojos
normales, a menos que tengan alguna otra enfermedad sanguínea.

Un grupo de genes que elabora la hemoglobina normal (hemoglobina A) y un grupo que elabora la hemoglobina S. Estas
personas tienen el rasgo drepanocítico (y son llamadas "portadores"), pero no tienen anemia drepanocítica. Por lo general,
el rasgo drepanocítico no es un factor perjudicial.

Dos grupos de genes que elaboran la hemoglobina S. Estas personas tienen anemia drepanocítica. Ambos padres tienen el
rasgo drepanocítico o anemia drepanocítica. A menudo, los glóbulos rojos falciformes causan problemas de salud
recurrentes, llamados crisis drepanocíticas.

Un grupo de genes que elabora hemoglobina S y un grupo que elabora algún otro tipo anormal de hemoglobina. Según el
otro tipo de hemoglobina anormal, estas personas pueden tener un trastorno drepanocítico leve o grave.

7.7 PRUEBAS DE RESISTENCIA OSMÓTICA ERITROCITARIA (ROE)

La Resistencia Globular Osmótica (RGO) también se puede denominar Resistencia Osmótica Eritrocitaria (ROE)
o Prueba de fragilidad osmótica. Se define como la capacidad que tienen los hematíes para resistir el efecto hipotónico del
medio.
Se determina incubando los hematíes en soluciones salinas hipotónicas y valorando la hemólisis que se produce como
resultado de la entrada de agua desde el medio hacia el interior de los hematíes.

Resistencia Globular Osmótica (RGO)

La RGO se expresa como la concentración de NaCl necesaria para producir un 50% de hemólisis. A dicha concentración
se le denomina H50. La RGO es inversamente proporcional a ésta, es decir, si la Resistencia Globular Osmótica es mayor,
el valor de la H50 será menor, y viceversa.
Los valores de referencia son:

 Prueba inmediata (muestra reciente): H50 = 0,36 – 0,42%.

 Prueba incubada (muestra incubada): H50 = 0,45 – 0,52%.
Cuando existe una alteración de la forma que conlleve una disminución de la relación superficie/volumen, la resistencia
osmótica eritrocitaria es menor (H50 aumentada). Así ocurre en la esferocitosis hereditaria, estomatocitosis congénica,
ovalocitosis hereditaria o en la anemia hemolítica microangiopática.
Si la relación superficie/volumen aumenta, la fragilidad osmótica es mayor (H50 disminuida), como ocurre en la
xerocitosis, anemia ferropénica, reticulocitosis, beta-talasemia menor, hemoglobinopatía S y hemoglobinopatía C.
Material
 Centrífuga
 Espectrofotómetro o fotocolorímetro
 Diez tubos de ensayo
 Pipetas de vidrio
 Pera para pipeta
 Pipetas pasteur
 Micropipeta automática
 Puntas de micropipeta
 Papel milimetrado
 Suero salino fisiológico (NaCl 0,9%)
 Vasos de precipitado
 Parafilm
Reactivos
 Soluciones de NaCl en las siguientes concentraciones, en tanto por ciento: 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8
y 0,9. Todas ellas se preparan a partir de una solución madre de NaCl de 9 g/l.
 Sangre anticoagulada con EDTA.
Técnica
1. Rotular 10 tubos de centrífuga y colocarlos ordenadamente en una gradilla.
2. Poner en cada uno de ellos 10 ml de solución salina con las diferentes concentraciones.
3. Añadir a cada tubo 50 microlitros de sangre anticoagulada con EDTA. Importante homogeneizar bien la sangre
antes de dispensarla en los tubos.
4. Tapar con parafilm los tubos y mezclar suavemente por inversión.
5. Dejar a temperatura ambiente durante una hora.
6. Centrifugar a 2800 rpm durante 5 minutos.
7. Recoger el sobrenadante con una pipeta pasteur y pasarlo a tubos limpios, rotulados con su número
correspondiente.
8. Leer la absorbancia de cada uno de los sobrenadantes a 546 nm. La lectura se realiza con una misma cubeta,
utilizando el tubo número 1 como blanco y leyendo el resto de forma ordenada (1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y
18).
9. Hallar los porcentajes de hemólisis de cada tubo utilizando los resultados de las absorbancias.

10. Extrapolar los resultados en una hoja de papel milimetrado para realizar la curva de resistencia globular
osmótica o resistencia osmótica eritrocitaria.
 11. Determinar sobre la gráfica el valor de NaCl para el que corresponde la hemólisis al 50% (H50).

7.8 PRUEBAS DE HEMOLISIS ACIDA (HAM)

Esta prueba puede confirmar el diagnóstico de hemoglobinuria paroxística nocturna (hpn) y también se puede utilizar para
diagnosticar otro trastorno poco común llamado anemia diseritropoyética congénita. la hemoglobinuria paroxística
nocturna (hnp), llamado también síndrome de marchiafava-micheli, es una enfermedad rara y crónica causada por un
defecto en la membrana (superficie celular) de las células sanguíneas debido a una mutación del gen (pig-a), que codifica
a una proteína de la membrana celular localizada en el cromosoma x llamado glucosilfosfatidilinositol (gpi). la ausencia
de este gen hace suceptible las celulas a la hemólisis. esta prueba de laboratorio identifica a las células sanguíneas que no
tienen proteínas de anclaje gpi (monocitos, granulocitos y glóbulos rojos).
7.9 PRUEBAS DE COOMBS

El Test de Coombs Directo (TCD) 

Es una técnica muy utilizada en el laboratorios de inmunohematología del área de Banco de Sangre. Esta prueba analítica
recibe otros nombres como Prueba de la Antiglobulina Humana (PAH) directa o Test de la Antiglobulina Humana (TAH)
directa.
Se utiliza de forma individual o como parte de otras técnicas. En éstos casos forma parte del paso final, el cual es
conocido como «llevar a Coombs«. Existe otra variante de esta técnica denominada Test de Coombs Indirecto (TCI).

Utilidad del Test de Coombs Directo

Este test se utiliza para la detección de hematíes sensibilizados in vivo, es decir, hematíes recubiertos por anticuerpos.
Éstos pueden ser de clase IgG, IgM, IgA y/o fracciones del Complemento. Los hematíes de la muestra son enfrentados
directamente a la antiglobulina humana, también llamado Suero de Coombs.
Esta técnica es muy útil para:

 El diagnóstico de la Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido (EHRN). Esta enfermedad también es conocida
como Eritroblastosis Fetal y como Enfermedad Hemolítica Feto-Neonatal (EHFN).
 El diagnóstico de la Anemia Hemolítica Autoinmune (AHAI).
 La investigación de hematíes sensibilizados por medicamentos.
 La investigación de reacciones transfusionales.
También es muy útil en situaciones dispares como unas pruebas cruzadas incompatibles en un paciente con Escrutinio de
Anticuerpos Irregulares (EAI) negativo. Es relativamente común realizar un Test de Coombs Directo a un Concentrado de
Hematíes Filtrados (CHF) y que sus hematíes den positivo, desvelando así la causa de la incompatibilidad.

Material necesario para realizar el Test de Coombs Directo

 Tubos de centrífuga, de ensayo o de vidrio con las medidas necesarias para su uso en una centrifugadora-
lavadora
 Centrífuga
 Pipetas pasteur
 Suero salino fisiológico (SSF) al 0,9% NaCl
 Suero de Coombs poliespecífico y/o Suero de Coombs monoespecífico (Anti-IgG, Anti-IgM, Anti-IgA y Anti-
Complemento)
 Muestra de sangre anticoagulada con EDTA

Técnica del Test de Coombs Directo

1. Hacer una dilución al 3% de los hematíes de la muestra.
2. Dispensar dos gotas de esta dilución en un tubo.
3. Lavar los hematíes tres veces con SSF.
4. En el último lavado decantar completamente el suero salino, dejando el botón hemático.
5. Añadir dos gotas de Suero de Coombs poliespecífico.
6. Homogeneizar, centrifugar 10 minutos a 1500 rpm y resuspender el botón hemático para comprobar si existe
aglutinación.
La técnica es idéntica si se utiliza un Suero de Coombs monoespecífico en lugar del poliespecífico. De este modo se
puede identificar si la sangre problema está sensibilizada por la fracción C3D del complemento o por un anticuerpo de
clase IgG, IgA o IgM. Si alguno de los monoespecíficos es positivo, es muy probable que sea necesario, además, titular
tanto del poliespecífico como el monoespecífico si han dado positivo. Los antisueros monoespecíficos son Anti-IgA, Anti-
C3D, Anti-IgM y Anti-IgG.

Test de Coombs Directo en autoanalizador

Debido a la sensibilidad de los autoanalizadores, muchos laboratorios optan por realizar un Test de Coombs Directo en
tubo si el TCD del autoanalizador da positivo. Si la prueba es positiva en autoanalizador pero negativa en tubo, la prueba
se cataloga como negativa. En cualquier caso, hablando en términos de la prueba a un Recién Nacido (RN), si la prueba es
positiva en autoanalizador se debe avisar al Nido, aunque posteriormente la prueba en tubo sea negativa y se transfiera
este resultado informáticamente.

Es muy común obtener un resultado positivo en autoanalizador de 0,5 y que sea negativo en tubo. Es un falso positivo que
no debe evitar el aviso al Nido para la vigilancia del RN al que pertenece la muestra. El resultado se transferirá
como Negativo con una nota adjunta que incluya el contenido «Test de Coombs Directo positivo en autoanalizador
(Cantidad de cruces) y negativo en tubo. Se valida el resultado como negativo. Avisado Nido«.

El Test de Coombs Indirecto (TCI) 

Es una técnica muy utilizada en el laboratorios de inmunohematología del área de Banco de Sangre. Esta prueba analítica
recibe otros nombres como Prueba de la Antiglobulina Humana (PAH) indirecta o Test de la Antiglobulina
Humana (TAH) indirecta.
Esta técnica es una variación de la técnica original denominada Test de Coombs Directo (TCD).

Utilidad del Test de Coombs Indirecto

Este test se utiliza para la detección de hematíes sensibilizados in vitro, es decir, hematíes conocidos recubiertos por
anticuerpos. La finalidad no es tanto la de determinar si hay anticuerpos adheridos a la membrana del hematíe, sino la de
buscar anticuerpos en una muestra de plasma problema enfrentándola a hematíes conocidos.
Esta técnica es muy útil para:

 Escrutinio de anticuerpos irregulares (EAI)

 Identificación de anticuerpos irregulares
 Pruebas cruzadas pretransfusionales
En el escrutinio de anticuerpos irregulares, y en la identificación de los mismos, se enfrenta el suero o plasma problema
a hematíes con fenotipo conocido. La finalidad está implícita en el nombre de las pruebas.
En las pruebas cruzadas pretransfusionales ha desplazado a las clásicas pruebas cruzadas mayor y menor. El Test de
Coombs Indirecto, enfrentando el plasma del paciente a los hematíes de los Concentrados de Hematíes Filtrados (CHF) a
transfundir, ofrece mejores resultados. De hecho, las pruebas cruzadas mayor y menor aún se realizan en casos concretos
como transplantes de médula ósea, y lo hacen utilizando el TCI.

Material necesario para realizar el Test de Coombs Indirecto

 Tubos de centrífuga, de ensayo o de vidrio con las medidas necesarias para su uso en una centrifugadora-
lavadora
 Centrífuga
 Baño termostatado a 37ºC
 Cronómetro
 Pipetas pasteur
 Parafilm
 Reactivo de Albúmina Bovina al 22%
 Suero salino fisiológico (SSF) al 0,9% NaCl
 Suero de Coombs poliespecífico
 Hematíes conocidos (I/II/III, panel de 11 células, CHF…)
 Muestra de sangre problema anticoagulada con EDTA
Técnica del Test de Coombs Indirecto
 La técnica del TCI que se expresará a continuación es la referente al EAI. La identificación de anticuerpos o las
pruebas cruzadas pretransfusionales varían en el número de hematíes distintos a los que enfrentar el plasma
problema.
 En un Escrutinio de Anticuerpos Irregulares se enfrenta el plasma problema a hematíes comerciales de 3
donantes diferentes (I, II y III). Estos donantes son del grupo O con fenotipo conocido de los
sistemas RH, Kell, Duffy, Kidd, Xg o Lewis entre otros.
 En un Panel de Anticuerpos Irregulares el plasma se enfrenta a hematíes comerciales de 11 donantes diferentes.
Y en las pruebas cruzadas petransfusionales se enfrentará el plasma problema a cuantas bolsas de sangre quieran
reservarse y/o trasfundirse al paciente en cuestión.

Escrutinio de Anticuerpos Irregulares

1. Centrifugar la muestra problema a 3500rpm durante 10 minutos para tener acceso al plasma del paciente.
2. Numerar tres tubos como I, II y III, y dispensar en cada uno de ellos 2 gotas de plasma problema.
3. Añadir a cada tubo correspondiente 1 gota de hematíes de fenotipo conocidos (I, II y III).
4. Homogeneizar, centrifugar 30 segundos a 1500 rpm y realizar una lectura en busca de aglutinación. A este paso
se le denomina Fase de salino o Fase de salino inmediata.
5. Añadir a cada tubo 1 gota de albúmina bovina al 22%.
6. Homogeneizar, centrifugar 30 segundos a 1500 rpm y realizar una lectura en busca de aglutinación. A este paso
se le denomina Fase de albúmina o Fase de albúmina inmediata.
7. Incubar los tres tubos a 37ºC durante 30 minutos.
8. Centrifugar 30 segundos a 1500 rpm y realizar una lectura en busca de aglutinación. A este paso se le
denomina Fase a 37ºC o Fase de albúmina a 37ºC.
9. Lavar los tres tubos, en tres ocasiones, con SSF.
10. Decantar completamente el sobrenadante después del último lavado.
11. Añadir a cada tubo 2 gotas de Suero de Coombs.
12. Homogeneizar, centrifugar 30 segundos a 1500 rpm y realizar una lectura en busca de aglutinación. A este paso
se le denomina Llevar a Coombs, Fase de Coombs, Fase de antiglobulina humana o Test de Coombs
Indirecto.
Consideraciones sobre la técnica del Test de Coombs Indirecto
Existen una serie de factores que afectan al Test de Coombs Indirecto, ya sea en el EAI, en la Identificación de
Anticuerpos Irregulares o en las Pruebas Cruzadas.

Fase de sensibilización
Uno de estos factores es la temperatura en la fase de sensibilización in vitro. Debe ser a 37ºC porque es la temperatura en
la que tiene lugar la fijación del complemento y a la que mejor reaccionan los anticuerpos de clase IgG. Esta temperatura
permite la identificación de la mayor parte de los anticuerpos clínicamente significativos.

Otro factor es el medio en el que están suspendidos los hematíes. Éste puede ser albúmina, suero salino, un medio de baja
fuerza iónica (LISS), un medio enzimático (Ficina, Papaina, Bromelina…), Ditiotreitol (DTT) o Polietilenglicol (PEG).
Esto permite una variedad de técnicas asociadas (Autoanalizadores, paneles enzimáticos, adsorbidos y Técnica del DTT).
La proporción plasma/hematíes puede variar. Se puede incrementar a 3/4 gotas de plasma por gota de hematíes. Esto es
útil para aumentar la sensibilidad ante anticuerpos débiles. Se debe tener cuidado con la cantidad de muestra, ya que la
positividad en un estudio puede ser el preludio del inicio de otro en el que se requiera mayor cantidad.
Fase de lavado
El lavado debe ser rápido e ininterrumpido para reducir todo lo posible la elución de anticuerpos y su posterior pérdida
tras decantación. Respecto a la decantación, se debe decantar la mayor cantidad de sobrenadante posible en cada lavado y
agitar después el botón hemático. De este modo los hematíes se resuspenden y se homogeneizan con mayor facilidad al
entrar en contacto con SSF para un nuevo lavado.

7.10 INDUCCIÓN DE PRUEBAS DE HEINZ

FUNDAMENTO.-Los cuerpos de Heinz toman un color púrpura cuando se exponen a colorantes básicos. Los cuerpos de
Heinz son

precipitado de hemoglobina desnaturalizada que se encuentran pegados a la membrana celular.

REACTIVOS.

 Violeta de metilo al 0.5%, (preparar con solución salina).

 La solución debe filtrarse antes de su uso.

MATERIAL BIOLOGICO.

1. 3 ml de sangre con anticoagulante EDTA del paciente.

2. 3 ml de sangre con anticoagulante EDTA del testigo.

TECNICA.

Se mezcla usando pipeta Pasteur en un tubo de ensayo 1 gota de sangre y 4 gotas de solución salina de violeta de metilo

previamente filtrado, incubar 10 minutos a temperatura ambiente. Se hacen frotis con la mezcla y se observa la suspensión
celular

entre portaobjetos y cubreobjetos. Los cuerpos de Heinz se tiñen de color púrpura intenso y su tamaño varía desde 1 a 2
micras.

Habitualmente se encuentran cerca de la órbita de los eritrocitos y pueden encontrarse varios cuerpos en cada uno.

Informar el % de eritrocitos que contienen cuerpos de Heinz contando 1000 glóbulos rojos por lo menos, de acuerdo con
el cálculo siguiente: % de eritrocitos que contienen cuerpos de Heinz= No. de eritrocitos con cuerpos de Heinz/1000 X100

7.11 TINCIONES HISTOQUÍMICAS

Las reacciones químicas consisten en la modificación química de moléculas del tejido para posteriormente poder
colorearlas. Existen técnicas histoquímicas para detectar glúcidos, proteínas y nucleótidos. La técnica histoquímica más
empleada es la reacción de PAS (Periodic Acid Schiff) (Figuras 1y 2). Se utiliza para la detección de hidratos de carbono,
libres o conjugados, cuando están en cantidades relativamente grandes en los tejidos. La modificación química del tejido
consiste en la oxidación mediante el ácido periódico de los enlaces entre los carbonos próximos que contienen grupos
hidroxilos. Esto provoca la formación de grupos aldehídos que serán reconocidos por el reactivo de Schiff, el cual se
combinará con ellos para dar un color rojizo brillante (Figura 1). Entre los componentes del reactivo de Schiff está la
pararosanilina (un componente de la fucsina básica) tratada con ácido sulfúrico. Una gran ventaja de la tinción
histoquímica PAS es su capacidad de discriminación de tipos de glúcidos con pequeñas modificaciones de la técnica.

La histoquímica enzimática o histoenzimología se basa en la capacidad que tienen algunos enzimas del tejido de mantener
funcional su centro activo tras el proceso de fijación. Estos enzimas y las células que los poseen se ponen de manifiesto
mediante una reacción enzimática que convierte a unos sustratos solubles e incoloros en productos insolubles y
coloreados. Los sustratos son específicos para el enzima y los productos se depositan en el lugar preciso donde se produjo
la reacción, es decir, donde se localiza el enzima. Las enzimas que se pueden detectar son variadas como las peroxidasas,
fosfatasas, deshidrogenasas, diaforasas, acetilcolinesterasa, etcétera.
figure 2. Pasos de la tinción histoquímica PAS-Hematoxilina sobre cortes de parafina. Los pasos con letras en color verde
son los específicos para esta tinción.
Figura 4. Los pasos para la detección histoquímica de la actividad diaforasa es muy sencilla. Tras una fijación,
preferentemente por perfusión, hay que permeabilizar el tejido con un disolvente de lípidos como el Triton-X100. El
revelado se produce a 37 oC y el final de la reacción se controla mediante observaciones periódicas. Las concentraciones
del sustrato (NADPH) y del azul de tetrazolio varía según el tejido o el proceso de fijación.

7.12 OBSERVACION DE FROTIS

MATERIALES
• Microscopio • Cubeta de tinción
• Portaobjetos • Frasco lavador
• Mechero de alcohol • Alcohol absoluto
• Hematoxilina
• Lanceta estéril • Eosina

PROCEDIMIENTO
• Con la lanceta estéril realizar una punción en un pulgar.

• Depositar una gota de sangre en la parte central de un portaobjetos.

• Colocar un portaobjetos como indica el dibujo y deslizarlo sobre toda la superficie del porta de manera que se
pueda obtener una fina película de sangre. El porta absorbe la gota y la arrastra, pero sin pasar nunca por
encima de ella para no dañar los hematíes.

• Colocar el frotis de sangre sobre la cubeta de tinción y añadir unas gotas de alcohol absoluto y dejar que el
alcohol se evapore para fijar la preparación.

• Cubrir con unas gotas de hematoxilina y dejar actuar durante 15 minutos. Evitar la desecación del colorante
agregando más líquido.

• Lavar la preparación y añadir unas gotas de eosina dejándola actuar 1 minuto.

• Volver a lavar hasta que no queden restos de colorante.

 • Dejar secar aireando el porta o bien al calor muy lento de la llama del mechero.

• Observar al microscopio.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

Al microscopio se verán con un dominio predominante los glóbulos rojos, hematíes o eritrocitos teñidos de color rojo por
la eosina. No tienen núcleo y son más delgados por el centro que por los bordes.

Los glóbulos blancos o leucocitos se identifican fácilmente por la presencia de núcleo, teñido de morado por la
hematoxilina. Hay varias clases de leucocitos:

1. Linfocitos: de tamaño aproximado al de los glóbulos rojos, tienen un solo núcleo que ocupa casi todo el
glóbulo.

2. Monocitos: son los leucocitos mayores, poco frecuentes normalmente, núcleo grande, redondo, son los más
móviles y su función principal es la fagocitosis.

3. Polimorfonucleares: núcleo fragmentado o arrosariado. Pueden ser eosinófilos, con abundantes

granulaciones teñidas de rojo por la eosina, neutrófilos y basófilos.

Las plaquetas no son visibles ya que precisan una técnica especial de tinción.

7.13 DESCARTE DE FACTORES DE COAGULACION, PRUEBAS DE COAGULACION

El diagnóstico incluye pruebas de detección y análisis del factor de coagulación. Las pruebas de detección son análisis de
sangre que muestran si la sangre se coagula de manera adecuada. Los análisis del factor de la coagulación se llaman
también pruebas de coagulación y son requeridos para el diagnóstico de los trastornos de la sangre.

Pruebas de detección
Las pruebas de detección son análisis de sangre que muestran si la sangre se coagula de manera adecuada. Tipos de
pruebas de detección:

Hemograma completo (CBC)

Esta prueba común mide la cantidad de hemoglobina (el pigmento rojo dentro los glóbulos rojos que transporta oxígeno),
el tamaño y la cantidad de glóbulos rojos, y la cantidad de los diferentes tipos de glóbulos blancos y plaquetas que se
encuentran en la sangre. El CBC es normal en las personas con hemofilia. No obstante, si una persona con hemofilia tiene
hemorragias inusualmente abundantes o sangra durante un tiempo
prolongado, la hemoglobina y el conteo de glóbulos rojos pueden ser
bajos.

Prueba del tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA)

Esta prueba mide cuánto tarda la sangre en coagularse. Mide la gota de
capacidad de coagulación de los factores VIII (8), IX (9), XI (11) y XII sangre
(12). Si cualquiera de estos factores de la coagulación son muy bajos,
la sangre tarda más de lo normal en coagularse. Los resultados de esta prueba mostrarán un tiempo de coagulación más
largo en las personas con hemofilia A o B.

Prueba del  tiempo de protrombina (PT)

Esta prueba también mide el tiempo que tarda la sangre en coagularse. Mide fundamentalmente la capacidad de
coagulación de los factores I (1), II (2), V (5), VII  (7) y X (10). Si los niveles de cualquiera de estos factores son muy
bajos, la sangre tarda más de lo normal en coagularse. Los resultados de esta prueba serán normales en la mayoría de las
personas con hemofilia A y B.

Prueba de fibrinógeno
Esta prueba también ayuda a los médicos a evaluar la capacidad del paciente para formar coágulos de sangre. Se realiza
junto con otras pruebas de coagulación sanguínea o cuando el paciente tiene resultados anormales en la prueba PT, en la
prueba APTT o en ambas. Fibrinógeno es otro nombre que se usa para el factor de la coagulación.

Pruebas de los factores de la coagulación

Las pruebas del factor de la coagulación se llaman también pruebas de coagulación y se requieren para el diagnóstico de
los trastornos de la sangre. Este análisis de sangre muestra el tipo de hemofilia y su nivel de gravedad. Es importante saber
cuál es el tipo y el nivel de gravedad para crear el mejor plan de tratamiento.

7.14 TIEMPO DE COAGULACION Y SANGRAMIENTO

TIEMPO DE SANGRAMIENTO
Es una medida de la integridad de los componentes vascular y plaquetario. Su prolongación se relaciona con
púrpuras vasculares y trastornos cualitativos y cuantitativos de las plaquetas.
En general, el tiempo de sangramiento se encuentra prolongado cuando los recuentos de plaquetas son
inferiores a 50 x 109/L en las alteraciones de la función plaquetaria y en la enfermedad de von Willebrand,
aunque en esta última si es normal no invalida el diagnóstico.
Para su determinación se describen varios métodos; entre los más utilizados están el método de Duke y
el de Ivy.

Método de Duke
Principio: se hace una incisión estandarizada en el lóbulo de la oreja y se registra el tiempo requerido
para que cese el sangramiento en la piel en un período de tiempo.

Valores de referencia:

- Normal: 1 a 3 min.
- Prolongado: por encima de 3 min.

Método de Ivy
Principio: se coloca el esfigmomanómetro alrededor de la parte superior del brazo y se insufla a 40 mmHg;
posteriormente se realizan 3 incisiones en la parte externa del antebrazo y se pone en marcha un
cronómetro pera medir el tiempo en que deja de sangrar.

Valores de referencia:

- Normal: hasta 5 min.

- Prolongado: por encima de 5 min.

PRUEBA DEL LAZO (Rumpel Leede)

Normalmente, la pared vascular no permite extravasación de sangre. Sin embargo, en algunas situaciones anormales, tales
como desnutrición, intoxicaciones, trombocitopenias, desarreglos hormonales, se puede presentar una fragilidad del
endotelio capilar o pared vascular, que permite una salida anormal de la sangre hacia los tejidos circulantes, lo que se
traduce en la aparición de petequias. Por lo tanto, es una medida de la integridad de los componentes vascular y
plaquetario.

Principio: la prueba del lazo o torniquete consiste en aplicar una presión positiva en el antebrazo del paciente y observar
en un tiempo determinado la aparición de petequias en el antebrazo por debajo del sitio de la lesión.

Valores de referencia:

- Negativa: no aparición de petequias.

- Positiva: aparición de petequias en el antebrazo por debajo del sitio de la lesión.

RETRACCIÓN DEL COÁGULO (método cualitativo)

La retracción del coágulo depende del número de plaquetas, de su actividad funcional y de la concentración del
fibrinógeno. El grado de retracción se correlaciona muy bien con el número de plaquetas. En ciertas condiciones puede
resultar normal aún con un número tan bajo de plaquetas como 30 000/mm3.
Por alteraciones funcionales como en la tromboastenia de Glanzmann, en ciertas enfermedades sistémicas y en
insuficiencia renal aguda o crónica, la retracción del coágulo puede ser incompleta o nula.
En los métodos en sangre total, el grado de retracción es dependiente del hematócrito, o sea, del volumen globular a
retraer.
Principio: la retracción del coágulo depende de la actividad trombodinámica plaquetaria, porque se necesita un número
mínimo de plaquetas normales y cationes divalentes. La actinomiosina plaquetaria (trombosternina), proteína contráctil
plaquetaria, parece ser responsable de esta función.

Valores de referencia:

- Retráctil: el coágulo sanguíneo se desprende totalmente del tubo de ensayo.

- Parcialmente retráctil: solo una porción del coágulo se desprende.
- Irretráctil: el coágulo se mantiene adherido a las paredes del tubo.

RECUENTO DE PLAQUETAS

Las plaquetas desempeñan una función importante en el mecanismo de la hemostasia, así como en la respuesta a la lesión
vascular. La detención de la hemorragia depende de la formación de un trombo plaquetario que se consolida con la
formación de fibrina por activación del mecanismo de la coagulación; su disminución o incorrecto funcionamiento se
relaciona con trastornos hemorrágicos.

Para el recuento de plaquetas se emplean métodos manuales (cámara de Neubauer, lámina periférica) y automatizados;
estos últimos son los más utilizados actualmente luego de la introducción de los complejos hematológicos.

Método de Breacher (manual)

Principio: se basa en el recuento de plaquetas en sangre capilar obtenida por punción directa a través de la piel. La sangre
se mezcla con un diluente que causa hemólisis de los glóbulos rojos y las plaquetas se cuentan directamente en un
microscopio de contraste de fase. 8,12,13

Valores de referencia:

- Normal: 150 - 400 x 109 / L.

- Trombocitopenia: menos de 150 x 109/L.
- Trombocitosis: por encima de 400 x109/L.

TIEMPO DE COAGULACIÓN (método de Lee White)

Antiguamente se empleaba como método de pesquisa de alteraciones del mecanismo intrínseco de la coagulación y para
monitorear la terapia con heparina. Hoy se conoce que este método tiene poca reproducibilidad y es sensible solo a
deficiencias graves de factores de la coagulación; por lo tanto, su uso en el laboratorio está limitado. Puede estar
prolongado en las hemofilias graves, en la afibrinogenemia y en estados fibrinolíticos severos.

Principio: el tiempo de coagulación de la sangre total es el requerido para que una cantidad de sangre
determinada coagule en condiciones específicas en un período de tiempo entre 5 y 10 minutos.

Valores de referencia:

- Normal: 5 - 10 min.
- Prolongado: por encima de 10 min.

7.15 TIEMPO DE RECALCIFICACIÓN DEL PLASMA

Objetivo
Calcular el tiempo de coagulación de un plasma pobre en plaquetas (PPP) mediante la técnica del tiempo de
recalcificación del plasma.

Fundamento
El tiempo de recalcificación del plasma es una prueba de exploración de la coagulación de tipo global. Con este método se
puede medir el tiempo que tarda en coagular un plasma pobre en plaquetas (PPP) citratado y descalcificado al que se
vuelve a recalcificar. Los valores de referencia de esta técnica son 1-4 minutos.
Tiempo de recalcificación del plasma
Se llama tiempo de Howell cuando la prueba se realiza con plasma rico en plaquetas (PRP). Los valores normales de esta
técnica están entre un minuto y medio y dos minutos y medio.

El PRP se obtiene mediante centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos de sangre fresca obtenida y recogida sobre
citrato trisódico al 3,8% en una proporción 1:9 (1/10). Posteriormente, el plasma sobrenadante se transfiere a un tubo seco
y limpio.
El PPP se obtiene de la misma forma que el PRP, pero difiere en que la sangre se centrifuga a 3000 rpm formando una
capa leucoplaquetaria entre el plasma y el paquete hemático.
Es importante realizar la prueba con un plasma control que nos indique el buen funcionamiento del baño termostatado y
del cloruro cálcico, que se debe atemperar.

Material
 Tubos de centrífuga
 Tubo de hemólisis
 Pipeta de 200 microlitros
 Punta de micropipeta
 Centrífuga
 Baño termostatado
 Balanza analítica
 Vidrio de reloj
 Mortero de vidrio
 Matraz aforazo
Reactivo
 Cloruro Cálcico (CaCl2) 0,025 M
 Plasma control
 Sangre total anticoagulada con citrato al 3,8% en proporción 1:9
 Agua destilada

Técnica
1. Centrifugar la sangre citratada durante 10 minutos a 1500 rpm (PRP para tiempo de Howell) o a 3000 rpm (PPP
para tiempo de recalcificación del plasma).
2. Separamos el plasma con una pipeta pasteur y lo guardamos en tubos eppendorf.
3. Depositamos 0,2 ml de plasma en dos tubos de hemólisis.
4. Incubamos a 37ºC durante 3 minutos.
5. Añadimos 0,2 ml de CaCl2 previamente atemperado.
 6. Cada 30 segundos inclinamos el tubo 1 hasta que se produzca la coagulación y, a continuación, seguiremos con
el tubo 2 hasta que finalice. Ese será el tiempo de recalcificación del plasma (PPP) o tiempo de Howell (PRP).
Resultado
El resultado obtenido ha sido de 3 minutos y 30 segundos.
Interpretación de los resultados
Los valores de referencia para PPP (tiempo de recalcificación del plasma) son de 1 a 4 minutos. Por tanto, el valor
obtenido se encuentra dentro de los valores normales. Los valores inferiores a los normales no tienen significado clínico.
Los superiores a los de referencia resultan útiles para detectar anomalias en los factores de la coagulación, excepto el
factor VII, y para controlar el tratamiento con anticoagulantes, especialmente heparina.

7.16 TIEMPO DE PROTROMBINA (MÉTODO DE QUICK)

Es un método global que explora la coagulación extrínseca. Es más sensible a los defectos de los factores VII, X y V que a
la deficiencia de protrombina. No detecta disminuciones moderadas de fibrinógeno, pero si este último es muy bajo o
existe un potente inhibidor de la reacción trombina-fibrinógeno, se obtiene un TP prolongado. Es la prueba de elección
para el control de la terapia con anticoagulantes orales (Fig. 3).

Principio: el TP consiste en determinar el tiempo de coagulación de un plasma en presencia de tromboplastina tisular y de

calcio.19,20

Valores de referencia:

- Normal: hasta 3 s por encima o por debajo del control.

- Prolongado: más de 3 s por encima del control.
- Acortado: más de 3 s por debajo del control.

7.17 TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (TTPA) O TIEMPO DE CEFALINA

(método de Rappaport)

Objetivo
 Determinar el Tiempo de Tromboplastina Parcial activada (TTPa) de una muestra problema.
 Explorar la vía intrínseca de la hemostasia de un paciente.
Fundamento
El Tiempo de Tromboplastina Parcial activada (TTPa), también denominado Tiempo de Cefalina, es el tiempo que tarda
en coagular un plasma citratado descalcificado al añadirle calcio en presencia de un sustituto del fosfolípido procoagulante
y caolín. El caolín es una sustancia activadora de los factores de contacto y se utiliza plasma fresco pobre en plaquetas
(PPP).
Tiempo de Tromboplastina Parcial activada (TTPa)
El TTPa valora la vía intrínseca de la coagulación. Es una prueba sensible a la concentración de todos los factores de la
coagulación, salvo el VII y el XIII, por lo que se suele realizar cuando se sospecha la alteración de alguno de ellos.
También se realiza cuando se desea descartar la presencia de algún anticoagulante circulante o de un inhibidor del
fosfolípido procoagulante. Además, se emplea en el seguimiento evolutivo de personas tratadas con heparina.

El TPTA es una prueba global que explora los factores o componentes plasmáticos relacionados con las vías intrínseca y
común de la coagulación (factores XII, XI, IX, VIII, X, V, II y I), por lo que está particularmente indicado para el
diagnóstico de las anomalías de estas vías y la vigilancia de la terapia con heparina (Fig. 3).
Principio: consiste en determinar el tiempo de coagulación de un plasma a 37 °C en presencia de un sustituto plaquetario
(cefalina) y de un activador (celite, caolín, ácido elágico).16-18

La presencia de deficiencias en el sistema de contacto puede ser indicada por un TPTA anormal cuando se emplea un
tiempo de incubación menor de 5 min (3 min), que se normaliza cuando se prolonga la incubación con el activador
durante 10 min.

Valores de referencia:

- Normal: hasta 6 s por encima o por debajo del control.

- Dudoso: 6 - 10 s por encima del control.
- Prolongado: más de 10 s por encima del control.
- Acortado: más de 6 s por debajo del control.

7.18 TIEMPO DE TROMBINA

Objetivos
 Determinar el Tiempo de Trombina de una muestra problema.
 Exploración de la fase final de la coagulación.
Fundamento
El Tiempo de Trombina (TT) es el tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado al que se añade trombina
cálcica. Esta prueba se emplea para investigar alteraciones que afectan a la conversión del fibrinógeno en fibrina. Está
alterada cuando el plasma tiene un nivel bajo de fibrinógeno (hipofibrinogenemia) o bien una ausencia del mismo
(afibrinogenemia). Igualmente el Tiempo de Trombina estará alargado cuando hay presencia de inhibidores de la reacción
fibrinógeno-fibrina tales como la heparina, los productos de degradación de la fibrina (Dimeros-D), etc.
Tiempo de Trombina
La prueba es útil para analizar si quedan restos de heparina en muestras procedente de personas que han sido o están
siendo tratadas con este anticoagulante. En este caso los pacientes presentan un tiempo alargado, pero si se sustituye el
reactivo trombina por un reactivo de batroxobina, o reptilase, la prueba da un valor normal.

Material
 Micropipetas automáticas de 200 microlitros
 Cubeta de coagulómetro
 Limaduras de hierro
 Puntas de micropipeta
 Guatix
 Coagulómetro
 Papel de filtro
Reactivos
 Trombina cálcica 5 NIH/ml
 Muestra de plasma pobre en plaquetas citratado
Técnica
1. Pipetear en una cubeta de coagulómetro 200 microlitros de la muestra.
2. Añadir a continuación una limadura de hierro.
3. Incubar a 37ºC durante 3 minutos.
4. Añadir 200 microlitros de trombina cálcica.
5. Anotar el tiempo del coagulómetro.
Resultado
El Tiempo de Trombina obtenido fue de 21 segundos.
Interpretación
Los valores de referencia para esta técnica son de 15-20 segundos. El tiempo obtenido se encuentra alargado, algo que
ocurre en situaciones de disfibrinogenemia e hipofibrinogenemia, en personas tratadas con heparina o cuando existe algún
inhibidor de la fibrinoformación.

7.19 FIBRINÓGENO E INVESTIGACIÓN DE LOS FACTORES DE COAGULACIÓN

Fibrinógeno

Sustancia albuminoidea soluble, existente en la sangre y otros fluidos animales, que, por la acción de un fermento, se
descomponen y dan origen a la fibrina.Es una proteína producida por el hígado que ayuda a detener el sangrado al
favorecer la formación de coágulos de sangre. Un examen de sangre se puede llevar a cabo para determinar qué tanto
fibrinógeno tiene una persona en la sangre.

Resultados normales

El rango normal es de 200 a 400 mg/dL (de 2.0 a 4.0 g/L).

Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Algunos laboratorios usan
diferentes medidas o podrían evaluar diferentes muestras. Hable con su médico acerca del significado de los resultados
específicos de su examen.

Factores de coagulación

Los factores de la coagulación son proteínas de la sangre que ayudan a controlar el sangrado. En la sangre hay varios
factores de la coagulación. Cuando una persona se corta o sufre una herida que causa sangrado, los factores de la
coagulación funcionan en forma coordinada para formar un coágulo de sangre. El coágulo evita la pérdida de una cantidad
excesiva de sangre. Este proceso se conoce como cascada de la coagulación.

Las pruebas de los factores de la coagulación son análisis de sangre que comprueban cómo funcionan uno o más factores.
Los factores de la coagulación se denominan mediante números romanos (I, II, VIII, etc.) o por nombre (fibrinógeno,
protrombina, hemofilia A, etc.). Si cualquiera de los factores falta o es defectuoso, se puede producir un sangrado
abundante y descontrolado después de una herida.

7.20 DETERMINACION DEL FIBRINOGENO

Determinación del fibrinógeno por Inmunodifusión Radial (IDR)

Objetivo
Determinar la concentración de fibrinógeno por Inmunodifusión Radial (IDR).
Fundamento
La Inmunodifusión Radial (IDR) es una técnica de inmunoprecipitación que consiste en hacer reaccionar un antígeno con
su anticuerpo correspondiente en un medio semisólido. Como medio se puede utilizar gel de agarosa, teniendo en cuenta
que su espesor debe ser uniforme y coloreado para visualizar mejor los anillos formados.

La reacción de inmunoprecipitación es un fenómeno progresivo, al principio las precipitaciones se van produciendo cerca
del pocillo y el anillo se va alejando hasta que todo el antígeno ha difundido y se encuentra en las concentraciones
equivalentes con el anticuerpo. Cuanto mayor es la concentración del antígeno de la muestra mayor es la difusión, así
como el área que formará el anillo.
Determinación del fibrinógeno por Inmunodifusión Radial (IDR)
Existen muchos factores que influyen en el diámetro del anillo como el volumen de la muestra, la concentración de
anticuerpo en el medio, el pH del mismo o el tiempo de incubación. Por tanto deben mantenerse estos parámetros fijos de
forma que el anillo solo dependa de la concentración de antígeno de la muestra.
Se puede conocer la concentración del antígeno en el plasma del paciente de dos formas distintas:

 Determinación rápida: Se realiza leyendo la concentración del fibrinógeno directamente de una tabla con valores
precalculados. En esta tabla, presente en cada kit comercial, se compara el diámetro del anillo del pocillo y se
lee directamente la concentración del fibrinógeno.
 Determinación de alta precisión: Se realiza en una recta de calibración que se efectúa haciendo diluciones de un
plasma calibrador con una concentración de fibrinógeno conocida. Lo procesamos según la técnica y se miden
los diámetros al cuadrado de los anillos de precipitación. Con estas lecturas se construye la recta de calibración.
En el eje de ordenadas se sitúa el diámetro elevado al cuadrado y en el eje de abscisas la concentración de
fibrinógeno de las diluciones. En esta recta se interpola el valor del diámetro al cuadrado del pocillo del paciente
y se obtiene la concentración de fibrinógeno.
Material
  Placa con gel de agarosa con anticuerpo anti-fibrinógeno repartido de forma homogénea
 Regla específica para la lectura de la placa
 Micropipeta automática de 5 microlitros
 Puntas de micropipeta
 Guatix
 Papel milimetrado
 Lapicero y/o bolígrafo
 Papel de filtro
Reactivos
 Plasma calibrador
 Muestra de plasma fresco pobre en plaquetas
Técnica
1. Extraer la placa del sobre.
2. Dejar destapado cinco minutos a temperatura ambiente para permitir la evaporación de las gotas de
condensación.
3. Aplicar cinco microlitros de los diferentes calibradores diluídos y de los diferentes plasmas problema en los
pocillos de la placa.
4. Esperar 20 minutos con la placa ya cerrada antes de volcarla para su incubación.
5. Transcurrido el tiempo se vuelca la placa, se guarda y se precinta en el sobre. Se deja a temperatura ambiente,
en horizontal, durante 48 horas.
6. Finalmente medir, con la regla especial, el diámetro de los halos (en milímetros).
7. El límite de sensibilidad del método es de 50,5 mg/dl (sensibilidad mínima) y 906 mg/dl (sensibilidad máxima).
Si la concentración del paciente superase el límite superior, diluir la muestra a 1/2 con agua destilada y luego
multiplicar por la inversa de la dilución el resultado final.
Resultado
La determinación rápida del fibrinógeno, mediante tabla, dio un resultado de 473 mg/dl para un diámetro al cuadrado de
50,04 mm2. Extrapolando ese valor en la recta de calibración el resultado es de 316,6 mg/dl.
Interpretación de los resultados
Los valores de referencia son 200-400 mg/dl para adultos y 150-300 mg/dl para niños. Utilizando una lectura de precisión
mediante recta de calibración comprobamos que los valores de concentración de fibrinógeno de la muestra están dentro de
los valores normales.
Observaciones
La incubación fue de 72 horas en lugar de 48 debido a que había un fin de semana de por medio. Es posible que ésta fuese
la causa de unos resultados dispares entre grupos y entre compañeros, además de la técnica en sí, ya que con la misma
muestra y el mismo tiempo de incubación, los resultados variaban en torno a 100 mg/dl de diferencia, una cantidad
demasiado grande.

Determinación del fibrinógeno por el método de Clauss

Objetivo
Realizar la determinación de la concentración de fibrinógeno funcional de una muestra problema mediante el método de
Clauss.
Fundamento
El fibrinógeno, en presencia de un exceso de trombina, se transforma en fibrina. El tiempo de formación del coágulo es
inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno presente en la muestra de plasma.
La cuantificación del fibrinógeno se puede realizar por métodos cronométricos, que exploran la funcionalidad del
fibrinógeno, y por métodos antigénicos, que solo exploran su concentración.
Determinación del fibrinógeno por el método de Clauss
Los métodos cronométricos miden el tiempo que tarda en degradar un exceso de trombina al fibrinógeno presente en un
plasma pobre en plaquetas. Se utiliza una trombina de una actividad de 100 U NIH/ml. Esta trombina no se ve inhibida
por la presencia de heparina.

Cuando un plasma diluído se pone en presencia de un exceso de trombina, el logaritmo del tiempo de coagulación está en
relación lineal con el logaritmo de la concentración de fibrinógeno de la muestra. Por tanto, si representamos los valores
en un papel milimetrado, la representación será una curva. En cambio, si se representa en papel logarítmico la
representación será una recta.
Material
 Micropipetas automáticas de 50 y 1000 microlitros
  Coagulómetro
 Limaduras de hierro
 Cubeta de coagulómetro
 Puntas de micropipeta
 Guatix
 Papel de filtro
Reactivos
 Trombina Bovina (Reactivo R1 que se reconstituye con 2 ml de agua destilada)
 Tampón Imidazol (Reactivo R2)
 Solución Caolín (Reactivo R3)
 Plasma calibrador de concentración conocida
 Plasma pobre en plaquetas, no ictérico, lipémico ni hemolizado
Técnica
1. Si el paciente tiene una fibrinogenemia baja conocida diluir la muestra 1/5, mientras que si el paciente tiene una
fibrinogenemia alta diluir a 1/20 (50 microlitros de muestra + 950 microlitros del tampón).
2. Realizar la recta y la curva de calibración con los siguientes datos:

1. El plasma calibrador tiene una concentración conocida de 228 mg/dl. En cada dilución se realizan dos
determinaciones y se representa la media de cada una.
2. A 0,2 ml de cada dilución añadir 20 microlitros de R3 y atemperar a 37ºC durante 4-6 minutos.
3. Añadir 0,1 ml de reactivo R1 y cronometrar la formación de coágulos. No atemperar la trombina bovina (R1).
4. Extrapolar la media de las dos determinaciones de la muestra en la curva de calibración.
Resultados e interpretación
La media de los dos tiempos fue de 17,12 segundos. Ese tiempo extrapolado en la recta de calibración de papel
milimetrado arrojaba un valor de 299 mg/dl de fibrinógeno. En cambio, extrapolado en la curva de calibración de papel
logarítmico daba un valor de 290 mg/dl. En cualquiera de los casos el resultado se encuentran dentro de los valores de
referencia (200-400 mg/dl).
La formación de fibrinógeno y su concentración pueden estar disminuídos en trastornos congénitos como las
afibrinogenemias e hipofibrinogenemias, o en trastornos adquiridos como las hepatopatías. En cambio, puede estar
aumentada de forme inespecífica en inflamaciones, en estrés o en el tercer trimestre del embarazo.

7.21 CORRECCIÓN DE FACTORES

El hematocrito es un parámetro de la biometría hemática que determina la concentración de células rojas en relación al
volumen de sangre. La medición se puede realizar mediante método manual o método automatizado que es el más
utilizado en el laboratorio y este puede presentar diferencias en pacientes con alteraciones hematológicas; por esta razón
en este estudio se buscó determinar un factor de corrección para el hematocrito automatizado obtenido mediante
impedancia eléctrica en pacientes con anemia ferropénica y poliglobulia. Materiales y Métodos: El presente estudio fue de
tipo descriptivo transversal. La muestra estuvo conformada por 231 pacientes, los cuales se distribuyeron en tres grupos:
anemia ferropénica, poliglobulia y control. La cuantificación se realizó en el analizador hematológico Sysmex XE-2100 y
en la microcentrífuga Fanem 211. Los resultados obtenidos fueron analizados mediante estadística descriptiva
paramétrica, coeficiente de correlación de Pearson (r), coeficiente de correlación intraclase (CCI), prueba “Z” y la gráfica
de Bland-Altman. Además se realizó el ensayo de repetibilidad para ambos métodos. Resultados: Las medias obtenidas
para el método manual y automatizado fueron: en el grupo de anemia ferropénica 30,72%±4,85 y 31,92%±4,92; en el
grupo poliglobulia, 59,98%±4,72 y de 58,92%±4,16; y en el grupo control 46,31%±3,09 y de 46,34±3,16
respectivamente. El coeficiente de correlación de Pearson (r) fue de 0,962; 0,592 y 0,906, y el CCI 0,934; 0,577 y 0,906
para los grupos anemia ferropénica, poliglobulia y control respectivamente. La prueba Z (p=0,05) demostró que existen
diferencias significativas entre ambas mediciones en los grupos patológicos, por lo que se obtuvo un factor de corrección
mediante el gráfico de Bland-Altman de ±1,2%. Los coeficientes de variación (CV) para el método manual fueron de
2,9%; 1,6% y 2,7% para los grupos anemia ferropénica, poliglobulia y control; mientras que para el método automatizado
fueron de 1,5%; 1,2% y 1,2% para los mismos grupos. Conclusiones y Recomendaciones: La diferencia entre medias para
ambos métodos fue de +1,2% en el grupo anemia ferropénica y -1,1% en el grupo poliglobulia. El coeficiente de
correlación de Pearson y el coeficiente de correlación intraclase demostraron que existe una buena correlación entre
ambas metodologías; sin embargo, el gráfico de Bland-Altman señaló que no existe concordancia entre las mismas. El
factor de corrección fue de ±1,2%; el cual debe ser restado en grupo anemia ferropénica y sumado en el grupo
poliglobulia. El ensayo de repetibilidad evidenció que el analizador hematológico tiene mejor precisión que la
microcentrífuga para la medición del hematocrito.

7.22 RECUENTO DE PLAQUETAS.

La cuantificación de la cifra de plaquetas en sangre periférica es esencial como herramienta diagnóstica en distintas
situaciones patológicas. La utilidad de la medida de otros parámetros plaquetares, que en la actualidad son determinados
por la mayoría de los contadores automáticos, como el volumen plaquetar medio (VPM), índice de distribución de
plaquetas (PDW) y plaquetocrito (PLTº), es algo mas controvertida1.Se cree que el VPM está influenciado por
determinados anticoagulantes2, por el tiempo pasado desde la extracción de la muestra hasta su determinación1-3, y por la
presencia en sangre periférica de artefactos como fragmentos de eritrocitos y blastos leucémicos, que influyen en la
distribución del volumen plaquetar y la aparente relación de éste con el contaje plaquetar4.

La mayoría de los laboratorios, así como los libros de consulta, consideran como cifra normal de plaquetas para la
población adulta la comprendida entre 150 - 450 x 109/l5, aunque se han descrito en nuestro país cifras inferiores en
sujetos sanos7, por lo que dichos límites podrían no ser los más adecuados para nuestra población.

Un conteo bajo de plaquetas está por debajo de 150,000 (150 × 109/L). Si su conteo de plaquetas es inferior a 50.000 (50
× 109/L), su riesgo de sangrado es mayor. Incluso las actividades cotidianas pueden causar hemorragia.

Un conteo alto de plaquetas es de 400,000 (400 × 109/L) o superior.

Una cantidad de plaquetas más alta de lo normal se llama trombocitosis. Esto quiere decir que su cuerpo está produciendo
demasiadas plaquetas. Las causas pueden incluir:

Un tipo de anemia en la cual se destruyen glóbulos rojos en la sangre antes de lo normal (anemia hemolítica)

Deficiencia de hierro

Después de ciertas infecciones, cirugía mayor o traumatismo

Cáncer

7.23 GRUPOS SANGUÍNEOS

Un grupo sanguíneo es una forma de agrupar ciertas características de la sangre en base a la presencia o ausencia de
determinadas moléculas, llamadas antígenos, en la superficie de los glóbulos rojos. Existen muchos grupos sanguíneos,
pero entre todos ellos destacan por su importancia a la hora de la transfusión los grupos pertenecientes al sistema ABO y
Rh.

El sistema ABO

En este caso la sustancia que determina el grupo sanguíneo son los azúcares, y según su composición encontramos cuatro
grupos: A, B, AB y O. En cada uno de estos grupos los hematíes tienen un antígeno que los diferencia, el grupo A tiene el
antígeno A, el grupo B tiene el antígeno B, el grupo AB tiene los dos antígenos y el grupo O no tiene antígeno A, ni B.

El sistema Rh

En 1940 se descubrió otro grupo de antígenos (D) que se denominaron factores Rhesus (factores Rh) porque fueron
descubiertos durante unos experimentos con simios del tipo Macaccus Rhesus.
UNIVERSIDAD POPULAR DE LA
CHONTALPA

Manual de Laboratorio
Hematología

Por: Lucely Casango De la Cruz