Utilización de Hoja de Cálculo electrónica para determinación de los

parámetros cinéticos de una enzima

Profesora Luz B. Pardo Rojas

Contenido
Utilización de Hoja de Cálculo electrónica para determinación de los parámetros cinéticos de una
enzima ................................................................................................................................................. 1
Objetivo ........................................................................................................................................... 1
Fundamento .................................................................................................................................... 1
Visión general .................................................................................................................................. 2
Obtención de parámetros cinéticos por el método de Henri ......................................................... 5
Obtención de parámetros cinéticos por el método de doble recíproco (Lineweaver – Burk) ....... 6
Determinación del tipo de inhibición ............................................................................................ 14
Determinación de las Constantes de inhibición ............................................................................ 16

Objetivo
El objetivo de esta actividad es aprende a utilizar Excel ® u OpenOffice Calc ®para determinar la
rapidez máxima y la constante de Michaelis, el efecto de inhibición del compuesto I y evaluar las
constantes de inhibición

Antes de iniciar esta actividad descargue el archivo EjercicioCinetica_para_ova, o

EjercicioCinetica_para_ovaOOcalc según la aplicación que vaya a utilizar, para ir aplicando las
instrucciones simultáneamente.

Fundamento
La cinética enzimática de estado estable y rapidez inicial se rige por la ecuación de Michaelis
:

El primer paso es la introducción de los datos, en este ejemplo, en las celdas A1: G12, o las que
usted quiera utilizar para realizar su trabajo, como se indica en a continuación

Visión general
Para ver gráficamente el comportamiento general de la enzima ante la presencia del inhibidor a
varias concentraciones, seleccione las celdas A2 ; G 12,

En la pestaña [Insertar] seleccione la opción para gráficos de dispersión, grafico de línea suavizada
sin puntos, como se nuestra a continuación:

En Excel

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En OpenOffice Calc

Aparecerá el asistente de gráfico

3
Modifique las opciones como se muestra a continuación

En Excel debe obtener una gráfica similar a la siguiente:

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Y en OpenOffice calc, la siguiente

Obtención de parámetros cinéticos por el método de Henri

Para calcular los valores de rapidez máxima Vm y constante de Michaelis Ka, se utiliza la serie de
datos sin inhibidor, por tanto debe seleccionar únicamente el rango A2 : B12, y proceder en la
forma anteriormente descrita.

En el gráfico obtenido se estima la rapidez máxima (asíntota horizontal a la curva), en este caso
aproximadamente 340. La constante de Michaelis es la concentración de sustrato que produce
una rapidez inicial igual a la mitad de la rapidez máxima. Se localiza en el eje vertical el valor de la
mitad de Vm, se lleva a la curva y el punto de corte se proyecta sobre el eje horizontal. El punto de
proyección es el valor de Ka. Las líneas rojas no las produce Excel sino que deben elaborarse
manualmente.

En Excel

5
En OpenOffice calc

Obtención de parámetros cinéticos por el método de doble recíproco

(Lineweaver – Burk)
El método de Henri es impreciso debido a la dificultad de estimar correctamente Vm, por ello se
prefiere utilizar alguna de las linearización de la ecuación de Michaelis, en este caso la de doble
recíproco (Lineweaver – Burk). La ecuación de doble recíproco obtenida a partir de la ecuación de
Michaelis es:

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Para poder aplicar el método de L-B, es necesario calcular los recíprocos de la concentración de
sustrato y de rapidez inicial.

En la celda H4 escriba =1/A4. Al presionar la tecla [Énter] aparecerá el valor calculado

Coloque el puntero sobre el pequeño cuadro negro de la esquina inferior derecha de la celda y
copie por arrastre hasta la celda H12.y luego extienda la selección hasta la celda I12.

En la celda H3 escriba 1/[A] y en la I3, 1/Vo. Utilice el rango H3 I12 para construir la gráfica como
se indicó anteriormente.

En Excel

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En OpenOffice calc

En este sistema de linearización la rapidez máxima es el inverso de del punto de intersección de

la recta con el eje vertical y la constate de Michaelis es pendiente / intersección vertical.

La pendiente y la intersección se pueden obtener en dos formas.

A partir de la recta de tendencia, para lo cual se selecciona la recta y con el botón derecho del
ratón se obtiene el menú del cual se puede elegir la opción [Agregar línea de tendencia]

En Excel

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En OpenOffice calc aparece el menú

Al seleccionar mostrar línea de tendencia aparece un cuadro de diálogo en el cual debe marcar las
opciones que se muestran en la figura.

En Excel

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Para terminar presione el botón [Cerrar].

En OpenOffice calc:

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Pulse aceptar

En la gráfica aparece la ecuación de la línea de tendencia.

En OpenOffice calc

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Debe recordarse que en este sistema la pendiente es: Ka / Vm (0,1145) y la intersección vertical es
1/Vm (0,003), por tanto la constante de Michaelis será: pendiente/ intersección = 0.1145/0,003 =
38,17 y la rapidez máxima será 1/intersección =1/0,003 = 333,33.

Los datos en Open office calc son diferentes pero se procede en la misma forma.

Otra forma de obtener los parámetros de la recta es mediante las funciones de Excel. Seleccione la
celda donde desea que aparezca la intersección o la pendiente El asistente de funciones aparece al
pulsar fx en la barra de escritura. Seleccione funciones estadísticas y dentro de ellas
[intersección.eje] y después pulse el botón [Aceptar] de calculada la intersección seleccione la
función [pendiente]

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Al pulsar [Aceptar] aparece un cuadro para colocar los argumentos de la función.

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Conocido Y es el rango correspondiente a los valores del inverso de rapidez inicial y conocido X es
el rango correspondiente al inverso de concentración de sustrato

Una vez introducidos los rangos, la barra de escritura mostrara:

Al pulsar [Aceptar] aparecerá el valor de la intersección:

Para calcular la pendiente se selecciona la función PENDIENTE dentro de las funciones estadísticas
y se procede en forma similar a la descrita para la intersección

Determinación del tipo de inhibición

Para determinar el tipo de inhibición y las respectivas constantes es necesario obtener los inversos
de las rapideces a las distintas concentraciones de inhibidor y las respetivas pendientes e
intersecciones. Las formulas se pueden copiar por arrastre a las cinco columnas siguientes. Si se
copian por arrastre las celdas donde están los valores de pendiente e intersección se cometerá un
error puesto que el rango conocido X debe ser el mismo para todas las pendientes e
intersecciones.

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 Referencia relativa

Este inconveniente se resuelve si en las fórmulas de pendiente e intersección se emplean

referencias absolutas. Las referencias absolutas se indican con el signo $ antes de la letra y el
número que identifican la celda. Excel automáticamente coloca estos signos al pulsar la tecla [F4].
En OpenOffice calc debe pulsar [Mayúsculas] fF4}

Referencia absoluta

Seleccione el rango I3 : I14. Cópielo por arrastre a las cinco columnas siguientes. Corrija el
encabezado de las columnas con la correspondiente concentración de inhibidor. Seleccione todo
el rango que contiene los recíprocos.

Construya la gráfica como se indicó anteriormente

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Determinación de las Constantes de inhibición
Para calcular las constantes de inhibición se utilizan gráficos de pendiente o intersección en
función de la concentración de inhibidor (“repleta “). El primer paso es elaborar una tabla con las
dos variables.

Seleccione el rango donde se encuentran las concentraciones inhibidor:

Copie el rango.

En Excel, seleccione la celda donde desea que aparezca el primer valor del rango. En [Pegar] dela
pestaña [Inicio] seleccione [Pegado especial] esto hace desplegar un cuadro donde debe
seleccionar las condiciones. Marque las que se muestran en la figura y pulse [Aceptar]

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La opción transponer convierte las filas en columnas

En OpenOffice calc, selección pegado especial en el menú editar

De desplegará un cuadro en el cual debe marcar las casillas que se muestra a continuación:

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Pulse aceptar. Para pegar las intersecciones repita el procedimiento pero en el cuadro de diálogo
desmarque Pegar todo y marque Texto y Números

Al realizar el pegado especial de valores y transponer, para la concentración de inhibidor e

intersección se obtendrá una tabla similar a la que se muestra en la figura.

Inserte una fila enzima d la fila en donde [I] = 0

La constante de inhibición está dada por el valor del punto de corte de la recta con el eje
horizontal, es decir cuando el valor de intersección sea 0. Para obtenerlo: inserte una fila enzima
de la que contiene [I] = 0

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En la celda vacía de la columna intersección escriba 0 y en la vacía de la columna [I] con el
asistente para fórmulas coloque la función pronóstico:

En Excel, en el cuadro de diálogo que se despliega para la función pronóstico para insertar el valor
de X señale la celda que contiene intersección = 0. Para _Y, el rango de las concentraciones de
inhibidor y para _X, el rango de intersecciones:

En la barra de escrituras aparecerá :

En OpenOffice calc el cuadro de dialogo es el siguiente:

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Proceda como se indicó para Excel

El resultado de la función pronóstico es -Kii.

Gráficamente este valor se puede obtener como se muestra continuación:

En Excel: seleccione el área en que están los valores de [I] e Intersección. Inserte el gráfico de
dispersión correspondiente.

Haga click, con el botón derecho del ratón, sobre alguno de los números del eje horizontal para
desplegar el cuadro de propiedades del eje. Modifique la opción mínima como se muestra en la
figura:

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El punto de corte de la recta resultante con el eje horizontal corresponde a –Kii este valor es igual
al obtenido mediante la función PRONOSTICO.

En OpenOffice calc al insertar el gráfico de dispersión, muestra un gráfico que incluye

directamente la intersección con el eje horizontal.

Para calcular Kis se procede en forma similar, pero utilizando las pendientes en vez de las
intersecciones.

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