Desarrollo Del Método CCD

Desarrollo del método CCD
Al establecer la metodología por CC se utilizó una muestra de referencia no comercial,

consistente en una fracción enriquecida en alcaloides marcadores de especies oxindólicos,
obtenidos por partición ácido-base clásico del extracto etanólico de corteza de tallo de U.
tomentosa previamente secada y molido, recolectado en Cruzeiro do Sul, Acre (datos sobre
identificación y exsiccata en Miranda et al., 2003) y proporcionado por la empresa Biosapiens.
Esta fracción fue sometido a cromatografía líquida de alta resolución (CLAE) con detector
ultravioleta (UV) a 245 nm, con caracterización de alcaloides oxindólicos marcadores
pentacíclicos para sus tiempos de retención en las condiciones descritas en la literatura (Laus;
Keplinger, 1994) y por HPLC acoplado a un detector de fotodiodos espectrometría de masas y
de matriz (CLAE-DAD-EM) con monitorización de iones [M + 1] + en m / z 369 y análisis
Espectros UV (Mazzei, 2004; Lopez-Avila et al., 1997). Para obtener sustancias estándar, la
fracción fue reflujo con metil t-butil éter que conduce a la precipitación, después de enfriar,
mitrafilina (2) que posteriormente se purificado por cristalización en el mismo disolvente. EL
sobrenadante se secó a presión reducida y secuencialmente a cromatografía en columna (CC)
en gel sílice con gradiente de disolvente hexano-acetato etil metanol y HPLC en fase inversa
para aislamiento pteropodina (5) e isopterópodo (6) (Laus; Keplinger, 1994; Mazzei et al.,
2002). Las sustancias puras eran estructuralmente identificado por espectrometría en el región
infrarroja (IV), técnicas de resonancia hidrógeno nuclear y carbono-13 (1H NMR) y 13C)
(300MHz y 75MHz respectivamente, CDCl3, TMS estándar interno) en una y dos dimensiones y
análisis los espectros UV y EM en HPLC-DAD-EM y sus datos comparados con los disponibles en
la literatura (Seki et al., 1993; Lopez-Avila et al., 1997). La determinación de pureza se realizó
integrando los cromatogramas de iones totales en HPLC-EM.
Mitrafilina (1): sólido cristalino blanco; CLAEDAD-
EM: λmax 244 nm, m / z 369 [M + 1] +, tR 3,86 min (pureza> 95%); RMN 1H: 1,11 (3H, d, J 6,6
Hz, H-18), 2,11 (2H, m, H-15 y 20), 2,42 (1H, dd, J 2,6, 10,1 Hz, H-3), 3.60 (3H, s, CH3O), 4.37
(1H, qd, J 3.0, 6.6 Hz, H- 19), 7,43 (1H, s, H-17), 7,91 (1H, s, NH); RMN 13C: 15,1 (C-18), 50,9
(CH3O), 55,7 (C-7), 74,0 (C-19), 74,8 (C-3), 107,1 (C-16), 114,9 (C-12), 122,8 (C-10), 123,2 (C-9),
154,3 (C-17), 167,3 (C-22), 181,2 (C-2); IV (KBr) νmáx 1622, 1705, 1725; 3269, 3412 cm-1.
Pteropody (5): sólido cristalino blanco;
HPLC-DAD-EM: λmax 247 nm, m / z 369 [M + 1] +, tR 4,82 min (99% de pureza); RMN 1H: 1,41
(3H, d, J 6,2 Hz, H-18), 1,58 (1H, m, H-20), 2,44 (1H, ddd, J 4,4, 4,7, 11,5 Hz, H- 15), 3.60 (3H, s,
CH3O), 4.56 (1H, qd, J 6.2, 10.6 Hz, H- 19), 7,49 (1H, s, H-17), 7,93 (1H, ls, NH); IV (KBr) νmáx
1624, 1701, 3257 cm-1.
Isopteropody (6): sólido cristalino blanco;
HPLC-DAD-EM: 247 nm, m / z 369 [M + 1] +, tR 7,49 min (100% de pureza); RMN 1H: 1,41 (3H,
d, J 6,2 Hz, H-18), 1,59 (1H, m, H-20), 2,57 (1H, dd, J 2,8, 11,7 Hz, H-3),3,60 (3H, s, CH3O), 4,35
(1H, qd, J 6,2, 10,8 Hz, H-19), 7,41 (1H, s, H-17), 8,80 (1H, s, NH); RMN 13C: 18,8 (C- 18), 51, 2
(OCH3), 71,4 (C-3), 124,7 (C-9), 127,8, 140,5 (C-13), 167,8 (C-22), 181,6 (C-2); IV (KBr) νmáx
1633, 1679, 1700, 1719, 3247 cm - 1.
Los análisis CCD se desarrollaron en placas de gel de sílice prefabricadas (hoja de
cromatografía Merck, gel de sílice 60 F254, 0,2 mm). Las muestras fueron aplicada
manualmente, utilizando una microjeringa de 25 mmμL (Hamilton ref. 80465).
Se probaron varios parámetros: ancho aplicación de muestra, espacio de elución, tipos de

desarrolladores, sistemas de control y concentración de muestras fase móvil. Como primer
paso del proceso, Se probaron cuatro sistemas de disolventes como fase móvil, entre los
descritos en la literatura (Keplinger et al., 2002; Philipson; Hemingway, 1975) que combinó la
mayor potencial de separación de alcaloides pentacíclicos en problema con facilidad de
manejo: acetato de etilo / hexano (95: 5), cloroformo / acetona (5: 4), cloroformo / metanol
(95: 5), acetato de etilo / isopropanol / hidróxido de amonio (16: 3: 1). Después de elegir el
eluyente, se probó la distancia de desarrollo óptima. Para ello, las placas cromatográficas con
11,5, 15 y 20 cm de largo, con espacio para correr 10, 13,5 y 18,5 cm respectivamente. Para la
prueba de concentración mínima de detección, y en consecuencia la concentración de análisis
ideal, se preparó una solución 5 mg / mL de la muestra de referencia en metanol. De eso
solución, se aplicaron tasas de 6, 10, 16, 20, 26, 30 y 36 μL. Luego, el ancho de las bandas de
aplicación del La muestra se ensayó con 0,5 y 1 cm. La pantalla de la tinción se realizó
mediante exposición a luz ultravioleta a 254 nm y el desarrollo, pulverizando con reactivo de
Dragendorff / nitrito de sodio al 10% (Wagner; Bladt, 1996). Las placas se documentaron
mediante fotografía digital.
Identificación de alcaloides en la placa cromatográfica
Se identificaron los seis alcaloides marcadores placa cromatográfica comparando el Rf del

manchas en la muestra de referencia con los RF estándar aislado y estructuralmente
identificado [mitrafilin (2), pteropody (5) e isopteropody (6)], como se describe previamente, y
a través de la comparación con el orden de elución descrito por Keplinger et al. (2002). Para los
estándares, se aplicó 10 μL de una solución. 1 mg / mL.
Métodos de extracción de alcaloides
Comparar los diferentes métodos de extracción alcaloides, el mismo partido fue tallo de U.
tomentosa, recolectado en Cruzeiro do Sul, Acre, utilizado para obtener la muestra de
referencia y aislamiento de sustancias estándar. Los extractos fueron preparado según una
metodología optimizada por Ganzera et al. (2001), donde 750 mg de material vegetal seco y
molidos se extrajeron con 2,5 mL de metanol con sonicación durante 10 min seguida de
centrifugación durante 5 min min. El proceso se repitió 4 veces y los sobrenadantes juntos. En
el tratamiento con resina básica (Ganzera et al., 2001) los sobrenadantes se transfirieron a
matraz aforado de 10 mL y el volumen completo con metanol. Entonces una alícuota de 3 ml y
se añaden a esta resina de nailon 6 de 300 mg Radilon S natural (Radici Plastics Ltda.)
(Poliamida 6) tamaño de partícula 53-125 μm y la mezcla se mantiene bajo agitación
magnética durante 15 min. El sobrenadante fue entonces se secó a presión reducida y se pesó.
En la partición ácido-base, los sobrenadantes resultantes de la extracción después recogidos se
secaron a presión reducida y se pesaron. EL el extracto seco se trató con una solución de ácido
clorhídrico 0,1 N en una proporción de 0,15 ml / mg.
La mezcla se colocó en el baño de ultrasonidos durante 5 min y luego se extrae con acetato de
etilo, siendo el volumen de acetato de etilo usado igual al ácido clorhídrico (3 veces). La
fracciónel agua se alcalinizó con hidróxido de amonio a Ph9-10 y se extrae con el mismo
volumen de acetato de etilo. (4 veces), generando una fracción orgánica enriquecida en
alcaloides. La fracción se secó con sulfato de sodio anhidro, se filtró, se evaporó a presión
reducida y se pesó. A las muestras se aplicaron a las placas por duplicado. Aplicación de la
metodología desarrollada El método desarrollado se aplicó en análisis de muestras de tallo y
hojas en U. guianensis, recolectada en Juruema, Mato Grosso y donada por O.N.G. Pro-Natura
(la planta fue identificada por el el botánico Pierro Delprete del Jardín Botánico de Nueva York
y se deposita una exsiccata en el Herbario Central Universidad Federal de Mato Grosso, con la
24,715), y en muestras de hojas y corteza U. tomentosa, recolectada en Acre y donada por
Embrapa- Acre (datos de identificación y exsiccata en Miranda et al., 2003). El método también
se aplicó en el análisis de cuatro toterapics basados en U. tomentosa de diferentes
proveedores, comprados aleatoriamente a minoristas local. La descripción de los fitoterápicos
analizados y su respectivos procedimientos de extracción se pueden encontrar en el Tabla 1.
Las muestras se aplicaron a las placas en duplicar.

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