Propagacion in Vitro de Lilium
Propagacion in Vitro de Lilium
Propagacion in Vitro de Lilium
RESUMEN
Los Lilium son plantas que poseen flores de buena calidad y durabilidad, muy
apreciadas por el consumidor y de alta demanda en el mundo, todo lo cual constituye
un atrayente especial. Motivado por lo anterior, se realizó la presente investigación con
el objetivo de establecer una metodología de regeneración de plantas a partir del
establecimiento de ápices meristemáticos in vitro y la obtención de bulbos para su
multiplicación. Se estudiaron diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio para la
desinfección de los explantes (0,5 %; 1 % y 2,0 % (v/v)) durante 15 minutos. El
establecimiento in vitro se realizó a partir de ápices meristemáticos incubados en el
medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) (sales y vitaminas), sacarosa (30 g.l -1)
complementado con diferentes concentraciones de 6-BAP (0,1; 0,2; 0,3 y 1,0 mg.L-1).
Para el enraizamiento se utilizó el medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) al 100 %
y 50 % de sus sales, además de la adición de ANA (0,5 mg.L-1) como una variante del
medio que contenía el 50 % del medio de cultivo MS (1962). Los resultados alcanzados
en la investigación posibilitaron el establecimiento in vitro del cultivar, seguido de la
obtención de bulbos, los cuales fueron multiplicados en el medio de cultivo que contenía
1,0 mgL-1 de BAP donde se obtuvieron los mejores resultados. El medio de cultivo
constituido por el 50 % de las sales de MS (1962) y suplementado con ANA propició el
mayor número de raíces. La metodología desarrollada posibilitó un 98 % de
sobrevivencia en la fase de aclimatización.
Palabras clave: aclimatización, coeficiente de multiplicación, micropropagación
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a variant of the medium containing 50 % of the culture medium MS (1962). The results
achieved in the research allowed the in vitro establishment of the cultivar, followed by
the obtention of bulbs, which were multiplied in the culture medium containing 1.0 mgL -1
of BAP, where the best results were obtained. The culture medium constituted by 50%
of MS salts (1962) and supplemented with ANA, provided the highest number of roots.
The methodology developed made possible a 98 % of survival at the acclimatization
phase.
Keywords: acclimatization, multiplication coefficient, micropropagation
INTRODUCCIÓN
El género Lilium, perteneciente a la familia Liliaceae, son plantas herbáceas perennes y
presentan bulbos compuestos por brácteas escamosas, incluye aproximadamente 100
especies (Pelkonen et al., 2012). Cerca de 55 especies y 32 variedades de Lilium son
nativas de China (Wu et al., 2014), 21 especies en América del Norte y 10 especies en
Europa y el Cáucaso (Pelkonen et al., 2012).
En el extremo caulinar se desarrollan las flores, solitarias o en inflorescencias
racimosas, que presentan seis tépalos muy vistosos, seis prominentes estambres con
anteras grandes y versátiles y un largo pistilo. Los cultivares longiflorum poseen flores
blancas en forma de trompeta con fragancia distintiva, y se pueden cultivar fácilmente
durante todo el año (Zhou et al., 2008; Hurrell et al., 2010).
Se cultiva a nivel mundial como uno de los cultivos de flores y jardinería de corte y
maceta más importantes, principalmente debido a las flores grandes, fragantes y
multicolores con una larga vida útil (Van Tuyl et al., 2011; Bakhshaie et al., 2016).
Para obtener plantas libres de virus existen varias técnicas de cultivo de tejidos
vegetales o cultivo in vitro. Las más conocidas son el cultivo de meristemas, la
termoterapia y la quimioterapia, entre otras (Rosales et al., 2018).
Aunque los protocolos de micropropagación se han desarrollado para las principales
especies de Lilium, la mayoría no son suficientemente viables en laboratorios
comerciales y una de las principales razones de esto es la formación inadecuada de
bulbos (Askari et al., 2018).
Atendiendo a lo anterior el objetivo de este trabajo fue establecer una metodología para
la propagación in vitro de Easter lilies (Lilium longiflorum L.).
MATERIALES Y MÉTODOS
La investigación se realizó en el Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales
(INIVIT) en el municipio de Santo Domingo, provincia de Villa Clara.
Procedimientos generales
Según el experimento, se emplearon tubos de ensayos (50 x 25 mm) con 10 mL de
medio de cultivo y frascos de cristal (50 mL), con 15 mL de medio de cultivo, los cuales
se colocaron en una cámara de cultivo a una temperatura de 27±2,0 °C e iluminación
artificial mediante tubos fluorescentes, con régimen de 16 horas de luz a una densidad
de flujo de fotones fotosintéticos (FFF) de 62-68 µmol m-2s-1). El pH fue ajustado con
NaOH 0,5 N y HCl 0,5 N, antes de la esterilización en autoclave.
El procesamiento de los datos se realizó con los paquetes estadísticos SPSS ver. 9.0.
En cada experimento se detallan las pruebas realizadas.
Determinación de la concentración de hipoclorito de sodio para la desinfección
del explante
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Los explantes fueron colocados en los frascos de cristal descritos en los procedimientos
generales. Se evaluó el tipo de estructura presente (características del explante) y el
coeficiente de multiplicación.
Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó el procedimiento no paramétrico
Kruskal-Wallis con un nivel de significación de p<0,05.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Determinación de la concentración de hipoclorito de sodio para la desinfección
del explante
Al evaluar la concentración de hipoclorito de sodio para la desinfección del explante se
pudo observar que existió diferencia significativa entre los tratamientos evaluados
(Fig. 2) resultando el mejor tratamiento cuando se utilizó la concentración de 2% de
hipoclorito de sodio donde solo se contaminó el 4% de los explantes establecidos,
seguido por la concentración del 1% de hipoclorito de sodio donde se contaminó el 12%
de los explantes iniciados. Según De Klerk et al. (2014), los contaminantes pueden
originarse de dos fuentes distintas, primeramente, aquellos que vienen en la superficie o
en los tejidos de la planta donadora y en segundo lugar los que aparecen como
resultado de fallas en los procedimientos de laboratorio.
KW= 9,54**
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Leyenda: 1 (Desinfección con hipoclorito de sodio al 0,5 %), 2 (Desinfección con hipoclorito de sodio al
1 %), 3 (Desinfección con hipoclorito de sodio al 2 %)
Figura 2. Concentraciones de hipoclorito de sodio utilizadas para la desinfección del
explante en el establecimiento in vitro de Lilium.
La superficie de los tejidos de las plantas constituye hábitats para los microorganismos,
los cuales pueden alojarse en estomas, lenticelas o cualquier otra abertura natural, lo
cual dificulta en extremo la eliminación de los mismos. Las formas de eliminar o evitar
los microorganismos endógenos son muy limitadas. El primero es un tratamiento de
termo terapia que mata los microorganismos, pero no los tejidos vegetales. Este método
solo puede usarse en tejidos vegetales robustos, como bulbos y brotes no germinados,
y a menudo no tiene éxito entre otros porque las esporas latentes sobreviven e incluso
se activan. La segunda forma es comenzar con tejidos que estén libres de
microorganismos. En particular, los meristemos están libres de microorganismos (De
Klerk et al., 2014).
Xiao et al. (2017) utilizaron para el establecimiento in vitro de Lilium cernuum el
hipoclorito de sodio (2 %) durante 12 minutos. Mientras que De Klerk et al. (2014)
utilizaron el hipoclorito de sodio (1 %) durante 30 minutos y luego realizaron los
enjuagues con hipoclorito de sodio (0,03 %) en lugar de agua.
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KW -57,20
Las estructuras evaluadas se caracterizaron por ser bulbos de color verde intenso
formados por varias escamas, lo cual constituyó el explante seleccionado para su
propagación in vitro, utilizado también por otros autores en este género (Ishioka y
Tanimoto, 1990).
Sahoo et al. (2018) lograron el establecimiento in vitro del cultivar Shirui lily (Lilium
mackliniae Sealy) utilizando 0,5 mg.L-1 de 6-BAP en el medio de cultivo.
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Figura 6. Plantas producidas in vitro de Lilium en fase de aclimatización, listas para ser
transferidas a condiciones de campo.
CONCLUSIONES
1. Se estableció una metodología para la regeneración de plantas por organogénesis
(bulbos) del Lilium.
2. Los coeficientes de multiplicación obtenidos por organogénesis y su posterior
regeneración de plantas posibilitaron incrementar los volúmenes de material de
propagación.
3. Se logró un 98 % de supervivencia en las plantas evaluadas durante la fase de
aclimatización.
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BIBLIOGRAFIA
ASKARI, N. 2016. Aspects of bulblet growth of lily in vitro. PhD thesis, Wageningen
University, Wageningen, NL. 130pp. ISBN: 978-94-6257-760-2. DOI:
10.18174/375959
ASKARI, N.; R. VISSER and G. DE KLERK. 2018. Growth of lily bulblets in vitro, a
review. International Journal of Horticultural Science and Technology. International
Journal of Horticultural Science and Technology, 5(2): 133-143.
ASWATH, C.; D. NHUT and V. BUL. 2001. Lilium. In: Biotechnology of Horticultural
Crops. Vol. 3. In: Parthasarathy, V.A.; T.K. Bose and R. Das (eds). Calcuta, India.
BAKHSHAIE, M.; S. KHOSRAVI; P. AZADI; H. BAGHERI and M.J. VAN TUYL. 2016.
Biotechnological advances in Lilium. Plant Cell Rep, 35(1):799-826.
CHEN C.; Y.U. CHEN-TERRN and S. WE-CHIN. 2000. A tissue culture protocol for
propagation of rare plant, Lilium speciosum Tunb. var. gloriosoides Baker. Bot. Bull.
Acad. Sin., 41:139-142.
DE KLERK, G.; N. VAN DER REST and N. ASKARI. 2014. Standard procedure
contaminates lily. Prophyta annual: 30-33.
DUONG, T.N.; T. NGUYEN; T. NHUYEN; T.H. NGUYEN and D. NANG. 2006. Effects of
lily genotype on regenerative ability via young stem transverse thin cell layer and
bulb scale culture. Journal of Biotechnology, 4(2): 227-232.
GERRITS, M. and G. DE KLERK. 1992. Dray matter partitioning between bulbs and
leaves in plantlets of Lilium speciosum regenerated in vitro. Acta Bot. Neerl,
41(4):461-468.
HURRELL, J.A.; G. DELUCCHI y J.A. TOLABA. 2010. Presencia de Lilium longiflorum
(Liliaceae) adventicia en la Argentina. Bol. Soc. Argent. Bot., 45(1-2): 195-200.
ISHIOKA, N. and S. TANIMOTO. 1990. Studies on bulblet differentiation in bulb-scale
segments of Lilium longiflorum. I. Effects of wounding and traumatic acid. Bul. Fac.
Agr., Saga Univ., 69: 27-33.
MURASHIGE, T. and F. SKOOG. 1962. A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, 15: 473-497.
PELKONEN, V.P. and A.M. PIRTTILÄ. 2012. Taxonomy and phylogeny of the genus
Lilium. In: Van Tuyl J.M. and P. Arens (eds). Floriculture & ornamental
biotechnology. London: Global Science Books; p. 9-23.
ROSALES, M.; M. PAZ; E. FARIAS; A. VIDAL y N. VEGA. 2018. Virus en Lilium: La
importancia de la sanidad del cultivo. Agronomía y forestall, 54: 45-48.
SAHOO, M.; M. PREMI; M. DASGUPTA; N. PRAKASH and S. VANAO. 2018. An
efficient protocol for in vitro regeneration and conservation of Shirui lily (Lilium
mackliniae Sealy): a lab-to-land approach to save the rare endangered Asiatic lily
species. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. Disponible en:
https://doi.org/10.1007/s11627-018-9916-z
SEON, J.H.; Y.S. KIM; S.H. SON and K.Y PAEK. 2000. The fed-batch culture system
using bioreactor for the bulblet production of oriental lilies. Acta Hort., 520:53:59.
STIMART, D.P. and P.D. ASCHER. 1978. Tissue culture of bulb scale sections for
asexual propagation of Lilium longiflorum Thunb. J. Amer. Soc. Hort. Sci.,
103:182-184.
VAN, J.M.; P. ARENS; M.S. AMANNA; A. SHAHIN; N. KHAN; S. XIE; A.
MARASEK-CIO-LAKOWSKA; K.B. LIM and R. BARBA-GONZALEZ. 2011. Lilium. In:
60
Rev. Agricultura Tropical Vol. 5 No. 2:52-61, julio-diciembre, 2019
eISSN: 2517-9292, RNPS: 2397
Kole, Ch. (edt). Wild crop relatives: genomic and breeding resources, plantation and
ornamental crops. Berlin: Springer. p. 161-208.
WU, X.W.; M. TIAN; L.H. WANG; G.F. CUI; R.P. YU; Z.H. LU; W.J. JIA; S.P. QU; M.
GUI and J.H. WANG. 2014. Native species of the genus Lilium in China. Acta Hortic,
10(27):27-40.
XIAO, H.Y.; H. HAO and Q.L. LIU. 2017. Micropropagation and bulblet transplantation of
Lilium cernuum. In: Wang, J.; D. Mu and W.B. Miller (eds). Acta Hortic. 1171. ISHS
p. 17-24. DOI 10.17660/ActaHortic.2017.1171.3
ZHOU, S.; M.S. RAMMANNA; R.G. VISSER and J.M. VAN. 2008. Analysis of the
meiosis in the F1 hybrids of Longiflorum x Asiatic (LA) of lilies (Lilium) using genomic
in situ hybridization. Journal of Genetic and Genomic, 32:687-695.
61