Propagacion in Vitro de Lilium

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Rev. Agricultura Tropical Vol. 5 No.

2:52-61, julio-diciembre, 2019


eISSN: 2517-9292, RNPS: 2397

PROPAGACIÓN IN VITRO DE EASTER LILIES (Lilium longiflorum L.)


Arletys Santos Pino*, Jorge López Torres, Nery Montano Pérez, Milagros Basail
Perez, Aymé Rayas Cabreras, Yenisey Gutierrez Sánchez, Dayana Rodríguez
González, Víctor Medero Vega, Yoel Beovides García, Daniel Rodríguez Pérez
Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales (INIVIT), Apartado 6, Santo Domingo CP: 53000,
Villa Clara, Cuba.
* Autora para la correspondencia: [email protected]

Recibido: 29 de octubre de 2019; Aceptado: 17 de diciembre de 2019

RESUMEN
Los Lilium son plantas que poseen flores de buena calidad y durabilidad, muy
apreciadas por el consumidor y de alta demanda en el mundo, todo lo cual constituye
un atrayente especial. Motivado por lo anterior, se realizó la presente investigación con
el objetivo de establecer una metodología de regeneración de plantas a partir del
establecimiento de ápices meristemáticos in vitro y la obtención de bulbos para su
multiplicación. Se estudiaron diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio para la
desinfección de los explantes (0,5 %; 1 % y 2,0 % (v/v)) durante 15 minutos. El
establecimiento in vitro se realizó a partir de ápices meristemáticos incubados en el
medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) (sales y vitaminas), sacarosa (30 g.l -1)
complementado con diferentes concentraciones de 6-BAP (0,1; 0,2; 0,3 y 1,0 mg.L-1).
Para el enraizamiento se utilizó el medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) al 100 %
y 50 % de sus sales, además de la adición de ANA (0,5 mg.L-1) como una variante del
medio que contenía el 50 % del medio de cultivo MS (1962). Los resultados alcanzados
en la investigación posibilitaron el establecimiento in vitro del cultivar, seguido de la
obtención de bulbos, los cuales fueron multiplicados en el medio de cultivo que contenía
1,0 mgL-1 de BAP donde se obtuvieron los mejores resultados. El medio de cultivo
constituido por el 50 % de las sales de MS (1962) y suplementado con ANA propició el
mayor número de raíces. La metodología desarrollada posibilitó un 98 % de
sobrevivencia en la fase de aclimatización.
Palabras clave: aclimatización, coeficiente de multiplicación, micropropagación

IN VITRO PROPAGATION OF EASTER LILIES (Lilium longiflorum L.)


ABSTRACT
Liliums are plants that have flowers of good quality and durability, greatly appreciated by
the consumer and of high demand worldwide, all of which is a special attraction.
Motivated by the above, this research was carried out with the aim of establishing a
methodology of regeneration of plants, from the establishment of in vitro meristematic
apexes and the obtention of bulbs for their multiplication. Different concentrations of
sodium hypochlorite were studied for the disinfection of explants (0,5 %; 1 % and 2,0 %
(v/v)) during 15 minutes. The in vitro establishment was carried out from meristematic
apices incubated in the culture medium Murashige and Skoog (1962) (salts and
vitamins), sucrose (30 g.l-1) supplemented with different concentrations of 6-BAP (0,1;
0,2; 0,3 and 1,0 mg.L-1). For rooting, the culture medium Murashige and Skoog (1962)
was used at 100 % and 50 % of their salts, besides the addition of ANA (0,5 mg.L-1), as

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a variant of the medium containing 50 % of the culture medium MS (1962). The results
achieved in the research allowed the in vitro establishment of the cultivar, followed by
the obtention of bulbs, which were multiplied in the culture medium containing 1.0 mgL -1
of BAP, where the best results were obtained. The culture medium constituted by 50%
of MS salts (1962) and supplemented with ANA, provided the highest number of roots.
The methodology developed made possible a 98 % of survival at the acclimatization
phase.
Keywords: acclimatization, multiplication coefficient, micropropagation

INTRODUCCIÓN
El género Lilium, perteneciente a la familia Liliaceae, son plantas herbáceas perennes y
presentan bulbos compuestos por brácteas escamosas, incluye aproximadamente 100
especies (Pelkonen et al., 2012). Cerca de 55 especies y 32 variedades de Lilium son
nativas de China (Wu et al., 2014), 21 especies en América del Norte y 10 especies en
Europa y el Cáucaso (Pelkonen et al., 2012).
En el extremo caulinar se desarrollan las flores, solitarias o en inflorescencias
racimosas, que presentan seis tépalos muy vistosos, seis prominentes estambres con
anteras grandes y versátiles y un largo pistilo. Los cultivares longiflorum poseen flores
blancas en forma de trompeta con fragancia distintiva, y se pueden cultivar fácilmente
durante todo el año (Zhou et al., 2008; Hurrell et al., 2010).
Se cultiva a nivel mundial como uno de los cultivos de flores y jardinería de corte y
maceta más importantes, principalmente debido a las flores grandes, fragantes y
multicolores con una larga vida útil (Van Tuyl et al., 2011; Bakhshaie et al., 2016).
Para obtener plantas libres de virus existen varias técnicas de cultivo de tejidos
vegetales o cultivo in vitro. Las más conocidas son el cultivo de meristemas, la
termoterapia y la quimioterapia, entre otras (Rosales et al., 2018).
Aunque los protocolos de micropropagación se han desarrollado para las principales
especies de Lilium, la mayoría no son suficientemente viables en laboratorios
comerciales y una de las principales razones de esto es la formación inadecuada de
bulbos (Askari et al., 2018).
Atendiendo a lo anterior el objetivo de este trabajo fue establecer una metodología para
la propagación in vitro de Easter lilies (Lilium longiflorum L.).

MATERIALES Y MÉTODOS
La investigación se realizó en el Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales
(INIVIT) en el municipio de Santo Domingo, provincia de Villa Clara.
Procedimientos generales
Según el experimento, se emplearon tubos de ensayos (50 x 25 mm) con 10 mL de
medio de cultivo y frascos de cristal (50 mL), con 15 mL de medio de cultivo, los cuales
se colocaron en una cámara de cultivo a una temperatura de 27±2,0 °C e iluminación
artificial mediante tubos fluorescentes, con régimen de 16 horas de luz a una densidad
de flujo de fotones fotosintéticos (FFF) de 62-68 µmol m-2s-1). El pH fue ajustado con
NaOH 0,5 N y HCl 0,5 N, antes de la esterilización en autoclave.
El procesamiento de los datos se realizó con los paquetes estadísticos SPSS ver. 9.0.
En cada experimento se detallan las pruebas realizadas.
Determinación de la concentración de hipoclorito de sodio para la desinfección
del explante
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Con el objetivo de determinar la concentración más adecuada para la desinfección del


explante a utilizar (ápices meristemáticos) se utilizaron tres concentraciones de
hipoclorito de sodio (NaOCl) al 0,5%; 1% y 2,0% (v/v) durante 15 minutos en
condiciones estériles en una cabina de flujo laminar, seguido de tres enjuagues con
agua estéril. Se utilizaron 24 explantes por cada concentración de hipoclorito de sodio
estudiada y fueron incubados en tubos de ensayos según se describió en los
procedimientos generales en las condiciones de cultivo descritas anteriormente.
Se evaluó la cantidad de explantes contaminados y se expresó los mismos en
porcentaje.
Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó el procedimiento no paramétrico
Kruskal-Wallis con un nivel de significación de p<0,05.

Establecimiento in vitro de los ápices meristemáticos


El establecimiento in vitro se realizó a partir de ápices meristemáticos (Fig. 1), los
cuales fueron incubados en el medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) (sales y
vitaminas), sacarosa (30 g.L-1) y suplementado con diferentes concentraciones de
6-bencilaminopurina (BAP) (0,1; 0,2; 0,3 y 1,0 mg.L-1) y solidificado con gelrite (2 g.L-1),
pH 5,7 durante 30 días de cultivo, incubados en las condiciones de cultivos señaladas
en los procedimientos generales.

Figura 1. Explantes utilizados para el establecimiento in vitro del Lilium.

Los explantes fueron colocados en los frascos de cristal descritos en los procedimientos
generales. Se evaluó el tipo de estructura presente (características del explante) y el
coeficiente de multiplicación.
Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó el procedimiento no paramétrico
Kruskal-Wallis con un nivel de significación de p<0,05.

Determinación del coeficiente de multiplicación durante tres subcultivos


realizados
A partir del resultado obtenido del experimento anterior, con relación a la concentración
más adecuada de 6-bencilaminopurina (BAP) para el establecimiento in vitro y su
multiplicación, se evaluó el número de brotes durante tres subcultivos en cada uno de
ellos.
La multiplicación de los mismos se realizó por secciones transversales de escama del
bulbo de algunos milímetros de espesor según Askari (2016). Se utilizaron 24 explantes
en cada subcultivo estudiado.
Las condiciones de cultivo y frascos utilizados fueron las descritas en procedimientos
generales.

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Los resultados fueron evaluados según el análisis estadístico no paramétrico Kruskal-


Wallis con un nivel de significación de p<0,05.

Influencia del medio de cultivo en la fase de enraizamiento


Con el objetivo de determinar la influencia del medio de cultivo en el enraizamiento del
explante se evaluó el número de raíces producidas en cada medio de cultivo estudiado,
a partir de una muestra de 15 explantes.
Los medios de cultivos estudiados fueron:
1. Murashige y Skoog (MS) (1962) (sales y vitaminas) 100% y sacarosa (30 g.L -1), pH
5,8 y solidificado con gelrite (2 g.L-1)
2. Murashige y Skoog (MS) (1962) (sales y vitaminas) 50% y sacarosa (30 g.L-1), pH 5,8
y solidificado con gelrite (2 g.L-1)
3. Murashige y Skoog (MS) (1962) (sales y vitaminas) 50%, sacarosa (30 g.L -1) y ANA
(0,5 mg.L-1), pH 5,8 y solidificado con gelrite (2 g.L-1)
Las condiciones de cultivo fueron las descritas en procedimientos generales y
colocados en los frascos de cristal.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Determinación de la concentración de hipoclorito de sodio para la desinfección
del explante
Al evaluar la concentración de hipoclorito de sodio para la desinfección del explante se
pudo observar que existió diferencia significativa entre los tratamientos evaluados
(Fig. 2) resultando el mejor tratamiento cuando se utilizó la concentración de 2% de
hipoclorito de sodio donde solo se contaminó el 4% de los explantes establecidos,
seguido por la concentración del 1% de hipoclorito de sodio donde se contaminó el 12%
de los explantes iniciados. Según De Klerk et al. (2014), los contaminantes pueden
originarse de dos fuentes distintas, primeramente, aquellos que vienen en la superficie o
en los tejidos de la planta donadora y en segundo lugar los que aparecen como
resultado de fallas en los procedimientos de laboratorio.

KW= 9,54**

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Leyenda: 1 (Desinfección con hipoclorito de sodio al 0,5 %), 2 (Desinfección con hipoclorito de sodio al
1 %), 3 (Desinfección con hipoclorito de sodio al 2 %)
Figura 2. Concentraciones de hipoclorito de sodio utilizadas para la desinfección del
explante en el establecimiento in vitro de Lilium.

La superficie de los tejidos de las plantas constituye hábitats para los microorganismos,
los cuales pueden alojarse en estomas, lenticelas o cualquier otra abertura natural, lo
cual dificulta en extremo la eliminación de los mismos. Las formas de eliminar o evitar
los microorganismos endógenos son muy limitadas. El primero es un tratamiento de
termo terapia que mata los microorganismos, pero no los tejidos vegetales. Este método
solo puede usarse en tejidos vegetales robustos, como bulbos y brotes no germinados,
y a menudo no tiene éxito entre otros porque las esporas latentes sobreviven e incluso
se activan. La segunda forma es comenzar con tejidos que estén libres de
microorganismos. En particular, los meristemos están libres de microorganismos (De
Klerk et al., 2014).
Xiao et al. (2017) utilizaron para el establecimiento in vitro de Lilium cernuum el
hipoclorito de sodio (2 %) durante 12 minutos. Mientras que De Klerk et al. (2014)
utilizaron el hipoclorito de sodio (1 %) durante 30 minutos y luego realizaron los
enjuagues con hipoclorito de sodio (0,03 %) en lugar de agua.

Establecimiento in vitro de los ápices meristemáticos


Durante el primer mes de cultivo los explantes duplicaron su grosor y fueron observados
tres tipos de estructuras (Fig. 3), brotes bien definidos, formados por pequeños bulbos
con la presencia en algunos casos de pequeños vástagos, que emergen del bulbo
similares a los descritos por Sahoo et al. (2018), estructuras que solo engrosaron y con
presencia de algunas zonas verdes sin desarrollo organogénico y por último estructuras
con desarrollo del ápice sin llegar a definirse el brote y rodeado de un callo.

Figura 3. Estructuras formadas a los 30 días de cultivo durante la etapa de


establecimiento in vitro del Lilium.

Aswath et al. (2001) al referirse al método de establecimiento in vitro por cultivo de


meristemos señalaron que aproximadamente 70 cultivares de Lilium habían sido
introducidos exitosamente, agregando que no fue hasta 1971 que se informó la
obtención de plantas libres de virus a través del cultivo de meristemos.

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Al evaluar la influencia de los medios de cultivos suplementados con diferentes


concentraciones BAP hubo una respuesta variada. Como se pudo observar (Fig. 4) en
el medio de cultivo constituido por 1 mg.L -1 se obtuvieron los mejores resultados al
evaluar el coeficiente de multiplicación de los mismos con diferencias significativas del
resto de los tratamientos estudiados.

KW -57,20

Figura 4. Influencia del medio de cultivo en la etapa de establecimiento in vitro de Lilium


en relación con el coeficiente de multiplicación.

Las estructuras evaluadas se caracterizaron por ser bulbos de color verde intenso
formados por varias escamas, lo cual constituyó el explante seleccionado para su
propagación in vitro, utilizado también por otros autores en este género (Ishioka y
Tanimoto, 1990).
Sahoo et al. (2018) lograron el establecimiento in vitro del cultivar Shirui lily (Lilium
mackliniae Sealy) utilizando 0,5 mg.L-1 de 6-BAP en el medio de cultivo.

Determinación del coeficiente de multiplicación durante tres subcultivos


realizados
Como se puede observar en la Tabla 1, a medida que aumentó el número de subcultivo
hasta el tercero se pudo apreciar un aumento del coeficiente (11 bulbos) con diferencias
significativas del resto de los dos subcultivos anteriores que se comportaron entre 5,4 y
6 bulbos (Fig. 5).

Tabla1. Coeficiente de multiplicación de Lilium durante tres subcultivos en el medio de


cultivo MS (1962) suplementado con 1 mg.L-1 de 6-BAP.
Tratamientos Coeficiente de multiplicación Media de rango
1 5.4 57.792 a
2 6 28.604 b
3 11 23.104 b
KW = 38,8207*

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Figura 5. Explantes de Lilium en tercer subcultivo de multiplicación en el medio de


cultivo MS (1962) suplementado con 1 mg.L-1 de 6-BAP.

Relacionado con los índices de multiplicación Gerrists (1992) y Gerrists y De Klerk


(1992) cuando multiplicaron la especie L. speciusum en la oscuridad lograron
incrementar el tamaño de los bulbos a expensas del número y tamaño de las hojas.
También otros autores como Stimart y Ascher (1978) en las mismas condiciones de
oscuridad aumentaron el número de bulbos diferenciados.
Xiao et al. (2017) lograron un coeficiente de multiplicación de 2.03 utilizando la
combinación de 0,5 mg.L-1 de 6-BAP y 0.1 mg.L-1 de ANA en el medio de cultivo, para la
multiplicación del Lilium cernuum.
Sahoo et al. (2018) obtuvieron 3.5 brotes por explantes al utilizar el medio de cultivo
enriquecido con 0.5 mg.L-1 de 6-BAP y 1.0 mg.L-1 de AG3 en el cultivar ‘Shirui lily’ (Lilium
mackliniae Sealy).
Seon et al. (2000) han propuesto una técnica de propagación en masa en biorreactores
para híbridos orientales y señalaron además que el cultivo en biorreactores con
suplementación periódica de medio de cultivo es un método eficaz para la producción
en masa de bulbos de Lilium en términos de economía, de mano de obra y de tiempo.

Influencia del medio de cultivo en la fase de enraizamiento


Al evaluar la presencia de raíces en los medios de cultivo estudiados, se determinó que
la mejor variante con diferencias significativas del resto de los tratamientos estudiados
fue el medio de cultivo que contenía 0,5 mg.L-1 de ANA con 20 raíces como media de la
plántula regenerada (Tabla 2).

Tabla 2. Influencia del medio de cultivo en el enraizamiento de los explantes de Lilium


en diferentes medios de cultivo.
Medio de cultivo utilizado Cantidad de raíces Media de rangos
MS-100% 13,0 27,542 a
MS-50% 18,16 21,167 a
MS-50% +0,5 ANA 20,0 6,791 b
Kw =24,767*

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Sin embargo, cuando se utilizó el medio de cultivo MS (1962) al 100% de la


concentración de sus sales y desprovisto de reguladores del crecimiento, los bulbos se
elongaron, siendo necesario para la diferenciación en plántula, un subcultivo posterior.
Resultados similares fueron obtenidos por Duong et al. (2006) al utilizar el ANA en el
enraizamiento in vitro del Lilium a partir de la formación de bulbos.
Sahoo et al. (2018) obtuvieron los mejores resultados en el enraizamiento de las plantas
cuando utilizaron 0,5 mg.L-1 de ANA.
Cuando fueron transferidas las plántulas a la fase de aclimatización se logró obtener un
98% de sobrevivencia de las plantas producidas in vitro (Fig. 6). Resultados similares
también fueron obtenidos durante esta fase por Chen et al. (2000) y Duong et al. (2006)
cuando obtuvieron una sobrevivencia de 97 y 98 % respectivamente.

Figura 6. Plantas producidas in vitro de Lilium en fase de aclimatización, listas para ser
transferidas a condiciones de campo.

Los resultados alcanzados posibilitaron el establecimiento de una metodología para la


propagación del Lilium a partir del establecimiento in vitro de los ápices meristemáticos
seguido de la multiplicación de los bulbos y su posterior transferencia a la fase de
aclimatización.

CONCLUSIONES
1. Se estableció una metodología para la regeneración de plantas por organogénesis
(bulbos) del Lilium.
2. Los coeficientes de multiplicación obtenidos por organogénesis y su posterior
regeneración de plantas posibilitaron incrementar los volúmenes de material de
propagación.
3. Se logró un 98 % de supervivencia en las plantas evaluadas durante la fase de
aclimatización.

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