Laboratorio de Biología Molecular

Cuestionario
Práctica 2
Nava Marmolejo María Fernanda | Sonia Lizette Yolanda Ortega Rivera | Brenda Lizethe Ortiz
Hernández

Instrucciones. Utiliza recursos bibliográficos para contestar correctamente las siguientes

preguntas.

1. ¿En dónde se encuentra localizado el DNA en las células eucarióticas?

Lo podemos encontrar en el núcleo celular ultracompactado en cromosomas; en las
mitocondrias y cloroplastos, como una molécula circular en la matriz y el estroma,
respectivamente [1, 2].

2. ¿En dónde se encuentra localizado el DNA en las células procariotas y como está
organizado?
En los procariotas, el DNA se encuentra en el citoplasma de la célula, particularmente
se ubica en la región central del cuerpo celular, a esta zona se le conoce como
nucleoide. El DNA procariota es de doble cadena, es una molécula circular y
covalentemente cerrada. También podemos encontrar DNA por separado a este
cromosoma circular, en forma de plásmidos, que conforman aproximadamente del
0.1 al 0.2% del DNA total de la célula [3].
El DNA de procariotas se ha descrito en un tipo de conformación de
superenrollamiento llamado forma plectonémica, caracterizada porque la doble hebra
se enrolla alrededor de otra parte de la misma molécula formando una hélice de orden
superior [4].

3. ¿Cuál es el fundamento de la cuantificación espectrofotométrica del DNA?

La espectofotometría es una técnica analítica, que permite determinar la
concentración de un compuesto en solución. Las moléculas absorben las radiaciones
electromagnéticas, por lo tanto, la cantidad de luz absorbida depende de la
concentración de estas en la solución [5]. Entonces, se puede conocer la
concentración y la pureza de una muestra si se conoce la capacidad de absorbancia
del compuesto a una longitud de onda determinada. El DNA tiene una capacidad de
absorción de luz UV de 2.600 Å, o una longitud de onda de 260nm, cuando se
encuentra en cadena doble; cuando está desnaturalizado o en cadena sencilla la
absorción aumenta [6].

4. ¿Cuál es el propósito de utilizar lisozima en su protocolo?

Para poder acceder al material genético de las células es necesario romper su

membrana y pared. La lisozima es capaz de romper la pared celular de las células
bacterianas, específicamente cataliza la hidrólisis de las uniones β1,4 entre los
residuos de ácido N-acetilmurámico y N-acetil-D-glucosamina.
5. ¿Cuál es el propósito de utilizar detergente (SDS) en su protocolo?
El SDS (sodio dodecil sultafo): Es un detergente aniónico que solubiliza los lípidos y
proteínas, y desestabiliza la estructura de la membrana celular.

6. ¿Cuál es el propósito de utilizar la mezcla de fenol/cloroformo en su protocolo?

Se emplean para separar el DNA de las proteínas y los lípidos. Se utiliza la fuerte
tendencia hidrofílica de los grupos fosfato para separarlos en medios acuosos,
mientras que las proteínas y los lípidos se separan en solventes orgánicos. La fase
acuosa y la orgánica se separan por centrifugación lo que permite aislar al ADN.

7. ¿Qué otros métodos de extracción de DNA existen?

• Método de calentamiento:
Se homogeneiza La muestra de manera manual con nitrógeno líquido y también
agua destilada. después en Cuba a 90 centígrados durante 15 minutos. finalmente se
hace una centrifugación hasta obtener un sobrenadante y este conservarlo o menos
20 centígrados.
• Método del acetato de potasio:
La muestra nuevamente se homogeneiza de manera manual en un tampón de lisis y
la suspensión se incuba durante 30 minutos a 65 centígrados. Después, los ácidos
nucleicos que se extrajeron fue adicionando acetato de potasio 8 M incubándose en
hielo durante 15 minutos, luego se centrífuga la mezcla durante 20 minutos y el
precipitado se lava con etanol al 70%. A continuación, luego de secarse, El ADN se
disuelve en él tampón TE. más tarde el RNA en que no estaba así elimina con
RNAsa H para que la suspensión se incube a 37 centígrados durante una hora. luego
de extraer con el mismo volumen del cloroformo- alcohol isoamílico la fase acuosa
se conserva a -20 centígrados
• Método por incubación del lisado para su uso:
Se incuba el lisado crudo a temperatura de entre 90 y 100 °C para de esta manera
usarlo directamente, sin embargo, este es un método de la que obtenemos muy baja
pureza y no tiene muchas aplicaciones además de que hay mucha perdida de DNA
por las nucleasas principalmente que se encuentran en contacto del DNA.
• Método de lisis por ruptura mecánica y extracción con disolventes
orgánicos:
Para este método lo más indicado es que se use para moléculas de ADN con alto
peso molecular para de esta manera obtener mejores rendimientos de moléculas
puras ya que se tiene que controlar el pH de la fase acuosa, así como también la
concentración de las sales. Este es un método donde se puede extraer el DNA de
material crudo, liofilizado o congelado, en el cual se puede romper con un mortero,
congelación- descongelación o mediante ultrasonidos. Se separa los ácidos
nucleicos ya que en el listado de células puede ser extraído con cloroformo, alcohol
isoamílico o fenol de esta forma las proteínas y algunos otros componentes celulares
solubles en disolventes son separados. Sin embargo, al requerir de varios trasvases
es más probable que la muestra se contamine.
• Método de lisado y purificación con un detergente iónico (CTAB):
Este método usualmente es usado para extraer DNA de vegetales, DNA genómico
de bacterias, entre otros microorganismos. Método en el cual se hace uso de un
detergente aniónico para que éste rompa la pare celular y de esta manera provocar la
lisis de las células, ya que, tú se hace uso del bromuro de cetil trimetil amonio como
detergente, también sí ETDA se encuentra presente actúa como agente quelatante y
TRIS-HCI como tampón, de manera que resultan complejos insolubles. Más tarde
se extraen los residuos orgánicos con cloroformo y después para separar el DNA
por precipitación con etanol.
• Método de salting-out:
Luego de un listado celular es posible separar las moléculas de proteínas y otros
contaminantes del DNA por medio de la a visión de altas concentraciones de sal de
esta manera disminuye la solubilidad de las moléculas orgánicas en la fase acuosa.
normalmente se hace el uso de proteinasa K, TRIS-HCI para el pH y Otras especies
químicas para que se inactiven totalmente a las células que puedan afectar el DNA.
Se hace uso de sales inorgánicas como puede ser el perclorato de sodio y cloruro de
sodio en altas concentraciones de forma que se precipiten las moléculas orgánicas y
de esta manera se haga la extracción, con el precipitado obtenido ese parado por
centrifugación y después se extrae el DNA de la disolución acuosa por medio de
adición de alcohol nuevamente por precipitación.
• Método de uso de la proteinasa K y el dodecilsulfato de sodio (PK-SDS):
En este método se usa la proteinasa K la cual se activa por dodecil sulfato de sodio,
ya que dicha proteinasa K inactiva DNAsas que esten en el listado celular con
detergente aniónico el SDS.
• Método con yoduro de sodio:
En este método se usa el yoduro de sodio como agente causal trópico, de manera
que provoca lisis celular rompiendo la capa de hidratación que se encuentra
rodeando el DNA y provoca que las cargas negativas de los fosfatos del DNA esten
es más expuestas. Más tarde, en el mismo tubo donde se realizó la extracción el
alma se baña de detergentes aniónicos como proteinasa K u otros que puedan
separar las proteínas y lípidos contenidos en el DNA.
• Método con gradientes de cloruro de cesio- bromuro de etidio:
 Para este método, se hace el lisado celular mediante métodos mecánicos o químicos
para después centrifugar la mezcla durante varias horas con bromuro de etidio, al
estar este último presente se pueden ver las diferentes capas en que los ácidos
nucleicos son agrupados por su densidad de luz ultravioleta al tener varias capas es
posible separarlas y obtener el DNA purificado.
• Método de intercambio aniónico para extracción de DNA del lisado celular:
En este método por medio de la cromatografía en fase sólida de intercambio
aniónico, Por la interacción establecida entre grupos fosfatos cargados
negativamente del DNA y matriz celular que se compacta la columna, de manera
que el DNA puede quedarse En la fase estacionaria de la columna de manera que se
pueden separar las proteínas y otros metabolitos, para después añadir una alta
concentración de sales a la fase móvil De forma que evita el DNA.
• Método de uso de matrices celulósicas:
En este método se impregna una matriz de celulosa con especies químicas que
permitan lisis celular y conservación del DNA, de manera que se unen tampones,
agentes quelatantes, sales, detergentes y moléculas con un alto grado de absorbancia
UV. en este método se pueden conservar las muestras durante mucho tiempo.
• Método de uso de resinas de intercambio iónico:
En este método se hace uso de resinas hidrocarbonadas con estructuras rígidas en 3
dimensiones de esta manera la superficie puede estar cargada con a una sustancia
que pueda retomarse en medio ácido y estar cargado positivamente de manera que
interacciona con los grupos sulfatos del DNA. Este es un método rápido y en un
solo tubo ya que es directo.
8. ¿Qué factores influyen en la cantidad de su DNA aislado?
Inicialmente un factor que puede afectar el rendimiento es la cantidad inicial de la
muestra de material biológico. Algunos otros factores que afectan el rendimiento es
el exceso de manipulación, ya sea, durante la extracción fenol cloroformo,
centrifugación, decantado, lavado, disolución y precipitado en frio. Esto se debería,
esto se debería al continuo y excesivo manejo de la muestra Además de que también
en algunos casos algunas sustancias químicas podrían degradar el DNA o también
podrían contaminar la muestra debido al excesivo manejo, razón por la que sutil
sobre distintos métodos según la aplicación que se le vaya a dar a la extracción y
purificación del DNA.
9. ¿Qué propiedades le permiten al DNA separarse en un campo electroforético?
La carga negativa otorgada por los grupos fosfato son los que hacen que migren en el
campo electroforético hacia el polo positivo, siendo aquellos fragmentos de menor
tamaño los que se desplacen con mayor facilidad, y, por ende, más distancia, entre
los poros del gel de agarosa.
 10. ¿Además del bromuro de etidio que otro procedimiento podría utilizar para
observar su DNA aislado en un gel de agarosa?
Puede emplearse el tinte SYBR safe o gold, el cual estudios de toxicidad indican que
es mucho menos mutagénico que el bromuro de etidio y hace posible la visualización
de las bandas con luz azul, eliminando otro riesgo al usar luz UV. Además, en caso
de no agregar algún colorante en el gel desde el momento de su preparación, es
posible realizar tinciones para observar las bandas de DNA como el fast blast en
donde unicamente es necesario sumergir el gel durante unos minutos en una solución
de fast blast 100x con agitación suave, para posteriormente realizar varios lavados de
la muestra con agua a 55° C hasta ir logrando observar las bandas. [8 y 9]

Referencias

[1] Espinosa, L. & Chávez, E. (2019). El otro genoma de las plantas: los cloroplastos y su
ADN. Desde el Herbario CICY 11: 201–206.

[2] Skorecki, K. & Behar, D. (2016). Principios de Medicina Interna. Cap. 85e: DNA
mitocondrial y enfermedades y rasgos hereditarios. Mc.Graw-Hill Interamericana Editores.
1-17.

[3] Nucleoide. PDF copias de libro, recuperado de:

http://cdigital.dgb.uanl.mx/la/1020111466/1020111466_019.pdf

[4] Cebrián, J. (2015). Superenrollamiento, encadenamiento y anudamiento del DNA en

procariotas y eucariotas. Departamento de Biología Celular y Molecular. Recuperado de:
https://repositorio.uam.es/bitstream/handle/10486/666812/cebrian_castillo_jorge.pdf?s

[5] Díaz, N., Bárcena, J., Fernández, E., Galván, A., Jorrín, J., Peinado, J., Meléndez, F. &
Túnez, I. (s.f.) Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de
biomoléculas. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Recuperado de:
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETRIA.pdf

[6] Estructura de los ácidos nucleicos. PDF obtenido de:

https://www.ucm.es/data/cont/media/www/pag-56185/02-
Estructura%20de%20los%20%C3%A1cidos%20nucl%C3%A9icos.pdf

[7] Velázquez, L. Martínez, M. & Romero, A. (s.f) extracción y purificación de DNA.

Recuperado marzo 16, 2022. PDF obtenido de
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf

[8] INVITROGEN (2016) SYBR™ Safe DNA Gel Stain. Recuperado Marzo 16, 2022.PDF
obtenido de https://assets.fishersci.com/TFS-
Assets/LSG/manuals/sybr_safe_dna_gel_stain_man.pdf
https://www.fishersci.es/shop/products/invitrogen-sybr-safe-dna-gel-stain-1/10328162
[9] González, G. González Hernández, G., Ramírez Zúñiga, M. & Torres Guzmán, J. (s.f)
Manual Ingeniería Genética experimentación. Recuperado Marzo 16, 2022. PDF obtenido de
https://campusdigital.ugto.mx/pluginfile.php/580640/mod_resource/content/3/Manual%20I
ngenieria%20Genetica%5B63%5D.pdf