APLICACIÓN DE LA LIPASA RECOMBINANTE RHIZOPUS ORYZAE PARA LA

OBTENCIÓN DE BIODIESEL A PARTIR DEL ACEITE DE ALPERUJO

Casas Preciado Cristian; Oré Sánchez Julissa.

Facultad de Ingeniería Química, Universidad Nacional del Callao, Av. Juan Pablo II 306. Bellavista,
Callao, Perú.

RESUMEN
El presente artículo se centra, en términos generales, en la síntesis enzimática de biodiésel utilizando una
lipasa recombinante de Rhizopus oryzae (rROL), expresada en Pichia pastoris. La primera parte se centra en
la evaluación de una nueva materia prima como sustrato para la producción de biodiesel. El aceite de
alperujo es un aceite vegetal, que puede ser representativo de otras materias primas con alto contenido en
FFA, consideradas como aceites residuales. Durante el proceso de experimentación en el laboratorio, se
hace hincapié en la mejora de la propia reacción enzimática utilizando viales de 10 mL. La temperatura se
ajusta para aumentar la estabilidad de la enzima. Se añaden metanol y etanol utilizando tres estrategias
escalonadas: uno, cinco y diez pulsos. También se comparan la estabilidad y la productividad para encontrar
la mejor. A continuación, se lleva a cabo la ampliación a un reactor agitado de 50 ml reproduciendo los
experimentos anteriores. La última parte se centra en la simulación de un proceso industrial de producción
enzimática de biodiésel utilizando todos los resultados obtenidos anteriormente. Se utiliza un software
específico (SuperPro Designer®) para plantear y desarrollar un proceso de producción y purificación del
biodiésel. A continuación, se realizan estudios de viabilidad y se sugieren algunas modificaciones para
encontrar un proceso rentable y factible.

Palabras clave: Aceite de alperujo, lipasas, biodiesel, sustrato.

ABSTRACT
This paper focuses, in general terms, on the enzymatic synthesis of biodiesel using a recombinant lipase
from Rhizopus oryzae (rROL), expressed in Pichia pastoris. The first part focuses on the evaluation of a new
feedstock as a substrate for biodiesel production. The alperujo oil is a vegetable oil, which can be
representative of other feedstocks with high FFA content, considered as waste oils. During the experimental
process in the laboratory, emphasis is placed on the enhancement of the enzymatic reaction itself using 10
mL vials. The temperature is adjusted to increase the stability of the enzyme. Methanol and ethanol are
added using three stepwise strategies: one, five and ten pulses. Stability and productivity are also compared
to find the best one. Next, scale-up to a 50 ml stirred reactor is carried out by reproducing the previous
experiments. The last part focuses on the simulation of an industrial enzymatic biodiesel production process
using all the results obtained previously. Specific software (SuperPro Designer®) is used to design and
develop a biodiesel production and purification process. Feasibility studies are then carried out and some
modifications are suggested to find a profitable and feasible process.

Keywords: Pomace oil, lipases, biodiesel, substrate.

1
INTRODUCCIÓN Biodiesel
El deterioro del medio ambiente, sumado a la Como combustible alternativo a base de
poca sostenibilidad de los combustibles petróleo, el biodiesel se produce mediante la
fósiles, crea en la población una creciente transesterificación de triacilgliceroles
conciencia ambiental que ha llevado al presentes en aceites vegetales y grasa. El
desarrollo de diversos combustibles y fuentes biodiésel reduce el efecto medioambiental de
de energía denominadas renovables. un producto de desecho y puede elaborarse a
partir de aceites de cocina usados y manteca
El desarrollo de un combustible en particular, de cerdo.
denominado biodiesel, se presenta como una
alternativa alentadora. Dicho combustible, Ventajas y desventajas
obtenido a partir de aceites y grasas animales
y vegetales, puede ser empleado sin mayores • Ventajas
modificaciones en motores de ciclo diésel.
 Es renovable, bajas emisiones,
Es así que existe la capacidad de generar reducción de la polución urbana.
biodiesel a partir de materias primas como el  Tiene alto punto de inflamación
del aceite de alperujo el cual es rentable y (>300F)
favorable el impacto sostenible que genera en  No son tóxicos y tienen una velocidad
el medio ambiente. de degradación cuatro veces
comparada con la del petrodiésel. Su
Biocombustibles contenido de oxígeno mejora el
Los biocombustibles son combustibles de proceso de degradación.
origen biológico obtenido de manera  No requiere de modificaciones en el
renovable a partir de restos orgánicos. Estos motor.
restos orgánicos proceden normalmente del  Bajo contenido de azufre y
azúcar, trigo, maíz, semillas oleaginosas, ósea compuestos aromáticos
que se puede extraer aceites, etc. Todos ellos
• Desventajas
reducen el volumen total de CO2 que se
emite en la atmósfera, ya que lo absorben a  Tienen alta viscosidad.
medida que crecen y emiten prácticamente la  Tienen 5% menos de energía por
misma cantidad que los combustibles galón
convencionales cuando se queman, por lo que  Puede causar taponamiento en los
se produce un proceso de ciclo cerrado. Los filtros a bajas temperaturas, debido a
biocombustibles son a menudo mezclados con la formación de polímeros, que se
otros combustibles en pequeñas proporciones, depositan en el tanque de combustible
5 o 10%, proporcionando una reducción útil y otros contaminantes, esto se puede
pero limitada de gases de efecto invernadero. evitar filtrando el combustible
(González, 2010).  Libera altas emisiones de óxido de
nitrógeno.
 Enzimas y catálisis

2
  La catálisis significa la reducción de la Para poder extraer esa pequeña cantidad de
energía de activación necesaria para aceite se utilizan disolventes químicos,
convertir un sustrato en un producto a comúnmente el hexano, y el procedimiento se
través de un catalizador. realiza en extractoras.
 Las enzimas son un tipo de
catalizadores, formados esencialmente Lipasas
por una estructura o secuencia Las lipasas son enzimas hidrolíticas cuya
primaria de residuos de aminoácidos. función natural es catalizar la hidrólisis de
 Sus excelentes propiedades hacen enlaces éster de un esqueleto de triacilglicerol
que estas moléculas sean perfectas en ácidos grasos. Pero también pueden
para manejar una amplia variedad de realizar un gran número de reacciones
procesos que implican la producción dependiendo del medio de reacción y las
de bienes como la industria condiciones, por esta razón, han hecho que
alimentaria, productos químicos a las lipasas se conviertan en una de las
granel, medicamentos y componentes enzimas más utilizadas por la industria -
farmacéuticos, tecnologías láctea, panadería, papelera, petrolera,
ambientales, confección de ropa y farmacéutica, etc. Aunque no representaban
combustibles entre otros. más del 4% del mercado mundial de enzimas
en 1989, hoy en día representan, además de
Alperujo
las carbohidrasas y proteasas, el 70% de
Antiguamente se llamaban alperujos a los todas las ventas de enzimas.
restos de aceituna que quedaban tras haber
extraído el aceite de oliva virgen. Entre las aplicaciones más exitosas de las
enzimas de las lipasas se encuentran aquellas
Los alperujos estaban formados por la pulpa, que se consiguen con sus formas
los huesos, agua y una cantidad residual de inmovilizadas. Las ventajas son la posibilidad
aceite de oliva, aproximadamente entre el 2 y de recuperar la enzima del medio de reacción,
el 3%. Actualmente, con los molinos de dos la obtención de un producto no contaminado
fases, el subproducto obtenido se llama con la enzima, y el incremento de la
alperujo, y es una masa más o menos estabilidad operacional del biocatalizador.
compacta formada por los mismos
componentes y con aceite todavía en su Lipasa de Rhizopus oryzae
interior en igual porcentaje.
Rhizopus oryzae se llamaba anteriormente R.
Aceite de Alperujo arrhizus. Sin embargo, la diversidad
taxonómica del género Rhizopus de hongos
El aceite de alperujo es un aceite vegetal que filamentosos se volvió a investigar y varias
proviene del olivar utilizado tanto para el especies se combinaron en tres nuevos
consumo en los hogares como para el grupos: El grupo Rhizopus oryzae, el grupo
consumo en la industria alimentaria. Según el Rhizopus microspores y el grupo Rhizopus
método de extracción es uno de los cuatro stolonifera.
tipos de aceite procedentes del olivar

3
En la lipasa de R. oryzae se han utilizado Métodos de Análisis
organismos bacterianos y fúngicos como
En el laboratorio se experimentó de 2 formas.
hospedadores para producirla. En este trabajo
se ha expresado a través de la levadura La primera fue utilizando viales cerrados de 10
metilotrófica Pichia pastoris. ml, que serían colocados en un incubador KS
400.
La caracterización de un R. oryzae
recombinante realizada por el grupo de La segunda fue un minireactor HME-R50 de
investigación determinó que es 40 veces más 50 ml el cual dispone de cuatro entradas: una
activo que la lipasa nativa y se ve menos para el eje de agitación, otra para la sonda de
afectado por la fuerza iónica. temperatura, otra para un condensador y la
última para la adición de alcohol y la retirada
La lipasa recombinante de R. oryzae
de la muestra.
expresada en Pichia pastoris por el grupo de
investigación se ha utilizado como Procedimiento Experimental
biocatalizador en varias reacciones
aprovechando su regioespecificidad.
Siembra de Pichia pastoris
Efecto del glicerol La muestra de P. pastoris se cultivó en vasos
El glicerol se ha considerado un problema de precipitados de 500 mL a 30°C, 150 rpm,
importante durante los procesos de síntesis de durante 24 horas en medio YPD (10 g de
biodiesel porque puede causar problemas extracto de levadura, 20 g de peptona, 20 g de
ambientales, inhibir las lipasas inmovilizadas D-glucosa y 500 μL de antibiótico zeocin por
dando lugar a la obstrucción de las partículas litro de agua destilada, pH 7.4). El cultivo se
del catalizador centrifugó y la biomasa resultante se
resuspendió en el medio de cultivo del
biorreactor.

MATERIALES Y MÉTODOS Recuperación de la Lipasa

Después de centrifugar el medio a 9000 rpm

Reactivos y materiales
durante 15 minutos, ya que P. pastoris
Para obtener el biodiesel mediante reacciones expresa lipasas heterólogas
de transesterificación se utilizó como materia extracelularmente, el sobrenadante se guardó
prima aceite de alperujo, agregando metanol y para los siguientes pasos de recuperación.
etanol; como biocatalizador utilizamos a la
lipasa recombinante de Rhizopus oryzae En primer lugar, el sobrenadante que contenía
(ROL). A la muestra final se le diluyo con n- la lipasa se microfiltro utilizando prefiltros de
heptano de grado HPLC. fibra de vidrio de 0,70 μm y, a continuación,
utilizando membranas de nylon acuoso de
Esta investigación se realizó en un laboratorio 0,45 μm para eliminar las células restantes y
de la Universidad Autónoma de Barcelona, otras impurezas.
España.

4
El siguiente paso fue concentrar 10 veces el Aquí se asumió el hecho de que toda la acidez
extracto de lipasa mediante ultrafiltración del sustrato provenía de la presencia del ácido
utilizando una membrana Centrasette de 10 oleico
kDa para rede corte para reducir la carga
proteica no deseada. El alperujo centrifugado suplementado; se
obtuvo añadiendo la cantidad necesaria de
El extracto final se liofilizó y se almacenó a ácido oleico para igualar la acidez del sustrato
4°C. Inmovilización covalente de lipasas en original. Este sustrato se utiliza para asegurar
HFA y HFAGlut el papel real de los FFA. La cantidad total de
ácido oleico necesaria se obtiene de la
En la presente tesis se han utilizado dos tipos siguiente ecuación:
de biocatalizadores resultantes del mismo
soporte: por un lado, el rROL inmovilizado m oleico
sobre el ReliZyme HFA403/S comercial no A=
moleico +m0 (1− AN )
tratado denominado HFA, y por otro lado, el
rROL inmovilizado sobre el mismo HFA pero donde A es la acidez del sustrato; moleico, la
previamente tratado con etilendiamina y cantidad total de ácido oleico (en g); m 0, la
glutaraldehído (HFAGlut). cantidad de sustrato a tratar (en g); AN, la
acidez neutralizada del sustrato
Materia prima del biodiésel
Reacciones de transesterificación
Como materia prima se utilizó aceite de
alperujo. Para este estudio se utilizaron tres Todas las reacciones de síntesis de biodiésel
tipos de sustratos. se denominan reacciones de
transesterificación
Alperujo centrifugado o inicial; obtenido por
centrifugación (5 min a 4500 rpm) para  Reacciones de transesterificación en
desparafinarlo mecánicamente.
viales de 10 mL
El alperujo centrifugado neutralizado; se Todas las reacciones se llevaron a cabo por
obtuvo añadiendo el volumen necesario de duplicado en viales cerrados de 10 mL,
una solución de hidróxido de sodio para utilizando un incubador KS 400 bajo agitación
neutralizar la cantidad total de FFA (ácidos orbital a 350 rpm, a diferentes temperaturas
grasos libres) presente en el sustrato inicial. según el experimento (30°C, 40°C, 50°C). Se
Este volumen (V, en L) se calculó a partir de la emplearon reacciones en disolvente libre con
siguiente ecuación: 8 g de aceite de alperujo y la cantidad total de
m0 . A biocatalizador seco correspondiente a 32000
V= UA -aproximadamente un 2-3 %wt respecto al
M .C
sustrato-. Se añadieron las cantidades
donde mo es la cantidad total de sustrato (en estequiométricas totales (relación
g) que debe neutralizarse; A, la acidez del alcohol/aceite 2:1) de metanol y etanol.
sustrato; M, es la masa molar del ácido oleico
(en g mol-1); C, la concentración de la solución
de hidróxido de sodio (en mol L-1).

5
En las reacciones completas, se utilizó la
estrategia escalonada de tres maneras
diferentes para añadir el volumen
estequiométrico total: un solo pulso al principio
de la reacción, cinco pulsos con el mismo
volumen y diez pulsos con volúmenes
decrecientes a lo largo del tiempo.

Las muestras se extrajeron con jeringas de 1

mL con agujas de 0,8 mm y luego se filtraron
con membranas Millex acuosas de 4 mm

Las reacciones de prueba de estabilidad se

llevaron a cabo dejando el biocatalizador
depositado en el fondo del vial y retirando el
medio por encima. A continuación, los viales
que contenían el biocatalizador se
almacenaron a 4°C hasta la siguiente
reacción.

 Transesterificación en minireactor de
50mL Para un mejor análisis se utilizó SuperPro
Designer®, versión 7.0, ya que este software
Las reacciones se llevaron a cabo siguiendo el facilita la modelización, evaluación y
mismo método descrito anteriormente optimización de procesos integrados en una
utilizando un minireactor de 50 mL HME-R50. amplia gama de industrias, como la del
Este equipo está provisto de un sistema de biodiésel.
agitación mecánica con un rango de agitación
entre 100-700 rpm. También está equipado La simulación se dividió en dos partes: la fase
con una placa de calentamiento -hasta 250°C. de lotes, que comprende el tratamiento del
sustrato y la reacción de transesterificación, y
Se aplica un cambio de escala (5 veces) la fase continua, que incluye el flujo
respecto a los volúmenes de los viales. Así, se descendente y la purificación del biodiésel y
emplearon 40 g de aceite de alperujo y la los subproductos.
cantidad total de biocatalizador seco
correspondiente a 160000 UA. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Como ya se ha dicho, las reacciones de

Contenido de acidez y ácidos grasos
prueba de estabilidad se realizaron dejando el
biocatalizador depositado en el fondo del En la tabla 1 se muestra la caracterización de
minireactor y retirando el medio por encima. A la acidez de los sustratos. La acidez del
continuación, el depósito que contenía el alperujo suplementada ajustada al índice de
biocatalizador se almacenó a 4°C hasta la acidez del alperujo inicial, demostrando la
siguiente reacción. correcta aplicación del método de

6
suplementación con ácido oleico. Este tipo de en climas fríos. Sin embargo, el biodiésel
sustrato se utilizó para dilucidar el papel real altamente insaturado puede requerir el uso
de los FFA. Además, cabe señalar que se
seguro de estabilizadores oxidativos como
consideró que el bajo porcentaje de acidez
neutralizada del alperujo fueron insignificantes combustible.
para comprender mejor los resultados.
Composición
Ácidos grasos
(%)

Ácido Palmítico (16:0) 5.53 ± 0.20

Ácido Esteárico (18:0) 1.25 ± 0.15

Sustrato Acidez (%)
Ácido Oléico (18:1) 89.73 ± 0.64
Alperujo Inicial 18.93 ± 0.93 Ácido linoleico (18:2) 3.32 ± 0.24

Alperujo neutralizado 1.705 ± 0.03 Ácido linolénico (18:3) 0.17 ± 0.09

Tabla 2. Composición de ácidos grasos (% en peso) del
Alperujo
17.99 ± 0.33 alperujo obtenido por saponificación.
Suplementado
Tabla 1. Valores de acidez de sustratos.
Comparación de biocatalizadores: reacciones
de transesterificación en viales de 10 ml

En la tabla 2. se muestra el principal contenido Las reacciones de transesterificación se

llevaron a cabo utilizando 8 g de sustrato en
de ácidos grasos del alperujo. El aceite de
viales de 10 mL a 30 ° C, así como en un
alperujo es un subproducto directo del cultivo medio libre de solventes por varias razones,
del aceite de oliva; por lo tanto, el ácido oleico pero en primer lugar para evitar etapas
es el principal ácido graso presente en él, posteriores para la recuperación de biodiésel.

representando un 89% del contenido total de

ácidos grasos, seguido por el ácido palmítico y
linoleico, que representan un 5.53% y 3.32%,
respectivamente. Además, estos valores
indican que el aceite de alperujo está
compuesto mayoritariamente por un ácido
graso monoinsaturado (89,73%), seguido de
saturados (6,78%) y poliinsaturados (3,49%).
El biodiésel elaborado a partir de grasas
saturadas tiene un punto de fusión más alto, En este estudio, cuatro reacciones de
metanólisis se propusieron de acuerdo con
una desventaja en comparación con los cada tipo de sustrato - inicial y neutralizado -
insaturados, que tienen mejores propiedades con el biocatalizador.

7
El tiempo de evolución del ácido oleico y el
rendimiento de la reacción (FAME) se
muestran en la siguiente Fig. 1. Es importante
señalar aquí que, de acuerdo con la baja
cantidad de metanol agregado para evitar la
inactivación del metanol, solo el 12% fue el En el caso de usar alperujo inicial como
rendimiento máximo a alcanzar en las sustrato, el rendimiento máximo se alcanzó a
reacciones. las 3.5 h cuando se usó rROL-HFA como
biocatalizador y a las 2 h en el caso de rROL-
HFAGlut, resultando en un 2.6 -frecuencia
inicial más alta en la segunda reacción, solo
por la única razón de que rROL se inmovilizó
en el soporte de HFA tratado con
glutharaldehído, en lugar del comercial.

Sin embargo, cuando se usó sustrato

neutralizado, se necesitaron tiempos más
altos para alcanzar el rendimiento máximo
(9%) que cuando se usó aceite con FFA. En el
caso de la reacción catalizada por el
biocatalizador rROL-HFA, tomó 8 h y la
reacción catalizada por el biocatalizador
rROL-HFAGlut tomó un tiempo similar, 9.5 h.
Esta mejora en la velocidad de reacción inicial
provendría del método de inmovilización, pero
los comportamientos de rendimiento cuando
se utilizó alperujo neutralizado llevaron a
pensar que habría algún tipo de mecanismo
de reacción diferente. De hecho, está claro
que los ácidos grasos libres, principalmente el
ácido oleico, jugaron un papel importante en la
cinética de la reacción porque la ausencia de
este componente ralentizó la reacción hasta
Figura 1 Tiempo de evolución del rendimiento de FAME (●) y 10 veces.
cantidad total de ácido oleico (○) en la reacción de
Biocatal Tasa Inicial (µmol FAME mL-1
transesterificación usando aceite de alperujo inicial como Sustrato izador min-1)
sustrato y rROL-HFA (A) o rROL-HFAGlut (B) como
rROL-
biocatalizador, o usando aceite de alperujo neutralizado como 2.493
HFA
sustrato y rROL-HFA (C) o rROL-HFAGlut (D) como
Alperujo Inicial
biocatalizador. rROL-
6.482
HFAGlut
En primer lugar, los tiempos de reacción rROL-
0.748
fueron bastante diferentes en algunos casos. HFA

8
 Alperujo oleico, mientras que la acidez inicial del aceite
Neutralizado
puede provenir de diferentes componentes.
rROL-
0.640
HFAGlut Figura 5.4. A: Evolución temporal del rendimiento de FAME
Tabla 3 . Valores de velocidad inicial para cada reacción cuando se usa aceite inicial (○) o suplementado (●), y cantidad
total de ácido oleico presente en el medio cuando se usa aceite
inicial (◊) o suplementado (♦), ambas reacciones usan rROL-
Reacciones de aceite suplementado
HFAGlut como biocatalizador.
Se sabe que el aceite de alperujo contiene
una gran cantidad de componentes que hacen
que este sustrato sea diferente de otras Biocatalizad Tasa Inicial (µmol
Sustrato
materias primas vegetales. La mayoría de or FAME mL-1 min-1)
estos componentes son lignina, hemicelulosa, Alperujo
6.482
Inicial
celulosa y grasas. Para asegurar que las rROL-
grandes diferencias en la velocidad de HFAGlut
reacción inicial entre el aceite neutralizado y el Alperujo
Suplementad 7.280
inicial, provenían de la presencia de FFA, se o
realizó una prueba de verificación. Por lo Tabla 4. Valores de la velocidad de reacción inicial cuando se
tanto, se preparó un nuevo sustrato. utilizaron diferentes sustratos.
Básicamente, se añadió una cantidad
específica de ácido oleico al aceite
neutralizado para simular la acidez inicial,
aproximadamente el 19%.

Se seleccionó rROL-HFAGlut como CONCLUSIONES

biocatalizador porque resultó en la mejor
opción, ya que se ha demostrado que la
velocidad de reacción inicial y la estabilidad
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alperujo inicial. En ambos casos se alcanzó un 332548321_Food_irradiation_A_review
rendimiento del 11% aproximadamente en 2 Ahari, H., Mahyar, S., & Fathollahi, H. (2012).
horas de reacción. Además, se mantuvo la
The Potential of Food Irradiation: Benefits
velocidad de reacción inicial, como se muestra
en la Tabla 4. El valor ligeramente superior de and Limitations. Trends in Vital Food and
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aceite complementado vendría de la https://doi.org/10.5772/34520
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