ARTÍCULO DE REVISIÓN

Las lipasas: enzimas con potencial para el desarrollo de

biocatalizadores inmovilizados por adsorción interfacial

Lipases: enzymes having the potential for developing

immobilised biocatalysts by interfacial adsorption

Jorge González-Bacerio1, Jairo Rodríguez Hernández2, Alberto del Monte Martínez3*

Resumen

Las lipasas son enzimas con propiedades funcionales muy interesantes que permiten su utilización práctica
en diversos campos de las industrias agroquímica, farmacéutica, de detergentes y alimentaria, así como en
química fina. Entre las aplicaciones más importantes de estas moléculas se encuentran: la resolución de mez-
clas racémicas, la obtención de compuestos ópticamente puros y la bioconversión de principios activos. En
este trabajo se presenta una amplia revisión del tema, que abarca desde aspectos estructurales y funcionales
de las lipasas, hasta la inmovilización de estas enzimas mediante adsorción interfacial y su empleo en biotec-
nología.
Palabras clave: activación interfacial, adsorción interfacial, bioconversión, esterasas.

Abstract

Lipases are enzymes having very interesting functional properties thereby enabling their practical use in diffe-
rent fields related to agro-chemical, pharmaceutical and food industries, as well as in fine chemistry. The most
relevant applications for these molecules would be racemic mixture resolution, obtaining optically-pure com-
pounds and the bioconversion of active principles. This work presents a broad review of the topic, ranging
from lipases’ structural and functional features to these enzymes’ immobilisation by interfacial adsorption
and their use in biotechnology.
Key words: Bioconversion, esterases, interfacial activation, interfacial adsorption.

Recibido: septiembre 16 de 2009 Aprobado: junio 23 de 2010

1 Bioquímico, profesor, Centro de Estudio de Proteínas, Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Cuba. jogoba@fbio.
uh.cu
2 Microbiólogo, Centro de Estudio de Proteínas, Facultad de Biología, Universidad de La Habana.
3 Autor de correspondencia, bioquímico, profesor e investigador, Centro de Estudio de Proteínas, Facultad de Biología, Univer-
sidad de La Habana. [email protected]

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 Introducción con baja actividad de agua (Segura et al., 2004;
Dandavate et al., 2009). Bajo determinadas con-
Las lipasas (glicerol-éster hidrolasas; EC
diciones, las lipasas pueden catalizar reacciones
3.1.1.3) son enzimas que catalizan la hidrólisis
químicas distintas de la hidrólisis, como este-
de los enlaces éster presentes en los acilglicero-
rificación, interesterificación, alcoholisis, aci-
les in vivo. Además, pueden catalizar la hidró-
dolisis y aminolisis (Balcão et al., 1996; Pandey
lisis o síntesis de un grupo amplio de ésteres
et al., 1999). Estas hidrolasas se han empleado
carboxílicos (Bornscheuer et al. 1994). Estas
ampliamente como aditivos para detergentes,
enzimas están ampliamente distribuidas en la
en las industrias alimentaria, papelera, química
naturaleza, y se encuentran en microorganis-
y energética; así como para la producción de
mos, plantas y animales (Berner y Hammond,
cosméticos, en tratamientos ambientales y en el
1970; Mukherjee, 1996; Ruiz et al., 2007). Una
diseño de biosensores (MacRae y Hammond,
característica peculiar de las lipasas es que son
1995). Es notable el impacto que han tenido
enzimas solubles en agua que actúan sobre sus-
las lipasas en la producción de fármacos más
tratos insolubles y agregados, por lo que ope-
selectivos y efectivos, con efectos secundarios
ran unidas a interfaces lípido-agua. Bajo estas
menores, y en la obtención de pesticidas de me-
condiciones, se produce un incremento de la
actividad catalítica, respecto a las soluciones nor toxicidad, todo ello mediante la síntesis de
con concentraciones por debajo de la concen- compuestos ópticamente puros y la resolución
tración micelar crítica, fenómeno conocido de mezclas racémicas (Kirchner et al., 1985;
como activación interfacial (Sarda y Desnuelle, Yoshimura et al., 2002; Zarevúcka y Wimmer,
1958). 2008). Es por ello que cobra vital importancia
profundizar en el conocimiento sobre las ca-
racterísticas funcionales de estas enzimas, a fin
Entre las aplicaciones más exitosas de las
de determinar las condiciones más ventajosas
enzimas están aquellas que se consiguen con
de aprovechamiento de sus propiedades, para
sus formas inmovilizadas. Esto se debe a las
lograr la optimización de los procesos en que
ventajas que confiere la inmovilización, entre
son empleadas.
las que se encuentran: la posibilidad de recu-
perar la enzima del medio de reacción, la ob- En este trabajo se presentan los resulta-
tención de un producto no contaminado con la dos de una amplia revisión en la literatura es-
enzima, y el incremento de la estabilidad ope- pecializada sobre las lipasas. En primer lugar,
racional del biocatalizador (Guisán et al., 1996a; se ofrecen las características estructurales más
Malcata, 1996; Knežević et al., 2004). Uno de importantes de estas enzimas en relación con
los protocolos de inmovilización más difun- las peculiares propiedades funcionales que es-
didos para las lipasas es la adsorción selectiva tas determinan. A continuación se presenta la
sobre soportes hidrofóbicos que reproducen inmovilización de lipasas como tecnología di-
las interfaces formadas por los sustratos na- rigida a la obtención de biocatalizadores más
turales de estas enzimas (Malcata et al., 1992; eficientes, con énfasis en la inmovilización por
Fernández-Lafuente et al., 1998). En este caso, adsorción interfacial: uno de los procedimien-
la inmovilización se produce a través de un tos de inmovilización más difundidos para estas
mecanismo de adsorción interfacial (Reis et al., proteínas. Por último, se resumen las principa-
2009), basado en la activación de estas enzimas les aplicaciones biotecnológicas de las lipasas.
en interfaces.
Las lipasas han suscitado un interés cre- Masa molecular
ciente para la industria debido a su versatili-
dad, estereoselectividad, estabilidad frente a
y punto isoeléctrico
solventes orgánicos y capacidad de sintetizar La mayoría de las lipasas presenta masas
compuestos orgánicos en mezclas de reacción moleculares entre 27 y 60 kDa. Sin embargo, se

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conocen algunos ejemplos de lipasas con masas para la mayor parte de las enzimas e isoenzimas
moleculares ubicadas fuera de este intervalo. de diversos orígenes se encuentran entre 3,8 y
Los puntos isoeléctricos que se han informado 7,3 (tabla 1).

Tabla 1. Masas moleculares y puntos isoeléctricos de lipasas procedentes de diversas fuentes

Masa molecular
Fuente Punto isoeléctrico Referencia
(kDa)

Chromobacterium viscosum 33 7,1 Taipa et al., 1995

Candida rugosa 60 4,80-5,04 (isoenzimas) Lotti y Alberghina, 1996

Pseudomonas pseudoalcaligenes 32 7,3 Shuen-Fuh et al., 1996

Rhizomucor miehei 31.6 3,8 Wu et al., 1996

Salvado de arroz 9.4 ND Bhardwaj et al., 2001

Acinetobacter sp. 33 ND Snellman et al., 2002

Escorpión (glándulas digestivas) 50 ND Zouari et al., 2005

Calamar Todarodes pacificus (hígado) 27 ND Park et al., 2008

ND: No determinado.

Plegamiento y aminoácidos secuencial pequeño-x-nucleófilo-x-pequeño-

catalíticos pequeño; donde x es cualquier aminoácido y
“pequeño” se refiere a un aminoácido poco vo-
La lipasas presentan un dominio estruc- luminoso (Ransac et al., 1996). Solo la histidina
tural canónico compuesto por ocho cadenas está completamente conservada en la tríada
β que forman una hoja β. Estas cadenas es- de las lipasas (Derewenda et al., 1994a), cuyo
tán conectadas por hélices α, que quedan em- arreglo topológico y secuencial es la imagen es-
paquetadas a ambos lados de la hoja β. Este pecular de la tríada de las proteasas serínicas
núcleo central es el responsable directo de la (Ollis et al., 1992) (figura 1).
actividad catalítica y define el plegamiento
α/β-hidrolasa, común para muchas hidrolasas
de orígenes filogenéticos y funciones catalíticas Centro activo
diferentes (Ollis et al., 1992). El centro activo de las lipasas permanece
protegido por una cubierta que impide la entra-
La actividad funcional de las lipasas se da del sustrato. Este solo tiene acceso cuando
sustenta en la tríada de aminoácidos clásica: la enzima se encuentra en su conformación ac-
nucleófilo-ácido-histidina (Alam et al., 2002; tiva y la cubierta se ha desplazado (Derewenda
Mead et al., 2002), dilucidada inicialmente para et al., 1994b; Miled et al., 2003). Esta cubier-
las proteasas serínicas (Carter y Wells, 1988). ta puede ser una hélice α anfifílica (Lotti y
Los elementos de la tríada se ubican en lazos Alberghina, 1996) o un lazo (Hui y Howles,
muy bien conservados del dominio catalítico. 2002). La estructura nativa de las lipasas es un
El nucleófilo, generalmente una serina, se loca- sistema dinámico de interconversión entre la
liza en un giro que conecta una cadena β con estructura cerrada, que predomina en ambien-
una hélice α (Petersen, 1996), en el contexto tes homogéneos, y la estructura abierta, que se

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Figura 1. Diagrama esquemático del plegamiento α/β-hidrolasa, presente en el dominio catalítico canónico de
las lipasas. Flechas: cadenas β. Rectángulos: hélices α. Conexiones: lazos. Puntos: residuos que componen la
tríada catalítica (nucleófilo, ácido, histidina). N y C: extremos amino y carboxilo-terminal.

estabiliza en las interfaces lípido-agua (Gro- como zona de contacto lipídico (Okkels et al.,
chulski et al., 1994a; Guisán et al., 1996a). Las 1996). También están presentes algunas molé-
estructuras tridimensionales de algunas lipasas culas de agua que participan en interacciones
en sus conformaciones activas se han determi- importantes para mantener una conformación
nado por cristalografía y difracción de rayos X del sitio activo catalíticamente competente
(Derewenda et al., 1994b; Kim et al., 1997; Tyn- (Triantafyllou et al., 1993).
dall et al., 2002; Ericsson et al., 2008).
Además del centro activo principal, las li- Activación interfacial
pasas pancreáticas humana y porcina, y otras De manera general, las lipasas son en-
de origen microbiano, presentan en su región zimas que requieren de activación interfacial
C-terminal lo que parece ser un sitio catalíti-
para desplegar al máximo su actividad catalítica
co mínimo. Este pudiera ser responsable de la
(Malcata, 1996; Ransac et al., 1996). Este fenó-
actividad enzimática frente a sustratos hidro-
meno consiste en el incremento de la actividad
solubles como los ésteres del p-nitrofenol (De
enzimática en presencia de interfaces lípido-
Caro et al. 1986). Por otra parte, esta actividad
también pudiera explicarse por las transiciones agua (Sarda y Desnuelle, 1958; Chahinian et
conformacionales que experimentan estas en- al., 2002). Se entiende por interface a la super-
zimas, aun en ambientes homogéneos, dadas ficie imaginaria que separa dos porciones del
por la interconversión estructura cerrada-es- espacio homogéneas y distintas físicamente. A
tructura abierta (Kim et al., 1997). nivel molecular, una interface consiste en un
conjunto de dos capas adyacentes de moléculas
En su conformación activa, las lipasas ordenadas con diferente carácter hidrofóbico-
presentan en su centro activo un grupo de re- hidrofílico (Malcata, 1996).
siduos hidrofóbicos dispuestos alrededor de
la serina catalítica que constituyen una región Cuando la enzima entra en contacto con
electrofílica conocida como cavidad oxianióni- una interface, el ambiente dieléctrico en la su-
ca (Grochulski et al., 1994b). Además, aparece perficie proteica se modifica, en el sentido de
una superficie significativamente apolar alrede- potenciar las interacciones electrostáticas. Ello
dor de la entrada al centro activo que se conoce posibilita que la cubierta del centro activo se

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desplace (Grochulski et al., 1994a; Petersen, implicaciones favorables para el reconocimien-
1996; Foresti y Ferreira, 2004), y se produce una to enzima-sustrato (Petersen, 1996) (figura 2).
reestructuración en la conformación de la mo-
lécula (Jensen et al., 2002; Aloulou et al., 2006;
Lin et al., 2007). Como resultado, los aminoáci- Agregación molecular
dos catalíticos quedan expuestos al solvente en Dado el carácter hidrofóbico de la zona
una orientación adecuada, y alrededor de éstos de contacto lipídico cercana al centro activo, no
se conforma la cavidad oxianiónica, por expo- es descartable su interacción con otras sustan-
sición de determinados residuos hidrofóbicos e cias de su misma naturaleza presentes en el me-
internalización de otros hidrofílicos (Ransac et dio, incluyendo las zonas hidrofóbicas de otras
al., 1996). Además, se estructura la zona de con- moléculas de enzima. Estas interacciones con-
tacto lipídico en la vecindad del centro activo y ducirían a la formación de agregados (Snellman
de la cubierta móvil (Grochulski et al., 1994a; et al., 2002) con baja o ninguna actividad cata-
Jensen et al., 2002). Todo esto incrementa la afi- lítica, debido al bloqueo de los centros activos
nidad de la enzima por sus sustratos lipídicos por las propias moléculas enzimáticas. El fenó-
y contribuye a la estabilización del estado de meno de agregación en soluciones acuosas ha
transición durante el ciclo catalítico (Malcata, sido demostrado experimentalmente por varios
1996; Ransac et al., 1996; Mead et al., 2002). grupos de investigadores (Flaschel y Renken,
Las características físico-químicas del sus- 1991; Guisán et al., 1996b; Palomo et al., 2003),
trato también contribuyen de manera significa- los que obtuvieron un rápido descenso de la
tiva a la activación interfacial (Egmond, 1996). actividad enzimática al aumentar la concentra-
En el estado agregado, los triacilglicéridos ex- ción de enzima (Pedersen et al., 2006).
hiben un grado de ordenamiento elevado, que
minimiza el número de estados conformacio-
Especificidad y selectividad
nales que pueden presentar estas moléculas en
solución acuosa, debido a la gran flexibilidad de Si bien las lipasas han sido definidas como
sus cadenas de ácidos grasos. Este efecto tiene enzimas específicas para catalizar la separación

Figura 2. Esquema cinético de la activación interfacial. v: velocidad inicial de la reacción catalizada

por la lipasa. [S]: concentración de sustrato. Líneas discontinuas: concentración micelar crítica del sustrato,
a partir de la cual el sustrato agrega y aparece la interface lípido-agua.

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hidrolítica de los ácidos grasos de cadena larga (Cygler et al., 1995), y alcanzan a distinguir
presentes en los acilgliceroles (Snellman et al., entre enantiómeros, frente a sustratos racé-
2002), los cuales son sus sustratos naturales, micos, o entre grupos enantiotópicos, para
muy pocas lipasas son específicas en sus reac- triacilglicéridos proquirales (Bornscheuer
ciones. Por este motivo, el término especifici- 2002). Por último, pueden establecerse cier-
dad se ha ido reemplazando en la literatura por tas combinaciones entre los tipos de selecti-
el de selectividad, el cual describe mucho mejor vidades anteriores (Jensen et al., 1994).
el comportamiento reactivo de estas hidrolasas.
En última instancia, la determinación de la es-
pecificidad de una lipasa depende de la sensibi- Efecto de la concentración
lidad del método empleado para ello (Jensen y de sustrato sobre la actividad
Hamosh, 1996). enzimática
Las lipasas pueden ser selectivas por la El efecto de la concentración de sustrato
clase de lípido (Bornscheuer et al., 1994; Li sobre la actividad lipasa ha sido ensayado con
et al., 2009) y por la posición (Berner y Ha- diferentes sustratos para enzimas de diversas
mmond, 1970) y el tipo de ácido graso (Sne- fuentes. En la tabla 2 se presentan algunos re-
llman et al., 2002; Zouari et al., 2005). Estas sultados que se han informado para lipasas en
enzimas pueden ser además estereoselectivas sus formas solubles.

Tabla 2. Parámetros cinéticos de diferentes lipasas en sus formas solubles

Fuente Sustrato KM Vmáx Referencia

Páncreas porcino p-nitrofenil acetato 0,20 mmol/L ND de Caro et al. 1986

7,1% (VTrioleína 55,5 mol / (mL

Thermus sp. Trioleína Silva et al., 1991
/ Visooctano) * h * mg prot.)

Candida rugosa A p-nitrofenil butirato 0,0392 mmol/L ND Rúa et al., 1993

C. rugosa B p-nitrofenil butirato > 0,4 mmol/L ND Rúa et al., 1993

C. rugosa Aceite de oliva 703 mmol/L 6032 mmol / (min * mg) Prazeres et al., 1996

Salvado de arroz Trioleína 6,71 mmol/L ND Bhardwaj et al., 2001

Bacillus sp. p-nitrofenil laurato 3,63 mmol/L 0,26 µmol / (min * mL) Dosanjh y Kaur, 2002

Burkholderia
p-nitrofenil palmitato 1,56 mmol/L 5,62 µmol / (mg * min) Dandavate et al., 2009
multivorans V2

ND: No determinado. KM: Constante de Michaelis-Menten para el par enzima-sustrato. Vmáx: Velocidad máxima de la reacción
catalizada por la lipasa.

El efecto de la concentración de sustra- los parámetros cinéticos, ya que estos se en-

to sobre la actividad enzimática también se cuentran sesgados por las condiciones de la
ha evaluado para lipasas inmovilizadas. En inmovilización (Tutar et al., 2009).
esos casos, se obtienen valores aparentes de

Lipasas: potencial para la adsorción interfacial y la biocatálisis 129

 Efecto del pH y la temperatura dencia del grado de exposición resultante de
sus centros activos (Balcão et al., 1996).
sobre la actividad enzimática
Las condiciones óptimas de pH depen- La temperatura óptima para una enzi-
den, entre otros factores, del sustrato (Berner ma depende, entre otros factores, del sustra-
y Hammond, 1970) y del tampón empleados to con el que se trabaje, ya que los ligandos
(Chávez et al., 1990). El pH óptimo para las ejercen un efecto protector frente a la des-
lipasas se encuentra generalmente en el in- naturalización térmica (Chávez et al., 1990).
tervalo entre 7,0 y 9,0 (tabla 3), cuando la La temperatura óptima para las lipasas pue-
actividad enzimática se ensaya frente a sus de encontrarse en el intervalo entre 35 y 50
sustratos específicos, como el aceite de oliva, °C, aunque existen lipasas termoestables que
la tributirina, otros triacilglicéridos peque- exhiben valores de temperatura óptima supe-
ños y la trioleína (Rúa et al., 1993; Prazeres et riores a 50 °C (tabla 3).
al., 1996). No obstante, para algunas lipasas, El medio en el que se encuentre la enzi-
el pH óptimo se encuentra en la región ací- ma también influye en el valor de temperatura
dica. Asimismo, se han encontrado lipasas óptima. De este modo, las lipasas presentes
con la mayor actividad a valores de pH más en preparados crudos, con altas concentra-
alcalinos (tabla 3). ciones de otras proteínas contaminantes dis-
También puede suceder que se obtenga tintas de las proteasas, serán más estables y
más de un valor de pH óptimo, manteniendo exhibirán valores aparentes de temperatura
invariables las demás condiciones del ensa- óptima superiores (Chávez et al., 1990). La
yo (Kiyotani et al., 1983). Esto suele ocurrir inmovilización puede producir incrementos
para lipasas obtenidas a partir de extractos en los valores de temperatura óptima de las
crudos o para mezclas heterogéneas con ac- lipasas solubles (Palomo et al., 2004; Wei y
tividad lipolítica (Berner y Hammond, 1970). Wu, 2008), debido a su efecto sobre la esta-
La inmovilización puede variar el valor de bilidad enzimática (Balcão et al., 1996).
pH óptimo de las lipasas con respecto a sus
formas solubles (Wei y Wu, 2008), en depen-

Tabla 3. Valores óptimos de pH y temperatura de diferentes lipasas en sus formas solubles.

Temperatura
Fuente pH óptimo Referencia
óptima (°C)

Conejillo de indias (macrófagos del peritoneo) 4,5/7,0 ND Kiyotani et al. 1983

Chromobacterium viscosum 7,0 42 Prazeres et al., 1996

Rhizomucor miehei 8,0 50 Wu et al., 1996

Salvado de arroz 11,0 80 Bhardwaj et al., 2001

Acinetobacter sp. 9,0 55 Snellman et al., 2002

Helicobacter pylori 10,0 50 Ruiz et al., 2007

Calamar Todarodes pacificus (lipasa hepática) 8,0 35-40 Park et al., 2008

Burkholderia sp. 8,0 40 Wei y Wu, 2008

ND: No determinado.

130 Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XII No. 1 Julio 2010 124-140
 Inhibidores, inhibición y efecto autores han informado inhibición competitiva
de aditivos sobre la actividad causada por concentraciones elevadas de deter-
gentes (Kimura et al., 1982).
enzimática

Las lipasas son inhibidas por los orga- La actividad lipasa puede ser afectada de
nofosfatos (Kordel y Schmid, 1991; Cavalier diferentes maneras por la presencia de iones
et al., 2000), como el dietil-p-nitrofenilfosfato metálicos en la preparación, los que pueden
y el diisopropil-fluorofosfato (Bhardwaj et estabilizar o desestabilizar la estructura de es-
al., 2001), por las carbodiimidas en presencia tas enzimas en solución (Tyndall et al., 2002).
de nucleófilos, como el glicin-etil éster, y por Muchas lipasas requieren del ion Ca2+ para
el iodo. También son inhibidores de lipasas mantener una conformación estable y/o ca-
los ácidos borónicos y el fenil-metil-sulfonil- talíticamente competente (Amada et al., 2001;
fluoruro (Dandavate et al., 2009), así como Snellman et al., 2002). Además del efecto inhi-
los metales pesados, el EDTA (Snellman et al., bitorio ya mencionado, los cationes metálicos
también pueden actuar como activadores de las
2002; Dandavate et al., 2009), algunos terpenos
lipasas (Kimura et al., 1982; Snellman et al., 2002;
(Morikawa et al., 2009), los iones halógenos,
Dandavate et al., 2009). El efecto activador del
los alcaloides, el cloroformo, el n-hexanol, el
Ca2+ puede manifestarse como un incremento
dietil-fenil carbonato, el bromoformo, varias
de la Vmáx y/o un decremento de la KM (Kimu-
lactonas (Colowick y Kaplan, 1955; Kordel y
ra et al., 1982). Algunos iones provocan efectos
Schmid, 1991) y algunos 1,2-etilen-di-N-alquil-
opuestos en lipasas diferentes (Wu et al., 1996;
carbamatos en presencia de detergentes (Lin et
Snellman et al., 2002). También pueden influir
al., 2007). Algunos cationes metálicos pueden
sobre la actividad de estas enzimas el tampón
producir inhibición (Wu et al., 1996; Snellman (Alston y Freedman, 2001), el solvente (Sugiura
et al., 2002; Park et al., 2008; Dandavate et al., e Isobe, 1975; Triantafyllou et al., 1993; Sharma
2009). et al., 2002; Dandavate et al., 2009) y la fuerza
iónica del medio (Mead et al., 2002). El efecto
Los inhibidores de naturaleza proteica inhibitorio del EDTA se basa en su capacidad
son más específicos por su lipasa blanco, como de quelar el Ca2+.
es el caso del aislado a partir de la harina de
trigo, que inhibió a la lipasa pancreática, pero Los detergentes o surfactantes son adi-
no fue capaz de inhibir completamente la ac- tivos de primera importancia para la actividad
tividad lipasa de Candida cylindracea y no ejer- lipolítica (Dandavate et al., 2009), puesto que
ció ningún efecto sobre otras lipasas aisladas intervienen en la formación de micelas a par-
de micobacterias (Tani et al., 1994). Algunas tir de la dispersión de los grandes agregados
proteínas hidrofóbicas, como la albúmina de hidrofóbicos en que se organizan espontánea-
suero bovino, inhiben a las lipasas mediante su mente los sustratos naturales de estas enzimas
unión competitiva a las interfaces (Larsson y en solución acuosa. Esto trae como consecuen-
Erlanson-Albertsson, 1983). Para varias lipasas cia un incremento notable del área superficial
se han informado los fenómenos de inhibición disponible para la interacción enzima-sustrato,
por exceso de sustrato, frente a trioleína (Bie- con el consiguiente efecto sobre la velocidad de
siot y Capuzzo, 1990; Prazeres et al., 1996), e la reacción (Egmond, 1996). Estas sustancias
inhibición por producto, causado por los áci- pueden además formar micelas invertidas en
dos grasos (Larsson y Erlanson-Albertsson, solventes orgánicos con un contenido de agua
1983). Los detergentes (Tsai et al., 1996; Broc- moderado, lo que puede traducirse en una ma-
kman, 2000) y las emulsiones de varios solven- yor actividad y estabilización de las moléculas
tes orgánicos (Sugiura e Isobe, 1975) pueden enzimáticas ubicadas en su interior (Shome et
actuar como inhibidores de las lipasas. Algunos al., 2007). Los detergentes también pueden in-

Lipasas: potencial para la adsorción interfacial y la biocatálisis 131

fluir sobre las propiedades estereoselectivas de Stelmaschuk, 1989). Sin embargo, algunas va-
las lipasas (Tsai et al., 1996). riantes de estos métodos experimentan inter-
ferencias debidas a la complejidad de ciertas
Sin embargo, el efecto de los detergentes mezclas. El consumo de los sustratos también
no es homogéneo para todas las enzimas, ni és- puede ser monitoreado por métodos espectro-
tas son afectadas del mismo modo por todos los fotométricos (Goujard et al., 2009), tensiometría
surfactantes (Aloulou et al., 2007). Además, la interfacial (Aloulou et al., 2007), microscopía de
influencia de estos compuestos sobre la activi- fuerza atómica (Prim et al., 2006) y espectros-
dad lipasa es dependiente de la dosis (Sonesson copía infrarroja. Los últimos tres métodos re-
et al., 2006). Las sales biliares son activadores quieren un equipamiento costoso.
fundamentales para las lipasas pancreáticas de
mamíferos en presencia de colipasa (Kimura El análisis de la velocidad de liberación
et al., 1982; Larsson y Erlanson-Albertsson, de los ácidos grasos puede efectuarse indirecta-
1983), y resultan inhibitorias para otras lipasas mente mediante el seguimiento de los protones
(Barnescu et al., 1997). El SDS, conocido por liberados durante la hidrólisis enzimática. El
su efecto desnaturalizante sobre las proteínas, método de pH-stat, que se fundamenta en la
activa a determinadas lipasas e inhibe a otras valoración de la disminución del pH en el tiem-
(Wu et al., 1996). Algunos detergentes no ió- po, es una de las técnicas más utilizadas bajo
nicos previenen la formación de agregados este principio (Bertolini et al., 1995). Los ácidos
enzimáticos (Palomo et al., 2003) y estabilizan grasos liberados por la actividad de la lipasa se
estructuralmente a la molécula (Guisán et al., ionizan en solución acuosa mediante la pérdida
1996b). El Triton-X100 es un detergente no ió- de protones y la mezcla de reacción tiende a
nico conocido por su capacidad de estimular la acidificarse. La velocidad de liberación de los
actividad de las lipasas (Sharma et al., 2002). ácidos grasos es proporcional a la velocidad de
liberación de los protones y, por tanto, a la ve-
locidad de acidificación del medio. Si se añade
Métodos de determinación de la NaOH a la misma velocidad a la que se liberan
actividad enzimática los protones, el pH de la mezcla se mantiene
constante en el tiempo. Este ensayo consiste en
La actividad esterasa más general puede registrar la velocidad a la que es necesario aña-
determinarse empleando como sustratos los dir el NaOH titulante a la mezcla de reacción, a
ésteres de cadena acílica del p-nitrofenol o del fin de mantener el pH en un valor fijo. Esta ve-
α/β-naftol, siguiendo la liberación de la base locidad es proporcional a la velocidad de hidró-
alcohólica por métodos espectrofotométricos. lisis enzimática de los enlaces éster del sustrato
Deben considerarse los distintos coeficientes y, por tanto, su medición permite determinar la
de extinción del p-nitrofenol a diferentes va- actividad de la enzima. La técnica de pH-stat se
lores de pH, la ausencia de absorbancia a pH ha empleado para cuantificar la actividad lipasa
ácido, y la ocurrencia de hidrólisis espontánea en plantas, suero, plasma y secreción duodenal.
a pH básico (De Caro et al., 1986; Gupta et al., El ensayo presenta un límite de detección en
2003). el orden de 0,1 µmol/min y solo puede desa-
rrollarse en un intervalo restringido de valores
Se han desarrollado numerosos ensayos
de pH, los que deben igualar o exceder el valor
para cuantificar la actividad hidrolítica de las
aparente de pKa de los ácidos grasos liberados,
lipasas en distintas muestras biológicas. Éstos
ya que éstos deben encontrarse parcialmente
permiten monitorear tanto el consumo de los ionizados (Beisson et al., 2000).
sustratos como la liberación de los productos
en el tiempo (Beisson et al., 2000). La desapa- Otra forma de medir la liberación de pro-
rición de los sustratos puede seguirse por ne- tones durante el avance de la reacción es me-
felometría o turbidimetría (von Tigerstrom y diante el empleo de indicadores coloreados,

132 Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XII No. 1 Julio 2010 124-140
cuyos espectros de absorción cambian con la Inmovilización
variación del pH. Estos métodos son poco
específicos y pueden detectar cualquier enzi- Las ventajas derivadas de la inmoviliza-
ma que acidifique el medio (Lobo de Araújo y ción de enzimas también son aplicables a las
Radvanyi, 1987). También es posible medir di- lipasas. Debido a la hidrofobicidad marcada
rectamente la disminución en el pH, pero esta que presentan los sustratos naturales de estas
variante es muy poco sensible y los cambios de enzimas, las mezclas de reacción en las que
pH pueden quedar enmascarados por la acción ellas operan deben contener un solvente orgá-
del tampón (Tan y Tan, 1988). nico o un agente emulsificante apropiados, que
traen consigo la ruptura de la homogeneidad
La cuantificación de los ácidos grasos del medio. Bajo estas condiciones, es deseable
liberados durante el transcurso de la reacción que la lipasa constituya una fase independiente
se ha abordado utilizando métodos colorimé- dentro del sistema de reacción, a fin de pre-
tricos que apelan a reactivos cromogénicos venir la contaminación de los productos con
cuyas absorbancias varían al interactuar con cierto nivel de actividad enzimática residual.
estas moléculas. Para garantizar una señal Esta aspiración tecnológica puede alcanzarse
de fondo lo más baja posible, los triacilgli- con la inmovilización, la que además extiende
céridos empleados como sustratos no de- el tiempo de vida útil del reactor (Balcão et al.,
ben contener cantidades elevadas de ácidos 1996; Knežević et al., 2004). Se ha desarrollado
grasos libres acompañantes. También se han una variedad amplia de protocolos de inmovili-
desarrollado ensayos fluorimétricos (Knotz zación para las lipasas (tabla 4).
et al., 2006), basados en la interacción entre
los ácidos grasos liberados y determinados
fluoróforos. Estos métodos son muy sensi- Inmovilización por adsorción
bles y costosos. La cromatografía en placa interfacial
fina permite cuantificar los ácidos grasos li- Uno de los protocolos de inmoviliza-
berados mediante técnicas densitométricas o ción más difundidos para las lipasas es la ad-
autorradiográficas. Este método es disconti-
sorción selectiva sobre soportes con cierto
nuo y consume mucho tiempo. La separación
grado de hidrofobicidad (Fernández-Lafuen-
entre el sustrato y los productos radiactivos
te et al., 1998). Según la propuesta de Bastida
también puede realizarse mediante HPLC,
et al. (1998), los soportes hidrofóbicos mime-
centrifugación o extracción con solventes.
tizan las interfaces formadas por los sustra-
El ensayo radioisotópico es muy específico y
tos naturales de las lipasas, por lo que estas
sensible, y su límite de detección es del orden
enzimas se adsorben fuertemente sobre ellos
de los picomoles. Su inconveniente principal
en una forma abierta e hiperactivada, involu-
radica en el empleo de triacilglicéridos sin-
crando la zona de contacto lipídico (Okkels et
téticos marcados radiactivamente (Beisson et
al., 1996). Esta interacción no es un efecto de
al., 2000).
asociaciones hidrofóbicas, ya que se produce
Esta variedad de ensayos enzimáticos pro- a fuerzas iónicas bajas (Bastida et al., 1998;
porciona amplias posibilidades al investigador Fernández-Lafuente et al., 1998; Sabuquillo
en este campo, pero al mismo tiempo dificulta et al., 1998; Snellman et al., 2002) y las lipasas
la comparación entre los resultados obtenidos son proteínas muy hidrofílicas (Fernández-
en distintos laboratorios mediante el empleo Lafuente et al., 1998). Por tanto, este es un
de métodos diferentes. Esto se debe a que las mecanismo de adsorción interfacial, basado
condiciones del ensayo influyen sobre la veloci- en la activación interfacial y propio solo de
dad de la reacción catalizada enzimáticamente proteínas con actividad superficial como las
(Chávez et al., 1990). lipasas.

Lipasas: potencial para la adsorción interfacial y la biocatálisis 133

 Tabla 4. Algunos métodos de inmovilización empleados para las lipasas

Fuente Soporte Método Referencia

Candida cylindracea Alginato de sodio Atrapamiento Hertzberg et al. 1992

Celite, esferas de vidrio-
Páncreas porcino aminopropil, silanizado Adsorción física Martins et al., 1994
y con lavado ácido.
C. antarctica Resina acrílica Enlazamiento iónico Claon y Akoh, 1994
C. rugosa Polipropileno Adsorción fisica López et al., 2001
C. antarctica A y B, C.
Sulfato-dextrana-MANAE-
rugosa, Rhizomucor Enlazamiento iónico Fuentes et al., 2004
agarosa CL 4B
miehei, Rhyzopus oryzae
Esferas de criogel Markvicheva
Páncreas porcino Enlazamiento covalente
polivinil-alcohol et al., 2005
Arthrobacter sp. Materiales hidrofóbicos sol-gel Encapsulación Yang et al., 2009
Thermomyces lanuginosa Glutaraldehído Entrecruzamiento Gupta y Khare, 2009

Entre las bondades que presenta el método poder catalítico. La aplicación industrial de la
de inmovilización por adsorción interfacial pue- tecnología enzimática es particularmente inte-
den citarse la sencillez de la técnica, la ausencia de resante en procesos que requieren condiciones
reactivos caros y tóxicos, la capacidad para retener de reacción suaves, en términos de pH, tempe-
o incrementar la actividad específica (Malcata et ratura y presión, debido a la labilidad de la mez-
al., 1992; Palomo et al., 2004; Cunha et al., 2009), cla. Estas moléculas se requieren en cantidades
la potenciación de la estereoselectividad de la li- pequeñas, pueden distinguir entre grupos fun-
pasa (Bastida et al., 1998; Fernández-Lafuente et cionales de reactividad similar y son capaces de
al., 1998), y la posibilidad de recuperar el soporte, modificar un sustrato dado dentro de una mez-
debido a la reversibilidad parcial de las interaccio- cla compleja, llegando a discriminar incluso
nes (Balcão et al., 1996). entre dos isómeros ópticos en el caso de com-
puestos quirales. En la literatura especializada
Entre los soportes más utilizados para puede encontrarse abundante documentación
estos fines se encuentran aquellos basados en sobre el empleo de enzimas en la obtención de
la activación de la agarosa con grupos hidro- principios activos (Klibanov, 1990).
fóbicos como butilo, fenilo y octilo (Bastida
et al., 1998; Sabuquillo et al., 1998; Fernández- Las lipasas son enzimas con una aplica-
Lafuente et al., 1998; Cunha et al., 2009). La ción amplia en diferentes procesos industriales,
fortaleza de la adsorción de las lipasas sobre particularmente en sus formas inmovilizadas.
octyl-agarosa es de tal magnitud, que se requie- Ellas se emplean en la producción de detergen-
ren altas concentraciones de detergente, urea o tes y de saborizantes naturales (Pandey et al.,
guanidina para romper las interacciones (Fer- 1999), en la hidrólisis de aceites y grasas (Ta-
nández-Lafuente et al., 1998). ylor, 1996), en la producción de papel (Jaeger y
Reetz, 1998) y en la elaboración de cosméticos
(Benjamin y Pandey, 1998). Debido a su capa-
Aplicaciones biotecnológicas cidad de catalizar la síntesis de determinados
Las enzimas son catalizadores biológi- compuestos en medios orgánicos con activi-
cos extraordinariamente específicos y de gran dad de agua controlada (Dandavate et al., 2009;

134 Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XII No. 1 Julio 2010 124-140
Gupta y Khare, 2009), las lipasas se han em- Profundizar en las bondades y limitaciones de
pleado en la producción de intermediarios para estas enzimas como biocatalizadores, contribu-
la síntesis orgánica (Vaidya, 1996), así como de ye a la optimización de los procesos biotecno-
penicilinas (Savidge, 1984). lógicos en los que ellas participan y, por tanto,
a una mejor aplicación de las lipasas para la ob-
Las lipasas han sido utilizadas extensiva- tención de bioproductos de utilidad humana.
mente en la obtención de compuestos óptica-
mente puros (Yoshimura et al., 2002) y en la
resolución de mezclas racémicas (Kirchner et Referencias bibliográficas
al., 1985; Felluga et al., 2009), aprovechando sus Alam, M., Vance, D. E., Lehner, R. 2002. Structure-function
propiedades estereoespecíficas (Bornscheuer, analysis of human triacylglycerol hydrolase by site-di-
2002; Segura et al., 2004). Esta aplicación tie- rected mutagenesis: identification of the catalytic triad
ne un impacto considerable en la producción and a glycosylation site. Biochem 41 (21): 6679-87.
de fármacos más selectivos y efectivos, con Aloulou, A., Puccinelli, D., De Caro, A. M., Leblond, Y.,
efectos secundarios menores, y en la obten- Carrière, F. 2007. A comparative study on two fungal
ción de pesticidas con menor incidencia en el lipases from Thermomyces lanuginosus and Yarrowia
medio ambiente (Zarevúcka y Wimmer, 2008). lipolytica shows the combined effects of detergents
and pH on lipase adsorption and activity. Biochim
Esto se debe a que la actividad funcional de los Biophys Acta 1771 (12): 1446-56.
compuestos quirales es debida generalmente a
uno de los enantiómeros, mientras que el otro Aloulou, A., Rodríguez, J. A., Fernández, S., van Ooster-
es inocuo o perjudicial, y puede reducir la ac- hout, D., Puccinelli, D., Carrière, F. 2006. Exploring
the specific features of interfacial enzymology based
tividad del primero, provocar reacciones cola- on lipase studies. Biochim Biophys Acta 1761 (9):
terales indeseadas, o simplemente aportar una 995-1013.
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con su presencia en la mezcla (Ariens, 1984). Alston, M. J., Freedman, R. B. 2001. A comparison of li-
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Conclusiones
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Las lipasas son enzimas extraordinaria-
ya, S. 2001. Ca2+-induced folding of a family I.3 lipase
mente versátiles que han recibido considerable with repetitive Ca2+ binding motifs at the C-terminus.
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tres décadas. Esto se debe a las peculiares pro-
Ariens, E. J. 1984. Stereochemistry, a basis for sophisticated
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Lipasas: potencial para la adsorción interfacial y la biocatálisis 135

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