Guias Laboratorios Microbiología General - Biología

Departamento de Biología asignatura Microbiología
General
UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA
MICROBIOLOGIA GENERAL
PRACTICAS DE LABORATORIO
ALEXANDER FRANCISCO PEREZ CORDERO

Ph.D en Microbiología, posdoctorado en Transcriptómica
microbiana.
Sincelejo-Sucre
2021
General
INDICE
Pág.
PREFACIO……………………………………………………………………………3
BIOSEGURIDAD Y ESTERILIZACIÓN EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA.………………………………………………………………….14
ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS EN DIFERENTES

AMBIENTES…………………………………………………………………………20
PREPARACIONES MICROSCÓPICAS EN FRESCO………………………….23
PREPARACIONES MICROSCÓPICAS FIJAS: COLORACIÓN SIMPLE…….26
PREPARACIONES MICROSCÓPICAS. TINCIÓN DIFERENCIAL: TINCIÓN DE

GRAM…………………………………………………………………………………29
COLORACION DE CAPSULAS BACTERIANAS………………………………..32
COLORACIÓN DE ESPOROS BACTERIANOS…………………………………34
PREPARACION Y ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVOS…………..38
AISLAMIENTO Y CONTEO DE MICROORGANISMO EN CULTURAS PURAS

………………………………………………………………………………………….43
ESTUDIO DE LAS CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DE LOS

MICROORGANISMOS………………………………………………………………48
MICROBIOLOGIA DEL AGUA Y DE ALIMEMENTO

...............................................................................................…………………...54
ANTIBIOGRAMA……………………………………………………………………..57
AISLAMIENTO, PREPARACIÓN Y OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE

HONGOS……………………………………………………………………………..61
DESTRUCCIÓN, SUPRESION E INHIBICIÓN DE LOS

MICROORGANISMOS………………………………………………………………65
GENETICA MICROBIANA…………………………………………………………..67
ALTERACIONES FENOTÍPICAS Y GENOTÍPICAS……………………………. 70
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE BACTERIAS………………………………86
2
General
PREFACIO
El manual de microbiología general fue preparado con el propósito de

brindarles a los estudiantes que cursan esta disciplina en la Universidad de
Sucre, las técnicas microbiológicas básicas de aislamiento, conservación e
identificación de microorganismos utilizados en investigación en el campo de la
medicina (humana, animal y vegetal) y biotecnología. Estas técnicas incluyen
observaciones microscópicas, aislamiento en medios sintéticos, in vitro,
esterilización y prácticas de asepsia e identificación, como también estudios
preliminares sobre aspectos ecológicos, fisiológicos y genéticos.
El estudiante trabajará con microorganismos (patógenos y no patógenos) de

importancia en las áreas de interés, razón por la cual deberá conocer las
normas básicas para el trabajo en el laboratorio en microbiología. El trabajo en
el laboratorio de microbiología es, como en la mayoría de las otras secciones
del Laboratorio Clínico, un trabajo de grupo. La actitud ante las practicas
seguras de cada uno de los integrantes del equipo, determinan su propia
seguridad, así como la de sus compañeros y la de la colectividad del
Laboratorio. Por otra parte, el equipamiento y el diseño del Laboratorio de
Microbiología es parte fundamental en el esfuerzo de protección de
trabajadores en el ejercicio de sus labores. También en éste contexto un grupo
de profesionales ha elaborado un protocolo de normas básicas en la
construcción de laboratorios biológicos. Sin embargo, las características
especiales del trabajo en microbiología, hacen imperante un Manual que sirva
de guía a los microbiólogos en su trabajo diario. La formación es pues clave en
la eficacia de los programas de seguridad y ésta debe ser facilitada a todas las
personas que están expuestas a los riesgos del laboratorio.
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General
LABORATORIO 1. BIOSEGURIDAD Y ESTERILIZACIÓN EN EL

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA.
Objetivos
• Conocer los aspectos básicos de bioseguridad y reglas generales de
trabajo para el desarrollo de actividades en el laboratorio de
microbiología.
• Examinar las metodologías existentes para la desinfección de superficies
e implementos del laboratorio.
• Aplicar algunos de métodos utilizados para la esterilización de medios de
cultivo, materiales y accesorios utilizados en el laboratorio de
Microbiología.
Introducción
Bioseguridad ha sido definida por el ministerio de Protección Social como el

conjunto de medidas y normas preventivas, destinadas a mantener el control
de factores de riesgo laborales procedentes de agentes biológicos, físicos o
químicos, logrando la prevención de impactos nocivos frente a riesgos propios
de su actividad diaria, asegurando que el desarrollo o producto final de dichos
procedimientos no atenten contra la seguridad de los trabajadores de la salud,
pacientes, visitantes y el medio ambiente. Esta definición debe extenderse a los
estudiantes que manipulen material biológico, físicos o químicos durante sus
prácticas de clase ya que el riesgo a que están expuestos es el mismo del
personal que trabaja en laboratorio de forma rutinaria.
Durante el trabajo diario en microbiología, se dan situaciones de potenciales

riesgos que varían según el agente infeccioso y los procedimientos utilizados.
Las Normas de Bioseguridad pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo
inherente a la manipulación de material peligroso. El trabajo en el laboratorio de
microbiología es, como en la mayoría de las otras secciones del Laboratorio
Clínico, un trabajo de grupo. La actitud ante las practicas seguras de cada uno
de los integrantes del equipo, determinan su propia seguridad, así como la de
sus compañeros y la de la colectividad del Laboratorio. Por otra parte, el
equipamiento y el diseño del Laboratorio de Microbiología es parte fundamental
en el esfuerzo de protección de trabajadores en el ejercicio de sus labores.
También en éste contexto un grupo de profesionales ha elaborado un protocolo
de normas básicas en la construcción de laboratorios biológicos.
Sin embargo, las características especiales del trabajo en microbiología, hacen
imperante un manual que sirva de guía a los microbiólogos en su trabajo diario.
La formación es pues clave en la eficacia de los programas de seguridad y ésta
debe ser facilitada a todas las personas que están expuestas a los riesgos del
laboratorio. Un programa de seguridad gestionado por profesionales bien
entrenados, con un alto grado de participación por parte de los trabajadores,
puede llevar no sólo a una disminución del número de lesiones y
enfermedades, sino también a un incremento de la satisfacción del trabajador y
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General
de su productividad. El propósito de este manual es describir la metodología a

seguir en un programa de Bioseguridad en microbiología, tal que sea una guía
para el trabajo seguro en el laboratorio que envuelve microorganismos
potencialmente peligrosos.
OBJETIVOS DE LA BIOSEGURIDAD DURANTE LAS PRÁCTICAS EN EL

LABORATORIO.
• Los estudiantes deben conocer los principios básicos de la bioseguridad

en los laboratorios.
• Aplicar todas aquellas acciones que conduzcan a la prevención, control,
reducción y eliminación de los factores de riesgos causados por agentes
biológicos, físicos y químicos.
• Reducir al máximo la posibilidad de contaminación y desimanación de
agentes biológicos.
NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA:
La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de

microorganismo y la manipulación a la que es sometido. Por ello es básico:
1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el

laboratorio.
2. Conocer la metodología de trabajo del laboratorio.
3. Conocer el equipamiento del laboratorio.
4. Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia.
5. Conocer las leyes relacionadas con la seguridad biológica.
6. Respetar y hacer cumplir todo lo anterior.
Para que se produzca un accidente por agente biológico deben concurrir
básicamente cuatro elementos:
a. Un huésped susceptible
b. Un agente infeccioso
c. Una concentración suficiente de éste
d. Una ruta de transmisión apropiada.
De todos ellos, el que mejor se puede controlar en el laboratorio es la ruta de

transmisión.
Las rutas de transmisión más comunes en el laboratorio son la aérea y la
inoculación directa, muy por encima de todas las demás, aunque la oral, la
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General
percutánea y el contacto directo con la piel o las mucosas también son

posibles.
Siendo imposible determinar a ciencia cierta si cualquier material biológico está
contaminado con microorganismos del grupo 2 ó 3, ciertas muestras
(respiratorias, etc.) en las que sea posible que exista un microorganismo del
grupo 3 deben manipularse rutinariamente en las Cabinas de Seguridad
Biológica (CSB).
CLASIFICACIÓN DE LOS AGENTES BIOLÓGICOS POR GRUPO DE

RIESGO:
1. Riesgo inocuo. Se refiere a aquél que resulta poco probable que cause una
enfermedad en el hombre.
2. Agente biológico del grupo 1. Es aquél que puede causar una enfermedad
en el hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco
probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis
o tratamiento eficaz. Ejemplos: Actinomyces sp, Bacteroides sp,
Enterobacterias, Shigella sp, Candida sp, Cryptococcus neoformans.
3. Agente biológico del grupo 3. Aquél que puede causar una enfermedad
grave en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, con
riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo frente a él
generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Ejemplos: Mycobacterium
tuberculosis, M. bovis, Histoplasma capsulatum, Neisseria meningitidis ,
Coccidioides inmitis, Chlamydia trachomatis.
4. Agente biológico del grupo 2.
5. Agente biológico del grupo 4. Se refiere a aquél que causando una

enfermedad grave en el hombre supone un serio peligro para los trabajadores,
con muchas probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que
exista generalmente frente a él profilaxis o tratamiento eficaz. Ejemplos: Virus
del Ébola.
6. Desechos con riesgo biológico. Se caracterizan por albergar

microorganismos patógenos o sustancias tóxicas, las cuales inciden en el
proceso salud – enfermedad al entrar en contacto con ellos, tanto en las
personas y medio ambiente. Se clasifican en tres (3) grupos: infectantes, no
infectantes y tóxicos.
7. Desechos infectantes. Son aquellos que sirven como fuente de infección.

Transportan agentes infecciosos ocasionando enfermedad a sujetos
susceptibles en el momento de entrar en contacto con ellos. Estos desechos
van en BOLSA ROJA, su destino final es la inactivación del germen por
métodos fisicoquímicos y/o incineración. Estos desechos, según sus
características físicas se clasifican en: desechos sólidos y líquidos.
6
General
8. Desechos sólidos: son aquellos que se generan en gran cantidad en las

instituciones de salud y debido a sus características, composición y origen,
requieren de manejos específicos para evitar propagación de infecciones,
proliferación de insectos y roedores, malos olores y contaminación ambiental.
Los desechos sólidos contaminados con sangre, semen o secreciones
vaginales tales como grasas, algodón, elementos corto punzantes, jeringas,
residuos anatomopatológicos y en general materiales absorbentes, deberán
colocarse en bolsas de color rojo impermeable, impregnado de Cloro a una
solución de 1:10 y posteriormente incinerarse.
9. Desechos líquidos. Como sangre entera, excreciones y secreciones (orina,

líquido amniótico y secreciones respiratorias) deberán depositarse con cuidado
en un lavabo o en un sumidero, conectado directamente con un sistema de
alcantarillado que tenga el tratamiento adecuado. Si el sistema no cuenta con
el tratamiento para desinfectar los líquidos potencialmente infectantes, se
deberá agregar algún desinfectante como Hipoclorito e Sodio a la solución
antes de tirarla al sumidero.
10. Desechos no infectantes. Son residuos que no tienen capacidad de

causar enfermedad, se clasifican según su destino final como reciclable y no
reciclable.
11. Desechos reciclables. son los residuos generalmente no biodegradables y

reutilizables provenientes de áreas sin ningún riesgo tóxico o biológico. Debido
a sus propiedades se pueden volver a utilizar como materia prima para otros
elementos. Estos deben ser separados en su sitio de origen, posteriormente
recolectados, almacenados y clasificados mientras se llega a su volumen para
su venta (su destino final es la venta a terceros). Entre otros tenemos el papel,
plástico, vidrio, placas de Rx, los metales, chatarra, etc.
13. Desechos no reciclables. son desechos que pueden ser o no

biodegradables, provienen de áreas de atención a pacientes y animales
infectados o sometidos a algún tipo de tratamiento como áreas de aislamiento,
laboratorios, salas de emergencia, sala de partos. Comprenden:
• Desechos ordinarios o basuras
• Residuos de alimentos
• Piezas anatomopatológicas
• Materiales hospitalarios desechables: tales como jeringas, agujas, tubos,
sondas, catéteres.
• Material de laboratorio y equipos que por su composición y uso
representan
• un riesgo biológico y/o tóxico.
• Su destino final es la incineración, alcantarillado o relleno sanitario.
12. Desechos tóxicos. Son aquellos que, por sus propiedades fisicoquímicas,
pueden producir daños en la salud de las personas, animales o en el medio
ambiente; por ejemplo: material radioactivo, sustancias químicas, pilas, etc.
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General
Para el uso en laboratorios de microbiología, existen diferentes moléculas que

pueden ser utilizadas con fines de desinfección (Tabla 1).
Tabla 1. Agentes desinfectantes comúnmente utilizados en microbiología y su

mecanismo de acción.
Agente Mecanismo de acción Aplicaciones

• Efecto letal por la
combinación rápida con • Purificación del agua.
proteínas. • Sanitización de
Halógenos: • Los clorados reaccionan utensilios en
Compuestos clorados: con el agua para formar industrias.
Hipoclorito de sodio ácido hipocloroso que es
(NaOCl) Microbicida. En superficies se
bactericida. recomienda una concentración
• Oxidante, corrosivo para de 1%, con variaciones entre
metales, de degradación 1g/L y 10g/L.
con el tiempo, se
recomienda almacenarlas
en frascos color ámbar,
guardar las soluciones en
frascos herméticamente
cerrados, protegidos de la
luz, el calor y la humedad;
preparar la cantidad para
uso.
• Altera la estructura de
Componentes proteínas e induce su Recomendación para la
fenólicos: Fenol precipitación. desinfección en solución
• Surfactante. al 5%.
• Alteración de la membrana
celular.
• Irritante y altamente tóxico.
Compuestos con base • No se tiene claro el - La tintura de Iodo es
en Iodo: Tintura de mecanismo de acción. Se empleada como
Iodo, solución presume que ocasiona la antiséptico.
Povidona-Iodo. precipitación de las - Efectivo contra esporas,
proteínas. hongos y virus.
• Agente activo de
superficies.
Ejercicio practico. ¿Cómo preparar la solución diaria de hipoclorito de sodio?.

Ej.: hipoclorito comercial 5% y se desea preparar 1L (1000mL), con una
concentración de 0.5% (5000 ppm).
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General
Aplique la fórmula: V CdxVd

Cc
Donde,
Vd: Volumen deseado; Cd: Concentración deseada; Cc: Concentración
conocida.
Entonces:
0.5%x1.000c.c = 100 cc
V
5%
Usted debe agregar 100 mL de hipoclorito de sodio comercial 5%, a 900mL de
agua, para un volumen final de 1L (1000mL), de una dilución al 0.5%.
Algunas dosis utilizadas para la desinfección de diferentes fuentes son: Agua
potable (0.2 ppm); desinfección de manos e instrumental de acero inoxidable
(50 ppm); camillas, mesas y camas (200 ppm); desinfección de pisos, mesones
en baldosín, ropa, útiles de aseo, material plástico y material contaminado
(ejemplo., V.I.H.) (500 ppm); y para la desinfección de material orgánico (5000
ppm).
MEDIDAS GENERALES
Las siguientes medidas son de obligado cumplimiento en cualquier área del
laboratorio:
• El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado.
• No deben entrar familiares ni amigos.
• El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las
normas de seguridad.
• Todas las áreas estarán debidamente marcadas con la señal de riesgo
biológico y su nivel de contención.
• Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la
adecuada contención biológica.
• Todas las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán diariamente
y siempre que se produzca un derrame. Los residuos y muestras
peligrosas que van a ser incinerados fuera del laboratorio deben ser
transportados en contenedores cerrados, resistentes e impermeables
siguiendo las normas específicas para cada tipo de residuo.
• El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado y no es aconsejable
utilizar los pasillos como almacén. Siempre debe quedar un espacio libre
no inferior an120 cm para poder evacuar el laboratorio en caso de
emergencia.
• El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se realizará de
tal manera que, en caso de caída, no se produzcan salpicaduras. Lo
recomendable es hacerlo en cajas herméticas o neveras transportables.
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General
Estas cajas o neveras deberán ser rígidas y resistentes a los golpes,

contar con materiales absorbentes en su interior y de fácil desinfección.
Se etiquetarán o identificarán de forma oportuna y no podrán ser
utilizadas para otros fines. Bajo ningún concepto se deben transportar
las muestras a mano.
• La ropa protectora, fácilmente ajustable y confortable, así como guantes,
gafas, etc. debe estar disponible en todo momento. La ropa protectora
de las áreas con nivel de contención 3 (batas) nunca debe ser usada
fuera del área de trabajo y si se quita debe de ser desechada
automáticamente en una bolsa de material contaminado. Jamás debe
volver a ser usada.
• Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la
piel con materiales potencialmente infecciosos. Con este fin deben
usarse guantes cuando se manipulen muestras o cultivos que contengan
posibles patógenos. Los guantes siempre serán desechados antes de
salir del área de trabajo. Jamás se saldrá de la misma con los guantes
puestos, ni con ellos se cogerá el teléfono, se tocarán las hojas de
examen, maniguetas de las puertas, etc.
• Tras quitarse los guantes, se realizará un lavado de manos.
• Se usarán gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de
salpicaduras y/o aerosoles.
• Se pondrá extremo cuidado en minimizar el riesgo de autoinoculación y
de generación de aerosoles.
• Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al
Supervisor y al jefe del Laboratorio y hacerse constar por escrito.
• Nadie podrá trabajar en el área de tuberculosis con una prueba de
Tuberculina negativa.
• Está rigurosamente prohibido pipetear con la boca. Se realizará pipeteo
automático con material adecuado y cada trabajador será instruido para
manejarlo debidamente.
• En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros
ya que el papel contaminado es de muy difícil esterilización.
• No deberán usarse lentes de contacto.
• El personal con el cabello largo debe llevarlo recogido.
• Comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos esta formalmente prohibido
en el área de trabajo del laboratorio, así como el almacenamiento de
comida o bebida.
• El personal debe lavarse las manos frecuentemente durante las
actividades rutinarias, tras acabar la jornada laboral y siempre antes de
abandonar el laboratorio (almorzar). Se usará un jabón antiséptico y el
secado se realizará con papel.
• Las heridas y cortes en las manos, si se han producido en el Laboratorio,
serán comunicados al responsable de la Sección correspondiente, así
como al Supervisor de Bioseguridad que lo registrará haciendo constar
todas las circunstancias. Las heridas y cortes deben ser
convenientemente vendados y después es imprescindible ponerse
guantes.
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General
DEFINICIONES A TENER ENCUENTA DURANTE LAS PRÁCTICAS DE

MICROBIOLOGIA.
Desinfección. Es el proceso mediante el cual se eliminan todos los

microorganismos patógenos en objetos inanimados, con excepción de las
esporas bacterianas y bacilos de la Tuberculosis, Clostridium Botulinium y
Clostridium tetani.
Desinfectante. Es el producto utilizado para destruir microorganismos en

objetos y superficies que intervienen en el cuidado del usuario.
Antiséptico. Es el compuesto químico utilizado externamente en la piel o

alrededor de las heridas para prevenir la colonización e infección. La necesidad
de desinfección depende del riesgo de infección del instrumento involucrado
con el uso en el cuidado del usuario.
Instrumentos críticos o de alto riesgo. son aquellos que entran en contacto

con tejidos estériles y sistema vascular. Ejemplo: instrumental quirúrgico,
catéteres venosos, urinarios, agujas, prótesis e implantes. Instrumentos
semicríticos, son aquellos que entran en contacto con membranas mucosas o
piel intacta. Ejemplo: endoscopios, termómetros, equipo de anestesia y terapia
respiratoria.
Instrumentos no críticos, son aquellos que entran en contacto con la piel

intacta. Ejemplo: ropa.
La desinfección puede hacerse mediante uso del calor (ebullición, hornos a

calor seco y autoclave o calor húmedo) o con agentes químicos tales como:
alcohol, hipoclorito de sodio, glutaraldehido y yodo. El más utilizado
actualmente es el hipoclorito de sodio.
Esterilización. Es la completa eliminación o destrucción de toda forma de vida

bacteriana, incluyendo las formas esporuladas. El vapor bajo presión, el calor
seco, el oxido de etileno y el glutaraldehído constituyen los elementos más
utilizados para la esterilización.
Si se aplican las PRECAUCIONES UNIVERSALES, el riesgo de contaminación

para los trabajadores de salud y/o estudiantes se reducirá notablemente, estas
minimizan el riesgo de transmisión de V.I.H. (SIDA), V.H.B. (Hepatitis B) y con
las siguientes:
PRECAUCIONES UNIVERSALES
1. Evitar contacto de piel o mucosa con sangre y otros líquidos de

precaución universal.
Esta precaución es necesaria tenerla en cuenta con TODOS los pacientes y no

solo aquellos que tengan diagnóstico de enfermedad, por lo tanto, se de
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General
implementar el uso del EQUIPO DE PROTECCIÓN PERSONAL (E.P.P.),

consiste en el empleo de precauciones de barreras con el objeto de prevenir la
exposición de la piel y mucosas a sangre o líquidos de cualquier paciente o
material potencialmente infeccioso.
El E.P.P. será considerado apropiado solamente si impide que la sangre y otro

material potencialmente infeccioso alcance y pase a través de las ropas, la piel,
los ojos, la boca, y otras membranas mucosas.
2. Lavado de manos.
Lávese las manos con agua y jabón:
a) Inmediatamente si se ha contaminado con sangre o alguno de los líquidos
corporales a los que se aplican las precauciones universales, o con objetos
potencialmente contaminados.
b) Entre clientes.
c) Inmediatamente después de quitarse los guantes, si no existen
instalaciones para lavarse las manos, utilice un antiséptico como alcohol.
3. Uso de guantes.
Use guantes para:
a) Tocar sangre y líquidos corporales que contengan sangre o superficies

contaminadas con sangre,
b) Al realizar venopunción,
c) Al realizar pinchazos en dedos o talón,
d) Al realizar limpieza de instrumentos y procedimientos de descontaminación.
4. Uso de mascarillas.
Con esta medida se previene la exposición de las membranas mucosas de la
boca, la nariz y los ojos a líquidos potencialmente infectados. Se indican en:
procedimientos en donde se manipulen sangre o líquidos corporales y/o
cuando exista la posibilidad de salpicaduras o expulsión de líquidos
contaminados con sangre.
5. Uso de delantales protectores.

Los delantales protectores deberán ser preferiblemente largos e impermeables.
Están indicados en todo procedimiento donde haya exposición a líquidos de
precaución universal, por ejemplo: drenaje de abscesos, atención de heridas,
partos y punción de cavidades, entre otros.
6. Manejo cuidadoso de elementos corto punzantes
Durante la manipulación, limpieza y desecho de elementos corto punzantes

(agujas, bisturís, otros), el personal de salud deberá tomar rigurosas
precauciones, para prevenir accidentes laborales. La mayoría de las punciones
accidentales ocurren al refundar las agujas después de usarlas, o como
resultados de desecharlas inadecuadamente (por ejemplo, en bolsas de
basura).
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General
Recomendaciones:
1. Desechar las agujas e instrumentos cortantes una vez utilizados, en

recipientes de paredes duras imperforables, los cuales deben estar situados lo
más cerca al sitio de trabajo.
2. Si no hay recolector, debe usarse un recipiente rígido (riñonera) para
trasladar el material corto punzante hasta el sitio donde se desecha.
3. No desechar elementos corto punzantes en bolsas de basura o cajas que
no sean resistentes a punciones.
4. Evitar tapar, doblar o quebrar agujas, láminas de bisturí y otros elementos
corto punzantes una vez utilizados.
5. La aguja NO debe ser tocada con las manos para retirarla de la jeringa,
doblarla o desecharla. De igual manera no deben ser reencapsuladas para su
desecho, porque la mayoría de los accidentes ocurren durante esta maniobra.
6. Una vez lleno el recolector, se le agrega una solución de Hipoclorito de
Sodio al 0.5% durante 30 minutos para su inactivación, posteriormente se
derrama la solución en el lugar donde se lava el material, se sella el guardián,
se coloca en una bolsa roja para su recolección y posterior incineración. Nunca
se debe rebosar el límite señalado en el recolector.
7. Restricción de labores en trabajadores de la salud cuando el personal de
salud presente abrasiones, quemaduras, laceraciones, dermatitis o cualquier
solución de continuidad de la piel de manos y brazos, deberá mantener
cubierta la lesión para evitar el contacto directo con fluidos corporales y
manipulación de objetos contaminados, hasta que exista curación completa de
la herida.
8. Disponer de elementos o aparatos especiales que suplan la respiración boca
a boca.
9. Realizar correctamente el proceso de Limpieza, Desinfección y
Esterilización.
10. Aplicar periódicamente las vacunas a trabajadores con riesgo de infección.
11. Disponer desechos en medio seguros
Cuestionario
1. Que desinfectantes son empleados en caso de una desinfección.

2. De acuerdo a la OMS ¿Cómo se clasifican los laboratorios según su
nivel de bioseguridad? Explique.
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General
LABORATORIO 2. TÉCNICAS DE MICROSCOPIA Y USO CORRECTO DEL

MICROSCOPIO BINOCULAR COMPUESTO
OBJETIVOS.
• Reconocer cada una de las partes que componen el microscopio óptico

y la función que cumplen en el equipo.
• Desarrollar en los estudiantes habilidades para la utilización correcta del
microscopio compuesto, enfatizando en las recomendaciones
necesarias para lograr un mayor tiempo de vida útil del equipo.
• Capacitar a los estudiantes en la observación correcta de las muestras
llevadas a microscopía y el reporte adecuado de las mismas.
INTRODUCCIÓN.
Para todos los investigadores, estudiantes y personal interesado en las

ciencias biológicas, es fundamental el conocimiento y manejo adecuado de
equipos de magnificación como los microscopios simples, compuestos,
binoculares, electrónicos y estereoscópicos; ya que estos equipos son parte
fundamental en el trabajo de campo y laboratorio de la Microbiología, Biología y
ciencias afines.
Los dos principios fundamentales de la microscopía son el poder de resolución

y el aumento o magnificación.
Resolución. La resolución del microscopio, es la capacidad que posee el

equipo de separar dos objetos adyacentes; es decir, es la capacidad que tiene
un microscopio de poder distinguir dos objetos que se encuentran muy unidos
uno al otro. Esto depende de varios aspectos como: La longitud de onda de luz
empleada, la densidad del medio circundante y las aperturas numéricas de los
lentes empleados en los objetivos y condensador. Esta apertura numérica,
hace referencia a la capacidad que tienen estos lentes para recibir el cono de
luz que pasa a través de la muestra y que es proveniente de la fuente.
La capacidad de aumento y resolución del microscopio depende del tipo de luz

que se emplea. Los microscopios de luz permiten la resolución de objetos de
tamaño mayor a la mitad de la longitud de onda de la luz utilizada, por tanto los
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General
microscopios ópticos que utilizan luz visible (La luz visible se encuentra desde
el violeta-390nm., al rojo-780nm.), de 500nm., no permiten resolver objetos
separados por distancias inferiores a 0,25µ (=250nm.); entre menor sea la
longitud de onda de luz empleada, mayor poder de resolución logra un
microscopio, entre mayor apertura numérica tenga este mayor poder de
resolución tendrá. El ojo humano, en comparación, sólo puede resolver puntos
separados por 25-100µ que en promedio daría resoluciones 250 veces
menores que el microscopio de óptico.
Componente óptico.
Componente Función
El papel de los oculares consiste en aumentar, a manera de lupa, la
imagen real proyectada por el objetivo tantas veces como indique el número
Oculares inscrito en ellos. Posee dos lentes: la que queda cerca del ojo se llama
ocular, la que queda en el extremo inferior se llama colectora. Hay
oculares de diferentes aumentos.
En uno de los oculares (generalmente el izquierdo) se encuentra un anillo de
Dioptrías, que sirve para ajustar la visión binocular.
Conjunto de lentes que producen imágenes de la muestra aumentadas 4, 10,
40 o 100 veces, según se indique en los mismos. Constan de dos lentes, la
que queda más cerca de la preparación se llama lente frontal y la que
queda en la parte superior se llama lente posterior. La denominación de
los objetivos se efectúa indicando su aumento propio, el cual se halla
Objetivos grabado en cada pieza.
Se distinguen dos clases de objetivos: Los secos y los de inmersión; al
primer tipo pertenecen los objetivos de aumento débil o mediano (5x,
10x, y 40x; donde x = aumentos). Los de inmersión son los de mayor
aumento (100) con mayor poder de resolución.
El poder de resolución está condicionado por la apertura numérica (AN). El
objetivo de inmersión tiene una distancia focal muy corta y una AN muy
limitada. Actúa a una
distancia de solo 1 a 2 mm del objetivo.
Componente mecánico.
Componente Función
Base Parte inferior en la cual se apoya el microscopio.
Brazo o Porción central de la cual se debe tomar el microscopio.

columna
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General
Parte donde se ubican los objetivos. Está construido de manera que un

Revólver
sistema rotatorio engrane automáticamente y se puedan rotar los objetivos
girando el revólver.
Placa cuadrada firmemente montada sobre el microscopio en forma horizontal.
Platina
Presenta un orificio central para permitir el paso de la luz y sobre la cual se
coloca la muestra que se va a observar.
Sistema de 2 pinzas ubicado encima de la platina, que sirve para desplazar la

Carro mecánico
muestra en el eje X y el eje Y (izquierda – derecha y adelante – atrás,
respectivamente), mediante una serie de perillas ubicadas en el costado de
la platina.
Cilindro que soporta los oculares en la parte superior y en la parte inferior se
ubica el revólver. El cabezal puede ser monocular o binocular. En estos
Tubo o cabezal
últimos, se encuentra una escala de ajuste interpupilar, que permite mover los
oculares hacia los lados y hacia
el centro, con el fin de ajustar a la distancia de los ojos de quien usa el
microscopio.
Componente Función
Tornillo Sirve para localizar la imagen, se acciona por medio de dos tornillos de
macrométrico cremallera que se encuentran a ambos lados del microscopio (Enfoque
grueso).
Se utiliza para dar el enfoque adecuado a la imagen localizada con el
Tornillo tornillo macrométrico. Lleva un tambor graduado que se desplaza sobre un
micrométrico Índice fijo que sirve para indicar su posición. Es de extraordinaria precisión y por
lo tanto muy delicado. Una vez enfocada la imagen con el lente de menor
aumento solo se debe usar el tomillo micrométrico para cambiar de aumentos
y dar la nitidez necesaria a la imagen (Enfoque fino).
Sistema de iluminación.
Componente Función
Es un sistema de lentes convergentes entre la fuente de luz y la platina.
Condensador Estos lentes concentran los rayos luminosos sobre la preparación
(condensador de abertura). El condensador de campo está ubicado en la
base del microscopio y su función es concentrar la luz proveniente de la
fuente hacia el condensador de abertura.
Es un disco de vidrio mate o de diferente color que se puede ubicar en la parte
Filtro inferior del diafragma y sobre un anillo transportable; este filtro permite
seleccionar la longitud de onda de luz a emplear.
Proporciona la luz necesaria para la observación de la muestra. Esta puede
Foco o
ser o bien espejos, Lámparas o bombillas. Si emplea espejos los cóncavos se
fuente
usan cuando la luz requerida es menor (con lentes de 4, 10 y 40) y el espejo
emisora de
plano para mayor iluminación.
luz
16
General
Está formado por un conjunto de láminas falciformes las cuales por medio
de una palanca lateral se pueden cerrar concéntricamente regulando la
cantidad de luz proveniente del condensador. El diafragma se estrecha en
preparaciones no coloreadas para aumentar la profundidad de enfoque, en
Diafragma tanto que en preparaciones coloreadas que absorben luz, tiene que dilatarse.
(Iris) Usualmente los rayos luminosos emergen de la cara superior del
condensador como un cono de luz con el vértice hacia abajo. Los rayos no
muy divergentes pasan a través del objetivo y cuanto más amplio es el alcance
de la apertura numérica más amplio es el ángulo que puede investigarse pues
mayor es el número de rayos divergentes que puede recoger.
PRECAUCIONES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO
1. Revisar el microscopio antes de usarlo. Si encuentra alguna anomalía,

informe inmediatamente al auxiliar de laboratorio o repórtalo en la hoja de
control.
2. Limpiar con gasa y liquido especial los objetivos y ocular antes y después de
usarlos.
3. Cuando utilice aceite de inmersión, limpie el objetivo de 100X con gasa y
alcohol.
4. No dejar nunca una placa montada en la platina del microscopio.
5. Dejar el microscopio con el objetivo de menor aumente que tenga este.
6. Colocar forros o plásticos de protección y dejarlos en el lugar designado.
Observaciones de microorganismos al microscopio óptico.
1. Coloque el microscopio sobre la mesa de trabajo.

2. Gire el revolver, encajando el objetivo de menor aumento (4x).
3. Coloque la lámina sobre la platina y ajústelas.
4. Encienda la luz del microscopio.
5. Regule la cantidad de luz utilizando el diafragma y bajando el condensador
(para organismos transparentes, disminuya la luminosidad, regulando la
abertura del diafragma y bajando el condensador).
6. Levante la platina, moviendo o el macrométrico hasta el punto máximo,
Observe por el ocular y utilizando el macrométrico, baje lentamente la platina
hasta que el material a examinar sea visualizado. Corrija la focalización,
utilizando solamente el micrométrico.
7. Coloque el objetivo de 10x y realice ajustes de focalización con el
micrométrico.
8. Observe el material, seleccione una determina área, coloque el objetivo 40x
y anote lo observado. Si el propósito es analizar bacteria, debe utilizar el
objetivo de 100X adicionando aceite de inmersión.
17
General
Partes de un microscopio óptico compuesto. La mayoría de los microscopios

compuestos tienen los mismos componentes básicos. Sin embargo, la disposición de
muchos de esos componentes varía según el modelo y la marca, así como, la posibilidad de
presentar otras piezas que son opcionales. La mayoría de microscopios actuales están
constituidos por tres componentes fundamentales: La óptica (conjunto de lentes), la
mecánica (soportes del sistema óptico, iluminación y otras funciones), y el sistema de
iluminación.
Aumento o Magnificación. El aumento o magnificación, es la capacidad que

posee un microscopio de amplificar una imagen resuelta en varias veces su
tamaño original; esta propiedad es independiente del poder de resolución de un
microscopio y está ligada con el poder de aumento de los lentes objetivos
(Figura 1) y oculares. El aumento de cualquier combinación de objetivo y ocular
es el producto de los aumentos de estos componentes por separado, es decir,
multiplicando el aumento de cada uno por el valor del otro. Este aumento es
expresado generalmente en diámetros.
4 2
3
6 11
6
7 13
13 7
9
8
12 15
14
10
16 10
17
18
General
Figura 1. Partes del microscopio binocular compuesto, donde se observan: 1. Oculares;

2. Escala de ajuste interpupilar; 3. Cabezal; 4. Anillo de dioptrías; 5. Revólver; 6. Objetivos; 7.
Platina; 8. Palanca del diafragma; 9. Condensador de abertura; 10. Condensador de campo; 11.
Columna; 12. Interruptor-perilla reguladora de voltaje; 13. Carro; 14. Perilla del carro; 15.
Tornillo macrométrico; 16. Tornillo micrométrico y 17. Fuente: laboratorio de
Investigaciones Microbiológicas de la Universidad de Sucre.
Metodología para la observación.
1. Revise el microscopio asignado. Localice y reconozca las partes

teniendo en cuenta el sistema óptico, el mecánico y el de iluminación.
2. Coloque el objetivo de menor aumento en posición de enfoque, ubique
adecuadamente la preparación sobre la platina y continué la observación
siguiendo la metodología descrita en “Pasos para la observación de muestras
bajo el microscopio compuesto”, descrita en esta guía.
3. Dentro de círculos, dibuje las observaciones realizadas de cada
preparación con cada uno de los objetivos, especificando el aumento obtenido
en cada uno de ellos.
4. Exponga verbalmente al tutor el procedimiento completo de observación
que acaba de realizar, relacionando cada parte del microscopio, así como, su
utilización adecuada.
5. Una vez concluidas las observaciones, siga las instrucciones dadas en
esta guía para desmontar las preparaciones y apagar el microscopio (este
equipo debe ser revisado por el responsable del laboratorio).
RECUERDE: Una vez haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación ya

no puede volver a enfocar el objetivo de 40x sobre el mismo campo, ya que
mancharía el lente con el aceite. En este caso es preferible emplear otro campo
de enfoque.
CUESTIONARIO.
1. Cuál es la utilidad del aceite de inmersión?

2. Qué otros tipos de microscopios (microscopía), se conocen? Mencione sus
diferencias.
Referencias
Ordóñez Smith Margaret. 2014. Guías Prácticas Para los Laboratorios de

Bacteriología Clínica. Edit. Médica Panamericana. 1 era edición, 266 p., ISBN:
9789588443478.
19
General
file:///C:/Users/Alexander%20P%C3%A9rez/Downloads/Dialnet-
PracticasDeMicrobiologia-100835.pdf
Struthers, Keith. 2018. MICROBIOLOGIA CLINICA 1 ED.

SKU: 9786074487046 Categoría: Libros de medicina, microbiología. PÁGINAS:
291, ISBN: 9786074487046.
https://repositorio.unal.edu.co/bitstream/handle/unal/8391/albertorojastrivino.20
11.pdf?sequence=1&isAllowed=y
LABORATORIO 3. ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS EN

DIFERENTES AMBIENTES.
I. INTRODUCCION.
Los microorganismos son encontrados en cualquier ambiente. El medio

acuático fue probablemente el ambiente original de los microorganismos, a
partir del cual se especializaron y colonizaron el ambiente terrestre. Los
microorganismos están presentes en las partículas de polvo, en el aire, en
desechos animales y de cosechas, en biotransmisores y reservorios, por lo
tanto, son posibles de entrar en el cuerpo humano y animal cada vez que
respiramos, siendo depositados en la piel, las fosas nasales y otros órganos.
Los microorganismos presentes en el aire contaminan alimentos, agua y suelo.
Los microorganismos en su mayoría son inocuos o beneficios, existiendo
relativamente pocos que causan perjuicios al hombre y animales. El
microbiólogo debe estar apto para estimular y optimizar el desarrollo de los
microorganismos benéficos y combatir aquellos que causan enfermedades en
animales o deterioro de los alimentos y del ambiente.
Una de la forma más sencilla para demostrar, en el laboratorio, la existencia de

microorganismos presentes en un ambiente determinado, es por medio de la
siembra y el aislamiento en medios naturales o artificiales.
En esta práctica el estudiante deberá conocer las normas básicas, los

materiales y equipos necesarios para el trabajo en el laboratorio de
microbiología. Tendrá la oportunidad de verificar la presencia de
20
General
microorganismos en diferentes ambientes, justificando en la práctica la

importancia de las normas propuestas.
II. OBJETIVOS.
• Reconocer materiales, equipos y normas del laboratorio de

Microbiología.
• Explorar la presencia de Microorganismos en diferentes ambientes.
• Demostrar la ubicuidad de los microorganismos utilizando medios de
cultivos sólidos y líquidos.
III. MATERIALES.
• Medios y soluciones: Agar nutritivo estéril, caldo nutritivo estéril.

• Equipos: Placas de Petri, tubos de ensayos y mecheros de Bunsen.
IV. PROCEDIMIENTO.
1. Para la exploración de la presencia de microorganismos en diferentes

ambientes, exponga la placa o tubo para la inoculación por superficie de la
siguiente manera:
Aire.
• Deje expuesto al aire, por 15 minutos, placas o tubos abiertos.
Agua.
• Tomar un 1 mL y colóquelo en un tubo con 9 mL de agua estéril

autoclavada.
• Agite por 2 minutos.
• Coloque 0,5 mL sobre la superficie de la placa o tubo con medio de cultivo.
Respiración.
• Inocule la placa o tubo, respirando directamente sobre ellos.
Microbiota de la mano
• Sin lavarse las manos, colocar los dedos sobre el agar nutritivo de una caja
de petri, haciendo círculos en su superficie.
Microbiota de la piel.
• Humedecer un escobillón en solución salina estéril.

• Frotar una pequeña zona de la parte inferior del brazo o de la cara.
• Aplicar sobre el medio de cultivo, formando estrías simples.
• Tapar adecuadamente la caja de petri.
21
General
Microbiota de las mucosas.
• Introducir un escobillón humedecido en solución salina estéril en las fosas

nasales o en la cavidad bucal.
• Aplicar sobre el medio de cultivo, formando estrías.
• Tapar adecuadamente la caja de petri.
Alimentos
• Colectar un 1 mL de leche cruda y colóquelo en un tubo con 9 mL de agua

estéril autoclavada.
• Agite por 2 minutos.
• Coloque 0,5 mL sobre la superficie de la placa o tubo con medio de cultivo.
Verificación de la utilidad del mechero de Bunsen.
• Próximo a la llama del mechero de Bunsen, abra por 60 segundos una

placa o tubo coN medio de cultivo estéril.
• Utilice como control de cualquier procedimiento una placa o tubo con medio
de cultivo estéril cerrado.
2. Una vez realizada la inoculación de las muestras, proceda de la siguiente

manera con las cajas de petri.
• Identifique las placas en la base de la tapa inferior y los tubos con el

número del grupo, ambiente, fecha y condiciones de inoculación.
• Incube las placas a 30 ºC por 72 horas. Incube las placas invertidas para
evitar la deshidratación del medio y evitar que el agua formada por
condensación caiga sobre la superficie del medio. Incube los tubos a la
misma temperatura.
• Después del periodo de incubación, anote la presencia y la diversidad
morfológica de las colonias microbianas que crecen sobre la superficie
del agar. Observe también la presencia de turbidez en el medio líquido
presentes en el tubo.
3. Las características morfológicas que se evalúan en las colonias que crecen

separadamente unas de otras en la superficie de los medios de cultivos son:
Forma: Circular, irregular, rizoide.
Tamaño: El tamaño de las colonias va desde muy pequeñas midiendo,

midiendo unas fracciones de milímetros de diámetro hasta muy grande
midiendo de 5 a 10 mm.
Cromogénesis o pigmentación: Una de las características más notables de

los cultivos, se observan en algunas especies productoras de pigmentos. Este
22
General
pigmento puede ser retenido dentro de la masa celular o excretado en el

medio.
Elevación: Las colonias pueden ser muy fina (aplanada) o gruesa (elevada);
cuando la colonia es elevada presenta diferentes grados de convexidad o
prominencia.
Superficie: Lisa, rugosa, brillante.
Bordes: Los bordes de las colonias presentan diferentes tipos de acuerdo a la

especie a estudiar así: Liso, ondulado, dentado, rizoide.
Consistencia: Cremosa, algodonosa, granulada.
Características ópticas: Opacas, transparentes, translúcida.
En medios de cultivos líquidos: Se observa el crecimiento microbiano con

base en la cantidad de crecimiento (escaso, moderado o abundante), la
distribución uniforme (turbiedad) en el medio, la formación de película
membranosa o lisa en la superficie de este o la formación de flóculos, anillos o
sedimentos.
V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.
MADIGAN; M., MARTINKO; J., PARKER; J. Biology of microorganisms Ninth

edition, Prentice Hall, New York. 2007. 991 p.
VI. RESULTADOS
Nombre…………………………………………………….grupo…………………..
Placas con agar nutritivo: Enumere, caracterice y dibuje las colonias que
crecen en la superficie de las placas en la tabla y espacios que se relacionan a
continuación.
23
General
Ensayo Mechero de Bunsen Control
Condiciones de inoculación utilizada:
Número de la color Forma Tamaño Superficie Consistencia Elevación

colonia
Tubos con caldo nutritivos. Esquematice el resultado obtenido en cada tubo.
Condiciones de inoculación utilizada:
Ensayo Mechero de Bunsen Control
24
General
VII. CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la utilidad del mechero de Bunsen en el laboratorio de

microbiología?
2. Con base en los resultados obtenidos en las placas de petri y las
observaciones hechas de colonias en los diferentes ambientes y en un
mismo ambiente, responda. ¿Qué ocurrió en los controles?.¿ Justifique los
resultados?.
Laboratorio 4. PREPARACIONES MICROSCÓPICAS EN FRESCO
I. INTRODUCCION
Preparaciones microscópicas comprenden las técnicas por medio de la

cuales especies microbianas son colocadas sobre laminas, para ser
observadas al microscopio. Dos técnicas generales permiten el examen
microscópico. Una es la suspensión de microorganismos en medios
líquidos, donde pueden ser examinados vivos, con la ayuda o no de
colorantes vitales. En la otra, las células microbianas son fijadas por medio
del calor y coloreadas con colorantes químicos específicos. La visualización
microscópica en fresco de microorganismos es difícil, debido al tamaño
reducido de estos y al índice de refracción, que es próximo al del agua, lo
que se torna prácticamente incolora cuando son suspendidos en medio
acuosos. A pesar de la dificultad de visualización, las preparaciones
microscópicas en fresco, son útiles para observar viabilidad y actividades
celulares como motilidad (movimiento) y fisión binaria (reproducción) y
también para observar tamaño y formas naturales de las células
microbianas, debido a que preparaciones fijas provocan distorsiones en la
morfología de las células, por la exposición al calor y al efecto de las
substancias químicas durante el proceso de coloración. En esta práctica,
serán realizadas preparaciones en fresco de microorganismos: bacterias,
hongos, levaduras y microalgas. Será observada tamaño de células
bacterias con relación a otros microorganismos como hongos, levaduras y
microalgas, similarmente será observada la diversidad de las células
25
General
microbianas en lo referente al tamaño y la forma, como también la

presencia o no de movimiento.
II. OBJETIVOS
• Preparar láminas en fresco para observaciones microscópicas de

muestras de bacterias, hongos, levaduras y microalgas.
• Capacitar en el manejo adecuado del microscopio óptico.
III. MATERIALES
• Microorganismos: Suspensión de levaduras y bacterias, muestras de

agua estancada.
• Medios y soluciones: Solución de azul de metileno, azul de lactofenol.
• Equipos y utensilios: Microscopio óptico compuesto, portaobjeto,
cubreobjetos y pipetas de Pasteur.
IV. PROCEDIMIENTO
1. Coloque sobre un portaobjeto limpio y estéril una gota del material a

examinar (bacterias, hongos, levaduras y microalgas) y cubra con una
laminilla, evitando la formación de burbujas.
2. Focalice de acuerdo al procedimiento descrito en Observación de
microorganismos al microscopio óptico.
3. Localice campos ópticos donde los organismos presenten movilidad.
4. Observe las diferencias entre los microorganismos focalizado y
dibújelos, considerando forma, tamaño y color.
5. Termina las observaciones, desligue la luz; gire el revolver para dejar el
objetivo de menor aumento, baje la platina y retire la lámina.
6. Repita el mismo procedimiento, pero esta vez antes de colocar la gota
de suspensión de microorganismos, adicione una gota de colorante
básico (azul de metileno o azul de lactofenol) y prosiga como el paso 1
hasta 5.
7. Después de las observaciones descarte los portaobjetos y cubreobjetos
en bandejas con detergentes y desinfectante, colocadas en el
laboratorio.
V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
MADIGAN; M., MARTINKO; J., PARKER; J. Biology of microorganisms Ninth

edition, Prentice Hall, New York. 2008. 991 p.
VI. RESULTADOS
26
General
Preparaciones en fresco: Diseñe los campos observados, haciendo distinción

entre las diversas muestras de microorganismos, con relación a la forma,
tamaño y movilidad en preparaciones en fresco y con colorante y registre los
resultados en los siguientes diagramas y tabla.
Bacterias Hongos Levaduras Microalgas
Identificación de Aumento(objetivo) Movilidad

células
VII. CUESTIONARIO
1. Por qué algunas células de levaduras, bacterias, hongos y microalgas, se

colorean de azul y otras permanecen incoloras, ¿cuándo utilizamos el
colorante de azul de metileno?
2. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la observación de láminas
preparadas en fresco?
LABORATORIO 5. PREPARACIONES MICROSCÓPICAS FIJAS:

COLORACIÓN SIMPLE
I. INTRODUCCION
27
General
Preparaciones microscópicas fijas y coloreadas son de gran utilidad para

visualizar los microorganismos y diferenciarlos en grupos, para su identificación
o estudio de sus propiedades. Un colorante es generalmente una sal, en que
uno de los iones es un cromóforo. Si el cromóforo es positivo, el colorante es
básico o catiónico, como es el caso del azul de metileno o la fascina. Se el
cromóforo es negativo, el colorante es ácido, como el ácido pícrico. Los
colorantes básicos son útiles para colorear bacterias, por que los ácidos
nucleicos y algunos componentes de la pared celular presentan cargas
negativas y atraen los cromóforos catiónicos. Los colorantes básicos más
comúnmente utilizados es el azul de metileno, cristal violeta y la fascina.
En la técnica de coloración simple, las células microbianas son inicialmente

frotadas sobre una lámina, seguida de fijación por calor y finalmente coloreadas
con un único colorante. La técnica es útil para observar morfología y formas de
agrupación de células microbianas. Algunas estructuras internas de las células
microbianas pueden ser observadas, como granos metacromáticos y de
glicógenos. En esta práctica será realizada técnica de colocación simple para
comparar forma y agrupación de diferentes células microbianas.
II. OBJETIVOS
• Realizar preparaciones fijas y coloreadas de células bacterianas para

examen microscópico.
• Diferenciar microorganismo de acuerdo a forma y agrupación de sus
células.
III. MATERIALES
Soluciones: Fascina o safranina, cristal violeta, agua destilada.

Culturas microbianas: en medio sólido o líquido.
Equipos: Microscopio óptico, asas, láminas, mechero de Bunsen.
IV. PROCEDIMIENTO
Preparación:
1. Limpie un portaobjeto con alcohol al 70%, flaméalo en la llama y déjela

enfriar a temperatura ambiente;
2. Esterilice el asa de replicar en la llama;
3. Si las muestras son suspensiones bacterianas, transfiera una gota para el
centro del portaobjeto. Si se encuentran en medio sólido prepare una
suspensión colocando una gota de agua destilada o solución salina sobre el
portaobjeto y coloque una pequeña cantidad de la colonia, realice frontis
suavemente, haciendo movimientos circulares hasta obtener una capa
uniforme y fina de las células;
4. Fije el frotis, pasando tres veces el lado opuesto del frotis por la llama. Evite
el calentamiento excesivo para no quemar las estructuras;
28
General
5. Deje enfriar o secar al aire;

6. Inicie la coloración, utilizando las bandejas y soportes colocados en el
laboratorio. Coloque el portaobjeto sobre el soporte y cúbrala con fuscina por
30 segundos, o cristal violeta por un minuto;
7. Lave la preparación, utilizando frasco lavador;
8. Deje secar al aire;
9. Observe el material usando, secuencialmente los objetivos de 4X, 10X e
40X;
10. Adicione una gota de aceite de inmersión y visualice con el objetivo 100X,
11. Después de la observación descarte el material utilizado.
V. REFERENCIA BIBLIOGRAFIA
CAPUCHINO, J.G., SHERMAN, N. Microbiology a laboratory manual.

Benjamin/Cummings. Publishing Company, Inc p 458. 1987.
VI. RESULATADOS
Preparaciones fijas: De la técnica de coloración simple. Dibuje lo observado,

haciendo diferenciación entre forma y tipo de arreglos bacterianos.
Muestra
Muestra Forma Tipo de Objetivo

arreglo
29
General
VII. CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es el objetivo de fijar las muestras al calor?

2. Compare la técnica de preparaciones microscópicas en fresco con
preparaciones fijas y coloreadas. ¿Cite ventajas y desventajas de cada
una?
3. ¿Porque los colorantes básicos son ideales para colorear células
bacterianas?
4. ¿Qué aplicación tiene para la microbiología el concepto de asepsia y cuál
es su importancia en medicina?
30
General
6. PREPARACIONES MICROSCÓPICAS- TINCIÓN DIFERENCIAL:

TINCIÓN DE GRAM.
I. INTRODUCCIÓN.
Las tinciones diferenciales se caracterizan porque no tiñen de forma

homogéneas a todos los tipos de células. La tinción de Gram es una de las
más importantes en microbiología por que permiten diferenciar a las
bacterias en gram-positivas y gram-negativas, con relación a la composición
química de la pared celular.
En esta coloración los reactivos actúan de la siguiente manera: El cristal

violeta colorante primario tiñen a las bacterias y la solución de lugol hace de
mordiente o fijador del color y las bacterias se observan teñidas de un azul
más fuerte. El alcohol acetona, actuará como decolorante al eliminar de la
pared celular de las gram-negativas la capa lipídica, permitiendo que el
colorante se libere. Las gram-positivas no se ven afectadas por la acción del
decolorante. En consecuencia, las bacterias gram-negativas no se observan
y las gram-positivas retendrán el color. La safranina, colorante secundario
tendrá la función de hacer el contraste al teñir las bacterias gram-negativas
decoloradas en el paso anterior.
II. OBJETIVO
Diferenciar las bacterias gram-negativas de las gram-positivas, utilizando la

técnica de tinción de Gram.
III. MATERIALES.
• Cultivos jóvenes de bactérias.

• Reactivos de Gram.
• Portaobjetos.
• Asa
• Microscópio.
• Mechero.
IV. PROCEDIMIENTO.
1. Preparar y fijar frotis bacteriano.

1. Agregar cristal violeta durante un minuto.
2. Lavar con agua, para eliminar el exceso de colorante.
3. Cubrir con lugol por un minuto y lavar con agua.
4. Cubrir el frotis con alcohol acetona, durante 30 segundos y lavar
rápidamente con agua.
5. Agregar el colorante de contraste durante un minuto.
6. Lavar con agua el exceso de colorante y dejar secar.
31
General
7. Observar al microscopio con los objetivos de 40x-100x.
Figura 3. Etapas de la técnica de tinción de Gram.
Figura 4. Morfología de bacterias
32
General
V. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA
MONTOYA, CAMPUZANO OLGA. Manual de Microbiología. Universidad de

Colombia, sede Medellín. 1999.
VI. RESULTADOS.
Dibuje las observaciones, anotando forma, arreglo y color predominante.
VI. CUESTIONARIO.
1. Porque la tinción de Gram es una técnica de uso común en microbiología?
2. Explique la razón porque algunas especies de bacterias optan por la

coloración roja o azul. ¿De ejemplo de otras técnicas de coloración diferencial,
de uso en microbiología y compárelas con la técnica de Gram?
3. Anote la importancia de cada uno de los reactivos utilizados en la tinción de

Gram.
33
General
LABORATORIO 7. COLORACION DE CAPSULAS BACTERIANAS
I. INTRODUCCION
La cápsula bacteriana localizada extracelularmente y no presentes en todas las

bacterias. Su composición química es muy variable y compleja, según el tipo de
bacteria puede estar constituida por péptidos, polisacáridos, polimetafosfatos,
lo que impide que se tiña con colorantes catiónicos. Para su observación se
requiere de técnica especial utilizando coloración de Antony y coloración
negativa. Para obtener una formación de cápsula bacteriana, es necesario
cultivarla en medio rico en carbohidratos.
II. OBJETIVO
• Visualizar cápsula bacteriana utilizando coloración negativa.

• Diferenciar bacterias capsuladas y no capsuladas.
III. MATERIALES
• Cultivos bacterianos
• Reactivos para coloración de cápsulas (sulfato de cobre, cristal violeta,
safranina)
• Mechero, asa, beakers.
IV. PROCEDIMIENTO
COLORACION DE ANTONY
1. Preparar un frontis bacteriano y dejarlo secar al aire

2. Agregar lentamente cristal violeta a temperatura de 34 oC por cuatro
minutos o sumergirla en una beakers por dos minutos.
3. Lavar la placa, sumergiéndola en una solución de sulfato de cobre a 20
%.
4. Secar la placa al aire en posición vertical
5. Observar al microscopio con 40x-100x.
COLORACION NEGATIVA
Se emplea un colorante ácido como la Nigrosina o tinta china
1. Colocar sobre la superficie de un portaobjeto limpio y desengrasado una

gota de agua
2. Tomar el inoculo bacteriano a analizar y mezclarlo con la gota de agua.
3. Agregar una gota de tinta china o nigrosina a la mezcla anterior.
4. Realizar un extendido, deslizando el borde de una porta objeto sobre el
portaobjeto que contiene la muestra.
34
General
5. Dejar secar la muestra y observar al microscopio con objetivos de 40x-

100x.
Figura 5. Observación de cápsula microbiana en microscopio (100x)

VI. RESULTADO
Diseñe un esquema de lo observado con relación a presencia de cápsula

bacteriana.
35
General
Presencia de cápsula Ausencia de cápsula
V. CUESTIONARIO
1. Qué es una cápsula y qué función cumple en una especie de bacteria.

2. Cuáles son los requerimientos químicos y físicos que requiere una
bacteria para la formación de la capsula.
3. Cuáles son los principales constituyentes químicos que poseen las
capsulas.
4. Liste ejemplo de géneros de bacterias formadoras de cápsulas y que
función cumplen estas bacterias en el ambiente
36
General
LABORATORIO 8. COLORACIÓN DE ESPORAS BACTERIANAS
I. INTRODUCCION
Algunas bacterias (Bacillus, Clostridium y Sporosarcina) producen en su interior

esporos o endosporas. Estas estructuras son muy resistentes al calor, la
desecación, la radiación, los ácidos, y los desinfectantes químicos. Los
producen algunas familias de bacilos Gram- positivos. El esporo se forma en la
célula vegetativa en ciertas condiciones como son la escasez de nutrientes. En
lugar de dividirse la célula, sufre una compleja serie de fenómenos que dan
lugar a la formación de la espora. Una espora puede permanecer en ese
estado durante muchos años, pero puede convertirse de nuevo en una célula
vegetativa y volver a multiplicarse, fenómeno denominado germinación de la
espora.
El descubrimiento de que hay bacterias que forman esporos fue de gran

importancia para la microbiología. El conocimiento de que existen estas formas
altamente termorresistentes fue esencial para el desarrollo de métodos
adecuados de esterilización de medicamentos, alimentos, medios de cultivo
microbiológicos, etc.
Los esporos son impermeables a los colorantes, entonces se pueden observar

como regiones no teñidas dentro de células que han sido coloreadas con
colorantes básicos como el azul de metileno. Existen además coloraciones
especiales para teñir los esporos. Si observamos una espora al microscopio
electrónico se ve que presenta numerosas capas. La capa más externa es una
delicada y delgada cubierta llamada exosporium. Le sigue la cubierta de la
espora, que está compuesta de una capa o más de una sustancia parecida a la
pared celular. Por debajo de la cubierta se encuentra la corteza y dentro de
ella, el núcleo o corazón que contiene la pared de la bacteria que dio origen al
esporo, la membrana citoplasmática y la región nuclear. Las esporas son ricas
en ácido dipicolínico e iones calcio y hay evidencias que esta asociación
cumple una función importante para conferir la excepcional resistencia al calor
de los esporos.
II. OBJETIVO
Distinguir una bacteria esporulada de una no esporulada.
III. MATERIALES
37
General
• Microorganismo: Cultivo de Bacillus cereus y Bacillus subtilis de 48 a

72 horas.
• Reactivos: Colorante verde malaquita, safranina, solución salina estéril.
• Equipos: Termostato.
VI. PROCEDIMIENTO
Método de Schearffer-Fulton.
1. Preparar y fijar frotis;

2. Cubrir con verde malaquita;
3. Flamear la muestra hasta que salgan los primeros vapores;
4. Repetir la operación durante 5 minutos;
5. Evitar que el verde malaquita no evapora ni ebulla;
6. Enfriar la preparación durante 5 minutos;
7. Lavar el exceso de colorante;
8. Agregar safranina durante un minuto;
9. Dejar secar la preparación;
10. Observar al microscopio con objetivo 40X – 100X.
Método Dorner modificado
1. Inocular una muestra en 0.5 mL de solución salina estéril;

2. Adicionar 0.5 mL de colorante verde malaquita y llevarlo a baño de
María a 100 oC durante 10 minutos;
3. Preparar y fijar frotis;
4. Lavar el exceso de colorante;
5. Adicionar safranina por un minuto;
6. Lavar el exceso de colorante:
7. Dejar secar la muestra;
8. Observar al microscopio con objetivo 40X – 100X.

VI. RESULTADO
Dibujar lo observado.
38
General
Bacteria con esporo Bacteria sin esporo
39
General
LABORATORIO 9. PREPARACION Y ESTERILIZACION DE MEDIOS DE

CULTIVOS
I. INTRODUCCION
El cultivo de microorganismos en el laboratorio requiere la formulación de

medios de cultivos y el establecimiento de condiciones que favorezca su
desarrollo fuera de su hábitat natural. Los medios de cultivos deben
proporcionar todos los elementos que componen a la célula (C, N, S, P, K,
entre otros.). Existen medios naturales como la sangre y leche y también
medios sintéticos con componentes químicos puros, orgánico e inorgánicos.
Los medios de cultivos difieren entre si según el origen, la composición química

y la consistencia. De acuerdo a la composición química los medios pueden ser.
Los Medios Básicos, se preparan generalmente con extracto de carne,

extracto de levaduras, peptonas, carbohidratos y trazas de sales. A partir de
estas bases se pueden preparar los otros tipos de medios por adición de
colorantes, proteínas, antibióticos, aminoácidos, etc.
Los medios Enriquecidos, proporcionan nutrientes especiales (cerebro.

Corazón, etc.), para aquellos microorganismos exigentes, incapaces de
sintetizar aminoácidos, vitaminas u otros elementos necesarios para su
metabolismo. Estos medios favorecen el crecimiento de determinadas
poblaciones microbianas.
Los medios Selectivos, contienen sustancias como antibióticos, ácidos o

bases que inhiben el desarrollo de algunas poblaciones microbianas y
favorecen el de otras.
Los medios Diferenciales, permiten distinguir microscópicamente

características morfológicas de las colonias formadas por diferentes
microorganismos, por contener agentes indicadores como colorantes y sales
biliares.
De acuerdo a la consistencia los medios de cultivos pueden ser líquidos,

usados en estudios de crecimiento, en fermentación y en la producción de
biomasa, los medios sólidos, útiles para el conteo y aislamiento de
microorganismos y medios semisólidos, empleados para la detención de
placa de lisis en cultivos de bacterias infectada por bacteriófago. Los medios
sólidos contienen agar, un polisacárido extraído de extractos microalgas
marinas, el cual funde a 96 oC y sodifica a 45 oC.
Los microorganismos difieren en cuanto las exigencias nutricionales, algunos

como los autotrofo, son capaces de crecer completamente minerales, y utilizan
40
General
el CO2 como fuente de carbono. Otros los heterótrofos, requieren compuestos

orgánicos como fuente de carbono.
Además de los requerimientos nutricionales. Los factores físicos interfieren en

el crecimiento microbiano como temperatura, presencia de oxígeno, luz y pH.
Cada microorganismo tiene su rango de temperaturas características.
La esterilización es el proceso por el cual se eliminan todas las formas de vivas

presenten en un medio material o ambiental. La esterilización puede ser
realizada por el calor por la radiación, por la filtración y por agentes químicos.
Estos procesos destruyen células microbianas en una progresión geométrica.
Cuanto menor es la población inicial, más rápida es la esterilización.
La relación tiempo/temperatura y volumen/arrea del material o medio a ser

esterilizado, como la eficiencia de penetración o difusión del agente letal del
agente, deben ser consideradas en la escogencia del proceso de esterilización.
II. OBJETIVOS
• Prepara medios de cultivos: Agar nutritivo y caldo nutritivo,

• Ejecutar esterilización en autoclave (calor húmedo) de los medios de
cultivos.
III. MATERIALES
Medios de cultivos, espátula, vidriería (probeta, beaker, erlenmeyer),

potenciómetro, autoclave.
IV. PROCEDIMIENTO
1. Pese separadamente cada uno de los componentes de los medios a

preparar para el volumen final indicado,
2. Disuelva cada componente en beakers, adicionando un pequeño
volumen de agua destilada y agite hasta disolver completamente,
3. Transfiera cada componente del medio a una probeta y complete con
agua destilada hasta el volumen señalado,
4. Ajuste el pH del medio el cual debe ser especifico para los
microorganismos a aislar,
5. Transfiera la mezcla para Erlenmeyer, tape y lleve a esterilizar. Los
medios líquidos se vierten directamente en tubos de ensayos con tapa.
La esterilización de los medios de cultivos debe hacerse en autoclave de la

siguiente manera.
1. Complete el volumen de agua de la autoclave.

2. Introduzca el material a ser esterilizados en autoclave.
3. Selle la autoclave de acuerdo a las recomendaciones del fabricante.
41
General
4. Inicie el calentamiento.
5. Abra la válvula de regulación.
6. Verifique en el manómetro, el aumento de la presión del autoclave.

Después de alcanzar 15 lbs/pulgadas2, comience a controlar el tiempo
de esterilización, el cual debe ser de 15 minutos.
7. Terminado el tiempo de esterilización, desligue el aparato y espere que
el autoclave enfríe hasta que el manómetro indique cero, momento en el
cual debe ser abierta la tapa del autoclave.
8. Coloque cada una de las partes que conforma una olla de autoclave en
la siguiente figura 6.
Figura 6. Autoclave
42
General

VI. RESULTADOS
Diseñe un flujograma de la práctica iniciando con la preparación del medio,

incluyendo esterilización y culmine con el vertido de los medios en placas de
petri.
VII. CUETIONARIO
1. Señale los componentes de los medios de cultivos: agar nutritivo y caldo

nutritivo.
2. Por que algunas veces, la esterilización de medios de cultivos por calor
sobre presión, en autoclave, no es adecuada para todos los materiales.
¿Cuál sería la alternativa para la esterilización de estos materiales?
43
General
LABORATORIO 10. AISLAMIENTO Y CONTEO DE MICROORGANISMO EN

CULTURAS PURAS
I. INTRODUCCION
El aislamiento de microorganismos consiste en separar una especie microbiana

de otra a partir de una muestra dentro una población mixta. Una porción
representativa de la muestra es transferida, con asepsia, para un medio de
cultivo sólido contenidos en placas de petri. Las células microbianas presentes
en la muestra, son inmovilizadas en el gel de agar conteniendo nutrientes en
donde se multiplican, formando agregados de células idénticas llamadas
colonias. Este método asume que una colonia es proveniente de una célula
microbiana. Cuando una colonia aislada es transferida para un nuevo medio,
las células se multiplican libres de otros microorganismos, constituyéndose en
una colonia pura, si la colonia proviene de una célula única, o cultura axénica
se proviene de más de una colonia.
Los estudios microbiológicos y sus aplicaciones son realizados con poblaciones

de los microorganismos y no con una única célula. El crecimiento microbiano
es medido por el aumento poblacional, pudiéndose expresar en términos de
número de células, masa celular o cualquiera propiedad que aumente
linealmente con la masa de célula. Existen diversos métodos para evaluar el
crecimiento microbiano, y la selección de ellos depende de la muestra y del
objetivo de la evaluación. En este laboratorio, serán realizados procedimientos
para la obtención de culturas puras, por el método de agotamiento de l inóculo
en medio sólido, utilizando estrías simples y compuestas. Adicionalmente, será
realizada la estimación de la densidad de la célula de una muestra por el
conteo de colonias en placas, utilizando diluciones seriadas y el plaqueo. El
resultado será expresado como UFC (unidades formadoras de colonias) por
mililitro de la muestra.
II. OBJETIVO
• Demostrar y utilizar los métodos más comunes para la obtención de

culturas puras.
• Entrenar y ejecutar estrías simples y compuestas para la obtención de
culturas puras.
• Ejecutar siembras en placas, con el propósito de contar
microorganismos presentes en una muestra determinada.
III. MATERIALES
• Medios y soluciones: Placas de petri con medios sólidos (plate count),

agua peptona o solución salina (0,85 %) distribuidos en tubos (9 mL por
tubo).
44
General
• Muestras: muestras de leche, queso, agua, suelo etc.
IV. PROCEDIMEINTO
Aislamiento de cultura pura- estrías en placas
1. Esterilice el asa bacteriológica.

2. Transfiera asépticamente la suspensión o colonia bacteriana presente
en el asa bacteriológica para la superficie del medio de cultivo sólido,
distribúyalas utilizando estrías simples y compuestas.
2.1. Estrías simples.
Con el asa bacteriológica, distribuya el inoculo en la parte superior de la placa,

en forma de zig-zag bien próximos, deslizando el asa suavemente sobre el
medio de cultivo aprovechando al máximo la superficie del medio.
Figura 7. Siembra en estría simple
2.2. Siembra en cajas de petri por agotamiento o estrías cruzadas
1. Divida la placa en cuatro cuadrantes.

2. Distribuya el inoculó en el primer cuadrante, haciendo movimientos en
zig-zag.
3. Flamee nuevamente el asa bacteriológica y enfríelo sobre la superficie
del agar. Gire la placa 90 grados y toque con el asa un canto de la estría
del primer cuadrante, deslízalo varias veces, mediante movimientos en
zig-zag hasta el otro extremo del segundo cuadrante de la placa.
4. Flamee nuevamente el asa y enfríelo. Gire la placa 90 grados y estrié el
tercer cuadrante de la placa repitiendo el procedimiento anterior.
5. Finalmente, en el cuarto cuadrante de la placa, realice estrías a partir
del tercer cuadrante y distribúyalo en sentido contrario. El asa no debe
tocar ninguna de las estrías previamente formadas.
6. Después de hacer las estrías, enfrié el asa, incube las placas en
posición invertidas, a 37 ºC por 24 horas.
7. Observe el crecimiento de las colonias aisladas.
45
General
Figura 8a. Pasos para la obtención de culturas axénicas en medios de cultivo.
Figura 8b. Pasos para la siembra de bacterias por la técnica de agotamiento.
2.3. Siembra en cajas de Petri por la Técnica de siembra en cuadrantes.
El objetivo de esta técnica, es el de diluir el inóculo a medida que se realizan

estrías en la superficie del agar. Para realizar la siembra, la caja se divide en
cuatro cuadrantes (imaginariamente o con un lápiz marca charpie por la base
de la caja); se procede a esterilizar el asa en el mechero, se toma el inóculo y
se inicia el rayado de la superficie del agar, en cuatro cuadrantes consecutivos
(sin esterilizar el asa posteriormente o tomar nuevamente inóculo). Las cajas
46
General
así sembradas, se incuban a la temperatura adecuada de acuerdo a la

bacteria.
Figura 8c. Técnica de siembra en cuadrantes.
2.4. Siembre por la técnica en tubos.
La siembra de medios contenidos en tubos requiere mayor cuidado, puesto que

un solo organismo contaminante del aire puede superar en crecimiento al
microorganismo de interés, por lo tanto, se deben tener las siguientes
precauciones:
• Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir,

de modo que los microorganismos del aire caigan en las paredes
externas del tubo y no en la boca de este.
• Los tapones se deben mantener en la mano contraría a aquella que
contiene el tubo, sosteniéndolos entre el dedo meñique, el anular y el
dedo del corazón. Nunca deben colocarse sobre la mesa de trabajo o
algún otro lugar.
• Flamear la boca del tubo antes de cerrarlo después de la siembra o
inoculación.
• Esterilizar el asa adecuadamente (toda la porción que entra en contacto
con el medio de cultivo).
• Sumergir el asa en el medio de cultivo, sin tocar las paredes del tubo.
• Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo.
• Después de realizar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente
la boca del tubo.
• Siembre trabaje con material abierto, en cámara de flujo laminar o en su
defecto con mecheros Bunsen.
• En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de cultivo,
así como, utilice asas totalmente rectas.
47
General
Figura 8d. Pasos de siembras aplicadas a medios de cultivo contenidos en

tubos, donde: (A) Siembra por estría simple, (B) siembra mixta (picadura y
estría), (C y D) siembra por picadura en agar inclinado y recto y, (E) siembra
con asa bacteriológica en medio líquido
3. Medida de densidad poblacional a partir de una muestra-conteo de colonias

en placas mediante dilución seriada.
• Tome un mL de una muestra liquida o 1 gramo si es sólido y disuélvalo

en 9 mL de agua peptonada. Agítelo hasta obtener una solución o
suspensión;
• Prepare diluciones decimales seriadas de la muestra, transfiriendo,
asépticamente un mL de la muestra para tubo de ensayo conteniendo 9
mL de agua peptonada estéril (10-1); agite la suspensión y repita el
procedimiento hasta formar dilución de 10-5;
• Transfiera alícuotas de 1 mL de cada dilución para placas de petri
estériles (siembre en profundidad). Otra alternativa seria colocar 0.1 mL
de cada alícuota directamente sobre la superficie de medio sólidos,
distribuya la muestra 8siembra sobre superficie);
• Sobre la placa conteniendo alícuotas con 1mL coloque el medio de
cultivo fundido e mantenido a 55 ºC en las placas y homogenice,
deslizando la placa suavemente en forma de “8”. El medio debe estar en
48
General
tubo en baño a maría, entre 50-55 ºC. Trabaje rápido para evitar la
sodificación del medio.
• Espere que el medio resfrié y sodifique;
• Incube a 37 º C por 24 a 46 horas;
• Realice conteo del número de colonias por placa. Evalué la densidad
poblacional de la muestra utilizando la siguiente formula:
UFC/mL = NC x FD
-------------------------
Va
UFC/mL: Unidades formadoras de colonias por mL;

NC: Número de colonias por placa en la dilución;
FD: Factor de dilución (inversa de la dilución). Por ejemplo, si es 10-2,
corresponde 102
Va. Volumen adicionado en la caja de petri.
Observación: Si la dilución la prepara con muestra de suelo, debe multiplicar
el volumen adicionado por la masa de suelo seco.
49
General
Figura 9. Dilución seriada para conteo de microorganismos viables
V. REFERENCIA BIBLIOGRAFICAS

Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. 2003. Brock: Biología de los

Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed.
Madrid. 1011p.
VI. RESULTADOS
1. Esquematice el crecimiento obtenido en la superficie de la placa estriada

(simple y compuesta).
2. Muestre una colonia que usted utilizaría para el aislamiento. Si usted no
obtuvo una colonia aislamiento, sugiera las razones posibles para este
error. Que mediada utilizaría para corregirla.
3. Mida la densidad poblacional de las muestras contadas en placas. Para ello
seleccione una placa que contenga entre 25 y 300 colonias y llene la tabla
de abajo, en UFC/mL
D I L U C I O N E S
Repetición 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10
1
2
3
VII. CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles es la importancia y diferencias entre culturas mixtas, puras y

axénicas?
2. ¿Porque los microorganismos son aislados para su identificación en medios
sólidos?
3. Cuál es el objetivo de las diluciones seriadas, para el conteo de
microorganismos,
50
General
4. Por que al realizar conteo de colonias en placas solamente consideramos

aquellas que han sido formadas entre 30 y 300?.
LABORATORIO 11. ESTUDIO DE LAS CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS

DE LOS MICROORGANISMOS
I. INTRODUCCIÓN
Después del aislamiento en cultivo puro, los microorganismos pueden ser

identificados en el laboratorio. Miles de especies bacterianas ya fueron aisladas
y sus características descritas en el “Manual de Bergey”, una referencia en
cualquier estudio taxonómico de bacteriología.
La identificación de bacterias es realizada observando las características

morfológicas (forma, arreglo, dimensión), culturales (apariencias
macroscópicas en diferentes medios de cultivos), fisiológicas, relacionadas
con la capacidad de los microorganismos de sintetizar intra y extracelular, de
asimilar diferentes substratos o generar productos metabólicos específicos y
genéticos por medio de la identificación de regiones específicas del genoma
de la célula.
El metabolismo celular comprende transformaciones de los nutrientes por

reacciones químicas organizadas, catalizadas por enzimas. Las enzimas son la
expresión del potencial genético de la célula y la evaluación de la presencia de
un conjunto definido de enzimas, puede ser de ayuda en la identificación de los
microorganismos. Las enzimas microbianas pueden ser intra o extracelulares.
Las enzimas extracelulares o las ligadas a la pared ejercen su actividad
catalítica fuera de la célula. Algunas transforman substratos de elevado peso
molecular en compuestos menores, para ser transportadas a través de la
membrana celular y metabolizadas en el interior de la célula. Las enzimas
intracelulares son responsables por la síntesis de estructuras celulares y por la
producción de energía.
El metabolismo genera productos que son excretados por la célula en el medio

de cultivo, y la presencia o ausencia de esos productos también pueden ser
utilizados en su identificación.
51
General
El estudio de las características bioquímica de los microorganismos constituye

un aspecto importante para la identificación microbiana. Su fundamento radica
en la dotación enzimática bacteriana, visualizada a través de la acción de las
mismas, sobre determinados substratos con agentes reveladores.
Para visualizar las reacciones bioquímicas se utilizan diferentes agentes

reveladores que permiten visualizarlas. A los medios de cultivos se les
adicionan indicadores de pH, sales de hierro, aminoácidos azufrados, entre
otros.
En esta práctica, algunas pruebas bioquímicas utilizadas en la identificación de

bacterias serán demostrada, como la presencia de enzimas extracelulares
como la amilasa, responsable por la hidrólisis del almidón y de algunas
enzimas intracelulares y de membrana, como triptofanasa y citrato permeasa.
Algunas pruebas bioquímicas importantes en la identificación de
microorganismos son descritas. En una rutina de identificación, los resultados
de varias pruebas son comparados a los de especies descritas en el “Manual
de Bergey”.
II. OBJETIVOS
1. Identificar Diversos géneros bacterianos, observando reacciones

bioquímicas en diferentes medios de cultivos.
2. Detectar la presencia de algunas enzimas bacterianas a través de las

reacciones bioquímicas.
III. MATERIALES
✓ Cultivos bacterianos axénicos

✓ Medios de cultivos
✓ Tubos con caldos
✓ Reactivos
✓ Carbohidratos (azúcares)
IV. PROCEDIMIENTO
Rojo de Metilo (indicador de pH).
Algunas bacterias fermentan la glucosa con la producción de acido fórmico,

acético, láctico, succínico y otros productos. Esos ácidos promueven una
disminución en los valores del pH del medio. Las diferencias metabólicas
pueden ser evidenciadas por la adición de una solución de rojo de metilo en el
medio donde fue cultivado el microorganismo interés (10 gotas). En medio
52
General
acido (pH < 4,2), el indicador se torna rojo (resultado positivo); en pH < 4,2, el
indicador adquiere un color amarillo (resultado negativo).
Fermentación de azúcares.
Esta prueba bioquímica, es evaluada la capacidad de fermentar determinados

carbohidratos por los microorganismos, principalmente mono y disacáridos, por
medio de la producción de ácido o gas. Se utilizan medios de cultivos básicos,
adicionando una fuente de carbono en la forma de mono y disacáridos y el rojo
de fenol como indicador de Ph. La reacción es alcalina, si el color del medio
permanece inalterado (prueba negativa); si la reacción es ácida, se verifica la
aparición de un color amarillo en el medio (prueba positiva). La producción de
gas es evidenciada por la presencia de burbujas en el interior de los pequeños
tubos de Durhan invertidos dentro del medio de cultivo (prueba positiva). En los
procesos de fermentación de carbohidratos se utilizan tubos de Durham con
diferentes tipos de azucares, siendo positivo por la presencia de burbujas o gas
dentro del tubo.
Fermentación de lactosa.
En agar y caldo Maconkey adicione 5 gotas de agua residuales o muestras de

baterías provenientes de cultivos axénicos, incube a 37 °C por 48 horas,
observe los resultados y compare mediante la siguiente tabla.
Colonias microorganismos
Incoloras, transparentes Salmoenella, Shigella
Grandes, rojas, halo turbio Escherichia coli
Grandes, rosadas, mucosas Enterobacter, Klebsiella
Diminuta, de crecimiento aislado, Enterococos, Stamphylococcus
opaca
Las sales biliares y el cristal violeta inhiben considerablemente la flora Gram-

positiva. La lactosa, junto con el indicador de pH rojo neutro sirve para la
comprobación de la degradación de dicho azúcar.
En caldo de MacConkey se observa un cambio de color del medio de azul

violeta a blanco con formación de burbujas sobre el medio.
Producción de indol, acido sulfúrico y movilidad.
El agar SIM, proporciona fuentes necesarias para evidenciar la capacidad de

un microorganismo de producir indol, ácido sulfhídrico. Adicionalmente permite
evaluar si la bacteria presenta o no movilidad.
1. Producción de indol
53
General
Los microorganismos producen indol a partir de la oxidación del triptófano por

la acción de la enzima triptofanasa; la cual puede ser detectada agregando 0.5
ml del reactivo de Kovacs al medio donde crecen las bacterias. La función del
reactivo es reaccionar con el indol y producir un anillo rojo en la superficie del
agar.
2. Producción de ácido sulfhídrico (sulfuro de Hidrógeno)
Algunos microorganismos pueden desdoblar aminoácidos azufrados como

cisteína, cistina y metionina, liberando sulfuro de hidrógeno que es el producto
más reducido del azufre. Para observar la producción de gas H2S, el medio
debe tener la presencia de sales de metales pesados como hierro, níquel,
cobalto, bismuto o plomo, que al reaccionar con este forman un precipitado de
color negro.
3. Movilidad
Se observa por la aparición de un velo blanco difuso alrededor de la línea de

inoculación. Cuando la bacteria es productora de H2S, se dificulta la lectura de
la movilidad, por lo tanto, se recomienda inocular en agar blando
Utilización del citrato sódico.
La asimilación de citrato indica la presencia de la enzima citrato permeasa, que

transporta el citrato para el interior de la célula. Del metabolismo de del citrato
es producido piruvato y C02. Este ultimo, al reaccionar con el sodio presente en
el medio, forma carbonato de sodio, elevando el pH. El medio de cultivo agar
citrato de Simmons (pH 7,3 - verde), contiene citrato de sodio como única
fuente de carbono y el azul de Bromotimol como indicador de pH. Con un
aumento del pH, el medio adquiere un color azul (pH > 7,6), indicando
resultado positivo.
Prueba de la catalasa.
La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno, en

oxígeno y agua (H2O2 → H2O + O2 (burbujas de gas)). La catalasa es una
hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina, excepto que los
cuatro átomos de hierro de la molécula están en estado oxidado (Fe+++) en
lugar de reducido (Fe++). Excluyendo los estreptococos, la mayoría de las
bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa. El
peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del
metabolismo oxidativo aeróbico de los carbohidratos. Si se deja acumular, el
peróxido de hidrógeno es letal para las células bacterianas. La prueba de la
catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es comúnmente utilizada
para diferenciar Streptococcus (catalasa negativa) de Staphylococcus spp.
(catalasa positiva).
54
General
Procedimiento
• Un cultivo de 24 horas del microorganismo en un medio no selectivo y

que no contenga sangre y, peróxido de hidrógeno 3%.
• Se transfiere una alícuota del microorganismo al centro de un
portaobjetos en el que se colocó previamente una gota de peróxido de
hidrógeno 3% y se emulsiona (las asas no deben contener hierro, ya que
se pueden producir falsos positivos).
• La rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas o
efervescencia, indica una prueba positiva. Dado que algunas bacterias
pueden poseer enzimas distintas de la catalasa, capaces de
descomponer el peróxido de hidrógeno, unas pocas burbujas diminutas,
formadas a los 20 a 30 segundos no se consideran una prueba positiva
(Control positivo Staphylococcus aureus, control negativo: Streptococcus
spp.)
Prueba de Oxidasa.
El sistema citocromo oxidasa, está constituido por hemoproteínas capaces de
catalizar la oxidación de un citocromo reducido por el oxígeno molecular. Las
bacterias que obtienen su energía por respiración y utilización del oxígeno
molecular como aceptor final de electrones, contienen diferentes sistemas
citocromo oxidasa; en tanto que las bacterias anaerobias obligadas, no
contienen tales sistemas. La prueba de la citocromo-oxidasa, permite detectar
la presencia en el microorganismo de ciertas enzimas del sistema citocromo-
oxidasa, capaces de oxidar rápidamente al colorante redox. Esta prueba, es útil
para sospechar la presencia de los géneros de bacterias que dan el ensayo
positivo como Neisseria spp., Aeromonas spp., Vibrio spp., Campylobacter
spp., y Pseudomonas spp., y para excluir las Enterobacteriaceae que dan
reacciones negativas. La prueba se realiza, partiendo de un cultivo fresco del
microorganismo en un medio no selectivo y libre de colorantes que puedan
causar interferencias, de una solución 1% de Diclorhidrato de Dimetil-p-
Fenilendiamina (de color rosado), o Clorhidrato de Tetrametil-p-Fenilendiamina
(de color azul), recién preparados.
El reactivo, se adiciona a una tira o disco de papel filtro colocado sobre una
placa de Petri limpia y se extiende una alícuota generosa del microorganismo
(Se debe realizar un control negativo del asa utilizado, pues ésta puede
producir falsos positivos). Cuando se utiliza el reactivo Tetrametil-p-
55
General
Fenilendiamina, se considera el ensayo como positivo la aparición de un color

azul profundo en un tiempo menor a 10 segundos; se considera positivo lento a
confirmar cuando el color aparece entre 10 y 60 segundos y se considera
negativo cuando no hay desarrollo de color o cuando se produce en un tiempo
mayor a 60 segundos. Cuando se utiliza el reactivo Dimetil-p-Fenilendiamina,
se considera el ensayo como positivo cuando aparece un color rosado-fucsia,
en aproximadamente 2 minutos (Control Positivo: Pseudomonas aeruginosa;
Negativo: Escherichia coli).
Prueba de la ureasa.
La urea es una carbamida del ácido carbónico que es hidrolizada por la enzima
ureasa. El medio de cultivo de urea contiene como indicador de pH, el rojo de
metilo, su cambio de color de rosa pálido a fucsia permite observar si la
reacción es positiva.
Hidrólisis del almidón.
Bacterias que utilizan el almidón como fuente de carbono producen amilasa,

enzima extracelular capaz de hidrolizar el amido. La acción de esa enzima
puede ser evidenciada, estriando la bacteria a ensayar sobre un medio sólido
que contengo 0.2 % de amido y adicionado, después del crecimiento, solución
saturada de yodo (lugol) sobre el medio de cultivo. El yodo reacciona con el
amido, formando un complejo de color azul. La aparición de zonas claras
alrededor de las colonias de la bacteria indica la desaparición de las cadenas
de amido por la acción de la amilasa (resultado positivo.
Prueba de Oxidación-Fermentación (OF).

La prueba de oxidación-fermentación, es importante en las primeras etapas de
identificación de un microorganismo. Permite diferenciar las bacterias según el
rol del oxígeno atmosférico en la utilización de carbohidratos. El medio más
comúnmente utilizado es el agar semisólido de Hugh-Leifson que, a diferencia
de otros medios de cultivo, contiene una baja concentración de peptonas (0,2
%); en las concentraciones de peptona habitualmente usadas en otros medios
(1 al 2%), no es posible detectar la baja concentración de ácidos que se
produce por metabolismo oxidativo de azúcares, ya que, las aminas generadas
por el uso aerobio de las peptonas alcalinizan el medio. La baja concentración
de peptona del medio Hugh-Leifson, permite diferenciar los microorganismos
oxidativos, de los inactivos frente a la glucosa. En ausencia de otros aceptores
externos de electrones (ej.: NO3-), la oxidación de carbohidratos es un proceso
estrictamente aerobio, en tanto que la fermentación es un proceso que no
requiere oxígeno.
56
General
Aquiahuatl Ramos, M. A., y Pérez Chabela, M. L. 2004. Manual de prácticas del

Laboratorio de Microbiología General. Universidad Autónoma Metropolitana,
Unidad Iztapalapa. México. Departamento de Biotecnología. 116 p.

VI. OBSERVACION DE RESULTADOS
Llene la tabla con los resultados obtenidos, colocando (+), para reacciones
positivas y (–) para la negativa.
Prueba bioquímica Muestra

Catalasa
Ureasa
Fermentación
de carbohidratos
Citrato
Indol
Almidón
Oxidasa
VII. CUESTIONARIO
1. ¿En la identificación de microorganismos por que las pruebas bioquímicas

son importantes?
2. Cual es la importancia de la de la catalasa, ureasa, fermentación de

carbohidratos, citrato e Indol.
3. De qué manera se puede identificar un microorganismo por el “Manual de

Bergey”.
4. Cuáles son las técnicas desde el punto de vista fisiológico y molecular

utilizadas en la identificación de microorganismos.
57
General
LABORATORIO 12. MICROBIOLOGIA DEL AGUA
I. INTRODUCCION
El reconocimiento de la importancia sanitaria y de la calidad del agua es una

consecuente aplicación de medidas de tratamiento que ha traído beneficios
incalculables para la salud del hombre. La cualidad microbiológica del agua
puede ser determinada por análisis bacteriológicos. Microorganismos
patógenos (Salmonella thypi, Vibrio Cholera, Shigella dysenteriae, virus de la
hepatitis, etc.) puede ser aislados de aguas contaminadas, utilizándose
procedimientos extensos y demorados. Es impractico investigar,
rutinariamente, todos los patógenos que posiblemente se encuentran
vinculados al agua. Asimismo, el control microbiológico de la calidad del agua
es realizado determinando la presencia de microorganismos de origen fecal,
que es un indicador de la contaminación del agua por heces de humanos y
animales.
Los indicadores de contaminación fecal, o los que tienen mayor aceptación es

el grupo de las bacterias coliformes. Este grupo es definido por la por las
siguientes características: Bacterias gram-negativas, bastones, no formadoras
de esporos, anaerobio o aerobios facultativos, con capacidad de fermentar la
lactosa con producción de gas en 48 horas, a 35 oC. El grupo coliformes es
heterogéneo, esta representado por los géneros Escherichia, Enterobacter,
Klebsiella y Citrobacter.
Para indicar contaminación fecal reciente, se utiliza como indicadores de

contaminación los coliformes fecales, que tienen como hábitat exclusivo el
intestino de de animales homeotérmicos, y cuyo representante mas importante
es la Escherichia coli. Los coliformes fecales son aquellos que fermentan la
lactosa con producción de gas, cuando son incubados a 44.0 – 45 oC por 24
horas.
El análisis patrón de agua para la detección de microorganismos coliformes es

dividida en tres partes: Test presuntiva, test confirmativo y completo. La
observación de resultados positivos o negativos, obtenidos en cada test, es
esencial para evidenciar la presencia o ausencia de contaminantes en una
muestra.
II. OBJETIVOS
1. Ejecuta test presuntivo de análisis bacteriológico del agua.
2. Determinar el numero mas probable (NPM) de bacterias presumiblemente

coliformes, en muestras de agua de diferentes procedencias.
58
General
III. MATERIAL
Medios de cultivos y soluciones: Tubos con agar nutritivo fundido, tubos con
10 mL de caldo lactosado con concentraciones dobles, conteniendo tubos de
Durhan invertidos; muestras de agua.
Equipos: Pipetas de 1,0 y 10 mL; frascos esterilizados para colectas de

muestras de agua, placas de petri esterilizadas; baño a María a 50oC, estufa a
25 oC y 37 oC, micropipetas de volumen regulable.
IV. PROCEDIMIENTO
Conteo del número de células viables en placa.
1. Agite la muestra de agua a ser analizada;

2. Transfiera dos alícuotas de 1,0 mL y 0.1 mL para dos placas de petri;
3. Adicione agar nutritivo fundido y mantenido en termostato,
aproximadamente a 50 oC. Agite suavemente y deje sodificar;
4. Incube las placas a 25 oC, por 24 a 48 horas;
5. Evalúe el número de colonias formadas. Anote los resultados en tablas.
Test Presuntivo en tubos con Caldo Lactosado.
1. Identifique, tres series de tubos con: numero del grupo, muestra, fecha y
alícuota y repetición;
2. Transfiera, asépticamente, tres alícuotas de 1,0 mL y tres de 0,1 de mL,
para cada una de las series de tres tubos con caldo lactosado y tubos de
Durhan invertido;
3. Incube a 37 oC. por 48 horas;
4. Evalúe La producción de gas en los tubos de Durhan, anotando los
resultados en tablas;
5. Consulte la tabla del NMP para la conversión de los resultados obtenidos en
número presuntivo de coliformes/100 mL de muestra.
Consideraciones
Los test para detectar la presencia de bacterias coliformes puede ser partes:
test presuntivo, confirmativo y completo.
En el test presuntivo, son detectados microorganismos capaces de fermentar

lactosa con la producción de gas, presumiblemente coliformes. A través de la
utilización de inóculos múltiples, se puede determinar el número más probable
de microorganismos presumiblemente coliformes en la muestra.
59
General
El test confirmativo es realizado a través de subcultivo de los tubos lactosado

positivos (producción de gas) en un medio selectivo diferencial para el grupo de
coliformes-aerógenos. El test confirmativo reduce posiblemente los falsos-
positivos que pueden ocurrir, a partir de la actividad metabólica de las bacterias
gram-positivas formadoras de gas.
A veces, es necesario aislar las bacterias e identificarlas como coliformes

mediante test completo.
La demostración de que los aislamientos productores de gas son Gram-

negativos, no esporulados y bastones, es evidencia conclusiva para coliformes
en el test confirmativo.
Secuencia en la Ejecución de Análisis Bacteriológicos
Muestra
Test Presuntivo
Caldo lactosado- 35 oC/48 horas Caldo lactosado- 35 oC/48 horas

Producción de gas: evidencia de coliformes Gas ausente: ausencia de coliformes
Análisis continua Análisis concluido
Caldo lactosado-Bili Verde Brillante

- 35 oC /48 horas
Producción de gas: confirmada la presencia
de coliformes
Figura 9. Secuencias en la ejecución de análisis bacteriológico del agua.
TEST MICROBIOLOGICO RAPIDO.
IDENTIFICACION DE BACTERIAS COLIFORMES.

En agar y caldo MacConkey adicione 5 gotas de agua residuales o muestras
de baterías provenientes de cultivos axénicos, incube a 37°C por 48 horas,
observe los resultados y compare mediante la siguiente tabla.
60
General
Colonias microorganismos
Incoloras, transparentes Salmoenella, Shigella
Grandes, rojas, halo turbio Escherichia coli
Grandes, rosadas, mucosas Enterobacter, Klebsiella
Diminuta, de crecimiento aislado, Enterococos, Stamphylococcus
opaca
En caldo de MacConkey se observa un cambio de color del medio de azul

violeta a blanco con formación de burbujas sobre el medio.
V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.
BURROW, W. Textbook of Microbiology. 30th Ed. Saunder Co, Fhiladelfia.

1993.
MICKINNFY, R.E. Microbiology for Sanity Engeneers. McFgraw Hill Co.

N.Y.1982.
VI. RESULTADOS
1. Conteo en placas
Muestra Alícuota No de UFC

1,0 mL
0,1 mL
1,0 mL
0,1 mL
2. Prueba presuntiva en tubos
Muestra Alícuota No de tubos (+)

10,0 mL
1,O mL
0,1 ml
10,0 mL
1,O mL
0,1 ml
VI. CUESTIONARIO
1. ¿Por qué utilizamos bacterias del grupo coliformes como indicador de

calidad del agua?
61
General
2. ¿Porque utilizamos el caldo lactosado como medio de incubación para

las muestras de agua durante la prueba presuntiva?
3. ¿Discuta el principio y las posibles aplicaciones de la prueba del número

más probable (NPM)?
62
General
Laboratorio 13. PRUEBAS MICROBIOLOGICAS PARA DETERMINAR LA

CALIDAD MICROBIOLOGICA DE ALIMENTOS.
INTRODUCCIÓN
La microbiología de alimentos es la parte de la microbiología que trata de los

procesos en los que los microorganismos influyen en las características de los
productos de consumo alimenticio humano o animal. La microbiología de
alimentos, por consiguiente, engloba aspectos de ecología microbiana y de
biotecnología para la producción
IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS EN ALIMENTOS.
Prueba de Peroxidasa.
A un tubo estéril tapa rosca, adicione 2 mL de leche, 1 mL de peróxido de

hidrogeno al 3% v/v y 2 mL del reactivo guayacolato. La prueba es positiva si
se produce un color Curuba. Es negativa si no cambia de color.
Prueba de la reductasa.
A un tubo estéril tapa rosca adicione 10 mL de leche, 1 mL del reactivo de azul

de metileno al 0.05 % v/v. Incubar a 37 oC y observar cada media hora si se
observa decoloración de la leche. Si se observa decoloración de la leche antes
de la media hora, es un indicativo que la calidad microbiológica de la leche es
mala.
Prueba de la Fosfatasa.
A un tubo estéril tapa rosca, adicionar 2.5 mL del reactivo 4-para nitrofenil
fosfato disódico, posteriormente 0,5 mL de leche, incubar a 35 oC por 1 hora. Si
no hay cambio de color la prueba es negativa. Si se presenta un cambio de
color amarillo y cambia hasta verde la prueba es positiva.
Presencia de Salmonella.
1. Tomar 25 mL de leche o 2,5 g de carne, queso, pescado, etc.

2. Adicionar 22,5 mL de caldo de cerebro-corazón a la mitad de la
concentración específica del medio.
3. Incubar a 37 oC durante 24 horas.
4. Tomar 1 mL de la muestra incubada.
5. Inocular a 9 mL de caldo tetrationato (adicionar 3 gotas de yodo para
evitar contaminación y verde brillante para inhibir flora acompañante)
7. Tomar una asada e inocular por el método de siembre en superficie en
medio con agar Hecktoen.
63
General

9. Observar colonias típicas de Salmonella (puntos negros rodeados de un
halo transparente
Presencia de Staphylococcus aureus.
1. Tomar 0,1 mL de leche

2. Inocular sobre la superficie del medio con agar Baird Parker.
3. Incubar a 37 oC durante 24 a 48 horas
4. Observar colonias típicas de Staphylococcus aureus (punto negro con
doble halo transparente).
Presencia de Listeria.
1. Tomar 1,0 mL de leche o 1 g de carne, queso, pescado, etc. Y disolverlo

en 9 mL
2. Tomar una muestra y sembrar en estrías compuesta sobre la superficie
de de agar tripticasa de soya.
3. Incubar a oC durante 24 horas
4. Inocular una asada sobre la superficie de agar Palcam suplementado.
5. Incubar 30 oC durante 24 horas.
6. Observar colonias típicas de Listeria (Punto negro, halo verdoso).
64
General
Laboratorio 14. ANTIBIOGRAMA
I. INTRODUCCION
Los antibióticos son compuestos químicos producidos por microorganismos

que, en pequeñas concentraciones, son capaces de ocasionar la muerte o
inhibición del crecimiento de otros microorganismos. Hongos Actinomices y
otras bacterias son los principales productores de antibióticos. Además de la
síntesis biológica, algunos de esos antibióticos pueden ser producidos por
síntesis químicas.
Para la utilización de antibióticos para fines clínicos, es necesario considerar

algunas características importantes como la selectividad, el espectro de acción,
la resistencia, solubilidad, efectos en el microbiota del tracto digestivo.
La determinación in Vitro de la resistencia o sensibilidad de una bacteria a uno

o varios antibióticos recibe el nombre de ANTIBIOGRAMA, que puede ser
utilizado para determinar el espectro de acción de un antibiótico nuevo o para
determinar la concentración minima requerida inhibitoria.
El antibiograma puede ser realizado por medio de la técnica: Dilución seriadas

en tubos o placas, o por difusión en medios sólidos (método de Kirby-Bauer).
Esta última técnica es la más empleada, con discos de papel filtro previamente
impregnada con dosis conocidas de antibióticos y colocadas en contacto con
bacteria inoculadas en la superficie del medio. La determinación del grado de
sensibilidad o de resistencia de la bacteria esta relacionada con el tamaño del
diámetro de la zona de inhibición formada alrededor del disco de papel
impregnados con antibióticos, después de 16 a 18 horas de incubación.
II. OBJETIVOS
1. Demostrar la actividad antimicrobiana de algunos antibióticos

seleccionados;
2. Realizar antibiograma por la técnica de difusión en medios sólidos

(método de Kirby-Bauer), para determinar la sensibilidad de bacterias a
algunos antibióticos.
III. MATERIALES
Cultivos bacterianos
Medios de cultivos
Discos de papel impregnados con antibióticos
Escobillon
Incubadora
65
General
IV. METODOLOGIA
1. Tomar una caja de petri con agar nutritivo y marcar con el número del grupo
2. Inocular la cepa interés con escobillón de algodón estéril
3. Colocar en forma uniforme, sobre la superficie del agar inoculado, discos de
sensibilidad, de deferentes antibióticos,
5. Observar y evaluar los resultados.
Figura 10. Prueba de sensibilidad de bacterias a diferentes antibioticos

VI. RESULTADOS
1. Complete el diseño de abajo, según los resultados obtenidos, representando

el diámetro de los halos obtenidos con los diferentes antibióticos.
66
General
2. Completar el cuadro e interpretar los resultados, indicado si la bacteria

es resistente(R) o sensible (S) a los antibióticos probados.
Antibiótico Diámetro (mm) Resistente Sensible
VII. CUESTIONARIO
1. Cite los principales microorganismos productores de antibióticos.
2. Haga una lista de los principales antibióticos existente en el mercado

nacional y mundial. Indique el rango de acción para grupos de
microorganismos.
67
General
Laboratorio 15. Actividad antimicrobiana de extractos y aceites esenciales

de plantas medicinales y aromáticas.
INTRODUCCIÓN
Entendiendo la gravedad del problema se han creado estrategias que

sustituyen parcial o en su totalidad la dependencia a agroquímicos y así poder
acercarse a una agricultura sustentable, por lo cual los aceites esenciales,
representan una gran alternativa, debido a que han tomado mucha fuerza por
su efectividad contra diferentes patógenos, ya sean fúngico, bacterianos o
virales, siendo eficaces en pequeñas concentraciones.
Los aceites esenciales son catalogados como compuestos volátiles de olor

característico, naturales y complejos, presentes en plantas aromáticas (Bakkali,
Averbeck, Averbeck & Idaomar, 2008). Entre las principales familias de plantas
productoras de aceites esenciales tenemos a Myristicaceae, Asteraceae,
Lamiaceae, Apaceae, Lauraceae, Myrtaceae, Verbenaceae, Rosaceae,
Piperaceae y Rutaceae (Simões & Spitzer, 2000). Mayormente los aceites
esenciales están compuestos químicamente por monoterpenos y
sesquiterpenos, al igual encontramos fenoles aromáticos, esteres, alcoholes,
óxidos, éteres, aldehídos y cetona. Tales compuestos se creé que están
relacionados con sus propiedades herbicida, bactericida y fungicida (Bakkali et
al., 2008).
OBJETIVO
• Determinar in vitro la actividad inhibitoria de aceites esenciales de Lippia

origanoides contra patógenos y fitopatógenos.
• Evaluar in vitro la actividad antibacteriana de los aceites esenciales de
Lippia origanoides contra patógenos y fitopatógenos usando el método
de UFC y MTT.
METODOLOGIA
Extracción de bio-producto de origen vegetal. Para la extracción de los

aceites esenciales se utilizarán hojas frescas de L. origanoides empleando un
equipo de hidrodestilación asistido por radiación de microondas, donde se
sumerge el material vegetal en agua y se calienta hasta hervir, durante tres
ciclos de 15 minutos cada uno y estos aceites esenciales extraídos se
deshidratarán con sulfato de sodio anhidro y, se almacenarán en viales
cromatográficos ámbar a baja temperatura hasta su posterior uso.
68
General
Actividad antimicrobiana. Para esta prueba se utilizaron placas de Elisa de

96 pozos, en cada pozo se adicionarán 100 µL de una suspensión de bacterias
ajusta a una concentración de 0.1 a 0.08 DO equivalente. En la escala de
McFarland a 1,5x108 UFC/mL y el mismo volumen de los tratamientos, se
incubaron a 35±2°C por 24 horas a 160 rpm.
Pasado el tiempo de incubación, se adicionará 50 µL de una solución de

Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) de 5 mg/mL. Los
pozos que contengan los tratamientos y los controles, seguidamente las placas
se dejan por 2 horas en las mismas condiciones. Para determinar la inhibición
de B. glumae se medió la densidad óptica en un lector de microplacas de Elisa
Chromate Awareness, modelo 4300 utilizando una longitud de onda de 490 nm.
La absorbancia se tomó como una medida del porcentaje de inhibición del
aceite esencial mediante la siguiente formula:
En cada placa se incluyó controles. El ensayo se realizó por triplicado.
Actividad antibacteriana mediante unidades formadoras de colonias

(UFC). Del ensayo anterior se tomaron 5µL de las concentraciones y
tratamientos de cada pozo de la microplaca de Elisa y se adiciono cada uno en
un tubo de ensayo que contenía 15ml de agua destilada estéril para hacer una
dilución, luego se tomaban 10µL de esa dilución y se depositaban en placas de
Petri que contenían agar sólido, preparado el día anterior. Se hace el extendido
correspondiente de la muestra por toda la placa de Petri con la ayuda de una
espátula de Drigalsky, por último, se hace la respectiva rotulación y se sella
cada placa de Petri con papel de cocina y se incubaban a una temperatura en
un intervalo de 30°C a 35°C durante 48 horas, pasado se tiempo se hacia el
conteo de las colonias de mediante una cuenta colonias.
69
General
LABORATORIO 16. AISLAMIENTO, PREPARACIÓN Y OBSERVACIÓN

MICROSCÓPICA DE HONGOS
I. INTRODUCCIÓN
Los hongos son organismos heterótrofos, generalmente aerobios y adaptados

a ambientes diversos, donde pueden existir como saprofitos, parásitos o
simbióticos. Como saprofitos los hongos degradad la materia orgánica,
trasformándola en formas químicas simples que retornan al suelo. Como
parásitos causan enfermedades en humanos, animales vegetales. Co
simbiontes, pueden existir en asociación con otros organismos, tales como
algas, formando los líquenes, en el rumen o con la raíz de las plantas,
formando las micorrizas.
El aislamiento de hongos constituye una etapa fundamental para la

identificación y para el estudio de los requerimientos nutricionales y de
substancias resultantes de su metabolismo. Los métodos utilizados para el
aislamiento y cultivo de los hongos dependen de su hábitat natural.
Generalmente, se utilizan medios sólidos acidificados, con pH alrededor de 4 a
5, con el objetivo de inhibir el crecimiento de bacterias.
Los hongos saprofitos del suelo o de alimentos pueden ser aislados utilizando
métodos de dilución o estrías en superficie de medios sólidos. Para los hongos
parásitos, los métodos de aislamiento varían de acuerdo con el hongo y el tipo
de lesión. En la mayoría de las veces se colecta el tejido u órgano infectado,
que son transferidos para la superficie de un medio de cultivo apropiado. Las
placas son incubadas y el aislamiento es hecho a partir de las colonias que se
desarrollan de los fragmentos de tejidos.
La clasificación de los hongos filamentosos se basa, principalmente, en el tipo

de micelio vegetativo que forma (septado o cenocititco), la presencia de
estructuras de reproducción sexual y asexual. La tabla siguiente resume
algunas de las principales características utilizadas en la identificación y
clasificación de los hongos filamentosos (Tabla1).
II. OBJETIVOS
70
General
1. Realizar técnicas para el aislamiento de hongos;

2. Reconocer los diferentes modos de vida de los hongos en la naturaleza;
3. Observar las estructuras macroscópicas y microscópicas de algunos
hongos.
III. MATERIAL
Microorganismos: Rhizopus sp., Aspergillus sp., Penicillium sp.

Medios y soluciones: Tubos con solución salina esterilizada, medio P.D.A,
Saboraund, liquido de montaje (lactofenol).
Equipos: Microscopio óptico, asa de replicar, pipetas, laminas.
Muestras: Frutas en estado de descomposición, material vegetal contaminado.
Tabla 1. Características de los principales grupos de hongos filamentosos
Grupo Nombre común Tipo de hifa Espora Espora

asexual sexual
Ascomycota Hongos en septo conidios Ascospora

sacos
Basidiomycota mushroom septo conidios Basidiospora
Zygomycota Mohos del pan cenocíticos esporangio zygospora
Oomycota Hongos cenocíticos zoospora oospora

acuáticos
Chytriomycota Hongos Cenocíticos zoospora Oospora
acuáticos
Deuteromycota Hongos septo conidios ninguna
imperfectos
IV. PROCEDIMIENTO.
Aislamiento de hongos saprofitos.
1. recoja, con as de replicación, esporos o micelio de hongos presentes en la

superficie de alimentos alterados;
2. Diluya la muestra colectada en solución salina;
3. Transfiera 0,1 mL de la suspensión para la superficie de medio sabouraud,
espárzala con ayuda del asa de Drigalsky;
4. Incube las placas a temperatura ambiente por una semana.
71
General
Aislamiento de hongos de tejidos afectados.
1. Escoja en el material vegetal los sitios que presentan lesiones recientes,

para evitar que hongos saprofitos dificulten el aislamiento de patógenos;
2. Lave el material en agua estéril y seque el material en papel absorbente;
3. Con un bisturí o hoja de cuchilla de afeitar, corte secciones de 1 a 3 mm de
las partes lesionadas, teniendo la precaución de incluir porciones sanas de
tejidos;
4. Sumerja los fragmentos en alcohol 70% por 30 segundos, para romper la
tensión superficial e iniciar la descontaminación superficial del material
vegetal;
5. Con ayuda de una pinza, transfiera los cuadrados a una placa de petri con
solución de hipoclorito de sodio a 1,0 % por, aproximadamente, 30
segundos;
6. Con pinza estéril, retire los fragmentos de la solución de hipoclorito de
sodio, lavar en agua estéril y seque en papel filtro esterilizado;
7. Nuevamente, con ayuda de la pinza, coloque de 4 a 6 cuadros, bien
separados sobre la superficie del medio de cultivo;
8. Incube las placas a temperatura ambiente por una semana.
Preparación de un microcultivo.
1. Colocar en una caja de petri un pedazo de papel filtro, untándolo de

glicerina;
2. Colocar sobre el papel un puente de vidrio en forma de U;
3. Colocar un portaobjeto y encima un pedazo de agar PDA o Sabouraud de
1.0 cm x 1.0 cm;
4. Proceder a tomar varias veces una muestra de hongos usando el asa recta;
5. Inocule varias veces sobre el agar presente en el portaobjeto;
6. Selle las placas con papel;
7. Incubar durante 7 dias a temperatura ambiente;
8. Realizar observaciones diárias.
V. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA.
FUNDER, S, Practical Mycology. Manual for identification of fungi. Hafner Publ.

Co N.Y. 1986.
72
General
Esporas asexuales
Fuente:
https://www.google.com/search?q=estructuras+fungicas&source=lnms&tbm=isc
h#imgrc=_SM365KmZ94-sM&imgdii=CYrtXT3DCTrRLM
Fuente:
h#imgrc=23dakCOU29x4rM&imgdii=Df0iQzHbD78Q2M
73
General
Fuente:
h#imgrc=0_9fvlwCRPmVuM&imgdii=eanaxSCF7rJsWM
VI. RESULTADOS
1. Evalúe el crecimiento de hongos en los medios utilizados, anotando el

número de colonias, tipo, coloración y su identificación a nivel de genero, si
es posible. Para esto es necesario Hacer preparaciones de láminas.
Saprófitos Patógenos
2. Esquematice las observaciones microscópicas de las muestras de hongos.
74
General
Rhizopus sp.
Aspergillus sp. Penicillium sp.
VI. CUESTIONARIO
1. Cuales técnicas modernas existen para la identificación de hongos

patógenos;
2. Discuta las diferencias con relaciona modo de vida de los hongos;
3. Diga las principales características de cada grupo de hongos que aparece
en la tabla anterior.
75
General
17. DESTRUCCIÓN, SUPRESION E INHIBICIÓN DE LOS

MICROORGANISMOS
I. INTRODUCCION.
Las técnicas desinfección, esterilización y profilaxis, que buscan eliminar

organismos contaminantes viables de algunos materiales, fue inicialmente
adelantada como norma esencial para el desarrollo de cultivos bacterias puros
en el laboratorio y rápidamente adaptadas en medicina, cirugía y salud pública
para evitar la difusión enfermedades transmisibles e infecciosas.
1. ACCIÓN DE AGENTES FISICOS Y QUÍMICOS SOBRE LOS

MICROORGANISMOS
Primera parte: Acción del calor húmedo y seco sobre los

microorganismos
OBJETIVO:
Demostrar la acción de diferentes temperaturas sobre el crecimiento

microbiano
Materiales:
• Suspensiones bacterianas
• Agar nutritivo.
Metodología:
1. Someter la suspensión microbiana a la acción de las siguientes

temperaturas:
• 4 oC por 24 horas (siembre una asada en la superficie del agar e incube)

• 24 oC por 24 horas (siembre una asada en la superficie del agar e
incube)
• 50 ° C por 5, 10, 15 y 20 minutos. Divida una placa en 4 partes e incube
cada tiempo.
cada tiempo.
cada tiempo.
76
General
• Autoclave a 15 libras de presión por 15 minutos.

• Terminada la temperatura de calentamiento, cada grupo realizará
siembra, respectiva de sus cajas de petri con la suspensión
correspondiente.
• Incubar las cajas por 24 horas
• Leer y anotar los resultados.
RESULTADOS
Dibuje los resultados obtenidos para cada caso y note los resultados con cada
temperatura utilizada en el siguiente cuadro.
TIEMPO DE EXPOSICIÓN
TEMPERATURA 5 min. 10 min. 15 min. 20 min.
4°C
Temperatura de Laboratorio
50 ° C
75 ° C
100 ° C
Autoclave (15 lb/ presión) por 15
minutos
Parte 2. Efecto del pH sobre el crecimiento microbiano
1. Tomar 5 tubos de ensayo con 6 ml de caldo nutritivo cada uno.

2. Ajustar el pH para cada tubo respectivamente en: 3.0, 5.0, 7.0, 9.0 y 11.0
con HCL o NaOH según el caso.
3. Inocular, cada uno de los tubos con 0.1 mL de la muestra del
microorganismo de interés.
4. Incubar a 37 o C por 48 horas.
5. Observar cada 24 horas.
6. Evaluar el crecimiento.
RESULATDOS.
pH Presencia de crecimiento
3.0
5.0
7.0
9.0
11
77
General
Parte 3. Efecto de la presión osmótica sobre el crecimiento microbiano
1. Tomar 5 tubos de ensayos con caldo nutritivo, ajustarlos previamente con

glucosa en concentraciones de 5, 10, 15, 20 % y el control.
2. Incubar a 37 0C por 48 horas.
3. Observar cada 24 horas.
4. Evaluar el crecimiento microbiano.
RESULTADOS
Concentraciones de glucosa (%) Presencia de crecimiento

5
10
15
20
Control
2. ACCIÓN DE LOS AGENTES QUÍMICOS SOBRE LOS

MICROORGANISMOS.
Parte 1. AGENTES QUIMICOS
OBJETIVO
Demostrar la acción de diferentes sustancias antimicrobiana (antibióticos) y el

tiempo de acción.
Materiales.
• Caldo nutritivo con suspensión bacteriana

• Cajas de petri con agar nutritivo
• Antibióticos
• Pipetas estériles
• Agua estéril.
Metodología.
• Dividir las cajas en tres partes iguales.

• Transfiera una asada de suspensión bacteriana a un tercio de la caja
con agar nutritivo.
78
General
• Prepare una suspensión con antibiótico al 1 y al 5 %.

• Transfiera 2 ml de la suspensión con antibiótico al 1 % a uno de los
tubos con suspensión bacteriana, agite, espere 5 minutos y siembre en
el segundo tercio, Espere 10 minutos y transfiera al último tercio. Repita
este mismo procedimiento pero utilizando suspensión con antibiótico al 5
%.
• Incube por 24 horas.
RESULTADOS.
Anote los resultados obtenidos con cada Antibiótico y concentración utilizada

en el siguiente cuadro.
ANTIBIOTICO CRECIMIENTO CUANTITATIVO
5 minutos 10 minutos
Antibiótico al 1%
Antibiótico al 5 %
Parte 2. RADIACION ULTRAVIOLETA.
1. Tomar dos cajas de cajas de petri con agar nutritivo;

2. Inocular la muestra a estudiar con asa bacteriológica;
3. Asépticamente quitar la tapa a una de ella. La otra queda como control;
4. Exponer la caja a la radiación ultravioleta, por 10minutos;
5. Incubar a 37 oC durante 48 horas;
6. Observar y anotar el crecimiento;
79
General
RESULTADOS
Anote los resultados obtenidos.
Radiación ultravioleta Control
80
General
LABORATORIO 18. GENÉTICA BACTERIANA
Aislamiento de un mutante resistente a antibiótico.
I. INTRODUCCIÓN
La mutación es un cambio irreversible en un gen que puede manifestarse en la

síntesis de la proteína, alterando una característica fisiológica, morfológica o
bioquímica en la célula. La frecuencia de aparición de los mutantes en una
población microbiana está relacionada a ciertos cambios físico-químicos
ambientales. Para detectar y aislar un microorganismo mutante se requiere de
métodos especiales como el gradiente en placa. Este método es utilizado para
detectar cepas mutantes, por lo general cuando se presenta resistencia a
antibióticos, estos cambios son mutaciones espontáneas, detectadas fácil
mente por que la célula resistente a dicho antibiótico, solo crecerán en el medio
de cultivo específico en presencia de concentraciones de antibióticos; mientras
son inhibidas las cepas sensibles como la población normal. Para detectar
estas células mutantes se utiliza el método gradiente en placa.
II. OBJETIVOS
1. Utilizar el método de gradiente en placa para detectar cepas mutantes.

2. Diferenciar una cepa resistente y una sensible al antibiótico oxitetraciclina.
III. MATERIALES
Cepas de Staphylococcus aureus

Agar Soja Tripticasa
Oxitetrraciclina
Asas
Varillas de vidrio
IV. PROCEDIMIENTO
1. Colocar una caja de petri estéril por un extremo sobre una varilla de vidrio.
2. Verter agar tripticasa soja fundido a 50 oC en la caja de petri de manera que
cubra la superficie del fondo de la caja.
3. Dejar sodificar
4. Colocar la caja de petri en posición horizontal.
5. Añadir 0.1 mL del antibiótico oxitetraciclina a un tubo con agar tripticasa soja
fundido y temperado a 50 oC.
6. Mezclar bien el tubo.
7. Vertir el medio sobre la superficie de la caja de petri.
8. Inocular de 0.1 a 0.5 mL del cultivo de Staphylococcus aureus sobre la
superficie del agar tripticasa soja.
9. Esparcir la muestra.
81
General
10. Incubar a 37 oC por 24 a 48 horas.

11. Examinar el desarrollo de colonias resistente en las áreas de mayor
concentración del antibiótico.
12. Tomar varias colonias
13. Hacer una suspensión en caldo tripticasa soja.
14. Incubar con caldo tripticasa soja conteniendo 0.001 mg y 0.05 mg de
oxitetraciclina
15. Incubar a 37 oC por 24 horas.
16. Observar el crecimiento por turbidez.
WISTREICH, GEORGE & MAX D. LECHTMAN. Prácticas de laboratório de

microbiologia. Ed. Limusa, México, 1993.
VI. RESULTADOS
Realizar un cuadro especificando las características morfológicas de la colonia

de una cepa resistente con las cepas sensibles.
Cepas resistentes Cepas sensibles
VII. CUESTIONARIO
1. La presencia de oxitetraciclina en el medio de cultivo causa mutación.

Justifique su respuesta.
2. Que son y porque se producen las mutaciones en un microorganismo.
3. Cuáles son los principales tipos de mutaciones que existe.
82
General
LABORATORIO 19. ALTERACIONES FENOTÍPICAS Y GENOTÍPICAS
I. INTRODUCCION
El auge de la genética en los últimos años, se debe en parte, a la utilización de

los microorganismos en la investigación. Dentro los microorganismos
empleados en estudios genéticos, mas bacterias merecen especial destaque,
debido a su corto tiempo de generación y el número de células obtenidas en
espacios reducidos. Además, de las alteraciones causadas por las mutaciones
poden ser fácilmente identificadas en esos microorganismos. Las mutaciones
pueden ser definidas como una alteración hereditaria en la secuencia de bases
del DNA de un organismo. El individuo que lleva esa mutación es llamado
mutante.
Las mutaciones pueden ocurrir espontáneamente o pueden ser inducidas por

agentes físicos y químicos. Mutaciones resistentes a antibióticos pueden ser
seleccionadas por el plaqueamiento directo de las bacterias en medio
conteniendo antibióticos apropiados. El mutante presenta un genotipo
diferente del linaje parental. El genotipo representa un conjunto completo de
genes de un organismo. Las alteraciones genotípicas son alteraciones del
DNA y son trasmitidas de una generación a otra. El genotipo asociado al medio
ambiente determina el fenótipo de un organismo. Modificaciones en las
condiciones ambientales pueden provocar alteraciones fenotípicas. El efecto
de la temperatura de incubación sobre la producción de pigmentos por Serratia
marcescens es un ejemplo de una alteración fenotípica.
II. OBJETIVOS
• Observar alteraciones en la producción de pigmentos por Serratia

marcescens cultiva en diferentes temperaturas;
• Aislar mutantes espontáneos de Escherichia coli resistente a
antibióticos.
III. MATERIAL
• Microorganismos: Serratia marcescens, Escherichia coli.

• Medios y soluciones: Agar nutritivo, caldo nutritivo, soluciones de
estreptomicinas (10 mg/mL).
• Equipos: Placas de petri, asa de Drigalsky, pipeta, incubadora.
83
General
IV. PROCEDIMIENTO
Producción de pigmentos por Serratia marcescens
• Separe dos placas de petri con agar nutritivo. Con lápiz marca vidrio
divida la placa en dos partes iguales. En una de ella, siembre una
muestra de Serratia marcescens pigmentada y, en la otra mitad, la
muestra de la bacteria no pigmentada, utilizando técnica de estrías
simple;
• Inocule una de las placas a temperatura ambiente y la otra a 40 oC, por
48 horas.
Aislamiento de mutantes espontáneos resistentes a estreptomicina
• Coloque 10 mL de agar nutritivo fundido en una placa de petri. Espere

que sodifique;
• Adicione 10 mL nutritivo fundido y mantenido a 50 oC, conteniendo 100
µL de estreptomicina (10 mg/mL), sobre el medio anterior vertido
sodificado, espere una hora:
• Siembre 0.1 mL de cultivo de Escherichia coli cultivada en caldo nutritivo
por 24 horas a 37 oC y esparza el inoculo con el asa;
• Incube por 24 horas, a 37 oC;
• Observe la presencia de colonias de bacterias en las regiones donde la
concentración del antibiótico fue suficiente para inhibir el crecimiento de
la bacteria nativa.
WISTREICH, GEORGE & MAX D. LECHTMAN. Práticas de laboratório de

microbiologia. Ed. Limusa, México, 1993.
VI. RESULTADOS
1. Producción de pigmento por Serratia marcescens
Temperatura de incubación Presencia y/o ausencia de pigmento

Temperatura Ambiente
40 oC
84
General
2. Observe el crecimiento de las bacterias y esquematice.
VII. CUESTIONARIO
1. Porque las células blancas de Serratia marcescens no son consideradas

mutantes;
2. ¿La presencia de estreptomicina en el medio de cultivo causa mutación?
Justifique su respuesta.
85
General
LABORATORIO 20. IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE BACTERIAS
INTRODUCCIÓN.
El descubrimiento de la estructura de la molécula del ADN, puede considerarse

como el hallazgo científico más importante del siglo XX, dado que, permitió
“leer” el libro de la vida que hasta la fecha había sido un misterio; esclareciendo
los procesos que gobiernan la vida, así como, el inicio de los procesos de
exploración y creación de herramientas moleculares que permitieran su estudio
y la modificación de la misma. El trabajo publicado por Watson y Crick en abril
de 1953, permitió establecer que el DNA era la molécula encargada de portar el
código genético y por lo tanto la llave de la herencia y la evolución y, el
conocimiento de cómo se almacenaba-duplicaba la información genética
permitió el estudio de la biología a otro nivel, iniciándose la era de la Biología
molecular. Adicionalmente, en 1978 el descubrimiento de las enzimas de
restricción (por Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith), condujo al
desarrollo de la tecnología del ADN recombinante y a su vez a la Biotecnología.
Con estos descubrimientos, fue posible completar el genoma humano y de

otros organismos, así como, determinar exactamente géneros y especies de
microorganismos y, establecer las relaciones filogenéticas de los seres;
completando el árbol evolutivo (sistema de los tres dominios). La variabilidad
genética de microorganismos, puede ser evaluada mediante caracteres
morfológicos, bioquímicos, morfológicos, isoenzimáticos o con marcadores
moleculares, que son secuencias de ADN que se encuentran en el genoma.
Estos caracteres son llamados marcadores debido a que, pueden ser utilizados
directamente para obtener información acerca de la genética de caracteres de
interés del microorganismo en estudio. Los marcadores moleculares no son
afectados por el ambiente; pueden ser regiones de ADN codificantes (exones),
o no codificantes (intrones) (esto dependiendo de la naturaleza Eucariota o
Procariota). Se han desarrollado varios tipos de marcadores moleculares
basados en la técnica de PCR (Polymerase change reaction, por sus siglas en
inglés), la cual permite elaborar un número ilimitado de copias de cualquier
fragmento de ADN; a partir de una sola molécula de ADN, la PCR puede
generar 100.000 millones de
moléculas idénticas. Los marcadores moleculares se han usado para

identificación de géneros, mapeo genético, mejoramiento, estudios de
diversidad genética, flujo de genes y huellas genéticas. En la identificación de
microorganismos, la variación en las secuencias de ADN donde se alinean los
cebadores y la diferencia en la longitud del ADN amplificado, permite identificar
exactamente las especies que son morfológicamente similares.
86
General
OBJETIVOS.
• Identificar los conceptos básicos de las herramientas moleculares

aplicadas a la identificación de microorganismos.
• Adiestrar a los estudiantes en técnicas moleculares basadas en PCR,
aplicadas a la identificación de bacterias y hongos.
• El estudiante estará en la capacidad de proponer, aplicar y comparar
metodologías moleculares de identificación de microorganismos,
respecto a marcadores morfológicos y bioquímicos.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La reacción usa una plantilla de

ADN, dos oligonucleótidos “cebadores” o iniciadores (o primers), de 20 a 28
bases complementarias a su secuencia de ADN. La elongación de los
cebadores es catalizada por la enzima Taq ADN polimerasa, que es una
enzima termoestable aislada de la bacteria termofílica Thermus aquaticus. La
mezcla de cebadores, ADN, dNTP´s y Taq, es calentada para permitir la
separación de las cadenas de ADN que contienen las secuencias de interés, y
luego es enfriada para permitir que los cebadores encuentren su secuencia
complementaria, se acoplen a ellas y la Taq polimerasa inicie la extensión de
los cebadores y genere una nueva cadena. Con series de calentamiento-
enfriamiento se multiplica el ADN de forma exponencial, obteniendo
aproximadamente en 20 ciclos y en 1h, el ADN localizado entre los cebadores
amplificado 1 millón de veces (Sharrocks, 1994).
Genes ribosomales. El ADNr está compuesto de unidades repetidas que

incluyen el gen pre-RNAr y un espaciador. El pre-RNAr sintetizado por la RNA
polimerasa I, es procesado en moléculas de ARN maduro con diferentes
velocidades de sedimentación (5.8S, 18S y 28S). En algunos casos las
unidades repetidas también codifican para RNAr 5S, pero en general los genes
pre-RNA y 5S RNA en eucariotas no están ligados y en muchos de ellos la
unidad de transcripción de pre-RNA tiene un tamaño de cerca de 8kb. Las
unidades de transcripción alternan con regiones espaciadoras, una referidas
como espaciadores no transcritos (NTS), y otros espaciadores transcritos
dentro de regiones no conservadas del pre-RNA, que se dividen en internos,
ITS (Internal Transcribed Spacer, por sus siglas en inglés) y externos, ETS
(External Transcribed Spacer, por sus siglas en inglés). Análisis de secuencia
de genes de la subunidad ribosomal pequeña RNA, mostraron que las líneas
filogenéticas de diferentes Oomycetes, hongos superiores y plantas superiores
eran diferentes; así las secuencias de RNA han sido usadas en investigación
de relaciones genéticas entre organismos y microorganismos, para evaluar
distancias filogenéticas.
87
General
METODOLOGIA
1. Selección y recolección del material para el aislamiento del

microorganismo.
Con el objetivo aislar y purificar los microorganismos y, extraer los ácidos

nucléicos para el proceso de identificación, es importante realizar una
adecuada toma de la muestra y almacenamiento de la misma. Para esto, se
toman las muestras apropiadas (vegetales, animales o ambientales), donde se
encuentra o presume la existencia del microorganismo. El material colectado,
se empaca adecuadamente y se almacena en nevera de icopor a ±10°C, y en
estas condiciones se mantiene hasta el momento del análisis; en este paso se
debe subrayar que, para cada tipo de muestra y de microorganismo, se deben
seguir los lineamientos registrados.
Para todo tipo de muestra, debe registrarse información básica que, permita
identificarla y hacer análisis posteriores junto con los resultados obtenidos, así:
• Un código de muestra.
• Fecha de recolección y de procesamiento de la muestra.
• Nombre de la persona que realiza el muestreo y la recolección.
• Procedencia de la muestra.
• Composición de la muestra. En muchos casos, el microorganismo a
identificar puede encontrarse asociado a diferentes tejidos, partes o
estratos a muestrear; siendo la muestra compuesta finalmente por
diversas sub-muestras.
• Observaciones de la muestra bajo estereoscopio (si es necesario):
descripción de la muestra, condiciones naturales de la muestra y
definición de síntomas y/o signos (cuando son muestras de procedencia
humana, animal o vegetal), evidencia de otros organismos, y
presencia/ausencia de exudados, color y consistencia.
• Observaciones de la muestra bajo microscopio: microorganismo(s)
observado(s).
• Resultado y observaciones.
Conservación de muestras. Las muestras empacadas y rotuladas para

procesarse inmediatamente pueden ser mantenidas a 4°C. Si la muestra se
almacena por aproximadamente 20 días, esta debe almacenarse a - 20°C; y si
el tiempo de análisis es mayor a 20 días, la muestra se debe mantener a -80 C.
Para todos los casos, recuerde seguir los lineamientos específicos para el tipo
de muestra a analizar.
2. Aislamiento de microorganismos a partir de las muestras.
De las muestras registradas y codificadas adecuadamente, se realiza el

aislamiento del microorganismo (hongos o bacterias), siguiendo los métodos
apropiados para cada caso e incluyendo procesos de desinfección si son
requeridos.
88
General
Purificación de aislamientos. Esta etapa reviste gran importancia para el

proceso de identificación molecular, puesto que, las amplificaciones de los
ácidos nucléicos y su posterior secuenciación, requieren de pureza del
microorganismo (una solo identidad genética), y no una mezcla de él; esto
puede ser determinado en las etapas finales de la identificación, siendo un
factor de error para algunos tipos de muestras.
Para el caso de las bacterias, del aislamiento inicial, debe ser tomada una
alícuota con asa bacteriológica, sembrada por agotamiento en un medio de
cultivo apropiado e incubada bajo las condiciones adecuadas; concluido el
periodo de incubación, se toma una colonia aislada y uniforme (preferiblemente
de la última estría realizada sobre el medio), se transfiere a un medio de cultivo
nuevo y se incuba apropiadamente, evitando contaminaciones posteriores.
Para el caso de los hongos, se prepara un cultivo, partiendo de una sola espora
(cultivo monospórico). Para su elaboración, se toma con una aguja de
disección las esporas del hongo y se depositan en un tubo para microcentrífuga
de 1.5 mL (Eppendorf®), en 1mL de agua destilada estéril; en el caso de existir
micelio, se filtra el crecimiento del hongo, haciéndolo pasar por 2 o 3 capas de
gasa estéril. La suspensión acuosa de esporas se homogeniza en vórtex y se
verifica una concentración baja de las esporas por medio de una placa
observada bajo el microscopio.
Posterior a la obtención de la suspensión de esporas, se toma una alícuota de

0,1mL y se deposita sobre la superficie seca de una placa de Agar Agua 2%,
homogenizando con un asa de vidrio. Las cajas así inoculadas se incuban a la
temperatura adecuada por 15h (el tiempo puede ser menor o mayor, de
acuerdo al hongo). Cumplido el tiempo de incubación, la caja Petri sembrada
se observa bajo un estereoscopio para detectar la presencia de esporas
individuales germinadas; al ser detectadas, éstas se transfieren individualmente
con la ayuda de una microaguja a cajas con agar de PDA. El proceso puede
optimizarse, tomando al menos cinco esporas germinadas y transferidas a
cajas diferentes. El cultivo obtenido de esta manera, es procedente entonces
de una sola espora y debe ser conservado adecuadamente.
3. Propagación de inóculos. El objetivo de dicha propagación, es la

conseguir altas poblaciones del microorganismo, lo cual se traduce, en una alta
concentración de ácidos nucléicos disponibles para el momento de la
extracción.
Propagación de inóculos bacterianos. Para el caso de las bacterias, pueden ser

utilizados caldos o medios sólidos (como caldo o agar Nutritivo, medio de King-
B o el registrado para el microorganismo en cuestión), en los cuales se siembra
y se permite su crecimiento, evitando que el cultivo envejezca en el medio o se
contamine. Para nuestro caso, se utilizará el caldo Luria Bertani (LB), para la
propagación de Burkholderia glumae; la bacteria se inocula en tubos
89
General
conteniendo 3mL de caldo LB, por medio de asa bacteriológica estéril (puntas o
palillos estériles), y se incuba a 28°C/24h con agitación constante a 250rpm.
Este material será el utilizado para la extracción de ADN. La bacteria así
propagada, puede conservarse en partes iguales de Glicerol-60% (3mL LB-
bacteria + 3mL Glicerol 60%); almacenar a -80ºC.
3. Extracción de ADN de bacterias.
La extracción de ADN se realizará según el protocolo descrito por (Green &

Sambrook, 2012; M. N. Oliveira et al., 2013) Los aislados bacterianos será
purificados, y activados en medio LB, durante 18 horas, pasado este tiempo se
tomará 1 ml de la suspensión bacteriana y se centrifugará a 12000 rpm para
obtener un precipitado bacteriano; este precipitado se resuspenderá en EDTA
0.5M y fue centrifugado a 12000 rmp por 20 minutos; el precipitado se tratará
con buffer de lisis (EDTA 0.5m y SDS 0.25%) e incubándose la mezcla a 60°C
por 1 hora. Pasado este tiempo se adicionará NaCl 5M con incubación a 4°C
durante 5 minutos, para luego centrifugar las muestras a 12000rpm. A la
suspensión resultante se le adicionará un mismo volumen de fenol-cloroformo-
alcohol isoamilico 25:24:1 y se centrifugará a 12000rpm, a la suspensión se le
adicionará medio volumen de isopropanol para luego incubarlas durante 14
horas. Finalmente, las muestras se le adicionará etanol hasta secar el ADN
para luego ser resuspendidas en buffer TE 0.5X.
4. Amplificación de ADN.
Para identificación molecular de bacterias endófitas promotoras de crecimiento
se emplearon iniciadores Universales de la región ADNr 16S que gen que
codifica la molécula de la subunidad pequeña ribosomal ARNr 16S. Los
iniciadores específicos para cada uno de las clases pertenecientes al dominio
bacteria como son alfa, beta, gama-proteobacteria y firmicutes los cuales se
muestran en la tabla siguiente:
90
General
Tabla. Iniciadores (Forward y reverse) pertenecientes a los diferentes grupos

de bacterias
Iniciador Secuencia 5’ – 3’ Condiciones de PCR Referenci
a
F203α1 CCGCATAGCCCCTACGGGGGAAAGTT Etapa Inicial: 96°C x 5’ (Gomes
TATCGCACAAGCGGTGGATGA Desnaturalización: 96°Cx 1’ et al.,
Alineamiento 56°Cx 1’ 2001)
Extensión: 72°C x 2’
Ciclos: 30
Extensión Final: 72°x 10’
F948β2 CGCACAAGCGGTGGATGA Etapa Inicial: 94°C x 5 min (Gomes
Desnaturalización: 94°Cx 1’ et al.,
Alineamiento 60°Cx 1’ 2001)
Extensión: 72°C x 2’
Ciclos: 30
FD23 AGAGTTTGATCATGGCTCAG Etapa Inicial: 94°C x 5’ (Weisburg
Desnaturalización: 94°C x , Barns,
15” Pelletier,
Alineamiento 52°Cx 1’ & Lane,
Extensión: 72°C x 1’ 1991)
Ciclos: 30. Los últimos 20
ciclos se aumenta el tiempo
de extensión de 2” por ciclo
R14921,2 TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT (Weisburg
et al.,
1991)
RP13 ACGGTTACCTTGTTACGCTT (Weisburg
et al.,
1991)
1Grupo bacteriano alfaproteobacteria, 2Betaproteobacteria, 3Gamaproteobacteria, Firmicute
4. Cuantificación del ADN total extraído.
Esta etapa es de vital importancia para el proceso de amplificación de los

ácidos nucleicos, debido a que, de esta forma, se determina la concentración
lograda de ADN con la metodología de extracción aplicada. Para la
cuantificación del ADN, pueden emplearse diversas metodologías; la registrada
aquí, es una metodología basada en fluorometría. Para aplicar este método,
deben tenerse precauciones, dado que, el colorante Hoesch-Dye que se utiliza
para la cuantificación es altamente tóxico (posible mutágeno); recuerde que
SIEMPRE debe trabajar con guantes de nitrilo y evitar el contacto con la piel y
mucosas, así como, abrir o cerrar puertas con los guantes.
Para la cuantificación con el fluorómetro DyNA QUANTTM 200 (Hoefer

Pharmacia Biotech, INC.), siga las instrucciones:
• Encender el Fluorómetro 15 minutos antes de usarlo.

• Con el botón “cero”, ajustar el cero del equipo.
• Colocar la celda de modo que la “G”, quede frente a Usted.
91
General
• Depositar en la celda 2mL de solución de trabajo.

• Con el botón “cero”, ajustar el cero del equipo nuevamente.
• Añadir 2µL del patrón de ADN (100ng/µL).
• Con una pipeta Pasteur plástica, homogenizar suavemente el contenido
de la celda; cerrar la compuerta de la celda y con el botón de escala
ajustar la lectura hasta 100.
• Con la pipeta Pasteur, retire toda la solución de la celda.
• Repita los pasos desde 6 hasta 11.
• Tenga en cuenta que debe ajustar el botón de escala, hasta que al leer
el patrón de 100ng/µL, la lectura sea “100” (en su defecto la lectura de la
cantidad del estándar utilizado). En este momento el botón de escala no
debe moverse más.
• Repita los pasos desde 4 hasta 12, pero con el patrón de 25ng/µL.
• Cuando la lectura sea igual a 25ng/µL, no debe mover más el botón de
escala.
• Leer nuevamente el patrón de 100ng/µL. En este paso la lectura debe
ser de 100ng/µL sin necesidad de mover el botón de escala.
• Repetir los pasos de 6 a 10, pero con la muestra o muestras de la
extracción realizada.
• Al concluir la lectura de las extracciones, lave bien la celda con alcohol,
apague el equipo y deje todo en orden.
• Con la lectura de la concentración de ADN en la muestra, calcule las
cantidades necesarias para preparar su solución de trabajo.
Recuerde que la solución de trabajo o buffer con el colorante Hoechst-Dye,

debe prepararse en el momento de usarse; la celda debe limpiarse muy bien
antes de utilizarse; entre cada una de las lecturas de las muestras, el equipo
debe ajustarse a cero y en caso que la lectura no sea cero, se debe vaciarse la
celda y llenarla con nueva solución, para leer el cero nuevamente. Finalmente,
tenga cuidado que la solución no se derrame dentro del equipo.
Elaboración de gel de agarosa y montaje de la cámara de electroforesis. Para

la preparación del gel de agarosa al 1,2% (p/v), y el montaje de la cámara
donde se va a llevar a cabo la separación electroforética de los amplificados,
siga las instrucciones relacionadas a continuación:
• Pese la cantidad correcta de agarosa en un pesasales Erlenmeyer y

adicione el volumen adecuado de buffer de corrida (TAE 1X ó TBE 0.5X
de concentración final) (Preparación Buffer TBE10X: Trisma base 108g,
ácido bórico 55g y EDTA 0.5M 40mL, aforar a 1000mL con agua
destilada). Para calcular el volumen de gel a preparar al 1,2%, determine
el área de la bandeja y multiplíquela por 3 a 5 mm (espesor deseado del
gel). El espesor del gel depende de la cantidad de muestra que desee
cargar o de la cantidad de DNA que desee separar.
• Mientras se hidrata la agarosa, prepare la bandeja-molde. Selle los
extremos abiertos con cinta adhesiva para formar una caja. Disponga el
92
General
peine de manera tal que los dientes queden alejados de 0.5 a 1.0 mm
por encima de la superficie de la bandeja.
• En una plancha de calentamiento con agitación, caliente a ebullición la
suspensión de agarosa hidratada hasta completa disolución de la
agarosa. Evite la evaporación tapando el recipiente con papel aluminio.
Deje enfriar a 50°C antes de moldear. Alternativamente se puede
preparar el gel con Bromuro de etidio (para este caso, siempre use
guantes). En este caso, enfríe a 60°C y adiciónelo a una concentración
final de 0.5 µg/mL). Mezcle suavemente para no incluir burbujas de aire
en la matriz.
• Vierta con rapidez, pero cuidadosamente el gel de agarosa en el molde,
hasta alcanzar un espesor de 3 a 5 mm. Deje solidificar completamente
al menos por 30 minutos.
• Previo a la retirada del peine, adicione unos microlitros del buffer (TAE
1X o TBE 0.5X), para humedecer los dientes y evitar así el daño de los
mismos; también, puede retirar el peine antes de la deposición de las
muestras de ADN, cuando ya la bandeja del gel está dentro del buffer de
corrida en la cámara.
• Retire el peine aflojándolo con movimientos suaves.
• Retire la cinta adhesiva con la cual se sellaron los extremos de la
bandeja y traslade la bandeja con el gel a la cámara de electroforesis.
Ubique las celdillas del gel hacia el cátodo (polo negativo y de color
negro), para que la migración de la muestra sea hacia el ánodo (polo
positivo de color rojo). Para facilitar el servido de las muestras
amplificadas en los pozos, es conveniente colocar una cinta adhesiva de
color debajo de la bandeja de preparación del gel.
• Adicione una cantidad suficiente de buffer de corrida hasta cubrir
completamente el gel y sirva las muestras.
Preparación de la muestra y electroforesis. Una vez montado el sistema de

electroforesis, prepare las muestras amplificadas de la siguiente forma:
• A 5µL del amplificado, adicione 3µL de blue juice o buffer de carga

(permite precipitar el amplificado en el pozo y evitar la salida de él). El
volumen de muestra a servir en el pozo, está relacionado con el tamaño
del gel y de los pozos y en términos generales el buffer de carga se
calcula aproximadamente como la tercera parte del amplificado a utilizar.
• Con la ayuda de micropipetas, tome los 8µL totales de muestra (5µL del
amplificado + 3µL buffer de carga), y deposítelos cuidadosamente en el
segundo pozo, evitando romper el gel. Cambiando la punta de la
micropipeta, sirva todas las muestras siguiendo la misma instrucción.
Procure no demorarse en el servido de las muestras.
• Cuando haya concluido de servir las muestras y con puntas nuevas,
sirva 6µL en cada pozo de un marcador de peso molecular de 100pb (en
el primer y último pozo del gel).
• Cierre la cámara, conecte los cables del cátodo y el ánodo y, encienda la
fuente de poder.
93
General
• Realice la separación electroforética a 90 voltios por 1h.

• Finalizado la electroforesis, apague la fuente de poder, retire los cables y
retire cuidadosamente la bandeja con el gel.
• Retire el gel de la bandeja y realice la visualización de las bandas en un
analizador de imágenes o transiluminador UV (El bromuro de etidio es
fluorescente, por lo cual las bandas tendrán esta característica).
• Registre fotográficamente lo observado y analice los resultados
obtenidos.
Para realizar correctamente la electroforesis, tenga presente que: la agarosa

debe diluirse completamente en el buffer mientras se calienta; al servir las
muestras, debe evitar que se salgan del pozo y para evitar que las muestras se
difundan en el gel, sírvalas rápidamente y éntrelas en la matriz a 200V
aproximadamente; una vez dentro, baje el voltaje y déjelo constante hasta el
final de la electroforesis. También tenga en cuenta que el amperaje siempre
debe estar en un valor por debajo o muy cercano al del voltaje, nunca debe
superarlo.
Limpieza de amplificados con Polietilenglicol (PEG). Una vez visualizado el

amplificado en el gel de agarosa, debe ser realizada una limpieza de este. El
objetivo, es el de eliminar suciedades que puedan interferir con la
secuenciación del amplificado. Para esto, se debe realizar lo siguiente:
• Aproximadamente se debe contar con 40µL de amplificado, los cuales

se disponen en un tubo para microcentrífuga de 1,5mL de capacidad.
• Se adicionan 40µL de una solución de PEG 20% / NaCl 2.5M (10g PEG-
8000 + 7.3g NaCl; aforar a 50mL de agua tipo HPLC y dejar
resuspender a 37°C).
• Mezclar suavemente en vórtex.
• Incubar a temperatura ambiente por 15min.
• Centrifugar a13000 rpm / 5min a temperatura ambiente.
• Eliminar el PEG por inversión del tubo.
• Adicionar 100µL de etanol 70% (no se requiere que esté frío).
• Centrifugar a 13000rpm / 2 a 4min.
• Con una micropipeta eliminar el alcohol del tubo. Debe ser una
operación cuidadosa, pues el ADN amplificado puede no ser visible y
eliminarse junto con el alcohol.
• Abra parcialmente el tubo y permita que el alcohol termine de
vaporizarse a temperatura ambiente.
• Resuspenda en 10µL de agua tipo HPLC.
• Almacene a -20°C. Si se desea verificar el resultado de la limpieza del
amplificado, realice un corrido electroforético, como el descrito en el
apartado “Separación electroforética de regiones amplificadas para
hongos y bacterias”.
94
General
5. Secuenciación de ADN amplificado
Los productos de la amplificación fueron enviados para su purificación y

secuenciación a la empresa de Macrogen Korea. Una vez obtenidas las
secuencias nucleotidicas, se realizó una búsqueda de las secuencias
homologas con las secuencias almacenadas en la base de datos del National
Center for Biotechnology Information (NCBI). El alineamiento de bases se
realizó con el software Clustal W y el análisis y corrección con el programa
Mega 4.0.(Tamura et al., 2007). Empleando el mismo programa se determinó el
método con que se evaluó las inferencias filogenéticas.
Referencias
Gomes, N., Heuer, H., Schönfeld, J., Costa, R., Mendonca-Hagler, L., & Smalla,
K. (2001). Bacterial diversity of the rhizosphere of maize (Zea mays) grown in
tropical soil studied by temperature gradient gel electrophoresis. Plant and Soil,
232(1-2), 167-180.
Oliveira, M. N., Santos, T. M., Vale, H. M., Delvaux, J. C., Cordero, A. P.,
Ferreira, A. B., . . . Moraes, C. A. 2013. Endophytic microbial diversity in coffee
cherries of Coffea arabica from southeastern Brazil. Canadian journal of
microbiology, 59(4), 221-230.
Tamura, K., Dudley, J., Nei, M., & Kumar, S. (2007). MEGA4: molecular
evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular biology
and evolution, 24(8), 1596-1599.
Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., & Lane, D. J. (1991). 16S
ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of bacteriology,
173(2), 697-703.
95

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Departamento de Biología asignatura Microbiología

ALEXANDER FRANCISCO PEREZ CORDERO

BIOSEGURIDAD Y ESTERILIZACIÓN EN EL LABORATORIO DE

ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS EN DIFERENTES

PREPARACIONES MICROSCÓPICAS EN FRESCO………………………….23

PREPARACIONES MICROSCÓPICAS FIJAS: COLORACIÓN SIMPLE…….26

PREPARACIONES MICROSCÓPICAS. TINCIÓN DIFERENCIAL: TINCIÓN DE

COLORACION DE CAPSULAS BACTERIANAS………………………………..32

COLORACIÓN DE ESPOROS BACTERIANOS…………………………………34

PREPARACION Y ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVOS…………..38

AISLAMIENTO Y CONTEO DE MICROORGANISMO EN CULTURAS PURAS

ESTUDIO DE LAS CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DE LOS

MICROBIOLOGIA DEL AGUA Y DE ALIMEMENTO

AISLAMIENTO, PREPARACIÓN Y OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE

DESTRUCCIÓN, SUPRESION E INHIBICIÓN DE LOS

ALTERACIONES FENOTÍPICAS Y GENOTÍPICAS……………………………. 70

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE BACTERIAS………………………………86

El manual de microbiología general fue preparado con el propósito de

El estudiante trabajará con microorganismos (patógenos y no patógenos) de

LABORATORIO 1. BIOSEGURIDAD Y ESTERILIZACIÓN EN EL

Bioseguridad ha sido definida por el ministerio de Protección Social como el

Durante el trabajo diario en microbiología, se dan situaciones de potenciales

de su productividad. El propósito de este manual es describir la metodología a

OBJETIVOS DE LA BIOSEGURIDAD DURANTE LAS PRÁCTICAS EN EL

• Los estudiantes deben conocer los principios básicos de la bioseguridad

NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE

La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de

1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el

De todos ellos, el que mejor se puede controlar en el laboratorio es la ruta de

percutánea y el contacto directo con la piel o las mucosas también son

CLASIFICACIÓN DE LOS AGENTES BIOLÓGICOS POR GRUPO DE

5. Agente biológico del grupo 4. Se refiere a aquél que causando una

6. Desechos con riesgo biológico. Se caracterizan por albergar

7. Desechos infectantes. Son aquellos que sirven como fuente de infección.

8. Desechos sólidos: son aquellos que se generan en gran cantidad en las

9. Desechos líquidos. Como sangre entera, excreciones y secreciones (orina,

10. Desechos no infectantes. Son residuos que no tienen capacidad de

11. Desechos reciclables. son los residuos generalmente no biodegradables y

13. Desechos no reciclables. son desechos que pueden ser o no

Para el uso en laboratorios de microbiología, existen diferentes moléculas que

Tabla 1. Agentes desinfectantes comúnmente utilizados en microbiología y su

Agente Mecanismo de acción Aplicaciones

Ejercicio practico. ¿Cómo preparar la solución diaria de hipoclorito de sodio?.

Aplique la fórmula: V CdxVd

Estas cajas o neveras deberán ser rígidas y resistentes a los golpes,

DEFINICIONES A TENER ENCUENTA DURANTE LAS PRÁCTICAS DE

Desinfección. Es el proceso mediante el cual se eliminan todos los

Desinfectante. Es el producto utilizado para destruir microorganismos en

Antiséptico. Es el compuesto químico utilizado externamente en la piel o

Instrumentos críticos o de alto riesgo. son aquellos que entran en contacto

Instrumentos no críticos, son aquellos que entran en contacto con la piel

La desinfección puede hacerse mediante uso del calor (ebullición, hornos a

Esterilización. Es la completa eliminación o destrucción de toda forma de vida

Si se aplican las PRECAUCIONES UNIVERSALES, el riesgo de contaminación

1. Evitar contacto de piel o mucosa con sangre y otros líquidos de

Esta precaución es necesaria tenerla en cuenta con TODOS los pacientes y no

implementar el uso del EQUIPO DE PROTECCIÓN PERSONAL (E.P.P.),

El E.P.P. será considerado apropiado solamente si impide que la sangre y otro

a) Tocar sangre y líquidos corporales que contengan sangre o superficies